Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

En Neste generasjons Tissue Microarray (ngTMA) Protokoll for biomarkør studier

doi: 10.3791/51893 Published: September 23, 2014

Summary

Protokollen tar sikte på å optimalisere konstruksjon og kvaliteten på microarray for biomarkør forskning. Det inkluderer aspekter av planlegging og design, digital patologi, virtuelle lysbilde merknader, og automatisert vev oppstillings.

Abstract

Biomarkør forskning er avhengig av microarray (TMA). TMA fremstilles ved gjentatt overføring av små kjerner vev fra en "donor" blokker i en 'mottager' blokk og deretter brukes for en rekke anvendelser biomarkører. Konstruksjonen av konvensjonell TMA er arbeidskrevende, unøyaktig og tidkrevende. Her er en protokoll ved hjelp av neste generasjons microarray (ngTMA) skissert. ngTMA er basert på TMA planlegging og design, digital patologi, og automatisert vev microarraying. Protokollen er illustrert ved hjelp av et eksempel på 134 metastatisk kolorektalcancer. Histologiske, statistiske og logistiske aspekter er vurdert, slik som vevstype, spesifikke histologiske regioner, og celletyper for inkludering i TMA, antall vev flekker, utvalgsstørrelse, statistisk analyse, og antall TMA eksemplarer. Histologiske lysbilder for hver pasient blir skannet og lastet opp på en web-basert digital plattform. Der blir de sett og annotated (merket) med en 0,6 til 2,0 mm diameter verktøy, flere ganger ved hjelp av ulike farger for å skille vev områder. Donor blokker og 12 'mottakerens blokker er lastet inn i instrumentet. Digitale lysbildene er hentet og tilpasset donor blokk bilder. Gjentatt oppstillings av kommenterte regioner utføres automatisk resulterer i en ngTMA. I dette eksemplet er seks ngTMAs planlagt inneholdende seks forskjellige vevstyper / histologiske soner. To kopier av ngTMAs er ønsket. Tre til fire lysbilder for hver pasient skannes; 3 skanne kjører er nødvendig og utført over natten. Alle lysbildene er annotert; forskjellige farger er brukt for å representere de ulike vev / soner, nemlig svulst sentrum, invasjon front, svulst / stroma, lymfeknutemetastaser, levermetastaser, og normalt vev. 17 merknader / case er gjort; tid for merknad er 2-3 min / case. 12 ngTMAs er produsert med 4556 plasser. Arraying tid er 15-20 timer. På grunn av sin presisjon, fleksibilitet og hastighet, er ngTMA en kraftigverktøyet for ytterligere å forbedre kvaliteten på TMA brukt i klinisk og translasjons forskning.

Introduction

I løpet av de siste to tiårene, har microarray (TMA) hadde en bemerkelsesverdig innvirkning på biomarkør etterforskning studier. TMA er i hovedsak tissue "arkiv" fremstilt ved gjentatt overføring av små vev kjerner, vanligvis varierer i størrelse 0,6 til 2,0 mm i diameter, fra parafininnebygd 'donor "blokker i en enkelt TMA' mottakerens blokk (figur 1) 1. Ved hjelp av en liten kjerne størrelse, kan om lag 500 forskjellige vev flekker fra få eller mange forskjellige pasienter bli kledd i en TMA to.

Bruken av TMA for prognostiske eller prediktiv biomarkør studier har mange fordeler. Vurdere eksempel hvor uttrykket av et protein biomarkør ved immunhistokjemi skal evalueres på 450 pasienter. I stedet for å utføre 450 immunhistokjemiske flekker på 450 pasient lysbilder seksjonert fra det samme antall blokker, kan små kjerner fra hver prøve bli oppstilt på et enkelt TMA blokken. Selv om flere kjerner blir tatt fra hver enkelt pasient, er et minimum antall blokker produsert. Dette har den betydelige effekten av drastisk minkende kostnader og andre ressurser samt å redusere vevsødeleggelse. I tillegg tillater dette hensiktsmessig drevet studier ved hjelp av et stort antall vev som skal evalueres under de samme eksperimentelle betingelser.

TMA har mange forskjellige bruksområder. For eksempel kan de brukes til å studere morfologi, protein ekspresjon, RNA-ekspresjon og DNA aberrasjoner følgende farging med forskjellige fargestoffer, eller etter immunhistokjemi eller kromogene og selv fluorescens in situ hybridisering 3-7. Nyere studier har også brukt TMA å teste intra og Interlaboratory variasjon i farge protokoller, etablere spesifisitet eller sensitivitet av antistoffer for bestemte genmutasjoner, og å bestemme interobserver reproduserbarhet av protein uttrykk i internasjonalt samarbeid

Konstruksjonen av tradisjonelle TMA ved å bruke pasientavledet vev er en lang flertrinns fremgangsmåten (figur 2). Det begynner med et søk etter mulige egnede saker og valg av diagnostiske lysbilder fra arkivene på et institutt for patologi, eller annet institutt, hvor de hentes. Patologen evaluerer hvert lysbilde per sak og velger den mest representative lysbilde i forbindelse med studien. Det neste er at regionen av interesse merket ved hjelp av en penn direkte under mikroskopet. Dette er ofte utfordrende og upresis og resulterer bare i en "estimering" av hvor vev slag bør tas fra. Deretter blir de parafinblokker som svarer til disse merkede lysbilder hentes fra arkivet. En rask sammenlikning mellom blokken og dekselet er laget av. Ved hjelp av en halvautomatisk eller hjemmelaget vevet arrayer, blir donor blokken stanset ut i det beregnede området av interesse og overføres til en mottaker TMA blokk. Bygging av TMA bruker denne formerings teknikken er arbeidskrevende, tidkrevende, upresis, og lite fleksibel. Forbereder en TMA av 475 plasser i 3 eksemplarer er beregnet å ta ca 84 timer med arbeid.

En ny tilnærming til byggingen av TMA ble nylig introdusert av Institutt for patologi, Universitetet i Bern som er avhengig av tre komponenter: planlegging og design (eller rådgivning), digital patologi kombinert med kompetanse innen histologi og automatisert TMA arraying 12. Sammen blir dette konseptet kalles neste generasjons Tissue Microarray (ngTMA). Nedenfor er en protokoll for ngTMA beskrevet basert på et eksempel på 134 pasienter med metastatisk kolorektalcancer. Her, primære tumorer, så vel som lymfeknutemetastaser og levermetastaser skal kledd inn ngTMAs for etterfølgende analyse av biomarkører. I tillegg er små vev kjerner fra hver pasient for fremtidig ønskede nukleinsyre-ekstraksjon.

Protocol

MERK: Denne studien har blitt godkjent av den lokale etikkutvalg av Insel Hospital, Bern, Sveits (07-10-13). Vev ble hentet fra Tumor bank Bern, Institutt for patologi, Universitetet i Bern.

1. Planlegging og Design (Consulting)

  1. Tenk om problemstillingen skal besvares. Bestem deg for de vevstyper som skal inngå i prosjektet. Bestem hva histologiske strukturer er viktig å svare på spørsmålet.
  2. Fastslå de mest nyttige kjernediameter og antall kjerner pr pasient for prosjektet. Bestem deg for hvor mange eksemplarer av neste generasjons Tissue Micro Array (ngTMA) basert på mengden av biomarkører for å bli undersøkt.
  3. Vurdere statistiske aspekter som utvalgsstørrelse og analyse etter vevet microarray (TMA) er konstruert. Bestem antall pasienter for inkludering i studien og etablere kontroll vev for matrisen.
  4. Hent den histologiske (ellerdiagnostisk) haematoxylin og eosin (H & E) lysbilder av hver pasient. Kort gjennomgå lysbildene og identifisere de som inneholder relevant informasjon og histologi for prosjektet.
    MERK: Pass på nye deler av parafinblokker, hvis spesiell beis eller immunhistokjemi lysbilde er ønsket for lysbildeskanning og annotering, i stedet for H & E lysbilder

2. Skyv Skanning

  1. Slå på PC og lysbilde skanner og åpne skanneprogramvare. Velg "automatisk modus" for lyse skanning feltet fra forhåndsvisningen.
  2. Klikk på "skannealternativer" for å justere glidekvalitetsparametere. På denne tiden, velge om lysbildene er å være direkte skannet til den digitale plattformen tilgjengelig med web eller til en lokal stasjon (eller ekstern harddisk), og angi typen skanning og antall fokuspunkter.
  3. Klikk på "Server Parametere" for å skanne til "Case center". På dette trinnet, legge til flere magasiner, merke alle lysbilder og sattmappen i sak Center der lysbildene skal lagres. Hvert magasin har plass til opptil 25 lysbilder.
  4. Kontroller kvaliteten / renhold av selve histologiske lysbilder for skanning. Rengjør om nødvendig lysbilder med 70% etanol.
  5. Legg i opptil 25 lysbilder per magasin med etikettene peker innover (figur 3A)
  6. Plasser magasinet i skanneren. For mer enn ett magasin, plassere dem på toppen av hverandre.
  7. Begynne å skanne lysbilde ved å klikke på den grønne pilen (Figur 3B). Når alle lysbildene er skannet, losse magasiner og slå av programmet, PC og lysbilde skanner.

3. Digital Slide annotering

  1. Skriv inn nettleserens adresse for digital lysbildeadministrasjonssenter og laste ned gratis digital lysbildevisningsprogramvare.
  2. Åpne digital lysbilde seer programvare og velg mappen som inneholder de digitale lysbildene (Figur 4A).
  3. Legge til notater, ordne og styre Digital lysbilde mappe eller endre brukerrettigheter til kolleger eller legge til vedlegg i mappen.
  4. Klikk på ønsket digital lysbilde som vises i digital lysbildevisningen.
  5. Bruke forstørrelsesverktøyet, evaluere raset og finne de områder av interesse for integrering i ngTMA.
  6. Ved hjelp av den "TMA annotering verktøyet 'den ønskede størrelse for den ønskede kjerne, og fargen på merknader. Plasser anmerkningen på digital lysbilde ved å klikke på den (Figur 4B).
  7. Flytt merknad til de ønskede histologiske strukturer for innlemmelse i ngTMA (figur 4C).
  8. Gjenta denne fremgangsmåten for annotering på nytt ved hjelp av anmerkningen verktøyet, å velge en kjernestørrelse og en ønsket annotering farge. Gjenta lysbildevisning og annotering på alle lysbilder i mappen.
  9. Alternativt kan man legge vev kjerner for PCR inn 0,2 ml rør i stedet for integrering i TMA. Kommentere lysbilder ved hjelp av en annen farge for å identifiseredisse stedene for ytterligere molekylær analyse.
  10. Lag en liste over alle saker med deres tilsvarende merknader og farger.

4. Tissue Microarray Construction

  1. Hente de tilsvarende parafin vevsblokker for alle kommenterte digitale lysbilder, Sort blokker i ønsket rekkefølge for vev microarraying.
  2. Pass på at vevsblokker ha minimum 4 mm tykkelse. Hvis ikke, er nødvendig reembedding av vev.
  3. Snu PC "ON" og automatisert vev microarrayer instrument. Åpne vev microarrayer programvare og gi et navn til prosjektet
  4. Utfør en "Tool Change" og velg verktøydiameter som kreves for prosjektet (dvs. 0.6, 1.0, 1.5 eller 2.0 mm).
  5. Legg i opptil 12 'mottakerens TMA blokker inn i maskinen. Gi en ID til hver av de 12 blokkene
  6. Lag en TMA layout for hver mottaker blokk. Observere en TMA design med antall rader, kolonner, og empty linjer samt avstanden mellom kjernene. Lage et nytt oppsett for hver mottaker blokk eller bruke samme layout gjentatte ganger.
  7. Plasser markøren på mottakerens blokk layout til å ta den første kjernen.
  8. Deretter legger du opp til 60 donor blokker i vevet microarrayer (figur 5A). Plasser ti blokker i hver rad A til F. Gi hver blokk en donor-ID. Observere bilder av hver donor blokk på dataskjermen ervervet automatisk av vev microarrayer.
  9. Fra og med den første blokken, klikk på "Slide". Observer kommenterte digital lysbilde lagret i digital lysbilde Management Center (eller på den eksterne harddisken) ved hjelp av digital lysbildevisningen. Se bildet av giverblokken og det digitale skyve side-ved-side.
  10. Velg referansepunkter på blokken bildet for å blende inn donor blokk bildet med digital lysbilde
  11. Etter å ha klikket på "Next", observere merknader på et større bilde av blokken. (Figur 5B </ Strong>). Klikk på toppen av merknadene for å bekrefte, og klikk "Start".
    MERK: Dette ber vevet microarrayer å begynne å bore et hull på 0,6 mm i diameter i mottakerens blokk på valgt utgangspunkt. Deretter i et andre trinn, ved hjelp av stanseverktøyet, slår apparatet hullet i vev fra den valgte giverblokken på nøyaktig annotert og bekreftet region. Kjernene blir deretter overført fra donor til mottakeren blokken.
  12. Etter ca 500 kjerner, rengjøre drill og punching verktøy ved hjelp av en bomullspinne xylen.
  13. Hvis vev kjerner er ønsket (i stedet for slag i en ngTMA), klikk på "PCR" verktøyet for blokken, bekrefter opptil 4 merknader og trykke "Start". Dette vil slå og overføre kjerner i en 0,2 ml tube.
  14. Gjenta punkt 4.9 til 4.11 med den andre giver-blokken, og så videre.
  15. Etter å ha brukt alle donor blokker, skriv en ny runde med giver blokker (61-120) i vevet microarrayER og fortsette trinn 04.08 til 04.11.
  16. Oppdater donor og mottaker blokk bilder mens prosjektets fremdrift under boring og stansing skjer (figur 5C).
  17. Utfør en "Export" etter at prosjektet er fullført. Finn .xslx fil med donor og mottaker blokk IDer, lokalisering av alle slag innenfor TMA samt TMA layout / design, i den eksporterte mappen. Lagre alle donor blokk bilder med alle lagret merknad som jpg-bilder i den eksporterte mappen (figur 5D). Den endelige TMA blokken er deretter klar.

Representative Results

Planlegging og Design

Her eksempel av 134 pasienter med metastatisk colorectal cancer som blir undersøkt for en bestemt serie av biomarkører ble brukt. Ikke bare er en ngTMA planlagt for disse pasientene, men DNA-ekstraksjon etterfulgt av mutasjonsanalyse for noen spesifisert genet.

Under planlegging og designfasen av ngTMA, har følgende aspekter avgjort. Fra hver pasient, vil seks ulike histologiske regioner undersøkes: svulst sentrum, tumorinvasjon foran, områder med tetteste svulst spirende (tumor / stroma interaksjon), normalt vev, lymfeknutemetastaser og levermetastaser. Tre svulst flekker per svulstvev område og to normale vev flekker er å bli inkludert i prosjektet (n = 17 plasser per pasient). Siden det er planlagt at mer enn 50 biomarkører bli undersøkt på denne pasientmateriale, er to kopier av den endelige ngTMA ønsket. På grunn av den mulige lille størrelsen av lymfeknute og distant metastaser, er en liten kjernediameter på 0,6 mm for TMA konstruksjon for alle vev valgt.

I tillegg er det planlagt at hver region bli oppstilt for seg, slik at seks ngTMAs inneholdende forskjellige histologiske områder vil bli produsert: en ngTMA inneholdende vev fra a) tumor senter, b) invasjon foran, c) tumor spirende områder, d) normalt vev , e) lymfeknutemetastaser, og f) levermetastaser.

For TMA design ved hjelp av en 0,6 mm verktøyet, vil en komfortabel avstand på 0,4 mm mellom slagene velges. Fordi evaluering av vev flekker i lange rader og kolonner er ofte kjedelig, er to forskjellige design valgt. For tumorvev med 3 slag pr vev området, er en utforming som inneholder seks deler opprettet. Dette fører til et totalt antall på 402 slag vev. For normale vev slag, to slag per sak er å bli inkludert. En layout som passer 432 slag totalt er valgt.

Videre, for hvert tilfelle opp til 4kjerner på 0,6 mm vil i tillegg bli stanset ut og plassert i 0,2 ml rør. Disse vev kjernene vil også noteres.

For å oppsummere, vil seks ngTMAs av ulike vev bli produsert (5 svulst arrays x 3 slag x 134 pasienter; en normalt vev Array x 2 klipp x 134 pasienter) i tillegg til fire kjerner per pasient for rør. Til sammen vil 2814 merknader gjøres.

Deretter blir de tilsvarende H & E lysbilder fra utvalgte pasienter hentes fra glide arkivet. Hver sak er kort gjennomgått av en patolog og mest representative lysbilder av hver vevstype er valgt.

Skanning

Digitale lysbilder av hver histologisk seksjon er laget for fremtiden merknader. For denne studien, 3-4 vev lysbilder skal skannes per sak, dvs. primære kolorektal kreft, med eller uten tilstøtende normalt vev, lymfeknutemetastaser og levermetastaser og muligens en ekstra lysbilde conholde normal slimhinne.

Opp til 10 forskjellige magasiner kan være fullastet i lysbildet skanneren; derfor 250 lysbilder kan skannes i et enkelt løp. Tid for skanning og digitale bildestørrelsen varierer med dimensjonene av vev og kvalitetsfaktoren ønsket. Kvalitetsfaktoren varierer fra 0 til 100. Her blir en kvalitetsfaktor på 60 er valgt, da det gir en mindre scan filstørrelse uten merkbart tap av skanne kvalitet. Små biopsier kan skannes på under 30 sek mens hele vevssnitt, som de som brukes i dette eksemplet kan ta mellom 2 og 10 min. Digital lysbilde størrelse kan også variere fra 2 MB til 2 GB. Ved hjelp av en kvalitetsfaktor på 60, ​​skanner mellom 600 MB og 1 GB blir produsert.

Mellom 402 og 536 lysbilder er nødvendig for dette prosjektet på totalt 3 skanning går. Hvert løp er utført over natten. Omtrent 500 GB lagringsplass er nødvendig. Slides skannes direkte på en digital plattform kalt sak Center (ngtma.unibe.pathcasecenter). Sak Center er tilgjengelig fra hvor som helst med nettilgang ved å skrive inn det angitte brukernavn og passord.

Annotering

For merknader, bør to forhold vurderes: 1) ulike vev områdene bør gis ulike merknads farger og 2) antall merknader bør gjenspeile antall ønskede kopier av den endelige ngTMA.

I dette tilfellet har tre flekker per svulst område for en enkelt kopi er valgt. For to eksemplarer, må hver region anmerkes med 6 plasser. Nyttig er grønne for normalt vev, blå for svulsten sentrum, gul for svulsten invasjonen foran, rød for områder av svulsten spirende (tumor / stroma) interaksjon, svart for lymfeknutemetastaser, turkis for fjernmetastaser og til slutt hvit for regioner for å være brukes for rør. Annotering av hvert enkelt tilfelle krever 2-3 min.

ngTMA Construction

Denne studien krever seks ngTMA blokkerer to være konstruert i to eksemplarer, som resulterer i 12 sluttblokker. Det maksimale antall mottaker blokker som kan støttes av arrayer er 12. Hver svulst blokk vil inneholde 402 vev flekker og hver normalt vev blokk vil inneholde 268 plassene, totalt 4556 plassene i hele prosjektet.

En TMA layout blir opprettet for hver mottaker blokk og prosjektet er lagret (Tall 6A, 6B). 60 vevsblokker kan legges inn i vevet microarrayer parallelt; et bilde av hvert giverblokken blir tatt. Fra og med den første donor blokk, er den tilsvarende kommenterte digital lysbilde hentet fra sak Center. Slide matching er utført, som kan ta mellom 1-3 min. Merknader er bekreftet og arrayer er bedt om å starte punching (figur 7). Kjerne punching og transfer tid er ca 12 sek. Tap av kjerner under denne prosedyren er minimal. Total tid for arraying dette prosjektet er ca 24 timer, inkludert tid for SLIde / blokk matching og lasting av instrumentet. Noen eksempler på ngTMA er illustrert på figur 8A. Kjerner for etterfølgende molekylære analyser kan også stanses ut på dette tidspunktet (figur 8B).

Figur 1
Figur 1. A) En "donor"-blokken. Kjerner fra donor blokken er stanset ut og overført til B) en mottaker blokk, eller vev microarray (TMA).

Figur 2
Figur 2. Den konvensjonelle vev microarray arbeidsflyt. A) Histologiske lysbildene er hentet fra arkivet og B) gitt til patologen f eller gjennomgang. CD) Stempler er gjort på lysbildene som indikerer 'beregnet' region for overføring E.) Tilsvarende vevsblokker skal hentes. F) Blokk og lysbilde sammenlignet for matching, noe som kan G) noen ganger være en utfordrende oppgave. HJ ) tar Tissue microarraying deretter sted. K) Kjerner er gjentatte ganger overføres og L) en endelig TMA er konstruert.

Figur 3
Figur 3 A) Opp til 25 lysbilder kan plasseres i hvert magasin til skanning. B) Justeringer til kvalitetsfaktor og størrelsen kan bli gjort. Skanning fremgang kan overvåkes.

"Src =" / filer / Ftp_upload / 51893 / 51893fig4highres.jpg "width =" 600 "/>
Figur 4. A) Skannet lysbilder kan lastes opp på web-basert plattform, sak Center. B) Digitale lysbilder kan vises. TMA merknad verktøyet lar brukeren velge kjernen størrelse og farge som kreves for merknader. C) Merknader kan plasseres direkte på digital lysbilde. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5. A) Opp til 60 blokker kan lastes inn i vevet microarrayer, nemlig 10 giverblokker per rad og 12 mottakere blokker også. B) Et bilde av hvert giverblokken blir tatt, den digital lysbilde hentes. Tilpasning av blokken og slide er gjort og merknader er brukt til blokk stansing. C) Fremdriften av oppstillings kan overvåkes mens apparatet er punching. D) Etter stansing blir utført, en utførsel av plasseringen av hver flekk i utformingen, men også et bilde av hvert giverblokk med tilsvarende merknader er gjort.

Figur 6
Figur 6. Disse TMA oppsett ble brukt for arraying de A) tumorvev og B) normalt vev.

Figur 7
Figur 7. Skjermbilde av vevet microarrayer programvare. På venstre, 12 recipient blokker kan plasseres i instrumentet. På bunnen, er bilder av hver donor blokk tatt. I sentrum, TMA layout, er fremdriften av punching samt forstørrede bilder av hver donor blokk med merknader funnet.

Figur 8
Figur 8. A) Noen eksempler på nyopprettede ngTMA blokker. B) Andre vev slag kan tas for senere molekylær analyse. Disse kjerner er stanset ut og plassert i 0,2 ml rør.

Figur 9
Figur 9. Eksempler på ngTMA biomarkør applikasjoner. A) Immunhistokjemi farging av Ki67 i tykk-og endetarmskreft. Dual HER2 immunhistokjemi / in situ hybridiserings-analyse som viser B) lav ekspresjon av protein (brunt) og ingen forsterkning av HER2-genet (sort) i forhold til cent (red), C) med høy ekspresjon av proteinet (brunt) og HER2 genamplifikasjon ( svart) i forhold til cent (rød). D) kromogen in situ hybridisering av HER2 viser enkelt mRNA transkripsjoner i brystkreft ngTMA. E) Immunhistokjemi for CD8 i tykk-og endetarmskreft. F) Dobbelt immunhistokjemi flekken for pan-cytokeratin markør AE1 / AE3 (brun; kreftceller) og CD68 (rød;. Makrofager) fremhever svulstens mikromiljø i tykk-og endetarmskreft Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

I denne utredningen, er en protokoll for ngTMA skissert. ngTMA er et nyetablert konsept for vev microarraying involverer planlegging og design, digital patologi og lysbilde merknad samt automatisk vev microarraying 12.

Sammenlignet med konvensjonelle vev microarraying, tilbyr ngTMA mange fordeler. I et første skritt, er planlegging og designfasen kritisk. Fokuset er på å besvare en målrettet problemstilling. Dette bør ta hensyn til de histologiske problemer (f.eks, hvilke regioner og hvor mange steder ønsker jeg å inkludere?), Den statistiske planlegging (for eksempel utvalgsstørrelsen? Hvordan kan jeg analysere mine prøvene senere?) Og logistiske hensyn (for eksempel hvordan mange biomarkører og derfor hvor mange ngTMA kopier?). En spesifikk ngTMA er laget for spesifikke behov, enten det er for biomarkør screening og høy gjennomstrømming eller ment å studere spesifikke histologiske aspekter på bare noen få godt valgt cases.

En, hvis ikke, er det viktigste ulempe ved konvensjonelle vev microarraying den lave nøyaktigheten med hvilke markeringer på de histologiske preparater blir laget. Studiet av spesifikke histologiske strukturer, celler eller regioner er laget nesten umulig. ngTMA gir høy nøyaktighet fordi merknader er plassert direkte på de digitale lysbildene. Dette gjør det mulig for forskeren å nettopp velge regioner for å være stemplet, inkludert spesifikke celler. I dette eksemplet, er ulike områder innenfor det samme vev blokk stanses ut for arraying, slik som tumor sentrum invasjonen foran og områder av tumor / stroma interaksjon markert ved tilstedeværelsen av små tumorcelleklynger, eller til og med enkle celler. Denne nøyaktighet kan bare oppnås ved hjelp av ngTMA. For det tredje fordi lysbildene er skannet inn på en web-basert digital plattform, skyver visning og kommentering kan gjøres gjennom datamaskinen i stedet for med mikroskopet. Vevet formerings programvare gir en brukervennliggrensesnitt med en høy grad av fleksibilitet, derfor forskjellige oppsett og ngTMA design kan oppnås. Siden TMA konstruksjon utføres automatisk ved boring, er det lite behov for praktisk manøvrering, og mengden av tid for konstruksjonen blir vesentlig redusert. Tiden for TMA bygging i dette eksempelet her er mellom 24 hr. Ved hjelp av en konvensjonell TMA tilnærming og estimere 15 slag per time, ville dette prosjektet ta ca 304 timer.

ngTMA kan bli anvendt for å studere protein ekspresjon, mRNA eller DNA, så vel som kombinasjoner av disse. Figur 9 illustrerer flere av disse programmer til potensielle biomarkører. Standard immunohistokjemi kan anvendes for å bestemme spredningsindeksen av kreft ved hjelp av Ki-67. En kombinert metode for å undersøke protein ekspresjon og DNA-amplifikasjon for gener som HER2 kan brukes. Vev kan være samlet på en enkelt ngTMA å redusere kostnader, vev bruk og annen ressurss. I tillegg kan kromogent mRNA in situ hybridisering for HER2 og andre gener bli utført for å identifisere enkelt mRNA transkripter i et stort antall tilfeller ved hjelp av et minimalt antall vev lysbilder. Immunhistokjemi av immun markører som CD8 kan visualiseres i sammenheng med svulstens mikromiljø. Double immunhistokjemi kan også brukes til å markere bestemte regioner av interesse, slik som samspillet mellom immunceller (merket med rødt) og kreftceller (merket med brunt) ved invasjonen foran kreft. Et slikt område av interesse kunne ikke ha blitt tatt med konvensjonell vev microarraying.

Likevel inneholder denne protokollen noen begrensninger. Den viktigste utfordringen er overlappingen mellom giverblokk og digital lysbilde. Flere faktorer kan påvirke dette trinnet. For det første bør den siste avsnittet fra blokken benyttes for glide skanning. I mange tilfeller er H & E ikke er den siste delen av giverblokk, Rather det er en immunhistokjemisk eller annen flekk. I dette tilfelle også et farget lysbilde kan anvendes så lenge som den siste flekken blir skannet og annotert eller en ny H & E bør gjøres. Forsiktighet bør også tas når vevssnitt blir gjort som vev kan utvide i vannbad som fører til utfordrende matching av raset og blokk. For det andre, i det øyeblikk prosjekter er begrenset til 12 mottaker TMA blokker behandlet på en eneste gang. Større prosjekter som overstiger 12 TMA må tilordnes en andre prosjektnavn. For det tredje må giverblokker bli gjort ved bruk av standard støpeformer og kassetter som instrumentet kan ikke tilpasse seg til forskjellige størrelser. Endelig må giverblokker overskride den minimale høyde (4 mm) for å oppnå optimal boring. I noen tilfeller krever dette reembedding av vev.

Hundrevis av publikasjoner i løpet av de siste årene markere TMA som et uvurderlig verktøy for biomarkør forskning. TMA har blitt brukt til å studere lunge 13, kolorektal 7, breast 14, prostata 15, bukspyttkjertel 16, blære 17, og mage 18 kreftformer, for å nevne noen. Stadig flere forfattere har kombinert bruk av TMA med bildeanalyse og betydelige fremskritt blir gjort i denne retningen 19-21. Men ved siden av en håndfull av forskningsgrupper som har publisert innovative TMA ideer 22-24, lite oppmerksomhet har blitt gitt for å optimalisere TMA teknikken selv. Automatiserte vev microarrayers, som ATA-27 ved Estigen / Beecher oppgir layout design og hensiktsmessig og automatisert vev punching. Dette representerer imidlertid bare en del av ngTMA konseptet.

ngTMA er en betydelig forbedring i forhold til konvensjonelle vev microarraying teknikker. Det omfatter kompetanse innen histologi og TMA design med fleksibilitet av digital patologi og presisjonen av digitale merknader med hastigheten og påliteligheten av automatiserte TMA konstruksjon. Kombinasjonen av ngTMA og bildeanalyse for vurdering av protein og molekylære biomarkører vil være et kraftig verktøy for å ytterligere forbedre kvaliteten på klinisk og translasjonell forskning i fremtiden.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker å takke den tekniske staben av translasjonell Research Unit; Mary Economou, José Galván, Caroline Hammer, Dominique Müller, Liliane Schöni og informatikk teamet ved Institutt for patologi, Universitetet i Bern.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pannoramic 250 Flash II 3DHistech Slide scanner
TMA Grandmaster 3DHistech Tissue Microarrayer
Pannoramic Viewer 3DHistech free Slide viewing software
Case Center 3DHistech Digital slide platform

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kononen, J., et al. Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens. Nat Med. 4, 844-847 (1998).
  2. Tzankov, A., Went, P., Zimpfer, A., Dirnhofer, S. Tissue microarray technology: principles, pitfalls and perspectives--lessons learned from hematological malignancies. Exp Gerontol. 40, 737-744 (2005).
  3. Barlund, M., et al. Detecting activation of ribosomal protein S6 kinase by complementary DNA and tissue microarray analysis. J Natl Cancer Inst. 92, 1252-1259 (2000).
  4. Bubendorf, L., et al. Survey of gene amplifications during prostate cancer progression by high-throughout fluorescence in situ hybridization on tissue microarrays. Cancer Res. 59, 803-806 (1999).
  5. Garcia-Caballero, T., et al. Dual-colour CISH is a reliable alternative to FISH for assessment of topoisomerase 2-alpha amplification in breast carcinomas. Breast Cancer Res Treat. 81-89 (2014).
  6. Schraml, P., et al. Tissue microarrays for gene amplification surveys in many different tumor types. Clin Cancer Res. 5, 1966-1975 (1999).
  7. Zlobec, I., et al. Role of RHAMM within the hierarchy of well-established prognostic factors in colorectal cancer. Gut. 57, 1413-1419 (2008).
  8. Hsu, F. D., et al. Tissue microarrays are an effective quality assurance tool for diagnostic immunohistochemistry. Mod Pathol. 15, 1374-1380 (2002).
  9. Marin, C., et al. Detection of BRAF p.V600E Mutations in Melanoma by Immunohistochemistry Has a Good Interobserver Reproducibility. Arch Pathol Lab Med. 71-75 (2014).
  10. Polley, M. Y., et al. An International Ki67 Reproducibility Study. J Natl Cancer Inst. 1897-1906 (2013).
  11. Zlobec, I., Terracciano, L., Jass, J. R., Lugli, A. Value of staining intensity in the interpretation of immunohistochemistry for tumor markers in colorectal cancer. Virchows Arch. 451, 763-769 (2007).
  12. Zlobec, I., Koelzer, V. H., Dawson, H., Perren, A., Lugli, A. Next-generation tissue microarray (ngTMA) increases the quality of biomarker studies: an example using CD3, CD8, and CD45RO in the tumor microenvironment of six different solid tumor types. J Transl Med. 11, 104 (2013).
  13. Yoshida, A., et al. Immunohistochemical detection of ROS1 is useful for identifying ROS1 rearrangements in lung cancers. Mod Pathol. 711-720 (2014).
  14. Droeser, R., et al. Differential pattern and prognostic significance of CD4+, FOXP3+ and IL-17+ tumor infiltrating lymphocytes in ductal and lobular breast cancers. BMC Cancer. 12, 134 (2012).
  15. Fleischmann, A., et al. Androgen receptors are differentially expressed in Gleason patterns of prostate cancer and down-regulated in matched lymph node metastases. Prostate. 71, 453-460 (2011).
  16. Wang, T., et al. Pattern of breast cancer susceptibility gene 1 expression is a potential prognostic biomarker in resectable pancreatic ductal adenocarcinoma. Pancreas. 42, 977-982 (2013).
  17. Fleischmann, A., Rotzer, D., Seiler, R., Studer, U. E., Thalmann, G. N. Her2 amplification is significantly more frequent in lymph node metastases from urothelial bladder cancer than in the primary tumours. Eur Urol. 60, 350-357 (2011).
  18. Zhang, Z. Q., et al. Identification of Annexin A1 protein expression in human gastric adenocarcinoma using proteomics and tissue microarray. World J Gastroenterol. 19, 7795-7803 (2013).
  19. Chaux, A., et al. The epidermal growth factor receptor is frequently overexpressed in penile squamous cell carcinomas: a tissue microarray and digital image analysis study of 112 cases. Hum Pathol. 44, 2690-2695 (2013).
  20. McKenna, S. J., Amaral, T., Akbar, S., Jordan, L., Thompson, A. Immunohistochemical analysis of breast tissue microarray images using contextual classifiers. J Pathol Inform. 4, S13 (2013).
  21. Pages, F., et al. Effector memory T cells, early metastasis, and survival in colorectal cancer. N Engl J Med. 353, 2654-2666 (2005).
  22. Komiya, A., et al. Application of a new technique, spiral tissue microarrays constructed using needle biopsy specimens, to prostate cancer research. Int J Oncol. 44, 195-202 (2014).
  23. Quintayo, M. A., et al. Virtual tissue microarrays: A novel and viable approach to optimising tissue micro-arrays for biomarker research applied to Ductal Carcinoma in Situ (DCIS). Histopathology. 2-8 (2014).
  24. Torata, N., et al. Tissue tablet method: an efficient tissue banking procedure applicable to both molecular analysis and frozen tissue microarray. Hum Pathol. 45, 143-152 (2014).
En Neste generasjons Tissue Microarray (ngTMA) Protokoll for biomarkør studier
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zlobec, I., Suter, G., Perren, A., Lugli, A. A Next-generation Tissue Microarray (ngTMA) Protocol for Biomarker Studies. J. Vis. Exp. (91), e51893, doi:10.3791/51893 (2014).More

Zlobec, I., Suter, G., Perren, A., Lugli, A. A Next-generation Tissue Microarray (ngTMA) Protocol for Biomarker Studies. J. Vis. Exp. (91), e51893, doi:10.3791/51893 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter