Summary
نحن هنا وصف طريقة التلألؤ تحسين نقل الطاقة الرنين (انتقال البيئي بعيد المدى) حيث نقدم موقع البروتيني الانقسام بين المواقع fluorophore المانحة ومتقبل. هذا التعديل يسمح لنا للحصول على إشارات محددة انتقال البيئي بعيد المدى الناشئة عن بروتينات غشاء الفائدة، والسماح لدراسة البروتينات الغشاء دون تنقية البروتين.
Abstract
نقل التلألؤ الرنين الطاقة، أو انتقال البيئي بعيد المدى، هي تقنية قوية تستخدم لقياس المسافات بين موقعين في البروتينات ضمن نطاق مسافة 10-100 Å. عن طريق قياس المسافات تحت مختلف الظروف و ligated، والتغيرات متعلق بتكوين البروتين يمكن تقييمها بسهولة. مع انتقال البيئي بعيد المدى، وهو اللانثينيدات، التيربيوم في معظم الأحيان بالكلاب، ويستخدم في fluorophore المانحة، وتكفل مزايا مثل عمر أطول للمانحين الوحيد الانبعاثات، والمرونة في استخدام fluorophores المتقبلة متعددة، وفرصة للكشف عن انبعاث متقبل توعيتهم وسيلة سهلة لقياس نقل الطاقة دون التعرض لخطر أيضا الكشف عن إشارة المانحة الوحيد. هنا، نحن تصف طريقة لاستخدام انتقال البيئي بعيد المدى على بروتينات غشاء أعرب ويعاير على سطح خلايا الثدييات سليمة. ونحن نقدم موقع البروتيني الانقسام بين الزوج fluorophore انتقال البيئي بعيد المدى. بعد الحصول على إشارة انتقال البيئي بعيد المدى الأصلية، انشقاق في ذلك الموقع بإزالة الإشارة انتقال البيئي بعيد المدى محددة من البروتين لالفائدة مما يسمح لنا لطرح كميا في إشارة الخلفية التي تبقى بعد الانقسام. يسمح هذا الأسلوب لأكثر القياسات ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية لبذل دون الحاجة لتنقية البروتين.
Introduction
التلألؤ نقل الطاقة الرنين (انتقال البيئي بعيد المدى) هو مشتق من المعروف الإسفار الرنين نقل الطاقة (الحنق) تقنية 1. مماثلة لتأكل، انتقال البيئي بعيد المدى يمكن استخدامها لقياس المسافات والتغيرات المسافة بين المانحين ومتقبل fluorophores تعلق على مواقع محددة على البروتين من الفائدة ضمن نطاق 10-100 Å 1-3. مبادئ انتقال البيئي بعيد المدى هي أيضا مشابهة لالحنق في ذلك نقل الطاقة الرنين يحدث بين اثنين fluorophores القريبة عندما الطيف الانبعاثات من fluorophore المانحة يتداخل مع امتصاص الطيف من fluorophore المتقبلة. وترتبط كفاءة هذا النقل لبعد المسافة بين اثنين fluorophores بواسطة المعادلة التالية:
مكافئ. 1
حيث R هي المسافة بين اثنين fluorophores، E هو كفاءة ENنقل ergy، وR 0، ناقش أدناه، هو نصف قطر فورستر للزوج fluorophore، أي المسافة التي كفاءة النقل هي نصف القصوى. من هذه المعادلة، يمكن للمرء أن يرى أن يرتبط الكفاءة لحجم المسافة مرفوعة للقوة السادسة عكسية 1. هذا هو معكوس السادس الاعتماد السلطة التي تسمح للانتقال البيئي بعيد المدى الحنق والقياسات لتكون حساسة بشكل رائع حتى للتغيرات مسافة صغيرة عند قرب R 0 من الزوج الحنق. القدرة على تسمية المواقع على وجه التحديد المطلوب على بروتينات أو الجزيئات الأخرى يسمح لأحد للاستفادة من هذه الحساسية لرصد التغيرات متعلق بتكوين.
بالمقارنة مع الحنق، والذي يستخدم جزيئات الصبغة العضوية التقليدية، انتقال البيئي بعيد المدى يوفر مزايا إضافية. في انتقال البيئي بعيد المدى، بدلا من استخدام الصبغة العضوية مثل fluorophore المانحة، وهي الموجبة سلسلة اللانثينيدات، وعادة السل 3+ أو الاتحاد الأوروبي 3+، ويستخدم 1،4-6. Fluorophores التي تقع شالتانجو هذه الفئة، على سبيل المثال، التيربيوم كلاب، هي أيضا تنوعا للغاية لأنها يمكن استخدامها مع مجموعة واسعة من fluorophores المتقبلة. يتم إجراء هذه المرونة ممكنا لأن أطياف انبعاث اللانثينيدات بالكلاب تحتوي على عدة قمم الانبعاثات حادة، والسماح لنوع واحد من fluorophore المانحة ليتم استخدامها مع واحد من مجموعة واسعة من fluorophores المتقبلة. وبالتالي، يمكن الكشف عن الانبعاثات توعية متقبل دون أي خوف من تلوث تنزف من خلال من الانبعاثات المانحة 5. المجرب يختار متقبل محددة على أساس المسافة المتوقعة بين اثنين fluorophores (الشكل 1 والجدول 1). في هذه fluorophores اللانثينيدات بالكلاب، وبالكلاب الأيونات المعدنية بنسبة جزيء يحتوي على مجموعة الهوائي أن محسس اللانثينيدات عادة سيئة لامتصاص الإثارة فضلا عن مجموعة وظيفية bioreactive إلى حبل أيون إلى مجموعة وظيفية محددة على جزيء 1، 5،6. انسالبريد متحمس، اللانثينيدات الاسترخاء على ارض الدولة من خلال إطلاق الفوتونات مع معدل تسوس في نطاق ميلي ثانية واحدة. لأن تسوس ليست تخفيف القميص، إلى القميص ولا الاسترخاء الثلاثي، إلى القميص، انبعاث الفوتونات لا يمكن أن يسمى بشكل صحيح أو مضان تفسفر، ولكن أكثر وصفه بشكل صحيح التلألؤ 1. اضمحلال طويل من اللانثينيدات التلألؤ يساعد بشكل كبير في القياسات مدى الحياة. ويمكن بعد ذلك قياسات عمر استخدامها لتحديد كفاءة من خلال العلاقة التالية:
مكافئ. 2
حيث E هو كفاءة نقل، τ D هو عمر المانحة (اللانثينيدات بالكلاب) عندما لا تشارك في نقل الطاقة، وτ DA هو عمر المتبرع عند المشاركة في نقل الطاقة مع متقبل. مع انتقال البيئي بعيد المدى، يمكن τ DA اللهبحيث يتم قياسه وفقا لعمر الانبعاثات متقبل لتوعيتهم عمر التيربيوم هو اكبر من ذلك بكثير وfluorophore متقبل العضوية. ومتقبل تنبعث مع نفس العمر والتحريض على الإثارة (اللانثينيدات المانحة) لها، والمساهمة في أي عمر من عمر مضان الجوهرية الخاصة ومتقبل هي ضئيلة نسبيا. عن طريق قياس الانبعاثات توعية بدلا من الانبعاثات المانحة، ونحن أيضا قضاء على الحاجة إلى ضمان وضع العلامات في تمام نسبة 1: 1 من المانحين لالمتقبلة. يمكن بدلا من ذلك أن يكون المسمى البروتين في وقت واحد مع كل متقبل وfluorophores المانحة. وهناك سكان المسمى بتباين يؤدي، ولكن البروتينات المسمى المزدوج المانحة لا تنبعث في طول الموجة متقبل وسوف المزدوج متقبل البروتينات المسمى لا يكون متحمس. وعلاوة على ذلك، يجب أن تكون المسافة بين fluorophores نفسه، بغض النظر عن الموقع الذي السيستين تعلق fluorophore نظرا ل، وخاصة عند استخدام اللانثينيدات الخواص بمثابة المانحة، وبالتالي فإن نيد لتحديد موقع معين لتلقي إما الجهة المانحة أو متقبل غير ضروري. قد تتأثر كثافة مع السكان غير متجانسة، ولكن ينبغي أن يكون لا يزال أكثر من كافية ليتم الكشف.
عند تخطيط التجارب، ينبغي أملت اختيار fluorophores من قيمة R 0 من الزوج وكذلك نطاق مسافة المتوقع الذي يتم قياسه. يتم تعريف قيمة R 0 بواسطة المعادلة التالية:
مكافئ. 3
حيث R هو نصف قطر 0 فورستر في أنجسترومز، κ 2 هو عامل التوجه بين اثنين من الأصباغ (يفترض عادة أن يكون 2/3)، φ D هو العائد الكم من الجهات المانحة، J هو التداخل الطيفي يتجزأ بين المتبرع طيف الانبعاث والامتصاص الطيف متقبل في M - 1سم -1 4 نانومتر، و n هو معامل الانكسار من الوسط 1.
وقد أضاف لدينا المختبر تعديل لأسلوب انتقال البيئي بعيد المدى التقليدية عن طريق إدخال موقع الاعتراف البروتيني بين المواقع التسمية المانحة ومتقبل على البروتين يجري بحثها. هذا التعديل يسمح للتحقيق في النظم غير المنقى مثل خلايا الثدييات كلها 7. هذه التقنية مفيدة بشكل خاص عند استخدام cysteines كمواقع لوصفها، لأن في عملية وضع العلامات مع الأصباغ maleimide مترافق التي تربط لمجموعات سلفهيدريل السيستين، بروتينات أخرى على الخلايا التي وصفت أيضا cysteines. ومع ذلك، بما في ذلك مواقع الانقسام البروتيني على البروتين من الفائدة وقياس عمر قبل وبعد الانقسام، يمكن للمجرب طرح كميا في إشارة الخلفية بعد انشقاق الأنزيم البروتيني من إشارة الخام. هذا الطرح يعزل إشارة محددة تنشأ من البروتين من الفائدة (الشكللدى عودتهم 2). باستخدام التعديل المذكورة أعلاه، انتقال البيئي بعيد المدى يمكن استخدامها لقياس التغيرات المسافة بين المانحين التيربيوم كلاب والتحقيق متقبل على البروتين، وبالتالي رصد التغيرات متعلق بتكوين في الحالة الفسيولوجية القريب البروتين دون الحاجة لتنقية.
الرقم 1.The في امتصاص الأطياف وانبعاث التيربيوم بالكلاب باللون الأسود، بالإضافة إلى متقبل التمثيلي، اليكسا 488، في الحمراء. لاحظ قمم الانبعاثات متعددة وحادة، وضيق نطاق الانبعاثات لكل ذروة التيربيوم كلاب. هذا النمط يسمح للالتيربيوم ليتم استخدامها مع مجموعة متنوعة من fluorophores المتقبلة ويسهل قياس الانبعاثات توعيتهم ضمن هذه النطاقات حيث يظهر التيربيوم أي انبعاث. ذروة الانبعاثات التيربيوم لفي 486 نانومتر تتداخل بشكل جيد مع ل bsorption ذروة اليكسا 488، والسماح لنقل الطاقة الرنين تحدث بين اثنين fluorophores. والطول الموجي من 515 نانومتر هو خيار ممتاز لكشف الانبعاثات توعيتهم لهذا الزوج كما هو الحال في وادي بين قمم الانبعاثات التيربيوم، وجدا قرب اليكسا 488 في ذروة الانبعاثات من 520 نانومتر. لاحظ أنه يجري بالقرب من ذروة متقبل، على الرغم من المرغوب فيه، ليس مطلوبا-565 نانومتر لا يزال قادرا على كشف اليكسا 488 الانبعاثات أيضا دون الكشف عن الانبعاثات التيربيوم.
| fluorophore متقبل | R 0 (Å) | الانبعاثات الطول الموجي (نانومتر) |
| أتو 465 | 36 | 3PX؛ "> 508|
| فلوريسئين | 45 | 515 |
| الكسا 488 | 46 | 515 |
| الكسا 680 | 52 | 700 |
| الكسا 594 | 53 | 630 |
| الكسا 555 | 65 | 565 | 65 | 575 |
الجدول 1. قائمة fluorophores المتقبلة تستخدم عادة للانتقال البيئي بعيد المدى باستخدام كلاب التيربيوم كما المتبرع 11. تم قياس R 0 القيم عندما كانت تعلق على المانحة ومتقبل إلى ناهض نطاق ذوبان ملزم لمستقبلات أمبا. وهو مثالي لقياس قيمة R 0 مرة أخرى لكل نظام جديد قيد الدراسة.
الشكل 2. لمحة عامة عن طريقة انتقال البيئي بعيد المدى المعروضة. (A) ومستقبلات أمبا هو بروتين الغشاء الذي يخضع لتغيرات متعلق بتكوين عليه ملزم يجند. يجند ثنائية على شكل محارةوحلقت نطاق الاكتشاف هنا باللون الأحمر. (B) وجود المجال ملزم يجند من أمبا عندما لا بد أن البروتين في التشكل مفتوح (يسار). عندما بد أن يجند الغلوتامات، يغلق البروتين حول يجند لها (يمين). عن طريق وضع fluorophores في مواقع الثبوتية على الائتلاف الحزبي، يمكن أن ينظر إلى طبيعة هذا التغيير متعلق بتكوين والمسافة بين التغييرات fluorophores، والتي سوف ثم تؤثر مضان مدى الحياة. (C) عندما وصفها خلايا بأكملها، قد تحدث وسم كل من البروتين من الفائدة وكذلك بروتينات غشاء الخلفية (يسار). بعد انشقاق الأنزيم البروتيني، فإن إشارة انتقال البيئي بعيد المدى من البروتين من الفائدة تختفي بسبب الافراج عن جزء قابل للذوبان، وترك إشارة الخلفية سليمة (يمين). ويمكن بعد هذا إشارة الخلفية تطرح من إشارة الخام.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إنشاء تعبيد تحتوي على البروتين من الفائدة
استنساخ الجين التعبير عن بروتين من الفائدة الى ناقلات مناسبة. استخدام ناقلات مثل سلسلة pcDNA أو pRK5 كما هي مناسبة تماما للتعبير في أنظمة الثدييات مثل خلايا HEK293 وCHO.
2. حدد مواقع على البروتين أن يكون ذات الكلمات الدلالية مع Fluorophores
- اختيار مواقع العلامات التي تكون قادرة على تعكس التغيرات متعلق بتكوين الممكنة ضمن البروتين. إذا كان ذلك ممكنا، استخدام هيكل الكريستال من البروتين أو بروتين مماثل للمساعدة في جعل هذا القرار. إذا لم يكن هناك هيكل الكريستال المتاحة، استخدام البرمجيات على الانترنت للتنبؤ بنية ممكن من البروتين، وبالتالي الحصول على نظرة ثاقبة المواقع المناسبة.
- اختيار المخلفات بحيث سلاسل الجانب من بقايا المختارة هي السطح المعرض والوصول إلى fluorophores بحيث يمكن أن توصف البروتين.
- اختيار المخلفات التيليست حاسمة إلى وظيفة البروتين، على سبيل المثال المواقع التي لا تشترك في يجند ملزم.
- في إدخال طفرة السيستين، وإعطاء الأفضلية للمواقع التي تشبه، على سبيل المثال سيرين، التي من شأنها أن تتسبب في اضطراب الحد الأدنى للبنية البروتين.
- بعد اختيار المواقع وضع العلامات، وجعل الطفرات لضمان أن البروتين يعطي فقط من انتقال البيئي بعيد المدى هذه المواقع المقصودة. استخدام بروتوكولات الطفرات الموجهة الموقع قياسية لتتحول بعيدا cysteines المستعبدين غير ثاني كبريتيد التي يحتمل أن ربط maleimide-مترافق علامات الفلورسنت. لا يتحور بعيدا cysteines المستعبدين ثاني كبريتيد ودفن، cysteines الحرة لأنها لا ينبغي أن تتفاعل مع الأصباغ الفلورية في شكل مطوية من البروتين.
- إدخال بقايا السيستين في المواقع المطلوبة عن طريق الطفرات نقطة باستخدام بروتوكولات الطفرات الموجهة الموقع القياسية.
- يتضمن الموقع الانقسام البروتيني الذي يمكن أن يلتصق على وجه التحديد مرة واحدة من cysteines من البروتين. إذا كانتسلسل البروتين يسمح لذلك، ويعرض الموقع تحور متحفظ البروتين أن يكون الثرومبين (LVPRGS تسلسل الاعتراف) أو عامل شى (IDGR تسلسل الاعتراف أو IEGR) تسلسل بالقرب من السيستين وأدخلت في متناول البروتيني الانقسام. وإلا فإن تسلسل رباعي أو سداسي الببتيد يمكن إدراجها ككل. اختيار الموقع مثل أنه عند انشقاق أحد cysteines قدم تنأى عن بقية من البروتين في بعض الحالات، وهذا قد يتطلب موقعين الانقسام المرافقة السيستين تحور.
3. اختبار التعبير وظيفة البروتين
- إجراء طخة غربية لتأكيد التعبير عن البروتين تحور.
- إجراء الفحص الوظيفي للبروتين لضمان أن الطفرات غيرت وظيفة البروتين الحد الأدنى فقط، على كل حال، لتجنب دراسة التغيرات متعلق بتكوين بروتين مختلة.
ملاحظة: بما أن جميع بروتينات لها وظائف مختلفة، و ليس هناك واحدة فحص unctional التي تستخدم خصيصا للانتقال البيئي بعيد المدى. ومع ذلك، بعض الأمثلة من المقايسات الفنية وتشمل فحوصات انزيم النشاط للإنزيمات، المقايسات ملزم لمستقبلات يجند، والدراسات الكهربية لقنوات أيون.
4. حدد Fluorophores لاستخدامها
اختر fluorophores على أساس نطاق مسافة المتوقع أن قياس بحيث يكون النطاق بين 0.5-1x وR 0 للزوج fluorophore.
ملاحظة: هذا يسمح لالطرح أسهل من الخلفية، التي لديها عادة أعمار أطول بكثير. على سبيل المثال، إذا كان نطاق مسافة المتوقع الذي يتم قياسه حوالي 35 Å، زوج fluorophore المناسب لاستخدام كلاب سيكون التيربيوم والجهات المانحة واليكسا 594 باعتبارها متقبل، لأن R 0 لهذا الزوج هو 53 Å (الجدول 1).
5. التعبير عن البروتين عليها بنقل عابر المبلغ المطلوب من خلايا الثدييات
ntent "> عابر بالنقل البروتين من الفائدة في خلايا الثدييات المختارة باستخدام أي من الكواشف ترنسفكأيشن المشتركة عادة، استخدام أربعة أطباق 10 سم في تجربة انتقال البيئي بعيد المدى للخطوط الخلايا كلوة وCHO؛ ومع ذلك، قد تختلف هذه الكمية حسب تعبير البروتين والاستقرار، الخ. السماح للخلايا للتعبير عن البروتين ل36-48 ساعة قبل الحصاد.6. تسمية البروتينات
- فصل الخلايا من صحن الثقافة. فصل الخلايا HEK ببساطة عن طريق pipetting لعازلة ضد قاع الطبق. فصل خلايا CHO مع مكشطة الخلية، وغسل من وسائل الإعلام مع العازلة خارج الخلية.
- جمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 1100 x ج لمدة 3 دقائق. استخدام هذه الإعدادات نفس الطرد المركزي لجمع الخلايا بعد وضع العلامات، وكذلك بعد يغسل اللاحقة.
- تعليق الخلايا في 3 مل من العازلة خارج الخلية، ثم يضاف fluorophores المانحة ومتقبل بكميات متساوي المولية يصل إلى تركيز النهائي من 100-300 نانومتر. على احتضان و المدورةأو 1 ساعة على RT.
- غسل هذه الخلايا المسمى 3-4x مع العازلة خارج الخلية لإزالة fluorophores غير منضم، ثم تعلق هذه الخلايا في المخزن خارج الخلية (عادة 2 مل) لقياس انتقال البيئي بعيد المدى.
- كعنصر تحكم، تسمية مجموعة منفصلة من الخلايا مع fluorophore المانحة الوحيد (التيربيوم كلاب) من دون إضافة أي fluorophore المتقبلة.
ملاحظة: البيانات من هذه التجارب الجهات المانحة الوحيد هو ضروري لاستكمال التحليل. هذه التجارب يمكن القيام به على نفس أو مختلفة أيام. - مرة أخرى، إجراء التحقق من الصحة الوظيفية، وهذه المرة مع البروتين المسمى متحولة، وعملية وضع العلامات قد تتداخل أيضا مع وظيفة اعتمادا على الموقع تستخدم لوضع العلامات.
ملاحظة: هذه التجارب يمكن القيام به على نفس أو مختلفة أيام.
7. إعداد تجربة انتقال البيئي بعيد المدى
- وضع الخلايا معلق في كوفيت الكوارتز مع الحد الأدنى من حجم 1 مل.
- قم بتشغيل الكمبيوتر والصك وضبط المعلمات من داتبرنامج الاستحواذ وفقا لذلك.
- تعيين الطول الموجي الإثارة إلى مجموعة الامتصاصية من fluorophore المانحة (330-340 نانومتر يعمل بشكل جيد لالتيربيوم كلاب).
- تعيين الطول الموجي الانبعاثات بشكل مناسب، مع الأخذ في الاعتبار أن الانبعاثات متقبل يختلف على أساس متقبل المستخدمة. الأهم من ذلك، تحديد الطول الموجي الكشف الذي يقيس فقط الانبعاثات ومتقبل لا يتضمن أي تنزف من خلال الانبعاثات من المتبرع. على سبيل المثال، استخدام الطول الموجي من 565 نانومتر لترتيب 555 على أنه متقبل الجدول 1. لقياسات المانحة الوحيدة، التي وصفت البروتين فقط مع الجهات المانحة ولكن من دون متقبل، واستخدام الطول الموجي من 545 نانومتر لقياس الانبعاثات التيربيوم كلاب.
- تعيين طول الكشف عن الانبعاثات أن تكون على الأقل ثلاثة أضعاف العمر المتوقع انتقال البيئي بعيد المدى لضمان أنه لن يتم غاب عنصر العمر الطويل.
- إجراء المسح الضوئي. لا يقل عن ثلاثة بالاشعة من 99 الاحتلالات لضمان اتساق النتائج. حفظ عشرالنتائج البريد كملف نصي (* النص).
- لقياس التغيرات متعلق بتكوين جزئي من البروتين بالنسبة لظروف مختلفة (مثل إضافة يجند)، تغيير تلك الشروط مرة أخرى وأداء لا يقل عن ثلاثة بالاشعة من 99 الاحتلالات كل على نفس العينة تحت هذا الشرط جديدة. إذا دراسة آثار الغلوتامات على التشكل من مستقبلات الغلوتامات، على سبيل المثال، إضافة الغلوتامات إلى 1 ملم لنفس العينة الممسوحة ضوئيا في الخطوة 7.3، ثم مسح مرة أخرى.
- تضيف ما يصل الى خمس وحدات من البروتيني المناسب واتخاذ اجراء الفحوصات باستمرار حتى اكتمال الانقسام ويعتبر أي تغيير آخر في حياة لمدة ثلاثة بمسح المتعاقبة. عادة، انشقاق كاملة في غضون سنتين أو 3 ساعة. إذا كان يتم استخدامها لالبروتيني الانقسام وعامل شى الموقع الانقسام، على سبيل المثال، إضافة 3 ميكرولتر من عامل شى لعينة، ومسح كل 30 دقيقة لمدة 3 ساعة.
8. تحليل البيانات التي يتم الحصول عليها
- فتح برامج تحليل البيانات.
- تحميل عمر مضاناستيراد البيانات باستخدام ASCII لفتح ملفات نصية. تحميل جميع مكررات وكذلك القياسات خلفية النهائية، في ملف واحد.
- متوسط البيانات من جميع بالاشعة لكل حالة تجريبية للحصول على البيانات النهائية. للقيام بذلك، تسليط الضوء على الأعمدة التي تحتوي على التجارب الفردية، ثم ضمن القائمة بيانات في شريط القوائم، انقر على إحصاءات عن الصفوف لعرض متوسط كثافة مضان من المحاكمات، فضلا عن الانحراف المعياري والخطأ المعياري.
- رسم متوسط القيم كما رسم خط مع كثافة مضان على المحور Y وعمرها في ميكروثانية على المحور السيني لخلق منحنى الذي يمثل عمر الانبعاثات توعية للمتقبل. تغيير Y-محور المؤامرة على نطاق السجل، للسماح التصور أفضل من البيانات.
- كرر الخطوة 8.3 على بيانات القياس الخلفية، بمتوسط المسح النهائية التي تظهر التداخل يشير انشقاق كامل.
- عرض البيانات على خلفية متوسطنفس المؤامرة التي تحتوي على البيانات الخام المتوسط. للقيام بذلك، افتح مربع الحوار التحكم في طبقة وجدت ضمن القائمة الأرض. ثم، نقل البيانات التي تحتوي على خلفية يعني في قائمة المحتويات طبقة.
- محاذاة البيانات الأساسية يعني أن البيانات الخام يعني. للقيام بذلك، استخدم الدالة الرياضيات بسيطة ضمن القائمة الرياضيات للضرب أو تقسيم البيانات الأساسية حسب الحاجة حتى نهاية الذيل من الخلفية تتداخل مع نهاية الذيل من البيانات الخام.
ملاحظة: عند هذه نهاية الذيل، وعمر من البروتين من الفائدة يجب أن يكون بالفعل التهاوي تماما بعيدا؛ ما هو الانحياز هو ببساطة الخلفية إشارة الحالي قبل وبعد البروتيني الانقسام كليهما. - طرح إشارة الخلفية الانحياز من الخام الأولية إشارة انتقال البيئي بعيد المدى، ومرة أخرى باستخدام وظيفة الرياضيات بسيطة.
- تناسب البيانات إلى الاضمحلال الأسي (exponentials واحدة أو متعددة، اعتمادا على المواقع والتصميم التجريبي).
- تعيين حدود بداية لالمناسب لتبدأ بعد نهايةمن نبضة ليزر. استخدام هذا startpoint نفسها لجميع التجهيزات منحنى اللاحقة.
- في مربع الحوار وظيفة تركيب اختر، اختر الاضمحلال الأسي وذلك لتناسب عمر للمعادلة التالية لالاضمحلال الأسي واحد:
مكافئ. 4
حيث Y يمثل كثافة مضان، ذ 0 يمثل كثافة الخلفية بسبب الضوضاء من النظام، و 1 هو كثافة إشارة، تي هو عمر مضان، x هو الوقت، و x 0 هي المرة الإزاحة. - إصلاح س 0-0، بدء تركيب وظيفة، واحتواء البيانات.
ملاحظة: إذا تم تصميم التجربة أن يكون إشارة فقط من زوج واحد من المواقع، وينبغي أن تكون البيانات الناتجة تناسب بسهولة عن طريق الاضمحلال الأسي واحد 8. المتبقي من يصلح هو طريقة جيدة لتحديد الخير من يصلح وإذا أعمار تسوس هي اشتراطات إضافيةأد.
- استخدام أعمار الحصول عليها من البيانات لحساب المسافة بين fluorophores باستخدام معادلة فورستر (إعادة ترتيب المعادلات 1 و 2 أعلاه):
مكافئ. 5
ملاحظة: جميع المتغيرات هي على النحو المذكور أعلاه مع τ DA بعد أن تم قياسه وفقا لتوعيتهم عمر الانبعاثات المتقبلة. مزيد من التفاصيل والأمثلة على قياسات R 0 و R يمكن العثور عليها في أي مكان آخر 7،9،10. - تكرار التجربة وتحليل البيانات ثلاث مرات على الأقل لضمان التكاثر. التناقض بين التكرار الفردية من نفس قياس يدعو إلى التشكيك في صحة البيانات؛ استخدام التجارب تحكم إضافية أو التكرار. حساب الأخطاء في القياس باستخدام المجانية غوستافوس تحليل خطأ حاسبة (التي وضعها الدكتور توماس هوبر) أو نظام مماثل التي تنتشر الخطأ فييناسب من العمر.
مكافئ. 4 
مكافئ. 5 Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
مقياس انتقال البيئي بعيد المدى الناجح مع المانحين اللانثينيدات ينبغي أن يكون المتبرع مدى الحياة إلا في نطاق الوقت ميلي ثانية واحدة. فإن عمر الانبعاثات انتقال البيئي بعيد المدى لتوعيتهم البروتين المسمى مع كل من الجهات المانحة ومتقبل يكون أبرزها أقصر، مع عمر في نطاق ميكروثانية بعد الطرح خلفية الشكل 3. البروتيني نتائج الانقسام إلى زيادة في العمر التي يجب أن تصبح مستقرة على مر الزمن ( أي لم يعد تغيير)، وتبين أن الانقسام البروتيني اكتمال الشكل 4. إذا كانت الإشارة انتقال البيئي بعيد المدى يأتي من مجموعة واحدة فقط من المواقع، فينبغي عمر الانبعاثات الناتجة بعد الطرح الخلفية تعطي عمر الأسي واحد.
عند قياس التغييرات متعلق بتكوين، ينبغي للانتقال البيئي بعيد المدى إشارة محددة تظهر تغييرا في حياته خارج خطأ القياس الشكل 3. يمكن احتساب خطأ القياس من انتشار الخطأق المرتبطة يصلح للأعمار. بعد تركيب البيانات إلى الحد الأدنى لعدد الوظائف الاضمحلال الأسي وصفها في المعادلة 4، عمر، τ، يمكن تحديده. باستخدام المعادلة 5، للمتقبل المانحة والجهات المانحة أعمار الوحيد يمكن استخدامها جنبا إلى جنب مع قيمة R 0 للزوج انتقال البيئي بعيد المدى لحساب المسافة بين اثنين fluorophores وفقا للشروط التي تم اختبارها. المتعلقة التغيير المسافة الناتجة من تغيير هذه الشروط إلى الهيكل العام ووظيفة البروتين هو الآن مهمة المجرب.
الرقم 3. قياسات انتقال البيئي بعيد المدى من 1A ايون القناة حمض الاستشعار (ASIC1a). وقد تآمر كثافة مضان على مقياس لوغاريتمي لتحسين سهولة التفسير البصري. (أ) تظهر عينات المانحين الوحيد ل-exponentia احدل الاضمحلال الذي لا يتغير مع درجة الحموضة. (ب) في عينات المسمى المانحين متقبل، ويعتبر انخفاضا في عمر الانبعاثات توعيتهم على انخفاض في درجة الحموضة 8-6 (الأسود إلى الأحمر). يشير هذا الانخفاض إلى انخفاض مدى الحياة في المسافة بين إصبع الإبهام ومجالات ASIC1a. تم تعديل هذا الرقم من راماسوامي، وآخرون 2013 8.
الرقم 4. تأثير الطرح الخلفية على قياسات انتقال البيئي بعيد المدى المحرز في 1A ايون القناة حمض الاستشعار (ASIC1a). المواقع ليكون المسمى تحديدا تكون مفصولة موقع البروتيني انشقاق fluorophores. بعد إجراء قياسات انتقال البيئي بعيد المدى، وقدم البروتيني للعينة البروتين وانقسام لاحق من البروتين النتائج الفائدة إلى فقدان إشارة محددة. أي انتقال البيئي بعيد المدى الذي يبقىغير مضان الخلفية من fluorophores بد أن cysteines الآخرين موجودة على بروتينات غشاء الأخرى. طرح هذه الخلفية تعزل البيانات الحقيقية انتقال البيئي بعيد المدى للبروتين من الفائدة. تم تعديل هذا الرقم من راماسوامي، وآخرون 2013 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
انتقال البيئي بعيد المدى هي تقنية قوية تسمح للعلماء بقياس المسافات بين المجالات داخل بروتين واحد وكذلك بين مفارز في بروتين multimeric. على هذا النحو، ومناسبة تماما انتقال البيئي بعيد المدى لدراسة التغييرات وديناميكية بتكوين جزئي للبروتينات أو الجزيئات الأخرى. بروتوكول أعلاه ينبغي أن يسمح للمختبر مجهز بشكل مناسب لاختبار فرضياتهم بسهولة. ومع ذلك، هناك العديد من مصادر مشتركة من الخطأ التي قد يعاني منها المحقق الجديد. إذا رأيت القليل أو أي إشارة انتقال البيئي بعيد المدى، أولا التحقق من إعدادات طول الموجة المستخدمة. يجب أن تكون الإثارة في نطاق امتصاص التيربيوم (330-340 نانومتر). فقط القياسات المانحة، التي تم المسمى عينة فقط مع fluorophore المانحة ودون fluorophore متقبل، يجب أن يكون الطول الموجي الانبعاثات في واحدة من قمم هو مبين في الشكل 1، في حين لقياسات المانحين متقبل، ينبغي أن الطول الموجي الانبعاثات تطابق fluorophore متقبل تستخدم الجدول 1. إذا كان waveleإعدادات ngth صحيحة، والتحقق من توافق المخازن المؤقتة. قد لا تكون بعض fluorophores متوافق مع بعض مخازن أو في نطاقات معينة ودرجة الحموضة. بعد ذلك، تأكد من أن اختيار المخلفات وfluorophores متوافقة. إذا كان التصميم التجريبي هو الصحيح تماما، ثم المشكلة تكمن على الأرجح إما مع fluorophores أو البروتين نفسه. مع مرور الوقت، حلول المخزون من fluorophores قد تتحلل ويمكن أن يؤدي إلى عدم كفاية العلامات. أخيرا، تحقق التعبير وظيفة البروتين. تم إضافة العديد من الطفرات، بما في ذلك إدخال cysteines، وإزالة cysteines الأصلي، وإدخال واحد على الأقل موقع البروتيني الانقسام. وبالتالي، فمن الممكن أنه حتى في ظل ظروف ترنسفكأيشن العادية، والطفرات أدخلت زعزعة استقرار البروتين والسبب في إطار التعبير عن البروتين من الفائدة، وتخفيض إشارة رأيت. إذا أعرب، والطفرات أو وضع العلامات قد يسبب تمسخ من البروتين، مما تسبب في بقايا لتوضع بشكل مختلفمن المسافات المتوقعة ينظر في البرية من نوع البروتين. البقع الغربية يمكن استخدامها للتحقق من التعبير عن بروتين. إذا كان هناك أي سؤال حول الاتجار بروتين غشاء السطح، biotinylation من سطح الخلية والمنسدلة من البروتينات السطحية المعرضة لل، تليها طخة غربية للبروتين من الفائدة، وسوف تظهر على وجه التحديد الاتجار السطح. للاختبارات وظيفية، لا يوجد فحص واحد أن يوصي للاستخدام على وجه التحديد مع انتقال البيئي بعيد المدى، منذ انتقال البيئي بعيد المدى يمكن استخدامها في مجموعة واسعة من أنواع البروتين. على الرغم مرة أخرى، والأمثلة الممكنة من المقايسات الفنية وتشمل فحوصات انزيم النشاط، المقايسات ملزم يجند، والدراسات الكهربية. إذا التعبير أو وظيفة البروتين تأثر سلبا أيضا عن طريق الطفرات قدم، ثم يجب اختيار مواقع وضع العلامات الجديدة.
إذا رأيت إشارة انتقال البيئي بعيد المدى ولكن لا يمكن تركيبها من قبل الأسي واحد عندما يتوقع مثل هذه النتيجة، الاختيار الأول أن الخلفية تم طرح بشكل صحيح. إذا، AFثالثا الطرح، وينظر الاضمحلال الأسي متعددة، وهذا يمكن أن يكون إشارة مؤشرا على انتقال البيئي بعيد المدى يجري الاحتفال من التفاعلات متعددة بخلاف ما كان يقصد. تحقق للتأكد من أن يتم نقل جميع cysteines الوصول آخرين من البروتين. إذا كان التركيب البلوري هو متاح، وسوف يكون أداة مفيدة جدا للتحقق من هذه cysteines. مرة أخرى، العبودي ثاني كبريتيد ودفن، لا تحتاج cysteines قابلة للوصول إلى أن تحور بعيدا. لاختبار عدم إمكانية الوصول إلى هذه cysteines إذا كان هناك سبب مقنع لا يتحور بها بعيدا، وأعرض واحدة السيستين غير الأصلية في البروتين وضمان عدم وجود أي إشارة انتقال البيئي بعيد المدى في عينة المسمى المانحين متقبل. إذا كان قد تم بالفعل تحور كل cysteines الوصول بعيدا، وإذا كان لديه البروتين مفارز متعددة أو هو جزء من مجمع، ثم قد يكون هناك إشارة انتقال البيئي بعيد المدى الخلط بسبب صبغ ربط لتلك البروتينات أو مفارز القريبة. اختيار موقع مختلف البروتيني الانقسام قد يساعد مع هذه المشاكل؛ خلاف ذلك، وغيرها من العلامات الموقعق قد تحتاج إلى المختار. وأخيرا، إذا كانت المشكلة مع تركيب هي مجرد مسألة إشارة إلى الضجيج، فإن المشكلة المحتملة هي بسبب التعبير منخفضة من البروتين. والتعبير ثم تحتاج إلى أن يكون الأمثل من خلال الظروف ترنسفكأيشن مختلفة، ناقل مختلفة، الخ.
إذا القياسات انتقال البيئي بعيد المدى تنتج نتيجة الشاذة أو التي تبدو لا معنى لها جسديا، قد تكون هناك قضايا بروتين معين قد لا يكون واضحا بسهولة. على سبيل المثال، مع القنوات الأيونية الاستشعار الحمضي، وحتى إضافة الدقيق للحمض لتغيير درجة الحموضة قد يتسبب في بعض موت الخلايا والبروتين تمسخ. وبالتالي، يتعين على عينات متعددة لتكون على استعداد، واحد لكل درجة الحموضة لفحصها. أيضا، بالإضافة إلى نقل الطاقة الرنين، يمكن أن تؤثر التغييرات البيئة المحلية إشارة مضان. مثل هذا التغيير، إذا دلالة، فإن الإشارة في قياس المانحة الوحيد والاضمحلال المزدوج أو المتعدد الأسي. في هذه الحالات، تحتاج مواقع العلامات يمكن نقلها إلى مواقع مختلفة لمأك من أن التغيير في ظروف لا يغير الخصائص الطيفية للfluorophores.
حتى مع الحفاظ على هذه المصادر من المشاكل في الاعتبار، هناك بعض المحاذير والقيود على انتقال البيئي بعيد المدى من الذي يجب أن يكون على علم المجرب. تعتمد الأولى، تقنية وضع العلامات التقليدية على بقايا السيستين وضع العلامات. للحد من العلامات المخلفات غير محددة، عادة ما تحور cysteines الآخرين بها؛ ومع ذلك، وهذه الطريقة ليست عملية دائما. على سبيل المثال، إذا كان لديه الكثير من البروتين cysteines المستعبدين غير الناطقين ثاني كبريتيد هيكلها ذات الأهمية الحاسمة لبنية البروتين أو وظيفة، ثم تحور بها سيكون مستحيلا، زيادة كبيرة في الحد من هذه التقنية وتفسير البيانات. أيضا، هذه التقنية انتقال البيئي بعيد المدى هي أكثر ملاءمة للكشف عن تغيرات في المسافة، بدلا من مسافات المطلقة، لأن أي أخطاء على مسافة المطلقة بسبب تأثير عامل التوجه κ 2 على قيمة R 0 من المرجحأن تنخفض في تحليل تغير المسافة بسبب هذه الأخطاء تؤثر القياسات تحت كل الظروف على حد سواء. تقنيات بديلة يمكن القيام به للتغلب على بعض هذه القيود. على سبيل المثال، لتجنب إضافة الكثير من cysteines، يمكن للمرء أن يضعوا على صاحب العلامة وتسميته مع fluorophore بد أن النيكل NTA. أيضا، tryptophans الأم يمكن استخدام واحدة من fluorophores على أساس أن إذا ما استخدمت بوصفها المانحة، tryptophans لها عمر أصغر بكثير من التيربيوم، وبالتالي قد تكون قياسات كثافة استنادا أكثر ملاءمة من القياسات مدى الحياة. إذا كانت هناك حاجة إلى المزيد من الذرة الدقيقة مسافات ذرة، تقنيات مثل البلورات بالأشعة السينية، وديناميات الجزيئية، أو NMR لا تزال تقنيات أكثر ملاءمة للحصول على هذه المسافات المطلقة.
نظرا لحساسيتها رائعة إلى النأي التغييرات، يمكن قياس التغيرات انتقال البيئي بعيد المدى المسافة لقرار على مستوى أنجستروم للبروتينات حل المرحلة ويمكن أن توفر بيانات تجريبية دون الحاجة لارتفاع بوري-تاي، والعلامات النظائر أو تقييد الحجم الذي يضعف كلا NMR والديناميات الجزيئية. بعد التعلم واتقان هذه التقنية، الامتحانات إلى تغييرات متعلق بتكوين البروتينات يمكن أن يتم بشكل أسرع وأكثر سهولة مع من التقنيات التقليدية المتاحة بالفعل. كما يوفر انتقال البيئي بعيد المدى أساسا ممتازا للتقنيات نقل الطاقة الرنين مزيد المتخصصة مثل الحنق جزيء واحد (smFRET)، والتي يمكن دراسة التوزيع السكاني للدول بتكوين جزئي من الجزيئات الفردية، بدلا من المعدل الفرقة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح GM094246، وجمعية القلب الأميركية غرانت 11GRNT7890004، ومؤسسة العلوم الوطنية غرانت MCB-1110501.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LanthaScreen Thiol Reactive Tb Chelate | Life Technologies | PV3579 | |
| Acceptor fluorophore-Fluorescein-5-Maleimide | Life Technologies | F-150 | Choice of acceptor depends on the specific experiment |
| Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 488 C5 Maleimide | Life Technologies | A-10254 | Choice of acceptor depends on the specific experiment |
| Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 555 C2 Maleimide | Life Technologies | A-20346 | Choice of acceptor depends on the specific experiment |
| Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 594 C5 Maleimide | Life Technologies | A-10256 | Choice of acceptor depends on the specific experiment |
| Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 680 C2 Maleimide | Life Technologies | A-20344 | Choice of acceptor depends on the specific experiment |
| QuantaMaster 3-SS | Photon Technology International | Spectrofluorometer should have pulsed excitation with the ability to measure lifetimes in the millisecond range | |
| FluoreScan 2.0 | Photon Technology International | Data Acquisition Software used in manuscript. Software provided with fluorescence instrument | |
| Origin 8.6 | OriginLab | Origin is the data analysis software used in protocol. Can use other similar data analysis software | |
| Quartz cuvette | Starna Cells, Inc | 3-Q-10 | |
| Stir bar | Bel-Art Products | F37119-0007 | Used in cuvette to keep cells in suspension. Can use any stir bar that fits the cuvette |
References
- Selvin, P. R. Principles and biophysical applications of lanthanide-based probes. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 31, 275-302 (2002).
- Stryer, L., Haugland, R. P. Energy transfer: a spectroscopic ruler. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 58, 719-726 (1967).
- Stryer, L. Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler. Annual Review of Biochemistry. 47, 819-846 (1978).
- Selvin, P. R., Hearst, J. E. Luminescence energy transfer using a terbium chelate: improvements on fluorescence energy transfer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 10024-10028 (1994).
- Chen, J., Selvin, P. R. Thiol-reactive luminescent chelates of terbium and europium. Bioconjugate Chemistry. 10, 311-315 (1999).
- Ge, P., Selvin, P. R. Thiol-reactive luminescent lanthanide chelates: part 2. Bioconjugate Chemistry. 14, 870-876 (2003).
- Gonzalez, J., Rambhadran, A., Du, M., Jayaraman, V. LRET investigations of conformational changes in the ligand binding domain of a functional AMPA receptor. Biochemistry. 47, 10027-10032 (2008).
- Ramaswamy, S. S., Maclean, D. M., Gorfe, A. A., Jayaraman, V. Proton mediated conformational changes in an Acid Sensing Ion Channel. J. Bio. Chem. 288, (2013).
- Rambhadran, A., Gonzalez, J., Jayaraman, V. Conformational changes at the agonist binding domain of the N-methyl-D-aspartic acid receptor. The Journal of Biological Chemistry. 286, 16953-16957 (2011).
- Rambhadran, A., Gonzalez, J., Jayaraman, V. Subunit arrangement in N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors. The Journal of Biological Chemistry. 285, 15296-15301 (2010).
- Kokko, T., Kokko, L., Soukka, T. Terbium(III) chelate as an efficient donor for multiple-wavelength fluorescent acceptors. Journal of Fluorescence. 19, 159-164 (2009).
