Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Biyomarker Çalışmaları için bir sonraki nesil Doku Mikrodizi (ngTMA) Protokol

doi: 10.3791/51893 Published: September 23, 2014

Summary

Protokol biyomarker araştırma için inşaat ve doku microarrays kalitesini optimize edilmesini amaçlamaktadır. Bu planlama ve tasarım, dijital patoloji, sanal slayt açıklama ve otomatik doku arraying yönlerini kapsamaktadır.

Abstract

Biyomarker araştırma doku mikrodizilerinin (TMA) dayanır. TMAlar bir "alıcı" blok içine bir "verici" blok küçük doku çekirdeklerinin tekrar transferi ile üretilebilir ve daha sonra biyobelirteç çeşitli uygulamalar için kullanılır. Geleneksel tmas yapımı yoğun emek gerektirmekte, kesin ve zaman alıcıdır. İşte, yeni nesil Doku mikrodizileri kullanarak bir protokol (ngTMA) özetlenmiştir. ngTMA TMA planlama ve tasarım, dijital patoloji, ve otomatik doku microarraying dayanmaktadır. Protokol 134 metastatik kolorektal kanser hastalarının bir örneği ile. Histolojik istatistik ve lojistik yönleri gibi TMA, TMA kopya doku noktalar, örnek büyüklüğü, istatistiksel analiz sayısı ve numarası eklenmesi için doku tipi, spesifik histolojik bölgeler ve hücre türleri olarak, kabul edilir. Her hasta için histolojik slaytlar taranmış ve bir web-tabanlı dijital platform üzerine yüklenir. Orada, onlar inceledi ve ann edilirotated bir 0,6-2,0 mm çaplı aracı, doku alanları ayırt çeşitli renkleri kullanarak birden çok kez kullanarak (işaretli). Donör blok ve 12 'alıcı' blok alet içine yüklenir. Dijital slaytlar alınır ve donör blok görüntülere eşleştirilir. Açıklamalı bölgelerin tekrarlanan arraying otomatik olarak ngTMA sonuçlanan gerçekleştirilir. Bu örnekte, altı ngTMAs altı farklı doku türleri / histolojik bölgesi ile planlanmıştır. NgTMAs iki kopyası arzu edilir. Taranan her hasta için dört slaytlar üç; 3 tarama çalışır ve gerekli gecede gerçekleştirilmez. Tüm slaytlar açıklamalı; Farklı renkler, farklı dokular / bölgeleri, yani tümör merkezi, istila ön, tümör / dokudan lenf nodu metastazı, karaciğer metastazları, ve normal doku temsil etmek için kullanılır. 17 açıklamalar / vaka yapılır; açıklama için süresi 2-3 dk / durumdur. 12 ngTMAs 4,556 noktalarını içeren üretilmektedir. Zaman arraying 15-20 saattir. Nedeniyle hassas, esneklik ve hız, ngTMA güçlüayrıca tmas kalitesini artırmak için bir araç ve klinik araştırma translasyonel olarak kullanılır.

Introduction

Son iki yılda, doku mikroarray'ler (TMAlar) biyomarkör soruşturma çalışmaları dikkate değer bir etkisi oldu. TMAlar parafine gömülü 'vericinin blok tek bir TMA' alıcının blok içine, esas olarak (Şekil 1), tipik olarak çapı 0,6 ila 2,0 mm arasında değişen boyutu küçük doku çekirdeklerinin tekrar transferi, doku tarafından üretilen "arşiv" 1. Küçük bir çekirdek boyutu kullanarak, az ya da çok farklı hastadan yaklaşık 500 farklı doku noktalar tek TMA 2 içine dizilmiş olabilir.

Prognostik veya prediktif biyomarkör çalışmalar için TMAlar kullanımı birçok avantajı vardır. Imünohistokimya ile bir protein biyobelirteci ifade 450 hasta üzerinde değerlendirilecek olan örneği ele alalım. Aksine blokların aynı sayıda kesitli 450 hasta slaytlar üzerinde 450 immünohistokimyasal lekeleri gerçekleştirmek yerine, her örnekten küçük çekirdekler tek bir T üzerine dizilmiş olabilirMA bloğu. Birden çok çekirdek her bir hastadan alınan bile, blok en az sayıda üretilir. Bu şekilde bu masrafları ve diğer bilgi azalan ve doku yıkımı azaltma önemli bir etkisi vardır. Dokuların çok sayıda kullanarak Ayrıca bu uygun güç sağlar çalışmalar aynı deneysel koşullar altında değerlendirilmelidir.

TMAlar çeşitli kullanımlara sahiptir. Örneğin bunlar, morfolojisi, protein ekspresyonu RNA ekspresyonunu ve farklı boyalarla boyanması ile DNA sapmaları incelemek için kullanılabilir, ya da in situ hibridizasyon 3-7 immünohistokimya veya kromojenik ve daha sonra fluoresans. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, aynı zamanda, boyama protokolleri içi ve laboratuar varyasyonlarını deneme özgünlük ve belirli gen mutasyon için antikorların oluşturulması duyarlılık ve uluslararası ortak olarak protein ifade gözlemciler tekrarlanabilirliği belirlenmesi için bir tmas kullandık

Hasta-türetilmiş dokuları kullanılarak geleneksel TMAlar inşaat uzun bir çok aşamalı prosedür (Şekil 2). Bu alındıktan yerden bir patoloji enstitüsü veya diğer kurum, olası bir uygun durumlarda arama ve arşivlerden teşhis slaytlar seçimi ile başlar. Patolog vaka başına her slayt değerlendirir ve çalışmanın amaçları için en temsilcisi slayt seçer. Daha sonra, ilgi alanındaki bölgenin mikroskop altında doğrudan bir kalem ile işaretlenmiştir. Bu genellikle zorlu ve belirsiz ve sadece doku yumruklar alınmalıdır nerede bir "tahmininde" sonuçlanır. Sonra bu işaretlenmiş slaytlar karşılık parafin bloklar arşivden edilir. Blok ve kızak arasında hızlı bir karşılaştırma yapılır. Bir yarı otomatik veya ev yapımı doku dizici kullanarak, verici bloğu ilgi tahmini bölümünde dışarı doğru itilmekte ve bir alıcı blok içine aktarıldı TMA. Bu arraying tekniği kullanarak TMAlar İnşaat emek yoğun, zaman alıcı, kesin ve sert olduğunu. 3 nüsha olarak 475 noktalar bir TMA hazırlama çalışma yaklaşık 84 saat sürmesi tahmin ediliyor.

Planlama ve tasarım (veya danışmanlık), histoloji uzmanlık ve otomatik TMA 12 arraying ile birlikte dijital patoloji: TMAlar inşası için yeni bir yaklaşım son zamanlarda Patoloji Enstitüsü, üç bileşenden dayanmaktadır Bern Üniversitesi tarafından tanıtıldı. Birlikte, bu kavram yeni nesil Doku Mikroarray (ngTMA) denir. Aşağıda, ngTMA için bir protokol metastatik kolorektal kanserli 134 hastanın bir örnek temelinde tarif edilmiştir. Burada primer tümörleri hem de lenf düğümü metastazı ve karaciğer metastazları sonraki analiz için biyomarker ngTMAs içine dizilmiştir edilecektir. Buna ek olarak, her bir hastaya küçük doku çekirdekleri gelecek nükleik asit ekstraksiyonu için arzu edilir.

Protocol

NOT: Bu çalışma Insel Hastanesi, Bern, İsviçre (07-10-13) yerel etik kurul tarafından onaylandı. Dokular Tümör bankanın Patoloji Bern, Enstitüsü, Bern Üniversitesi elde edilmiştir.

1. Planlama ve Tasarım (Danışmanlık)

  1. Araştırma sorusu düşünmek cevaplanması gereken. Doku tipleri üzerinde karar projeye dahil edilecek. Histolojik yapıları soruyu cevaplamak için önemli olan ne belirleyin.
  2. En yararlı çekirdek çapı ve proje için hasta başına çekirdeklerinin sayısını teyit edin. Biyomarkerların miktarına göre nesil Doku Mikro Array (ngTMA) kopya sayısına karar araştırılmalıdır.
  3. Doku mikrotertip (TMA) inşa edildikten sonra örnek büyüklüğü ve analizi gibi istatistiksel yönlerini düşünün. Çalışmaya dahil hastaların sayısını belirlemek için bir dizi kontrol dokuların oluşturulması.
  4. Histolojik Al (veyadiyagnostik) Hematoksilen ve Eosin (H & E), her bir hastanın kayar. Kısaca slaytları inceleyin ve proje için ilgili bilgi ve histoloji içeren olanları belirlemek.
    NOT: özel leke veya immünohistokimya slayt slayt tarama ve açıklama için istenirse yerine H & E slaytlar, parafin blok yeni bölümler olun

2. Slayt Tarama

  1. PC ve slayt tarayıcı ve açık tarama yazılımı açın. Önizleme ekranından parlak bir alan tarama için "Otomatik modu" seçeneğini seçin.
  2. Slayt kalite parametrelerini ayarlamak için "tarama seçenekleri" üzerine tıklayın. Bu anda, slaytlar doğrudan web tarafından veya yerel bir sürücü (sürücü veya harici) erişilebilir dijital platforma taranacak olup olmadığını seçin ve tarama ve odak noktalarının sayısı türlerini ayarlayabilirsiniz.
  3. "Vaka merkezi" tarama "Server Parametreleri" üzerine tıklayın. Bu aşamada, daha dergiler eklediğiniz tüm slaytlar etiket ve setslaytlar saklanmalıdır Vaka Merkezi'nde klasör. Her dergi 25 slaytlar kadar tutar.
  4. Giriş kalite / tarama için gerçek histolojik slaytlar temizlik. % 70 etanol ile gerekli temiz, slaytlar halinde.
  5. Etiketler içe bakan ile dergi başına 25 slaytlar kadar yükleyin (Şekil 3A)
  6. Tarayıcıya dergi yerleştirin. Birden fazla dergisi için, birbirinin üzerine koyun.
  7. Yeşil ok (Şekil 3B) tıklayarak slayt taramaya başlayın. Tüm slaytlar tarandığında, dergi kaldırma ve programı PC ve slayt tarayıcı kapatın.

3. Dijital Slayt Açıklamalar

  1. Dijital slayt yönetimi merkezi için tarayıcı adresini girin ve ücretsiz dijital slayt görüntüleyici yazılımı indirmek.
  2. Dijital slayt görüntüleyici yazılımı açın ve dijital slaytlar (Şekil 4A) içeren klasörü seçin.
  3. , Notlar ekleyebilir yeniden düzenlemek ve yönetmek Digital slayt klasör veya meslektaşlarına kullanıcı hakları atamak veya klasöre ekleri ekleyin.
  4. Dijital slayt görüntüleyicide istediğiniz dijital slayt tıklayın.
  5. Büyütme aracını kullanarak, slayt değerlendirmek ve ngTMA entegrasyon için ilgi alanları bulabilirsiniz.
  6. 'TMA açıklama aracını' kullanarak, istenen çekirdeğin büyüklüğü ve şerhinin rengi seçin. (Şekil 4B) üzerine tıklayarak, dijital slayt üzerinde şerhi.
  7. NgTMA (Şekil 4C) içine dahil etmek için arzu edilen histolojik yapılarla açıklama getirin.
  8. Bir çekirdek boyutu ve istenen bir açıklama rengi, açıklama aracını kullanarak seçerek tekrar şerhinin bu işlemi tekrarlayın. Klasördeki tüm slaytlar üzerinde slayt görüntüleme ve açıklama tekrarlayın.
  9. Alternatif olarak, TTB içine 0.2 ml tüpler yerine entegrasyon içine PCR için doku çekirdeği yerleştirin. Tanımlamak için farklı bir renk kullanarak slaytlar AnnotateDaha fazla moleküler analiz için bu noktalar.
  10. Bunlara karşılık gelen açıklamalarla ve renkleri ile tüm olguların bir listesini oluşturun.

4. Doku Mikroarray İnşaat

  1. Doku microarraying için istenen amacıyla blokların sıralayın, tüm açıklamalı dijital slaytlar için gelen parafin doku blokları alın.
  2. Doku blokları 4 mm kalınlığında, en az olduğundan emin olun. Aksi takdirde, bir doku reembedding gereklidir.
  3. Ve otomatik doku mikro-dizici aracı "AÇIK" Turn PC. Doku mikro-dizici yazılımını açın ve projeye bir ad
  4. Bir "Aracı Değiştir" gerçekleştirin ve proje için gerekli alet çapı seçin (örneğin, 0.6, 1.0, 1.5 veya 2.0 mm).
  5. Makinenin içine 12 'alıcı' TMA blokları yükleyin. 12 blokların her biri bir numarası
  6. Her alıcı blok için bir TMA düzeni oluşturun. Satır, sütun, ve gidilmeyeceği sayısı ile bir TMA tasarım gözlemlemeky hatları gibi çekirdek arasında mesafe. Her alıcı blok için yeni bir düzen yaratmak, art arda veya aynı düzeni kullanmak.
  7. İlk çekirdek almak için alıcı blok düzeninde imleci yerleştirin.
  8. Sonraki, doku mikro dizicinin (Şekil 5A) içine 60 donör kadar blok yük. Her bloğu bir donör numarası F'ye her satır A on blok yerleştirin. Doku mikro dizicinin tarafından otomatik olarak elde bilgisayar ekranında her donör bloğun görüntüleri gözlemleyin.
  9. Ilk blok ile başlayarak, "Slide" üzerine tıklayın. Dijital slayt görüntüleyici kullanarak dijital slayt yönetim merkezi (veya harici sürücüde) saklanan açıklamalı dijital slayt gözlemleyin. Donör blok görüntü ve dijital slayt yan yandan görünüşüdür.
  10. Blok görüntü üzerinde seçin referans noktaları dijital slayt ile donör blok görüntü bindirmek için
  11. "Next" tıkladıktan sonra, bloğun bir büyük resim üzerine açıklamaları gözlemlemek. (Şekil 5B </ Strong>). Onaylamak ve "Başlat" tıklayın açıklamaları üstüne tıklayın.
    Not: Bu, seçilen başlangıç ​​noktasında alıcı blok çapı 0.6 mm bir delik başlatmak için doku mikro-dizici ister. Daha sonra, bir ikinci aşamada, delme aleti ile, cihaz tam açıklamalı ve teyit bölgesinde seçilen donör bloktan dokuda delik açar. Çekirdekler daha sonra alıcı blok vericiden aktarılır.
  12. Yaklaşık 500 çekirdek sonra, ksilen bir bez kullanılarak matkap ve delme aracı temizleyin.
  13. Doku çekirdekleri (yerine bir ngTMA içine yumruklar daha) istenirse, blok için "PCR" aracını tıklayın 4 işaretlere kadar teyit ve vurmak "Başlat". Bu yumruk ve 0.2 ml tüp içine çekirdeği transfer olacak.
  14. Tekrar nokta, ikinci verici bloğu ile 4,9-4,11, vb.
  15. Tüm donör blokları kullandıktan sonra, doku mikrodizisinden donör blok ikinci turda (61-120) giriner ve adımları 4,8-4,11 devam ediyor.
  16. Proje ilerleme delme ve delme (Şekil 5C) yapılırken ise donör ve alıcı blok görüntüleri yenileyin.
  17. Proje tamamlandıktan sonra, bir "Export" gerçekleştirin. Donör ve alıcı blok kimlikleri ile .xslx dosyasını bulun, ihraç klasöründe TMA içindeki tüm yumruklar yanı sıra TMA düzen / tasarım lokalizasyonu. Ihraç klasör (Şekil 5D) jpg görüntü olarak tüm bindirilmiş açıklama ile tüm donör blok görüntüleri kaydedin. Nihai TMA Blok daha sonra hazır hale gelir.

Representative Results

Planlama ve Tasarım

İşte biyobelirteçlerinin belirli bir dizi için araştırılmaktadır metastatik kolorektal kanserli 134 hasta örneği kullanılmıştır. Sadece bir ngTMA bu hastalar için planlanan, ancak DNA ekstraksiyon bazı belirtilen genin mutasyon analizi ile takip edilmektedir.

NgTMA planlama ve tasarım aşamasında, aşağıdaki hususlar karar verilmiştir. Her hastanın, 6 farklı histolojik bölgeleri araştırılacak: tümör merkezi, tümör istilası ön, yoğun tümör alanları (tümör / stroma etkileşimi), normal doku, lenf nodu metastazı ve karaciğer metastazları tomurcuklanan. Tümör doku alanı başına üç tümör noktalar ve iki normal doku noktalar projesi (n = hasta başına 17 noktalar) dahil edilecek. 50'den fazla biyo-malzeme üzerinde, bu hasta araştırılması planlanmaktadır için, son ngTMA iki kopyası arzu edilir. Bağlı lenf düğümü ve distan olası küçük boyutuT metastaz, bütün dokularda TTB yapımı için 0.6 mm çaplı küçük bir çekirdek tercih edilir.

Buna ek olarak, farklı histolojik alanları ihtiva eden 6 ngTMAs üretilecek şekilde her bir bölge ayrı ayrı, dizilmiş edilmesi öngörülmektedir: bir ngTMA a) tümörle merkezi doku ihtiva b) ön istila, c) tümör alanları tomurcuklanma, d) normal doku e) lenf nodu metastazı, f) karaciğer metastazı.

Bir 0.6 mm aracını kullanarak TMA tasarımı için, zımbalar arasındaki 0.4 mm rahat bir mesafe seçilecektir. Uzun sıralar ve sütunlar halinde doku noktalar değerlendirme genellikle yorucu olduğundan, iki değişik tasarım seçilir. Doku alanı başına 3 yumruklar ile tümör bloklar için, altı parça içeren bir tasarım oluşturulur. Bu 402 doku zımbalar toplam sayısına yol açmaktadır. Normal doku yumruklar için vaka başına 2 yumruklar dahil edilecektir. Toplam 432 yumruklar uydurma bir düzen seçilir.

Ayrıca, her bir durumda, en fazla 40.6 mm iç kısımlar kesilerek çıkarıldı ve ek 0.2 ml'lik tüplere yerleştirilir. Bu doku çekirdekleri de şerh edilecektir.

Tüpler için hasta başına 4 çekirdek ek olarak, özetlemek, farklı dokuların 6 ngTMAs üretilecek (1 normal doku dizi x 2 yumruklar x 134 hasta 5 tümör diziler x 3 yumruklar 134 hasta x). Birlikte ele alındığında, 2814 ek açıklamalar yapılacaktır.

Sonraki, seçilmiş hastalarda karşılık gelen H & E slaytlar slayt arşivden edilir. Her vaka kısaca bir patolog tarafından incelenir ve her doku tipinin en temsilcisi slaytlar seçilir.

Tarama

Her histolojik bölümün dijital slaytlar gelecek açıklama için yapılır. Bu çalışma için, 3-4 doku slaytlar muhtemelen komşu normal dokulara, lenf nodu metastazı ve karaciğer metastazı ve ek slayt con olan veya olmayan, yani durumda, birincil kolorektal kanser başına taranacakNormal mukoza taining.

Kadar 10 farklı dergi tam slayt tarayıcının içine yüklenebilir; Bu nedenle 250 slaytlar tek bir vadede taranabilir. Tarama ve dijital slayt boyutuna için zaman doku ve arzu edilen kalite faktörü boyutlarına göre değişir. Bu tarama kalitesi bir fark kaybı olmadan daha küçük tarama dosya boyutunu oluşturur beri 0'dan Burada 100'e kalite faktörü aralıkları, 60 bir kalite faktörü seçilir. Küçük biyopsiler 30 sn altında taranabilir ise 2 ile 10 dakika sürebilir Bu örnekte kullanılan olanlar gibi tam doku bölümleri. Dijital slayt boyutu da 2 MB ile 2 GB arasında olabilir. 60 kalite faktörü kullanarak, 600 MB ve 1 GB üretilmektedir arasındaki tarar.

402 ila 536 slaytlar 3 tarama çalışır bulan bu proje için gereklidir. Her bir işlem bir gece boyunca gerçekleştirilir. Yaklaşık depolama alanı 500 GB gereklidir. Slaytlar Olgu Merkezi adı verilen dijital platform üzerine doğrudan taranan (ngtma.unibe.pathcasecenter). Vaka Merkezi belirlenen kullanıcı adı ve şifrenizi girerek her yerden internet erişimi ile erişilebilir.

Açıklamalar

Açıklama için, iki yönü dikkate alınmalıdır: 1) Farklı doku alanları farklı açıklama renkler verilmeli ve 2) ek not sayısı son ngTMA istenen kopya sayısını yansıtmalıdır.

Bu durumda, tek bir kopya tümör alanı başına 3 noktalar seçilmiştir. 2 kopyaları için, her bölgenin 6 noktalar kullanarak şerh edilmelidir. Faydalı uzak metastaz lenf nodu metastazı, turkuaz siyah ve bölgeler olması için nihayet beyaz (tümör / stroma) etkileşimi, tümör tomurcuklanması alanları için kırmızı, tümör yayılması ön için sarı, tümör merkezi için mavi, normal doku için yeşil borular için de kullanılır. Her davanın şerhi 2-3 dk gerektirir.

ngTMA İnşaat

Bu çalışma 6 ngTMA blok t gerektirirO 12 son blok ile sonuçlanır 2 nüsha olarak tertip edilebilmektedir. Her tümör blok 402 dokusu noktalar içerecektir ve her normal doku blok tüm proje genelinde 4,556 noktalar toplam 268 noktalar, içerecektir dizici tarafından desteklenen olabilir alıcı blok maksimum sayısı 12'dir.

Bir TMA düzeni her alıcı blok için oluşturulur ve proje (Şekil 6A, 6B) kaydedilir. 60 doku blokları paralel doku mikro dizicinin yüklenebilir; her bir vericinin blok bir görüntü alınır. İlk donör blok ile başlayarak, ilgili açıklamalı dijital slayt Vaka Merkezi'nden alınır. Slayt uyan 1-3 dakika arasında sürebilir, yapılır. Açıklamalar teyit ve dizici (Şekil 7) delme başlatmak için istenir. Çekirdek delme ve transfer süresi yaklaşık 12 sn. Bu işlem sırasında çekirdek kaybı minimumdur. Bu projeyi arraying Toplam süre sli için zaman dahil, yaklaşık 24 saattirde / blok eşleştirme ve enstrümanın yeniden yükleme. NgTMA bazı örnekleri, Şekil 8A'da gösterilmiştir. Sonraki moleküler analiz için Çekirdekler, gene bu zamanda (Şekil 8B) üzerinden açılabilir.

Şekil 1
Şekil 1. A) 'donör' blok. Donör bloktan Çekirdekler zımbalandı ve B) bir alıcı blok, doku mikrodizisinin (TMA) aktarılır.

Şekil 2
Patolog f verilen Şekil 2. geleneksel doku mikroarray iş akışı. A) histolojik slaytlar arşiv ve B alınır) veya yorum. CD'si) Açıklamalar transferi için 'tahmin' bölgesini gösteren slaytlar üzerinde yapılır. D) gelen doku blokları alınır. F) Blok ve slayt eşleştirme için karşılaştırıldığında, hangi G olabilir) bazen zor bir görev olabilir. HJ ) Doku microarraying sonra alır yer. K) Damarlar, art arda transfer edilir ve L) bir nihai TMA inşa edilmiştir.

Şekil 3,
25 slaytlar kadar Şekil 3. A) kalite faktörü Düzeltme) tarama. B her bir dergi yerleştirilebilir ve boyut yapılabilir. Tarama ilerleme izlenebilir.

"Src =" / files / ftp_upload / 51893 / 51893fig4highres.jpg "width =" 600 "/>
Şekil 4. A) Taranan slaytları web-tabanlı platform, Olgu Merkezi. B) Sayısal slaytlar izlenebilir üzerine yüklenebilir. TTB açıklama aracı kullanıcı Açıklamalar dijital slayt üzerine doğrudan konabilir) açıklama. C için gerekli çekirdek boyutu ve rengi seçmenize olanak verir. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5,
60 blok Yukarı Şekil 5. A) alınır doku mikro dizicinin, yani satır başına 10 donör blokları ve 12 alıcıları blok yanı. B) Her donör bloğun bir görüntü yüklenebilecek, digital slayt alınır. Blok ve sürgünün eşleştirme yapılır ve açıklamalar blok delme aracı delme sırasında düzenlenmesiyle ilerlemesi izlenebilir. ° C). D) için kullanılan delme gerçekleştirildikten sonra düzeninde her bir nokta konumunun bir ihracat ama Ayrıca gelen açıklamalarla her donör bloğun bir görüntü oluşur.

Şekil 6,
Şekil 6. Bunlar TTB düzenleri A) tümör blokları ve B), normal dokuları arraying için kullanılmıştır.

Şekil 7
Doku mikro-dizici yazılımın Şekil 7. Screenshot. Solda, 12 yenidencipient blok aracı yerleştirilebilir. Dibinde, her donör bloğun görüntüleri alınır. Merkezi, TMA düzeninde, delme ilerleme gibi açıklamaları ile her donör bloğun büyütülmüş görüntüleri bulundu.

Şekil 8
Şekil 8. A) yeni oluşturulan ngTMA blokların bazı örnekler. B) Diğer doku yumruklar sonraki moleküler analiz için alınabilir. Bu çekirdekler kesilerek çıkarıldı ve 0.2 ml tüpler içine yerleştirilir.

Şekil 9,
Şekil ngTMA biyomarkır uygulamalar 9. örnekler. Kolorektal kanserde Ki67'nin A) İmmünhistokimya boyama. Çift HER2, immünohistokimya / in situ) düşük protein (kahverengi salgılanması) ve sentromer (kırmızı) için Her2 geni (siyah) nisbetle herhangi bir amplifikasyon B gösteren hibridizasyonu deneyi, C) proteinin (kahverengi) ve Her2 gen amplifikasyonu yüksek ifade ( meme kanseri ngTMA tek mRNA gösteren Her2'nin in situ hibridizasyon sentromer (kırmızı) d.) kromojenik siyah) göre belirlenmiştir. Kolorektal kanserde CD8 E) İmmünohistokimya. F) pan-sitokeratin işaretleyici AE1 / AE3 (kahverengi Çift immünohistokimyası leke; tümör hücreleri) ve CD68 (kırmızı;. Makrofajlar) kolorektal kanserde tümör mikro vurgulayarak , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Discussion

Bu yazıda, ngTMA için bir protokol özetlenmiştir. ngTMA planlama ve tasarım, dijital patoloji ve slayt şerh içeren doku microarraying yanı sıra otomatik doku microarraying 12 için yeni kurulan bir kavramdır.

Geleneksel ince microarraying ile karşılaştırıldığında, ngTMA birçok avantaj sunmaktadır. Bir ilk adımda, planlama ve tasarım aşamasında kritiktir. Odak hedeflenen araştırma sorusunu yanıtlayan üzerinde. Bu dikkate almalı histolojik konular (örneğin, kaç noktalar Ben istiyorum ki bölgeler ve dahil?), Istatistiksel planlama (örneğin, örneklem büyüklüğü? Sonra benim örnekleri analiz Nasıl?) Ve lojistik hususlar (örneğin, nasıl Birçok biyolojik belirteçler ve bu nedenle kaç kopya ngTMA?). Belirli bir ngTMA bu biyomarkör tarama ve yüksek verimlilik için olup olmadığını, özel ihtiyaçları için veya sadece birkaç iyi seçilmiş cas belirli histolojik yönlerini incelemek için tasarlanmıştıres.

Bir değil ise, geleneksel ince kağıttan microarraying en önemli dezavantajı, histolojik slaytlar üzerinde işaretler imal edildiği düşük doğruluğudur. Spesifik histolojik yapıları, hücreler veya bölgelerde çalışma neredeyse imkansız hale gelmektedir. açıklamalar dijital slaytlar üzerinde doğrudan yerleştirilen çünkü ngTMA yüksek doğruluk sağlar. Bu tam olarak bölgelerini seçmek için araştırmacı spesifik hücreler de dahil olmak üzere, delikli sağlar. Bu örnekte, aynı doku bloğu içinde farklı alanları gibi küçük tümör hücre kümeleri ya da tek hücrelerin varlığı ile vurgulanan tümör merkezinde, istilası ve tümör ön / stroma etkileşim sahaları, düzenlenmesiyle dışarı delinir. Bu doğruluğu, ngTMA kullanılarak elde edilebilir. Slaytlar web-tabanlı dijital platform üzerine taranır, çünkü Üçüncüsü, görüntüleme slayt ve not bilgisayar aracılığıyla yerine mikroskop ile yapılabilir. Doku arraying yazılımı kullanıcı dostu sağlarBir yüksek esneklik derecesi, bu nedenle de farklı düzenleri ve ngTMA tasarımı ile arayüz elde edilebilir. TMA inşaat delme tarafından otomatik olarak yapılır bu yana, eller manevra ve inşaat için zamanın miktarı önemli ölçüde azalır az ihtiyaç vardır. Burada, bu örnekte TMA yapımı için süre 24 saat arasındadır. Geleneksel TMA yaklaşımı kullanarak ve saat başına 15 yumruklar tahmin, bu proje yaklaşık 304 saat alacaktı.

ngTMA protein ifadesi, mRNA veya DNA yanı sıra, bu kombinasyonları incelemek için de uygulanabilir. 9 potansiyel biyolojik belirteçler bu uygulamaların birçok göstermektedir Şekil. Standart immünohistokimyasal Ki-67 ile kanserlerin çoğalma endeksi belirlemek için uygulanabilir. Bu gibi genler için HER2 protein ekspresyonu ve DNA amplifikasyon araştırmak için kombine olarak kullanılabilir. Dokular maliyetleri, doku kullanımı ve diğer kaynağın azaltılması için tek bir ngTMA üzerinde bir araya getirilebilirs. Buna ek olarak, HER2 ve diğer genler için in situ melezleme, kromojenik mRNA'nın doku örneklerinin minimal numarasını kullanarak vakaların büyük sayıda tek mRNA belirlemek için gerçekleştirilebilir. CD8 gibi bağışıklık belirteçlerin İmmünohistokimya tümörün mikro-ortamı bağlamında görüntülenmiştir. Çift immünohistokimya, aynı zamanda, kanserlerin istila ön (kahverengi etiketlenmiştir), immün (kırmızı etiketli) hücreleri ve tümör hücreleri arasındaki etkileşim gibi ilgi konusu belirli bölgelerini vurgulamak için kullanılabilir. Ilgi Böyle bir bölge, geleneksel doku microarraying kullanılarak yakalanan olamazdı.

Bununla birlikte, bu protokolü, bazı sınırlamalar içermektedir. En önemli zorluk donör blok ve dijital slayt arasındaki örtüşme olduğunu. Çeşitli faktörler bu adımı etkileyebilir. İlk olarak, blok en son bölümünde kayma tarama için kullanılmalıdır. Bir çok durumda, H & E donör blok -Rathe son bölümü değilr bir immünohistokimyasal ya da diğer leke olduğunu. Son leke taranmış ve not ya da yeni bir H & E ile yapılmalıdır olduğu üzere, bu durumda, aynı zamanda, bir boyanmış lam sürece kullanılabilir. Dokular slayt ve blok eşleme zorlu yol açan su banyosunda genişleyebilir olarak doku kesitleri yapıldığı zaman da bakımını alınmalıdır. İkincisi, şu anda projelerin tek seferde işlenen 12 alıcı TMA blokları ile sınırlıdır. 12 TMAlar aşan büyük projeler ikinci bir proje adı atanmalıdır. Üçüncü olarak, donör bloklar çeşitli boyutlarda kendini ayarlayamaz aracı olarak, standart kalıp ve kasetleri kullanılarak yapılmalıdır. Son olarak, donör bloklar optimum delme ulaşmak için minimum yüksekliği (4 mm) aşmamalıdır. Bazı durumlarda, bu dokuların reembedding gerektirir.

Son birkaç yıldır yayınların Yüzlerce biyomarkör araştırma için değerli bir araç olarak TMA vurgulayın. TMAlar akciğer 13, kolorektal 7, bre incelemek için kullanılmıştırast 14, prostat 15, pankreas 16, mesane 17, ve mide 18 kanserleri, birkaç isim. Yazarların giderek artan sayıda görüntü analizi ve önemli adımlar bu yönde 19-21 yapılıyor ile TMAlar kullanımını birleştirdik. Ancak, yenilikçi TMA fikirleri 22-24 yayınlanmış araştırma grupları bir avuç yanında, biraz dikkat TMA tekniği kendisini optimize verildi. Böyle ATA-27 Estigen / Beecher'la tarafından gibi otomatik doku microarrayers, düzeni tasarım ve uygun ve otomatik doku delme sağlarlar. Ancak bu ngTMA kavramı sadece 1 yönünü temsil eder.

ngTMA geleneksel ince microarraying tekniklere kıyasla büyük bir gelişme görülür. Bu dijital patoloji esneklik ve hız ve otomatik TMA inşaat güvenilirliği dijital ek açıklamaları hassasiyetle histoloji ve TMA tasarım uzmanlığı içermektedir. NgTM kombinasyonuProtein ve moleküler belirteçlerin değerlendirilmesi için bir görüntü analizi ve gelecekte daha da klinik ve translasyonel araştırma kalitesini geliştirmek için güçlü bir araç olacaktır.

Acknowledgments

Yazarlar Translational Araştırma Birimi teknik personeli teşekkür etmek istiyorum; Mary Economou José Galván, Caroline Hammer, Dominique Müller, Liliane Schöni ve Patoloji Enstitüsünde Bilişim Ekibi, Bern Üniversitesi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pannoramic 250 Flash II 3DHistech Slide scanner
TMA Grandmaster 3DHistech Tissue Microarrayer
Pannoramic Viewer 3DHistech free Slide viewing software
Case Center 3DHistech Digital slide platform

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kononen, J., et al. Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens. Nat Med. 4, 844-847 (1998).
  2. Tzankov, A., Went, P., Zimpfer, A., Dirnhofer, S. Tissue microarray technology: principles, pitfalls and perspectives--lessons learned from hematological malignancies. Exp Gerontol. 40, 737-744 (2005).
  3. Barlund, M., et al. Detecting activation of ribosomal protein S6 kinase by complementary DNA and tissue microarray analysis. J Natl Cancer Inst. 92, 1252-1259 (2000).
  4. Bubendorf, L., et al. Survey of gene amplifications during prostate cancer progression by high-throughout fluorescence in situ hybridization on tissue microarrays. Cancer Res. 59, 803-806 (1999).
  5. Garcia-Caballero, T., et al. Dual-colour CISH is a reliable alternative to FISH for assessment of topoisomerase 2-alpha amplification in breast carcinomas. Breast Cancer Res Treat. 81-89 (2014).
  6. Schraml, P., et al. Tissue microarrays for gene amplification surveys in many different tumor types. Clin Cancer Res. 5, 1966-1975 (1999).
  7. Zlobec, I., et al. Role of RHAMM within the hierarchy of well-established prognostic factors in colorectal cancer. Gut. 57, 1413-1419 (2008).
  8. Hsu, F. D., et al. Tissue microarrays are an effective quality assurance tool for diagnostic immunohistochemistry. Mod Pathol. 15, 1374-1380 (2002).
  9. Marin, C., et al. Detection of BRAF p.V600E Mutations in Melanoma by Immunohistochemistry Has a Good Interobserver Reproducibility. Arch Pathol Lab Med. 71-75 (2014).
  10. Polley, M. Y., et al. An International Ki67 Reproducibility Study. J Natl Cancer Inst. 1897-1906 (2013).
  11. Zlobec, I., Terracciano, L., Jass, J. R., Lugli, A. Value of staining intensity in the interpretation of immunohistochemistry for tumor markers in colorectal cancer. Virchows Arch. 451, 763-769 (2007).
  12. Zlobec, I., Koelzer, V. H., Dawson, H., Perren, A., Lugli, A. Next-generation tissue microarray (ngTMA) increases the quality of biomarker studies: an example using CD3, CD8, and CD45RO in the tumor microenvironment of six different solid tumor types. J Transl Med. 11, 104 (2013).
  13. Yoshida, A., et al. Immunohistochemical detection of ROS1 is useful for identifying ROS1 rearrangements in lung cancers. Mod Pathol. 711-720 (2014).
  14. Droeser, R., et al. Differential pattern and prognostic significance of CD4+, FOXP3+ and IL-17+ tumor infiltrating lymphocytes in ductal and lobular breast cancers. BMC Cancer. 12, 134 (2012).
  15. Fleischmann, A., et al. Androgen receptors are differentially expressed in Gleason patterns of prostate cancer and down-regulated in matched lymph node metastases. Prostate. 71, 453-460 (2011).
  16. Wang, T., et al. Pattern of breast cancer susceptibility gene 1 expression is a potential prognostic biomarker in resectable pancreatic ductal adenocarcinoma. Pancreas. 42, 977-982 (2013).
  17. Fleischmann, A., Rotzer, D., Seiler, R., Studer, U. E., Thalmann, G. N. Her2 amplification is significantly more frequent in lymph node metastases from urothelial bladder cancer than in the primary tumours. Eur Urol. 60, 350-357 (2011).
  18. Zhang, Z. Q., et al. Identification of Annexin A1 protein expression in human gastric adenocarcinoma using proteomics and tissue microarray. World J Gastroenterol. 19, 7795-7803 (2013).
  19. Chaux, A., et al. The epidermal growth factor receptor is frequently overexpressed in penile squamous cell carcinomas: a tissue microarray and digital image analysis study of 112 cases. Hum Pathol. 44, 2690-2695 (2013).
  20. McKenna, S. J., Amaral, T., Akbar, S., Jordan, L., Thompson, A. Immunohistochemical analysis of breast tissue microarray images using contextual classifiers. J Pathol Inform. 4, S13 (2013).
  21. Pages, F., et al. Effector memory T cells, early metastasis, and survival in colorectal cancer. N Engl J Med. 353, 2654-2666 (2005).
  22. Komiya, A., et al. Application of a new technique, spiral tissue microarrays constructed using needle biopsy specimens, to prostate cancer research. Int J Oncol. 44, 195-202 (2014).
  23. Quintayo, M. A., et al. Virtual tissue microarrays: A novel and viable approach to optimising tissue micro-arrays for biomarker research applied to Ductal Carcinoma in Situ (DCIS). Histopathology. 2-8 (2014).
  24. Torata, N., et al. Tissue tablet method: an efficient tissue banking procedure applicable to both molecular analysis and frozen tissue microarray. Hum Pathol. 45, 143-152 (2014).
Biyomarker Çalışmaları için bir sonraki nesil Doku Mikrodizi (ngTMA) Protokol
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zlobec, I., Suter, G., Perren, A., Lugli, A. A Next-generation Tissue Microarray (ngTMA) Protocol for Biomarker Studies. J. Vis. Exp. (91), e51893, doi:10.3791/51893 (2014).More

Zlobec, I., Suter, G., Perren, A., Lugli, A. A Next-generation Tissue Microarray (ngTMA) Protocol for Biomarker Studies. J. Vis. Exp. (91), e51893, doi:10.3791/51893 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter