Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Nästa generations tissue microarray (ngTMA) Protokoll för Biomarker Studies

doi: 10.3791/51893 Published: September 23, 2014

Summary

Protokollet syftar till att optimera konstruktionen och kvaliteten på vävnads microarrays för biomarkör forskning. Den innehåller aspekter av planering och design, digital patologi, virtuell slide annotering, och automatiserad vävnads ordnande.

Abstract

Biomarkör forskning bygger på vävnads mikroarrayer (TMA). TMA produceras genom upprepad överföring av små vävnadsbitar från en "givare" blocket i en "mottagare" blocket och sedan används för en mängd olika biomarkörer applikationer. Byggandet av konventionella TMA är arbetsintensiv, oprecisa och tidskrävande. Här är ett protokoll med hjälp av nästa generations Tissue Microarrays (ngTMA) beskrivs. ngTMA bygger på TMA planering och design, digital patologi och automatiserad vävnads microarraying. Protokollet illustreras med hjälp av ett exempel på 134 patienter med metastaserad kolorektalcancer. Histologiska, statistiska och logistiska aspekter beaktas, såsom typ vävnad, specifika histologiska regioner, och celltyper att ingå i TMA, antalet vävnads fläckar, urvalsstorlek, statistisk analys, och antal TMA kopior. Histologiska bilder för varje patient skannas och laddas upp på en webbaserad digital plattform. Där är de visade och annotated (märkt) med hjälp av ett verktyg 0,6-2,0 mm diameter, flera gånger med olika färger för att skilja vävnadsområden. Donor block och 12 "mottagare" block laddas in i instrumentet. Digitala diabilder hämtas och anpassas till donator blockera bilder. Upprepad ordnande av kommenterade regioner utförs automatiskt resulterar i en ngTMA. I detta exempel är sex ngTMAs planerade innehållande sex olika typer av vävnad / histologiska zoner. Två exemplar av ngTMAs önskas. Tre till fyra bilder för varje patient scannas; 3 skannings körningar är nödvändiga och utförs över natten. Alla bilder är kommenterad; olika färger används för att representera de olika vävnader / zoner, nämligen tumörcentrum, invasion fram, tumör / stroma, lymfkörtelmetastaser, levermetastaser, och normal vävnad. 17 kommentarer / fallet görs; tid för annotation är 2-3 min / fallet. 12 ngTMAs produceras med 4556 platser. Arraying tiden är 15-20 timmar. På grund av dess precision, flexibilitet och snabbhet är ngTMA en kraftfullverktyg för att ytterligare förbättra kvaliteten på TMA används i klinisk och translationell forskning.

Introduction

Under de senaste två decennierna har vävnads microarrays (TMA) haft en mycket positiv inverkan på biomarkörer utredningsstudier. TMA är i huvudsak vävnad "arkiv" produceras av upprepad överföring av små vävnadskärnorna, normalt varierar i storlek från 0,6 till 2,0 mm i diameter, från paraffininbäddade "givare" block till en enda TMA "mottagare" blocket (Figur 1) 1. Med hjälp av en liten kärna storlek, kan cirka 500 olika vävnads fläckar från några eller många olika patienter klädd i en TMA 2.

Användningen av TMA för prognostiska eller prediktiva biomarkörer studier har många fördelar. Tänk till exempel, där uttryck av ett protein biomarkör genom immunhistokemi ska utvärderas på 450 patienter. Hellre än att utföra 450 immunhistokemiska fläckar på 450 patientår diabilder sektione från samma antal block kan små kärnor från varje prov vara anordnade på ett enda TMA blocket. Även om flera kärnor tas från varje enskild patient, är ett minimum antal block som produceras. Detta har den stora effekten av drastiskt minskande kostnader och andra resurser samt minska vävnads slöseri. Dessutom detta låter lämpligt drivna studier med ett stort antal vävnader som ska utvärderas under samma försöksbetingelser.

TMA har många olika användningsområden. Till exempel kan de användas för att studera morfologi, protein expression, RNA-expression och DNA aberrationer följande färgning med olika färgämnen, eller efter immunohistokemi eller kromogen och även fluorescens in situ hybridisering 3-7. Nya studier har också använt TMA att testa intra och provnings variation i färgningsprotokoll, etablera specificitet eller känslighet av antikroppar för specifika genmutationer, och bestämma interobserver reproducerbarhet proteinuttryck i internationella samarbeten

Byggandet av traditionella TMA med hjälp av patientgenererade vävnader är en lång multi steg förfarande (Figur 2). Det börjar med ett sökande efter möjliga lämpligt och val av diagnostiska diabilder från arkiven vid ett institut för patologi, eller en annan institution, där de hämtas. Patologen utvärderar varje bild per ärende och väljer den mest representativa slide i samband med undersökningen. Därefter är det intressanta området markerat med en penna direkt under mikroskop. Detta är ofta utmanande och inexakt och resulterar endast i en "uppskattning" av var vävnads slag bör tas från. Därefter är paraffinblock som motsvarar dessa markerade diabilder hämtas från arkivet. En snabb jämförelse mellan blocket och bildspel görs. Med användning av en halvautomatiserad eller hemlagad vävnad arrayer drivs donatorblocket stansas ut i det beräknade området av intresse och överfördes i en mottagande TMA blocket. Konstruktion av TMA använda denna grupperings teknik är arbetsintensiv, tidsödande, oprecisa och oflexibel. Förbereda en TMA av 475 punkter i 3 exemplar beräknas ta ca 84 timmars arbete.

En ny metod för att bygga TMA infördes nyligen av Institutet för patologi, University of Bern som bygger på tre delar: planering och utformning (eller konsult), digital patologi i kombination med expertis inom histologi och automatiserad TMA arraying 12. Tillsammans är detta koncept som kallas nästa generations tissue microarray (ngTMA). Nedan är ett protokoll för ngTMA beskrivs utifrån ett exempel på 134 patienter med metastaserad kolorektalcancer. Här, primära tumörer samt lymfkörtelmetastaser och levermetastaser skall klädd i ngTMAs för efterföljande biomarkör analys. Dessutom är små vävnadskärnor från varje patient önskas för framtida nukleinsyra extraktion.

Protocol

OBS: Denna studie har godkänts av den lokala etiska kommittén i Insel sjukhuset, Bern, Schweiz (07-10-13). Vävnader erhölls från tumörbanken Bern, Institutionen för patologi, University of Bern.

1. planering och design (Consulting)

  1. Tänk på forskningsfråga som skall besvaras. Bestäm de vävnadstyper som ska ingå i projektet. Bestäm vilken histologiska strukturer är viktiga för att besvara frågan.
  2. Därefter bestäms den mest användbara kärndiameter och antalet kärnor per patient för projektet. Bestäm hur många kopior av nästa generations Tissue Micro Array (ngTMA) baserat på mängden av biomarkörer som ska undersökas.
  3. Tänk statistiska aspekter som urvalsstorlek och analys efter tissue microarray (TMA) är konstruerad. Bestäm antalet patienter som skall ingå i studien och upprätta kontrollvävnader för matrisen.
  4. Hämta den histologiska (ellerdiagnostik) Haematoxylin och eosin (H & E) diabilder av varje patient. Gå snabbt igenom bilderna och identifiera de som innehåller relevant information och histologi för projektet.
    OBS: Se nya avsnitt av paraffinblock, om särskilda bets eller immunohistokemi slide önskas för diabilder och annotering, i stället för H & E diabilder

2 Skjut Skanning

  1. Slå på datorn och skjut scanner och öppen scanning programvara. Välj "automatiskt läge" för ljusa fält skanning från förhandsgranskningsskärmen.
  2. Klicka på "skanningsalternativ" för att justera kvalitetsparametrar bildspel. Vid denna tid, välja om glasen vara direkt skannas till den digitala plattformen nås med webben eller till en lokal enhet (eller en extern enhet) och ange vilka typer av scanning och antal fokuspunkter.
  3. Klicka på "Server parametrar" skanna till "Case center". I detta steg, lägga till fler tidningar, märka alla bilder och ställamappen i mål Center där bilderna ska lagras. Varje Magasinet rymmer upp till 25 bilder.
  4. Kontrollera kvalitet / renhet faktiska histologiska bilder för skanning. Vid behov, rena bilder med 70% etanol.
  5. Fyll på upp till 25 bilder per magasin med etiketterna pekar inåt (figur 3A)
  6. Placera tidningen i skannern. För mer än en tidning, placera dem ovanpå varandra.
  7. Börja skanna bild genom att klicka på den gröna pilen (figur 3B). När alla bilder är skannade, lasta tidningar och stänga av programmet, PC och bild scanner.

3 Digital Slide Annotation

  1. Skriv in webbläsarens adress för digital slide Management Center och ladda ner gratis digital slide viewer mjukvara.
  2. Öppna digitala slide viewer mjukvara och välj den mapp som innehåller de digitala diabilder (Figur 4A).
  3. Lägga till anteckningar, ordna och hantera digital mapp slide eller tilldela användarrättigheter till kollegor eller bifoga filer i mappen.
  4. Klicka på önskad digital bild som visas i den digitala glid betraktaren.
  5. Med hjälp av förstoringsverktyget, utvärdera bilden och hitta områden av intresse för integration i ngTMA.
  6. Med hjälp av "TMA anteckningsverktyget", väljer du storleken på det önskade kärna och färgen på anteckningen. Placera anteckningen på den digitala bild genom att klicka på den (Figur 4B).
  7. Flytta anteckningen till önskade histologiska strukturer för införlivande i ngTMA (Figur 4C).
  8. Upprepa denna process för annotation igen med hjälp av anteckningsverktyget, välja en kärnstorlek och en önskad annotation färg. Upprepa bild visning och annotering på alla bilder i mappen.
  9. Alternativt, placera vävnadskärnorna för PCR i 0,2 ml rör snarare än integration i TMA. Kommentera diabilder med en annan färg för att identifieradessa platser för kompletterande molekylär analys.
  10. Skapa en lista över alla ärenden med deras motsvarande anteckningar och färger.

4 Tissue Microarray Konstruktion

  1. Hämta motsvarande paraffinvävnadsblock för alla kommenterade digitala bilder, Sortera block i önskad ordning för vävnads microarraying.
  2. Se till att vävnadsblock ha minst 4 mm tjocklek. Om inte, är nödvändigt reembedding av vävnad.
  3. Vänd datorn "ON" och automatiserad vävnads microarrayer instrument. Öppna vävnads microarrayer programvara och ange ett namn för projektet
  4. Utför en "Tool Change" och välj önskad verktygsdiameter för projektet (dvs, 0,6, 1,0, 1,5 eller 2,0 mm).
  5. Fyll på upp till 12 "mottagare" TMA block i maskinen. Ge ett ID till var och en av de 12 blocken
  6. Skapa en TMA layout för varje mottagande blocket. Observera en TMA design med många rader, kolumner och gripay linjer samt avståndet mellan kärnorna. Skapa en ny layout för varje mottagare block eller använda samma layout flera gånger.
  7. Placera markören på mottagarblocket layout för att ta den första kärnan.
  8. Därefter laddar upp till 60 givar block ner i vävnaden microarrayer (Figur 5A). Placera tio block i varje rad A till F. Ge varje block en donator-ID. Beakta bilder av varje donator blocket på datorskärmen förvärvats automatiskt av vävnads microarrayer.
  9. Från och med det första blocket, klicka på "Slide". Observera kommenterad digitala bildspel lagras i den digitala glid Management Center (eller på den externa enheten) med hjälp av digitala bildspel betraktaren. Visa bilden av det donerande blocket och den digitala glid sida-vid-sida.
  10. Välj referenspunkter på blocket bilden för att överlagra donatorblocket bilden med den digitala slide
  11. När du har klickat på "Nästa", observera anteckningar på en större bild av blocket. (Figur 5B </ Strong>). Klicka på toppen av anteckningarna för att bekräfta och klicka på "Start".
    OBS: Detta föran vävnaden microarrayer att börja borra ett hål på 0,6 mm i diameter i mottagarblocket vid den valda startpunkten. Sedan i ett andra steg, med hjälp av stansverktyg, instrumentet stansar hål i vävnaden från den valda donatorblocket vid exakt kommenterad och bekräftade regionen. Kärnor överförs sedan från givare till mottagare blocket.
  12. Efter cirka 500 kärnor, rengör borr och stansverktyg med hjälp av en bomullstopp av xylen.
  13. Om vävnadskärnorna önskas (snarare än slag i en ngTMA), klicka på "PCR" verktyg för blocket, bekräfta upp till 4 kommentarer och klicka på "Start". Detta kommer att stansa och överför kärnorna till ett 0,2 ml rör.
  14. Upprepa punkt 4,9-4,11 med den andra donatorblocket, och så vidare.
  15. Efter att ha använt alla givarblocken anger en andra omgång av givarblock (61-120) i vävnaden microarrayer och fortsätta stegen 4,8-4,11.
  16. Uppdatera donator och mottagare blockera bilder medan projektet pågår under borrningen och stansning sker (figur 5C).
  17. Utför en "Export" efter att projektet är avslutat. Leta reda på filen XSLX med givare och mottagare blockera ID, lokalisering av alla slag inom TMA samt TMA layout / design, i den exporterade mappen. Spara alla givare blockera bilder med alla lagrad annotation som jpg-bilder i den exporterade mappen (Figur 5D). Den slutliga TMA blocket är därefter klar.

Representative Results

Planering och design

Här exemplet med 134 patienter med metastaserande kolorektalcancer som utreds för en viss serie av biomarkörer användes. Inte bara är en ngTMA planeras för dessa patienter, men DNA-extraktion följt av mutationsanalys för vissa angivna genen.

Under planeringen och konstruktionsfasen av ngTMA, har följande aspekter beslutats. Från varje patient, kommer sex olika histologiska regioner utredas: tumörcentrum, tumörinvasion front, områden med tätaste tumör spirande (tumör / stroma växelverkan), normal vävnad, lymfkörtelmetastaser och levermetastaser. Tre tumör fläckar per tumörvävnad område och två normala vävnads fläckar som ska ingå i projektet (n = 17 ställen per patient). Eftersom det är planerat att mer än 50 biomarkörer utredas på denna patientmaterial, har två kopior av den slutliga ngTMA önskas. På grund av den möjliga lilla storleken av lymfkörteln och distant metastaser, är en liten kärndiameter på 0,6 mm för TMA konstruktion för alla vävnader valt.

Dessutom är det tänkt att varje region separat klädd, så att 6 ngTMAs innehåller olika histologiska områden kommer att produceras: en ngTMA innehåller vävnader från a) tumörcentrum, b) invasion fram, c) tumör spirande områden, d) normal vävnad , e) lymfkörtelmetastaser, och f) levermetastaser.

För TMA design med en 0,6 mm verktyg, kommer ett bekvämt avstånd på 0,4 mm mellan stansar väljas. Eftersom utvärderingen av vävnads fläckar i långa rader och kolumner är ofta tröttsamt, är två olika utföranden valda. För tumörvävnad med 3 slag per vävnadsområdet, är en design som innehåller sex delar skapats. Detta leder till ett totalt antal av 402 vävnads slag. För normala vävnads slag, två slag per mål ska ingå. En layout som passar 432 slag totalt väljs.

Dessutom för varje fall, upp till 4kärnor på 0,6 mm kommer dessutom stansas ut och placerades i 0,2 ml rör. Dessa vävnadskärnorna kommer också att kommenteras.

Sammanfattningsvis kommer 6 ngTMAs av olika vävnader produceras (5 tumör matriser x 3 stämplingar x 134 patienter, en normal vävnad array x 2 stansar x 134 patienter) som tillägg till 4 kärnor per patient för rör. Sammantaget kommer 2814 annoteringar göras.

Därefter motsvarande H & E diabilder från utvalda patienter hämtas från bildarkivet. Varje fall är kortfattat av en patolog och mest representativa glas av varje vävnadstyp väljs.

Skanning

Digitala diabilder i varje histologiska avsnitt görs för framtida annotation. För denna studie, 3-4 vävnads diabilder som ska skannas per case, dvs primär kolorektal cancer, med eller utan intilliggande normala vävnader, lymfkörtelmetastaser och levermetastaser och eventuellt ytterligare en slide conlande normal slemhinna.

Upp till 10 olika tidningar helt kan laddas in i bild scanner; därför 250 diabilder kan scannas i en enda körning. Dags för skanning och digital slide storlek varierar med dimensionerna på vävnaden och kvalitetsfaktorn önskas. Kvalitetsfaktorn varierar från 0 till 100 Här är en kvalitetsfaktor av 60 utvalda, eftersom det ger en mindre skannings filstorlek utan någon märkbar förlust av skanningskvaliteten. Små biopsier kan scannas in under 30 sekunder medan hela vävnadssnitt, som de som används i detta exempel kan ta mellan 2 och 10 min. Digital slide storlek kan också variera från 2 MB till 2 GB. Med hjälp av en kvalitetsfaktor på 60, ​​skannar mellan 600 MB och 1 GB produceras.

Mellan 402 och 536 glider krävs för detta projekt på totalt 3 skanning körs. Varje försök utföres över natten. Det behövs ca 500 GB lagringsutrymme. Diabilder skannas direkt på en digital plattform som heter Case Center (ngtma.unibe.pathcasecenter). Case Center är tillgänglig från var som helst med webbåtkomst genom att ange den utsedda användarnamn och lösenord.

Annotation

För anteckning, bör två aspekter beaktas: 1) olika vävnadsområden bör ges olika anteckningsfärger och 2) antalet anteckningar bör återspegla antalet önskade kopior av den slutliga ngTMA.

I det här fallet har 3 ställen per tumörområdet för en enda kopia valts. För två exemplar, ska varje region förses med hjälp av 6 punkter. Användbara gröna för normal vävnad, blå för tumörcentrum, gult för tumörinvasion fronten, rött för områden av tumör spirande (tumör / stroma) interaktion, svarta för lymfkörtelmetastaser, turkos för fjärrmetastaser och slutligen vitt för regioner som används för rör. Notering av varje ärende kräver 2-3 min.

ngTMA Konstruktion

Denna studie kräver 6 ngTMA blockerar To byggas i två exemplar, vilket resulterar i 12 sista block. Det maximala antalet mottagarländer block som kan stödjas av arrayer är 12 Varje tumör blocket kommer att innehålla 402 vävnads fläckar och varje normal vävnad blocket innehåller 268 punkter, totalt 4556 punkter över hela projektet.

En TMA layout skapas för varje mottagande blocket och projektet sparas (figurerna 6A, 6B). 60 vävnadsblock kan laddas in i vävnaden microarrayer parallellt; en bild av varje givare blocket tas. Från och med den första donatorblocket, är motsvarande kommenterad digitala bildspel hämtas från Case Center. Skjut matchning utförs, vilket kan ta mellan 1-3 min. Anteckningar bekräftas och arrayer uppmanas att börja stansning (Figur 7). Kärnstansning och överföringstiden är ca 12 sek. Förlust av kärnor under detta förfarande är minimal. Total tid för arraying detta projekt är cirka 24 timmar, inklusive tid för slide / blockmatchning och omlastning av instrumentet. Några exempel på ngTMA illustreras i figur 8A. Ledare för efterföljande molekylär analys kan också stansas ut vid denna tid (figur 8B).

Figur 1
Figur 1 A) En "donator" blocket. Ledare från donatorblocket stansas ut och överförs till B) ett mottagande block eller tissue microarray (TMA).

Figur 2
Figur 2 Den konventionella tissue microarray arbetsflödet. A) Histologiska diabilder hämtas från arkivet och B) ges till patologen f eller översyn. CD) Anteckningar görs på bilderna anger "uppskattade" region för överföring. E) Motsvarande vävnadsblock hämtas. F) Block och skjut jämförs för matchning, vilket kan G) ibland vara en utmanande uppgift. HJ ) Tissue microarraying sker sedan. K) Hylsor upprepat överföras och L) en slutlig TMA är uppbyggd.

Figur 3
Figur 3 A) Upp till 25 objektglas kan placeras i varje tidning för skanning. B) Justeringar för kvalitetsfaktorn och storlek kan göras. Scanning framsteg kan övervakas.

"Src =" / filer / ftp_upload / 51893 / 51893fig4highres.jpg "width =" 600 "/>
Figur 4 A) Skannade diabilder kan laddas upp på den webbaserade plattform, Case Center. B) Digitala diabilder kan visas. Den TMA anteckningsverktyget gör det möjligt för användaren att välja kärnan storlek och färg som krävs för annotation. C) Anteckningar kan placeras direkt på den digitala bilden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5
Figur 5 A) Upp till 60 block kan laddas in i vävnaden microarrayer, nämligen 10 donatorblock per rad och 12 mottagare block också. B) En bild av varje givare blocket tas, den digital slide hämtas. Matchning av blocket och skjut är gjort och anteckningar används för blocket stansning. C) Framstegen med grupperings kan övervakas medan instrumentet stans. D) Efter stans utförs, export av läget för varje plats i layouten, men också en bild av varje donator block med motsvarande anteckningar görs.

Figur 6
Figur 6 Dessa TMA layouter användes för arraying de A) tumörvävnad och B) normala vävnader..

Figur 7
Figur 7. Skärmdump av vävnads microarrayer mjukvaran. Till vänster, 12 reAdressaten block kan placeras i instrumentet. På botten är bilder av varje donator blocket tas. I centrum, TMA layouten, är utvecklingen av stans samt förstorade bilder av varje donator block med anteckningar hittades.

Figur 8
Figur 8 A) Några exempel på nybildade ngTMA block. B) Ytterligare vävnads slag kan tas för efterföljande molekylär analys. Dessa kärnor är utstansade och placerades i 0,2 ml rör.

Figur 9
Figur 9. Exempel på ngTMA biomarkörer applikationer. A) Immunohistokemi färgning av Ki67 i kolorektal cancer. Dual HER2 immunohistokemi / in situ hybridisering analys visar B) lågt uttryck av protein (brun) och ingen förstärkning av HER2-genen (svart) i förhållande till centromer (röd), C) högt uttryck av proteinet (brun) och HER2 genamplifiering ( svart) relativt centromer (röd). D) Kromogent in situ hybridisering av Her2 visar enstaka mRNA-transkript i bröstcancer ngTMA. E) Immunohistokemi för CD8 vid kolorektalcancer. F) Dubbel immunohistochemistry fläck för pan-cytokeratin markör AE1 / AE3 (brun, tumörceller) och CD68 (röd;. Makrofager) belyser tumören mikromiljö vid kolorektalcancer Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

I detta dokument är ett protokoll för ngTMA beskrivs. ngTMA är ett nystartat koncept för vävnads microarraying involverar planering och design, digital patologi och skjut annotation samt automatiserad vävnads microarraying 12.

Jämfört med konventionella vävnads microarraying, ngTMA erbjuder många fördelar. I ett första steg är att planera och designfasen kritisk. Fokus ligger på att besvara ett riktat forskningsfråga. Detta bör ta hänsyn till de histologiska frågor (t.ex., vilka regioner och hur många ställen vill jag inkludera?), Den statistiska planering (t.ex. urvalsstorlek? Hur analyserar jag mina prover senare?) Och logistiska överväganden (t.ex. hur många biomarkörer och därmed hur många ngTMA kopior?). En särskild ngTMA görs för specifika behov, om det är för biomarkör screening och hög genomströmning eller är avsedda att studera specifika histologiska aspekter på endast ett fåtal väl utvalda cases.

Ett, om inte det är mest viktig nackdel med konventionell tissue microarraying den låga noggrannheten med vilken markeringarna på de histologiska diabilder görs. Studien av särskilda histologiska strukturer, celler eller regioner görs nästan omöjligt. ngTMA möjliggör hög noggrannhet eftersom anteckningar är placerade direkt på de digitala bilderna. Detta tillåter forskaren att exakt välja vilka regioner som skall stansas, inklusive specifika celler. I detta exempel, finns olika områden inom samma vävnadsblock stansas ut för grupperande, såsom tumören centrum, invasionen främre och områden av tumör / stroma interaktion markeras genom närvaron av små tumörcellskluster eller enstaka celler. Denna noggrannhet kan endast uppnås med hjälp ngTMA. För det tredje, eftersom diabilder skannas på en webbaserad digital plattform, skjut visning och notering kan göras via datorn istället för med mikroskopet. Vävnadsgrupperings programvara ger en användarvänliggränssnitt med en hög grad av flexibilitet, alltså olika layouter och ngTMA design kan uppnås. Eftersom TMA konstruktion utförs automatiskt genom borrning, finns det lite behov av praktisk manövrering och den tid för byggnation har minskat avsevärt. Tiden för TMA byggande i detta exempel här är mellan 24 tim. Med hjälp av en konventionell TMA strategi och uppskatta 15 slag per timme, skulle det här projektet tar ungefär 304 timmar.

ngTMA kan användas för att studera proteinuttryck, mRNA eller DNA samt kombinationer av dessa. Figur 9 visar flera av dessa ansökningar till potentiella biomarkörer. Standard immunohistokemi kan tillämpas för att bestämma spridningsindex för cancer med hjälp av Ki-67. Kan användas Ett kombinerat tillvägagångssätt för att undersöka proteinuttryck och DNA-amplifiering för gener såsom HER2. Vävnader kan samlas ihop på ett enda ngTMA att minska kostnaderna, vävnadsanvändning och andra resurserar. Dessutom kan utföras kromogent mRNA in situ-hybridisering för HER2 och andra gener för att identifiera enskilda mRNA-transkript i ett stort antal fall med användning av ett minimalt antal vävnads diabilder. Immunohistokemi av immunmarkörer såsom CD8 kan visualiseras i samband med tumörens mikromiljö. Dubbel immunohistokemi kan också användas för att belysa vissa områden av intresse såsom interaktioner mellan immunceller (märkta i rött) och tumörceller (märkta i brunt) vid invasionen framför cancer. Ett sådant område av intresse inte kunde ha tagits med konventionell vävnads microarraying.

Ändå innehåller detta protokoll vissa begränsningar. Den viktigaste utmaningen är överlappningen mellan givare blocket och digital bild. Flera faktorer kan påverka det här steget. För det första bör det senaste avsnittet från blocket användas för diabilder. I många fall är inte den sista delen av det donerande blocket, rathe H & Er det är en immunohistokemisk eller annan fläck. I detta fall, även en färgade objektglas kan användas så länge som den sista fläcken skannas och kommenterad eller en ny H & E skall göras. Försiktighet bör också iakttas vid vävnadssnitt görs i vävnader kan expandera i vattenbadet, som leder till utmanande matchning av bild och block. För det andra, just nu projekt är begränsade till 12 mottagande TMA block behandlas vid ett och samma tillfälle. Större projekt som överstiger 12 TMA måste tilldelas en andra projektnamn. För det tredje måste givarblocken göras med hjälp av standard formar och kassetter som instrumentet kan inte anpassa sig till olika storlekar. Slutligen måste givarblocken överstiga den minimala höjden (4 mm) för att uppnå optimal borrning. I vissa fall kräver den här reembedding av vävnader.

Hundratals publikationer under de senaste åren markera TMA som ett ovärderligt verktyg för biomarkör forskning. TMA har använts för att studera lungan 13, kolorektal 7, breast 14, prostata 15, bukspottkörtel 16, urinblåsa 17 och gastric 18 cancer, för att nämna några. Allt fler författare har kombinerat användningen av TMA med bildanalys och betydande framsteg görs i denna riktning 19-21. Men vid sidan av en handfull forskargrupper som har publicerat innovativa TMA idéer 22-24, lite uppmärksamhet har ägnats åt att optimera TMA tekniken i sig. Automatiserade vävnads microarrayers, såsom ATA-27 från Estigen / Beecher do ger layout design och ändamålsenligt och automatiserad vävnadsstansning. Detta utgör dock endast en aspekt av ngTMA konceptet.

ngTMA är en väsentlig förbättring jämfört med konventionella vävnads microarraying tekniker. Det omfattar kompetens inom histologi och TMA design med flexibiliteten i digital patologi och precisionen i digitala anteckningar med hastigheten och tillförlitligheten i automatiserad TMA konstruktion. Kombinationen av ngTMA och bildanalys för utvärdering av protein och molekylära biomarkörer kommer att bli ett kraftfullt verktyg för att ytterligare förbättra kvaliteten på klinisk och translationell forskning i framtiden.

Acknowledgments

Författarna vill tacka den tekniska personalen i Translational Research Unit; Mary Economou, José Galván, Caroline Hammer, Dominique Müller, Liliane Schöni och informatik Team vid Institutet för patologi, University of Bern.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pannoramic 250 Flash II 3DHistech Slide scanner
TMA Grandmaster 3DHistech Tissue Microarrayer
Pannoramic Viewer 3DHistech free Slide viewing software
Case Center 3DHistech Digital slide platform

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kononen, J., et al. Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens. Nat Med. 4, 844-847 (1998).
  2. Tzankov, A., Went, P., Zimpfer, A., Dirnhofer, S. Tissue microarray technology: principles, pitfalls and perspectives--lessons learned from hematological malignancies. Exp Gerontol. 40, 737-744 (2005).
  3. Barlund, M., et al. Detecting activation of ribosomal protein S6 kinase by complementary DNA and tissue microarray analysis. J Natl Cancer Inst. 92, 1252-1259 (2000).
  4. Bubendorf, L., et al. Survey of gene amplifications during prostate cancer progression by high-throughout fluorescence in situ hybridization on tissue microarrays. Cancer Res. 59, 803-806 (1999).
  5. Garcia-Caballero, T., et al. Dual-colour CISH is a reliable alternative to FISH for assessment of topoisomerase 2-alpha amplification in breast carcinomas. Breast Cancer Res Treat. 81-89 (2014).
  6. Schraml, P., et al. Tissue microarrays for gene amplification surveys in many different tumor types. Clin Cancer Res. 5, 1966-1975 (1999).
  7. Zlobec, I., et al. Role of RHAMM within the hierarchy of well-established prognostic factors in colorectal cancer. Gut. 57, 1413-1419 (2008).
  8. Hsu, F. D., et al. Tissue microarrays are an effective quality assurance tool for diagnostic immunohistochemistry. Mod Pathol. 15, 1374-1380 (2002).
  9. Marin, C., et al. Detection of BRAF p.V600E Mutations in Melanoma by Immunohistochemistry Has a Good Interobserver Reproducibility. Arch Pathol Lab Med. 71-75 (2014).
  10. Polley, M. Y., et al. An International Ki67 Reproducibility Study. J Natl Cancer Inst. 1897-1906 (2013).
  11. Zlobec, I., Terracciano, L., Jass, J. R., Lugli, A. Value of staining intensity in the interpretation of immunohistochemistry for tumor markers in colorectal cancer. Virchows Arch. 451, 763-769 (2007).
  12. Zlobec, I., Koelzer, V. H., Dawson, H., Perren, A., Lugli, A. Next-generation tissue microarray (ngTMA) increases the quality of biomarker studies: an example using CD3, CD8, and CD45RO in the tumor microenvironment of six different solid tumor types. J Transl Med. 11, 104 (2013).
  13. Yoshida, A., et al. Immunohistochemical detection of ROS1 is useful for identifying ROS1 rearrangements in lung cancers. Mod Pathol. 711-720 (2014).
  14. Droeser, R., et al. Differential pattern and prognostic significance of CD4+, FOXP3+ and IL-17+ tumor infiltrating lymphocytes in ductal and lobular breast cancers. BMC Cancer. 12, 134 (2012).
  15. Fleischmann, A., et al. Androgen receptors are differentially expressed in Gleason patterns of prostate cancer and down-regulated in matched lymph node metastases. Prostate. 71, 453-460 (2011).
  16. Wang, T., et al. Pattern of breast cancer susceptibility gene 1 expression is a potential prognostic biomarker in resectable pancreatic ductal adenocarcinoma. Pancreas. 42, 977-982 (2013).
  17. Fleischmann, A., Rotzer, D., Seiler, R., Studer, U. E., Thalmann, G. N. Her2 amplification is significantly more frequent in lymph node metastases from urothelial bladder cancer than in the primary tumours. Eur Urol. 60, 350-357 (2011).
  18. Zhang, Z. Q., et al. Identification of Annexin A1 protein expression in human gastric adenocarcinoma using proteomics and tissue microarray. World J Gastroenterol. 19, 7795-7803 (2013).
  19. Chaux, A., et al. The epidermal growth factor receptor is frequently overexpressed in penile squamous cell carcinomas: a tissue microarray and digital image analysis study of 112 cases. Hum Pathol. 44, 2690-2695 (2013).
  20. McKenna, S. J., Amaral, T., Akbar, S., Jordan, L., Thompson, A. Immunohistochemical analysis of breast tissue microarray images using contextual classifiers. J Pathol Inform. 4, S13 (2013).
  21. Pages, F., et al. Effector memory T cells, early metastasis, and survival in colorectal cancer. N Engl J Med. 353, 2654-2666 (2005).
  22. Komiya, A., et al. Application of a new technique, spiral tissue microarrays constructed using needle biopsy specimens, to prostate cancer research. Int J Oncol. 44, 195-202 (2014).
  23. Quintayo, M. A., et al. Virtual tissue microarrays: A novel and viable approach to optimising tissue micro-arrays for biomarker research applied to Ductal Carcinoma in Situ (DCIS). Histopathology. 2-8 (2014).
  24. Torata, N., et al. Tissue tablet method: an efficient tissue banking procedure applicable to both molecular analysis and frozen tissue microarray. Hum Pathol. 45, 143-152 (2014).
Nästa generations tissue microarray (ngTMA) Protokoll för Biomarker Studies
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zlobec, I., Suter, G., Perren, A., Lugli, A. A Next-generation Tissue Microarray (ngTMA) Protocol for Biomarker Studies. J. Vis. Exp. (91), e51893, doi:10.3791/51893 (2014).More

Zlobec, I., Suter, G., Perren, A., Lugli, A. A Next-generation Tissue Microarray (ngTMA) Protocol for Biomarker Studies. J. Vis. Exp. (91), e51893, doi:10.3791/51893 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter