Свечение резонанс переноса энергии по изучению конформационных изменений мембранных белков выражается в клетках млекопитающих

Summary

Мы описываем здесь метод улучшить перевод люминесценция резонансной энергии (LRET), где мы вводим сайт расщепления протеазой между донором и акцептором флуорофорных сайтов. Эта модификация позволяет получить конкретные LRET сигналы, связанные с мембранными белками интересов, что позволяет для изучения мембранных белков без очистки белка.

Abstract

Свечение Резонанс Передача энергии, или LRET, является мощным средством для измерения расстояния между двумя узлами в белках в диапазоне расстояний 10-100 Å. Измеряя расстояния при различных лигированных условиях, конформационные изменения белка можно легко оценить. С LRET, лантанида, чаще всего в хелатной тербия, используется в качестве доноров флуорофором, предоставляя преимущества, такие как более длительный срок службы донорами только эмиссии, гибкость в использовании нескольких флуорофоры акцепторные, и возможность выявления сенсибилизированную эмиссию акцепторный как легкий способ для измерения перенос энергии без риска также обнаружения доноров только сигнал. Здесь мы описываем способ, чтобы использовать LRET на мембранных белков, экспрессированных и анализировали на поверхности интактных клетках млекопитающих. Введем сайт расщепления протеазой между флуорофором пары LRET. После получения исходного сигнала LRET, расщепление в этом сайте удаляет конкретный LRET сигнал от белкаИнтерес позволяет нам количественно вычесть фоновый сигнал, который остается после расщепления. Этот способ позволяет более физиологически соответствующие измерения быть сделаны без необходимости очистки белка.

Introduction

Свечение Резонанс Передача энергии (LRET) является производным от известный флуоресцентного резонанса Передача энергии (FRET) техники ^1. Похожие беспокоиться, LRET могут быть использованы для измерения расстояний и изменения расстояния между донором и акцептором флуорофорами прикрепленных к определенным сайтам на интересующего белка в диапазоне 10-100 Å ^1-3. Принципы LRET также похожи на FRET в этом резонансный перенос энергии происходит между двумя проксимальных флуорофорами когда спектр излучения донора флуорофором перекрывает со спектром поглощения акцептора флуорофора. Эффективность этой передачи связано с расстоянием между двумя флуорофоров с помощью следующего уравнения:

Уравнение. 1

где R является расстояние между двумя флуорофорами, E является эффективность ангия передачи, и R _0, обсуждается ниже, радиус Ферстер для пары флуорофором, т.е. расстояние, на котором эффективность переноса является полумаксимальную. Из этого уравнения, можно видеть, что эффективность будет зависеть от величины расстояния возведенного в обратной шестой степени ^1. Именно эта обратная шестой степенная зависимость, что позволяет рвать и измерений LRET быть чрезвычайно чувствительны даже к небольшим изменениям расстояния, когда рядом с R ₀ пары FRET. Возможность специально маркировать нужные сайты на белков или других макромолекул позволяет воспользоваться этой чувствительности для контроля конформационные изменения.

По сравнению с FRET, который использует обычные молекул органических красителей, LRET предлагает дополнительные преимущества. В LRET, вместо использования органического красителя, как доноров флуорофором, лантаноид серии катиона, как правило, Tb ^{3 +} или Eu ^{3 +,} используется ^1,4-6. Флуорофоры которые попадают UNDER этой категории, например, хелат тербия, также очень универсальным в том, что они могут быть использованы с широким диапазоном акцепторных флуорофоров. Эта гибкость стало возможным потому, что спектры излучения хелатных лантаноидов содержать несколько острых пиков выбросов, что позволяет в течение одного вида донора флуорофора, которые будут использоваться с одним из самых разнообразных акцепторных флуорофоров. Таким образом, сенсибилизированные выбросов акцептор может быть обнаружен, не опасаясь загрязнения проступание от излучения донора ^5. Экспериментатор выбирает определенную акцептор на основе ожидаемого расстояния между двумя флуорофорами (рисунок 1 и таблица 1). В этих хелатных лантанидов флуорофоров, ион металла хелатные молекулой, которая содержит группу антенн, что повышает чувствительность обычно плохо поглощающие лантаноид возбуждению, а в качестве функциональной группы bioreactive троса ион с конкретной функциональной группы на макромолекулы ^{1, 5,6.} Oncэ рады, лантаноиды расслабиться в основное состояние с помощью выпуска фотонов со скоростью распада в диапазоне миллисекунд. Потому что распад не является ни релаксации синглетного к-синглет, ни релаксации триплет-на-синглет, излучение фотонов может не правильнее было бы назвать флуоресценции или фосфоресценции, но более правильно называть свечение ^1. Длинная распад лантаноида люминесценции сильно помогает в измерение времени жизни. Измерение времени жизни, то можно использовать для определения эффективности по следующим соотношением:

Уравнение. 2

где, E является эффективность передачи, τ _D является время жизни донора (хелатные лантанидов), когда не участвующем в передаче энергии, и τ _DA время жизни донора при участии в передаче энергии с акцептором. С LRET, τ _DA может альтак быть измерена как время жизни сенсибилизированной эмиссии акцепторной потому срок службы тербия является настолько больше органического акцептора флуорофора. Акцептор излучает с той же жизни, как ее разжигание возбуждения (донора лантаноидов), и любой вклад в жизни от собственной жизни собственной флуоресценции акцептора относительно незначительным. Измеряя сенсибилизированный излучению, а не излучения донора, мы также устранить необходимость обеспечения маркировки ровно в соотношении 1: 1 донора к акцептору. Белок может быть вместо этого помечены одновременно с обеих акцептора и доноров флуорофорами. Гетерогенно помечены населения приведет, но дважды доноры меченые белки не издаст в волны акцепторной и дважды акцепторные меченые белки не будут рады. Кроме того, расстояние между флуорофоров должны быть одинаковыми, независимо от цистеина-сайт с учетом флуорофор придает, особенно при использовании изотропные лантаноиды в качестве донора, так что урождённаяд указать данный сайт на получение либо донор или акцептор является необходимым. Интенсивность может повлиять с гетерогенной популяции, но по-прежнему должны быть более чем достаточными, чтобы быть обнаружены.

При планировании экспериментов, выбор флуорофоров должны быть продиктовано R ₀ значением пары, а также ожидаемого диапазона расстояний измерения. Значение R _0, определяется следующим уравнением:

Уравнение. 3

где, R ₀ радиус Ферстер в ангстрем, κ ² является фактором ориентации между двумя красителями (которые обычно считаются 2/3), φ _D является квантовый выход донора, J является спектральный интеграл перекрытия между донора Спектр излучения и поглощения спектра акцептора в М ^{- 1}см ^-1 нм ⁴ и п-показатель преломления среды ^1.

Наша лаборатория добавила модификацию традиционной методике LRET путем введения сайт узнавания протеазы между донором и акцептором этикеток сайтов белка зондируемой. Эта модификация позволяет расследования в неочищенные систем, таких как целых клеток млекопитающих ^7. Этот метод особенно полезен при использовании цистеина в качестве участков для маркировки, так как в процессе маркировки с малеимид-конъюгированного красителей, которые связываются с цистеиновых сульфгидрильных групп, других белков в клетках, которые имеют цистеина также помечены. Тем не менее, в том числе с помощью протеазы сайтов расщепления на интересующего белка и измерения времени жизни до и после расщепления, экспериментатор может количественно вычесть фоновый сигнал после расщепления протеазой от исходного сигнала. Это вычитание изолирует определенный сигнал, возникающий от интересующего белка (рисЮр 2). Использование модификации описанного выше, LRET может быть использован для измерения изменения расстояния между тербия хелатного донором и акцептором зонда на белок, и, таким образом, контролировать конформационные изменения в ближайшем физиологического состояния белка без необходимости очистки.

Рисунок 1.The поглощения и спектры излучения хелатированный тербия в черном, а также представительного акцептора, Alexa 488, в ред. Обратите внимание на несколько пиков выбросов и резкий, узкий диапазон излучения для каждого пика тербия хелат. Эта схема позволяет тербия, которые будут использоваться с различными акцепторными флуорофоров и облегчает измерение сенсибилизированной излучения в этих диапазонах, где тербия не показывает выброс. Пик излучения тербия по адресу 486 нм перекрывает достаточно хорошо с а bsorption пик Alexa 488, что позволяет резонансной передачи энергии происходят между двумя флуорофорами. Длина волны 515 нм является отличным выбором для обнаружения сенсибилизированную эмиссию для этой пары, как это находится в долине между пиками выбросов тербия, и совсем рядом Alexa 488 в пиком излучения 520 нм. Обратите внимание, что, будучи вблизи пика акцептора, при том, что желательно, не требуется-565 нм по-прежнему способен обнаружить Alexa 488 эмиссию без также обнаруживать излучение тербия.

3px; "> 508 Cy3

Acceptor флуорофором	R 0 (Å)	Длина волны излучения (нм)
Атто 465	36
Флуоресцеин	45	515
Alexa 488	46	515
Alexa 680	52	700
Alexa 594	53	630
Alexa 555	65	565
65	575

Таблица 1 Перечень обычно используемых акцепторных флуорофорами для LRET помощью тербия хелат качестве донора ^11. В R ₀ значения были измерены, когда донор и акцептор, были присоединены к растворимым агониста связывающий домен АМРА-рецепторов. Он идеально подходит для измерения значения R ₀ раз для каждой новой системы изучается.

Рисунок 2 Обзор метода LRET представленной. (А) рецепторов АМРА является мембранный белок, который подвергается конформационные изменения при лигандсвязывающие. Раскладушка-образный лиганд-бинахождении домен кружил здесь красным цветом. (В) лиганд-связывающий домен АМРА, когда он не связан с белком существует в открытой конформации (слева). При связан с лигандом глутамат, белок закрывается вокруг его лигандом (справа). Размещая флуорофоров на доказательных сайтов в LBD, природа этого конформационных изменений можно рассматривать как расстояние между изменениями флуорофоров, которые затем будут влиять на время жизни флюоресценции. (С) при маркировке целые клетки, маркировка как интересующего белка, а также фоновых мембранных белков может произойти (слева). После расщепления протеазы, сигнал LRET от интересующего белка исчезнет в связи с выпуском растворимого фрагмента, оставив фоновый сигнал нетронутыми (справа). Это фоновый сигнал может быть вычтен из сырого сигнала.

Protocol

1 Создать конструкцию, содержащую белок, представляющий интерес

Клонирование гена, экспрессирующего белок, представляющий интерес в подходящий вектор. Использование векторы, такие как серии pcDNA или pRK5, так как они хорошо подходят для экспрессии в системах млекопитающих, таких как HEK293 и CHO клеток.

2 Выберите сайтов на белок, чтобы быть с меткой флуорофорами

1. Выберите маркировки сайтов, которые способны отражать возможные конформационные изменения белка. Если возможно, используйте кристаллическую структуру белка или гомологичного белка, чтобы помочь сделать это определение. Если нет кристаллическая структура, используйте программное обеспечение для онлайн предсказать возможную структуру белка и, следовательно, получать представление соответствующих сайтов.
2. Выбрать остатки таким образом, чтобы боковые цепи выбранных остатков поверхностно подвергается и доступными для флуорофоров, так что белок может быть помечены.
   1. Выберите остатки,не являются критическими для функции белка, например сайтов, которые не вовлечены в связывание лиганда.
   2. Представляя мутацию цистеина, отдают предпочтение сайтам, которые похожи, например, серин, которые могут вызвать минимальное возмущение в структуре белка.
   3. После выбора места маркировки, чтобы мутации, чтобы гарантировать, что белок только дает LRET из этих сайтов, предназначенных. Использование стандартных протоколов сайт-направленного мутагенеза мутировать в сторону, не дисульфидным мостиком цистеина, которые потенциально могут связываться с малеимидом конъюгированные флуоресцентных меток. Не мутировать в сторону дисульфидным мостиком цистеина и погребен, свободные остатки цистеина, так как они не должны вступать в реакцию с флуоресцентными красителями в сложенном виде белка.
3. Введение остатков цистеина в желаемых участков, сделав точечные мутации с использованием стандартных протоколов сайт-направленного мутагенеза.
4. Включите сайт расщепления протеазы, которые могут специфически расщепляют с одной из цистеинов из белка. Еслипоследовательность белка позволяет это, представить сайт на консервативно мутирует белок, чтобы иметь тромбина (последовательность узнавания LVPRGS) или фактор Ха (последовательность узнавания IDGR или IEGR) последовательность вблизи введенной цистеина и доступными для расщепления протеазы; в противном случае тетра-или гекса-пептид, последовательность может быть вставлена ​​в целом. Выберите сайт таким образом, что при расщеплении одной из введенных цистеинов отделяется от остальной части белка в некоторых случаях это может потребовать две фланкирующие сайты расщепления мутированный цистеин.

3 Тест Экспрессия и Функциональность белка

1. Выполнение вестерн-блот, чтобы подтвердить экспрессию мутантного белка.
2. Выполнение функциональный анализ белка, чтобы гарантировать, что мутации изменили функцию белка лишь в минимальной степени, если вообще, чтобы избежать изучения конформационных изменений дисфункциональной белка.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Так как все белки имеют различные функции, нет ни одного F Функциональные анализ, который используется специально для LRET; Тем не менее, некоторые примеры функциональных анализов включают ферментативные анализы активности для ферментов, лиганд-анализов связывания с рецепторами, и электрофизиологических исследований для ионных каналов.

4 Выберите флуорофоры, которые будут использоваться

Выберите флуорофоры, основанных на ожидаемой расстояний измеряется таким образом, что диапазон между 0.5-1x R ₀ пары флуорофором.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это упрощается вычитания фона, который, как правило, имеет гораздо большее время жизни. Например, если ожидаемый Расстояние измеряется составляет около 35 А, соответствующий флуорофор пара, чтобы использовать будет тербия хелата в качестве донора и Alexa 594 в качестве акцептора, так как Р ₀ для этой пары 53 A (Таблица 1).

5 экспрессии белка по Временно трансфекции необходимое количество клетках млекопитающих

ntent "> Временно трансфекции интересующий белок в выбранных клетках млекопитающих с использованием любого из обычных реагентов трансфекции Как правило, используют четыре 10-см чашки на LRET эксперимента по НЕК и клеточных линий СНО;. Тем не менее, это количество может варьироваться в зависимости от экспрессии белка , стабильность и т.д.. Разрешить клетки для экспрессии белка для 36-48 часов до сбора урожая.

6 Этикетка Белки

1. Отделить клетки от культуральной чашки. Снять HEK клетки просто пипетки буфер против дно тарелки. Снять СНО клеточным скребком, смывая СМИ с внеклеточной буфера.
2. Сбор клеток путем центрифугирования при 1100 мкг в течение 3 мин. Используйте эти же центрифуг настройки для сбора клеток после маркировки, а также после последующих стирок.
3. Приостановить клеток в 3 мл внеклеточной буфера, а затем добавить донорных и акцепторных флуорофоров в эквимолярных количествах до конечной концентрации 100-300 нМ. Выдержите на ротатора Fили 1 ч при комнатной температуре.
4. Вымойте эти меченых клеток 3-4x с внеклеточной буфера для удаления несвязанных флуорофоры, то приостановить эти клетки внеклеточного буфера (обычно 2 мл) для измерений LRET.
5. В качестве контроля, маркировать отдельный набор клеток только с донорской флуорофора (тербия хелатной) без добавления любого акцептора флуорофора.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Данные из этих доноров только экспериментов необходимо завершить анализ. Эти эксперименты можно сделать на одних и тех же или в разные дни.
6. Опять же, выполнить функциональную проверку, на этот раз с надписью мутантного белка, так как процесс маркировки может также столкнуться с функцией в зависимости от места, используемого для маркировки.
   Примечание: Эти эксперименты можно сделать на одних и тех же или в разные дни.

7 Настройте LRET эксперимент

1. Поместите ресуспендировали клетки в кварцевую кювету с минимальным объемом 1 мл.
2. Включите компьютер и инструмента и регулировки параметров DATПрограмма приобретения соответственно.
   1. Установка длины волны возбуждения в диапазоне поглощения донорного флюорофора (330-340 нм хорошо работает для тербия хелата).
   2. Установите длину волны излучения соответствующим образом, имея в виду, что излучение акцептор изменяется в зависимости от акцептора используется. Важно отметить, что выбрать длину волны детектирования, который измеряет только излучение акцепторный и не включает любую проступание от эмиссии донора. Например, использовать длину волны 565 нм для Alexa 555 в качестве акцептора таблице 1. Для измерений донорами только, в котором белок меченных только донора, но без акцептора, использовать длину волны 545 нм для измерения выбросов тербия хелатного.
   3. Установите длину обнаружения излучения, по крайней мере в три раза его срок службы LRET чтобы гарантировать, что компонент долгосрочной жизни не будет упущена.
3. Выполните сканирование. Есть по крайней мере три сканы 99 взмахов в целях обеспечения согласованности результатов. Сохранить йе результаты в виде текстового файла (* txt-).
4. Для измерения конформационные изменения белка в отношении различных условиях (например, при добавлении лиганда), изменить эти условия и снова выполнить по крайней мере три сканирование 99 зачисток каждый на том же образце в рамках этого нового состояния. Если изучая эффекты глутамата на конформацию рецепторов глутамата, например, добавить глютамат до 1 мМ до того же образца отсканированного в шаге 7.3, и повторите сканирование.
5. Добавить до пяти единиц соответствующей протеазы и принять сканирования постоянно, пока расщепление не является полным и никаких дальнейших изменений не видно в жизни в течение трех последовательных сканирований. Обычно, декольте завершена через два-три часа. Если фактор Ха сайт расщепления используется для расщепления протеазой, например, добавить 3 мкл фактора Ха в образце, и сканирование каждые 30 мин в течение 3 часов.

8 Анализ полученных данных

1. Откройте программное обеспечение для анализа данных.
2. Загрузите жизни флюоресценции,Данные с помощью Import ASCII открыть текстовые файлы. Загрузите все повторов, а также окончательные фоновых измерений, в один файл.
3. Среднее значение на основании данных из всех сканирований для каждой экспериментальной состоянии получить окончательные данные. Чтобы сделать это, выделите столбцы, содержащие отдельные испытания, то в меню Data в строке меню, нажмите по статистике на строк для отображения средних интенсивностей флуоресценции от испытаний, а также стандартное отклонение и стандартная ошибка.
4. Участок средние значения как линейного графика с интенсивности флуоресценции от Y-оси и жизни в микросекунд на оси Х, чтобы создать кривую, которая представляет жизни сенсибилизированной излучения акцептора. Измените Y-ось сюжета в логарифмической шкале, для обеспечения лучшего визуализации данных.
5. Повторите шаг 8.3 на данных измерений фон, в среднем окончательные сканы, которые показывают перекрытие указывает полное расщепление.
6. Дисплей средние фоновые данные оже сюжет, что содержит усредненную исходные данные. Для этого откройте диалоговое окно Layer Control находится в меню Plot. Тогда, передавать данные, содержащие фон означает, в список Layer Содержание.
7. Совместите средние фоновые данные средних исходных данных. Чтобы сделать это, используйте простую функцию Math в меню Math умножить или разделить данные фоновых мере необходимости, пока задняя часть фона не совпадает с заключительной части исходных данных.
   Примечание: В этой заключительной части, срок службы от интересующего белка должны уже полностью распадались в сторону; что выровнен просто сигнал присутствует фон как до, так и после расщепления протеазой.
8. Вычтите выровненный фонового сигнала от первоначального исходного сигнала LRET, снова используя простую функцию Math.
9. Установите данные экспоненциальное (одиночные или множественные экспоненты, в зависимости от серверов и экспериментального проектирования).
   1. Установите начальный границу для установки, чтобы начать после окончаниялазерного импульса. Используйте этот же начальную для всех последующих арматуры кривой.
   2. В диалоговом окне Выбор Место Функция выберите экспоненциальное затухание таким образом, чтобы соответствовать жизнь, чтобы к следующему уравнению для одной экспоненциального затухания:
      Уравнение. 4
      где Y представляет собой интенсивность флуоресценции, Y ₀ представляет собой интенсивность фона вследствие шума от системы, ₁ интенсивность сигнала, т время жизни флюоресценции, х является время, и X ₀ является смещение времени.
   3. Fix х _{от 0} до 0, начать Место Функция, и соответствует данным.
      Примечание: Если эксперимент предназначен, чтобы сигнал только от одной пары участков, полученные данные должны легко быть в форме одной экспоненциального затухания ^8. Остаточная подгонки является хорошим методом для определения благость форме и, если дополнительные времена жизни распада являются эксплуатацию комплексред.
10. Используйте времена жизни, полученные из данных для вычисления расстояния между флуорофорами использованием уравнения Форстер (перестановку уравнений 1 и 2 выше):
    Уравнение. 5
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все переменные, как указано выше, с τ _DA будучи измеряется как сенсибилизированной жизни эмиссии акцепторной. Более подробная информация и примеры по измерению R ₀ и R может быть найден в другом месте ^7,9,10.
11. Повторите эксперимент и анализ данных, по крайней мере три раза, чтобы обеспечить воспроизводимость. Несоответствие между отдельными повторениями одного и того же измерения, ставит под вопрос обоснованность данных; использовать дополнительные контрольные эксперименты или повторений. Рассчитать ошибок измерения при помощи бесплатного Gustavus анализ ошибок калькулятор (разработанной доктором Томасом Huber) или аналогичной системы, которая распространяется ошибку вподходит из жизни.

Representative Results

Успешный измерения LRET с лантаноида донора должны иметь донора только жизни во временном диапазоне миллисекунд. Срок службы сенсибилизированной эмиссии LRET для белка, меченного как донора и акцептора будет короче, в частности, со сроком службы в диапазоне микросекунд после вычитания фона рисунке 3. Протеазы результаты расщепления к увеличению срока службы, которые должны стать стабильными с течением времени ( т.е. больше не меняется), показывающий, что расщепление протеазой является полным Рисунок 4. Если сигнал LRET получается только из одного набора сайтов, в результате чего срок службы эмиссии после вычитания фона должен дать одну экспоненциальную срок службы.

При измерении конформационных изменений, специфический сигнал LRET должен показать изменение в жизни за пределами погрешности измерения рисунке 3. Погрешность измерения может быть вычислена путем распространения ошибкиы, связанные с подгонки жизни. После подгонки данных и минимальным количеством функций экспоненциального распада, описанных в уравнении 4, время жизни, τ, может быть определена. Используя уравнение 5, донор-акцептор и донорами только срок службы может быть использован вместе со значением R ₀ для пара LRET для вычисления расстояния между двумя флуорофорами в условиях испытания. Относительно изменения расстояния в результате изменения этих условий в общей структуре и функции белка в настоящее время является работа экспериментатора.

Рисунок 3 LRET измерения кислотно-зондирования ионного канала 1а (ASIC1a). Интенсивность флуоресценции была построена в логарифмическом масштабе, чтобы улучшить простоту визуальной интерпретации. (А) Образцы донорской крови только показать одну-exponentiaл распада, что не меняется с рН. (Б) В донорно-акцепторных меченых образцов, уменьшение срока службы сенсибилизированной эмиссии видно при уменьшении рН от 8 до 6 (черного до красного). Это уменьшение жизни указывает на уменьшение расстояния между большим и указательным пальцами областях ASIC1a. Эта цифра была изменена с Ramaswamy, и др, 2013 ^8.

Рисунок 4 Эффект вычитания фона на измерениях LRET сделанных на кислота зондирования ионного канала 1а (ASIC1a). Сайты должны быть специально помечены флуорофорами разделенных сайта расщепления протеазы. После измерения LRET сделаны, протеаза, вводят в образце белка и последующего расщепления белка результатов процентных к потере конкретного сигнала. Любой LRET что остаетсяявляется фон флуоресценции от флуорофорами, связанных с другими цистеинами присутствующих на других мембранных белков. Вычитая этот фон изолирует истинные данные LRET для интересующего белка. Эта цифра была изменена с Ramaswamy, и др, 2013 ^8.

Discussion

LRET является мощным средством, что позволяет ученым измерять расстояния между доменами в пределах одного белка, а также между подразделениями в мультимерного белка. Таким образом, LRET хорошо подходит для изучения конформационных изменений и динамики белков или других макромолекул. Выше протокол должен позволить правильно оборудованная лаборатория легко проверить свои гипотезы; Однако, есть много общих источников ошибок, которые могут произойти новый следователь. Если мало или нет сигнала LRET видно, сначала проверьте настройки длин волн, используемых. Возбуждение должно быть в диапазоне поглощения тербия (330-340 нм). Для доноров только измерения, в которой образец был назван только с донорской флуорофора и без акцептора флуорофора, длина волны излучения должна быть в одном из пиков, показанных на фиг.1, в то время как для измерения донорно-акцепторных, длина волны излучения должна совпадать с акцепторным флюорофором используется Таблица 1. Если wavelength настройки верны, проверить совместимость буферов. Некоторые флуорофоров могут быть несовместимы с некоторыми буферов или в определенных интервалах рН. Далее, убедитесь, что выбор остатков и флуорофорами совместимы. Если опытно-конструкторских совершенно правильно, то проблема, скорее всего лежит либо с флуорофорами или самого белка. В течение долгого времени, исходные растворы флуорофоров может ухудшить и может привести к недостаточной маркировки. Наконец, проверьте выражение и функциональность белка. Многие мутации, которые были добавлены, в том числе введение цистеинов, удаления нативных цистеинов, и введение по меньшей мере одного сайта расщепления протеазой. Таким образом, вполне возможно, что, даже при нормальных условиях трансфекции, введенные мутации дестабилизации белка и причину под-экспрессии интересующего белка, снижение сигнал видно. Если выразиться, мутации или маркировки может привести к денатурации белка, в результате чего остатки, которые будут размещены по-другомуот ожидаемого расстояния видели в дикого типа белка. Вестерн-блоты может быть использована для проверки экспрессии белка. Если есть вопрос о торговле белка поверхности мембраны, биотинилирования поверхности клетки и в выпадающем поверхностно-подвергается белков, с последующим вестерн для интересующего белка, будет специально продемонстрировать торговлей поверхности. Для функциональных тестов, нет ни одного анализа рекомендовать для использования специально с LRET, так LRET может использоваться на самых разнообразных типов белков. Снова, хотя, возможно примеры функциональных анализов включают ферментные анализы деятельности, лигандообменных исследований и электрофизиологии исследования. Если экспрессия белка или функция была слишком пострадала от введенных мутаций, то новые сайты маркировке должен быть выбран.

Если сигнал LRET видно, но не могут быть установлены на одной экспоненты, когда такой результат, как ожидается, первый чек, что фон был правильно вычитается. Если, афтер вычитание, мульти-экспоненциальный спад видно, этот сигнал может быть признаком LRET наблюдается от других, чем то, что было предназначено множественных взаимодействий. Проверьте, чтобы убедиться, что все другие доступные цистеина были удалены из белка. Если кристаллическая структура доступно, это будет очень полезный инструмент для проверки этих цистеинами. Опять же, дисульфид-стружечных и похоронен, недоступные цистеина не нужно быть мутировал далеко. Чтобы проверить недоступность этих цистеинами если есть веские причины не мутировать их, ввести один неродной цистеин в белке и убедитесь, что нет LRET сигнал в донорно-акцепторной меченого образца. Если все доступные цистеина действительно были мутировали в сторону, и, если белок имеет несколько субъединиц, или является частью комплекса, то могут быть мешающих LRET сигнала за счет красителя крепления к этим белкам или соседних субъединиц. Выбор другого сайта расщепления протеазой может помочь с этими проблемами; в противном случае, другой сайт маркировкас, возможно, потребуется выбрать. Наконец, если вопрос с фитинга просто вопрос сигнал-шум, скорее всего, проблема связана с низкой экспрессии белка. Выражение тогда должны быть оптимизированы с помощью различных условиях трансфекции, другой вектор, и т.д..

Если измерения LRET производить аномальную или физического смысла, казалось бы, результат, могут возникнуть проблемы конкретных белков, которые не могут быть легко очевидны. Например, с кислотными зондирования ионных каналов, даже осторожным добавлением кислоты, чтобы изменить рН может привести к некоторой гибели клеток и денатурации белков. Таким образом, несколько образцов должны быть готовы, по одному для каждого рН для тестирования. Кроме того, в дополнение к резонансной передачи энергии, локальные изменения окружающей среды могут повлиять на флуоресцентный сигнал. Такое изменение, если значительная, будет отмечено в измерении доноров только в качестве двойной или мульти-экспоненциального затухания. В этих случаях, сайты маркировки должны быть перемещены в различные положения в маке, что изменение условий не меняет спектральные свойства флуорофорами.

Даже при сохранении этих источников проблем в виду, есть некоторые предостережения для и ограничения LRET из которых экспериментатор должен быть в курсе. Во-первых, обычный метод маркировки зависит от маркировки остатков цистеина. Для уменьшения маркировку неспецифических остатков, другие цистеина обычно мутировал из; Тем не менее, этот способ не всегда практично. Например, если белок имеет много не-дисульфидные связями цистеина родные своей структуре, что имеет решающее значение для структуры или функции белка, его мутация их будет невозможно, значительно увеличивая ограничение технике и интерпретацию данных. Кроме того, методика LRET больше подходит для обнаружения изменений в расстоянии, а не абсолютных расстояний, так как любые ошибки на абсолютной расстоянии в связи с действием фактора ориентации κ ² на величину R _0, вероятнодолжны быть сокращены в анализе изменения расстояния, потому что эти ошибки влияют на измерения в любых условиях одинаково. Альтернативные методы могут быть сделано для преодоления некоторых из этих ограничений. Например, чтобы избежать слишком много добавлением цистеина, можно было прикрепить His-метку, и пометить его с флуорофора, связанного с никель-NTA. Кроме того, носители триптофаны может быть использован в качестве одного из флуорофоров с пониманием того, что при использовании в качестве донора, триптофаны имеют гораздо меньший срок службы, чем тербия, таким образом, измерение интенсивности основе может быть более подходящим, чем измерение времени жизни. Если точнее атом на расстояния атомов требуются, такие методы, как рентгеновская кристаллография, молекулярной динамики, или ЯМР-прежнему более подходящие методы, чтобы получить эти абсолютных расстояний.

Благодаря своей изысканной чувствительности дистанцироваться изменения, LRET может измерять расстояния изменения с разрешением Ангстрем уровня для решения фазы белков и может обеспечить экспериментальных данных без необходимости высокого пурити, изотопные метки или ограничение размера, что ухудшает как ЯМР и молекулярной динамики. После обучения и овладения техникой, экзамены в конформационных изменений белков можно сделать гораздо быстрее и с большей легкостью, чем уже имеющихся традиционных методов. LRET также обеспечивает отличную основу для дальнейшего специализированных технологий передачи резонансной энергии, таких как одной FRET молекулы (smFRET), которые можно изучить распределение населения конформационных состояний отдельных молекул, а не в среднем ансамбля.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
LanthaScreen Thiol Reactive Tb Chelate	Life Technologies	PV3579
Acceptor fluorophore-Fluorescein-5-Maleimide	Life Technologies	F-150	Choice of acceptor depends on the specific experiment
Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 488 C5 Maleimide	Life Technologies	A-10254	Choice of acceptor depends on the specific experiment
Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 555 C2 Maleimide	Life Technologies	A-20346	Choice of acceptor depends on the specific experiment
Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 594 C5 Maleimide	Life Technologies	A-10256	Choice of acceptor depends on the specific experiment
Acceptor fluorophore-Alexa Fluor 680 C2 Maleimide	Life Technologies	A-20344	Choice of acceptor depends on the specific experiment
QuantaMaster 3-SS	Photon Technology International		Spectrofluorometer should have pulsed excitation with the ability to measure lifetimes in the millisecond range
FluoreScan 2.0	Photon Technology International		Data Acquisition Software used in manuscript. Software provided with fluorescence instrument
Origin 8.6	OriginLab		Origin is the data analysis software used in protocol. Can use other similar data analysis software
Quartz cuvette	Starna Cells, Inc	3-Q-10
Stir bar	Bel-Art Products	F37119-0007	Used in cuvette to keep cells in suspension. Can use any stir bar that fits the cuvette