Summary
यह लेख एक टूटनेवाला sucrose के ढाल पर ultracentrifugation द्वारा synaptic प्लाज्मा झिल्ली के साथ जुड़े प्रोटीन का संवर्धन का विवरण. बाद synaptic घनत्व प्रोटीन के बाद तैयारी भी वर्णन किया गया है. प्रोटीन की तैयारी पश्चिमी सोख्ता या 2 डी DIGE विश्लेषण के लिए उपयुक्त हैं.
Abstract
Neuronal subcellular fractionation तकनीक को और अन्तर्ग्रथन से तस्करी कर रहे हैं कि प्रोटीन की मात्रा का ठहराव अनुमति देते हैं. मूल रूप से 1960 देर में वर्णित है, synaptic प्लाज्मा झिल्ली के साथ जुड़े प्रोटीन एक sucrose के घनत्व ढाल पर ultracentrifugation द्वारा अलग किया जा सकता है. अन्तर्ग्रथनी झिल्ली अलग कर रहे हैं एक बार, बाद synaptic घनत्व के रूप में जाना macromolecular परिसर बाद में इसकी वजह से डिटर्जेंट जटिलता को अलग किया जा सकता है. अन्तर्ग्रथनी प्लाज्मा झिल्ली और बाद synaptic घनत्व प्रोटीन को अलग करने के लिए इस्तेमाल की तकनीक अनिवार्य रूप से 40 साल के बाद ही रहते हैं, और व्यापक रूप से वर्तमान तंत्रिका विज्ञान अनुसंधान में इस्तेमाल किया जाता है. यह लेख synaptic प्लाज्मा झिल्ली और बाद synaptic घनत्व एक टूटनेवाला sucrose के ढाल का प्रयोग से जुड़े प्रोटीन का विभाजन विवरण. परिणामस्वरूप प्रोटीन तैयारी पश्चिमी सोख्ता या 2 डी DIGE विश्लेषण के लिए उपयुक्त हैं.
Introduction
न्यूरॉन्स synapses के माध्यम से संवाद, और इस संचार की गुणवत्ता अन्तर्ग्रथन में प्रोटीन की संरचना में परिवर्तन से काफी हद तक नियंत्रित किया जाता है. विशेष रूप से, बाद synaptic घनत्व में स्थित प्रोटीन उनके संकेत पारगमन प्रणाली 1 के साथ परिचित मचान स्नायुसंचारी रिसेप्टर्स द्वारा न्यूरोनल संचार में भाग लेते हैं. इसके अलावा, synaptic प्रभावकारिता की ताकत में स्थायी परिवर्तन के बाद synaptic घनत्व 1-6 पर अतिरिक्त या रिसेप्टर्स को हटाने के द्वारा नियंत्रित कर रहे हैं. इसलिए, synaptic प्रोटीन का अलगाव और मात्रा का ठहराव न्यूरॉन्स उत्तेजनाओं और synaptic प्रभावकारिता 7 में परिवर्तन करने के लिए जवाब है कि मायनों में जानकारी हासिल करने के लिए एक आवश्यक और उपयोगी तकनीक है. यह लेख टूटनेवाला सूक्रोज ढ़ाल पर ultracentrifugation द्वारा कृंतक मस्तिष्क के ऊतकों से synaptic प्रोटीन को अलग करने के लिए एक आम तकनीक का वर्णन है. अन्तर्ग्रथनी प्लाज्मा झिल्ली अंश को समृद्ध किया जा सकता है और पर आधारित पृथकअनुभव से 1.2 एम sucrose के लिए समान होने के लिए निर्धारित किया गया है जो सुक्रोज में इसकी घनत्व,.
जैविक सवाल पर निर्भर करता है, subcellular भिन्न सूक्रोज या Percoll या तो सतत या टूटनेवाला ढ़ाल के द्वारा अलग किया जा सकता है. सतत ढ़ाल कई भागों में प्रोटीन की जुदाई के लिए अनुमति देते हैं; इसमें दिए गए अंश 8 के भीतर प्रोटीन की सह स्थानीयकरण प्रदर्शित करने के लिए विशेष रूप से उपयोगी हो सकता है. हालांकि, निरंतर ढ़ाल की तैयारी अधिक श्रमसाध्य है और कई अनुप्रयोगों के लिए अनावश्यक है. टूटनेवाला ढ़ाल तैयार करने के लिए अपेक्षाकृत आसान कर रहे हैं और कुछ ही, आम तौर पर परिभाषित भागों में प्रोटीन को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. बढ़ती molarity के तीन सूक्रोज परतों से बना रहे हैं कि टूटनेवाला ढ़ाल व्यापक रूप से synaptic प्लाज्मा झिल्ली (एसपीएम) के साथ जुड़े प्रोटीन को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. इस synaptic प्लाज्मा झिल्ली अंश आगे बाद synaptic घनत्व fractio के लिए कार्रवाई की जा सकतीडिटर्जेंट अघुलनशील अंश का डिटर्जेंट उपचार और अलगाव से n (PSD).
इस प्रक्रिया पहले 1960 9,10 में वर्णित किया गया था, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी मोटे तौर पर synaptic प्लाज्मा झिल्ली और बाद synaptic घनत्व भिन्न 9-14 परिभाषित कि organelles और झिल्ली प्रदर्शित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. इन अध्ययनों से पूर्व और बाद अन्तर्ग्रथनी झिल्ली और एसपीएम अंश में synaptic पुटिका के शामिल किए जाने का प्रदर्शन किया; डिटर्जेंट उपचार मुख्यतः इलेक्ट्रॉन घने बाद, बाद synaptic घनत्व दिखाई दे रहे थे. प्रक्रिया में, एक hypotonic झटका सेल शरीर में 10 से synaptic प्रक्रियाओं चुटकी बंद किया जाता है. यह कदम माइटोकॉन्ड्रिया आसमाटिक सदमे के लिए प्रतिरोधी होते हैं और बरकरार रहेगा, और इसलिए वे sucrose ढाल (चित्रा 1) के तल पर तलछट कि तथ्य का लाभ लेता है.
यह वही संवर्धन तकनीक का उपयोग करना, एसपीएम और PSD भिन्न biochemically पहले थेpolyacrylamide जेल वैद्युतकणसंचलन और प्रमुख प्रोटीन घटक 15-17 का अनुक्रमण से परिभाषित किया. इसके बाद पश्चिमी धब्बा विश्लेषण (चित्रा 2) इन अंशों को परिभाषित आगे का पता लगाने और synaptic प्रोटीन के स्तर यों और करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. हम Slc6a3 ठिकाना चूहों 18 में दोहराया गया है कि हो जब डोपामिन ट्रांसपोर्टर की synaptic स्तर में परिवर्तन यों हमारी प्रयोगशालाओं में इस तकनीक का इस्तेमाल किया है. हम भी DISC1 interactome 19 का हिस्सा हैं कि प्रोटीन में synapse विशेष कटौती को उजागर करने NMDA रिसेप्टर कमी चूहों में इस तकनीक का इस्तेमाल किया है.
यह एसपीएम भिन्न synaptic पुटिका झिल्ली प्रोटीन, endosome मार्कर, mitochondrial प्रोटीन, झिल्ली जुड़े सिंथेटिक एंजाइम और संकेत पारगमन अणु है, साथ ही बाद synaptic घनत्व का अभिन्न घटकों और synaptic प्लाज्मा झिल्ली 20-23 होते हैं कि पश्चिमी धब्बा विश्लेषण से स्पष्ट है. ईउपक्रम PSD भिन्न प्रचुर mitochondrial प्रोटीन के साथ संदूषण हो सकता है और यह उनके 13 को निकालने के लिए एक दूसरे की ढाल अवसादन या अतिरिक्त शुद्धि चरणों को पूरा करने के लिए आवश्यक हो सकता है. हाल ही में, मात्रात्मक मास स्पेक्ट्रोमेट्री अकेले बाद synaptic घनत्व में 100 से अधिक प्रोटीन की एक सूची है, साथ ही इन घटकों 24,25 के रिश्तेदार बहुतायत का एक संकेत प्रदान की गई है.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
निम्नलिखित प्रोटोकॉल पशु की देखभाल के कनाडाई परिषद के दिशा निर्देशों के अनुरूप है और टोरंटो विश्वविद्यालय में चिकित्सा और फार्मेसी पशु की देखभाल समिति के संकाय द्वारा अनुमोदित किया गया है.
तालिका 1 में वर्णित के रूप में 1 आवश्यक अभिकर्मकों की तैयारी
- तालिका 1 में उल्लिखित सांद्रता में सभी सूक्रोज समाधान, बफ़र्स के लिए प्रोटीज और फॉस्फेट (यदि आवश्यक हो) अवरोधकों जोड़ें और DDH 2 हे. महत्वपूर्ण: प्रयोग के शुरू करने से पहले अभिकर्मकों और उपकरणों के सभी 4 डिग्री सेल्सियस पर सभी चरणों के प्रदर्शन और पूर्व शांत. स्थायी मार्कर के साथ ultracentrifuge ट्यूब, सहित सभी ट्यूबों लेबल.
उपयुक्त मस्तिष्क क्षेत्र के 2 विच्छेदन
- ग्रीवा अव्यवस्था या कत्ल द्वारा पशु बलि. हाउस और जानवरों की देखभाल पर संस्थागत और सरकारी नीतियों के अनुसार जानवरों euthanize.
- तेजी वें हटानेएक ठंडा विच्छेदन ब्लॉक पर खोपड़ी और जगह से ई मस्तिष्क.
- ताजा ऊतक से उचित मस्तिष्क क्षेत्र काटना और 3 चरण पर जाएँ.
मोटर चालित ग्लास, Teflon Homogenizer साथ 3 ऊतक homogenization
- 0.32 एम HEPES बफर sucrose के समाधान के 4 एमएल युक्त एक लेबल 13 मिलीलीटर polypropylene ट्यूब में विच्छेदित ऊतक के (एसपीएम के लिए) 50-100 मिलीग्राम, या (PSD के लिए) 100-200 मिलीग्राम रखें. एक 15 मिलीलीटर पतला गिलास Teflon ऊतक चक्की / homogenizer के लिए नमूना स्थानांतरण, 900 आरपीएम (7 सेटिंग) को मोटर ड्राइव सेट और एक 30 सेकंड की अवधि में 12 स्ट्रोक के साथ नमूना homogenize. नमूने के बीच एक अलग गिलास Teflon homogenizer का प्रयोग करें, या नमूनों के बीच ठंड आसुत जल के साथ homogenizer कुल्ला और एक Kimwipe के साथ सूखी पोंछे. नोट: ऊतक की 4 जी के लिए ऊपर हालांकि यह उचित विभाजन सुनिश्चित करने के लिए कम ऊतक का उपयोग करने की सलाह दी जाती है, 0.32 एम HEPES बफर sucrose के समाधान के 4 मिलीलीटर में homogenized किया जा सकता है.
- टी वापस homogenized नमूना स्थानांतरणवही 13 मिलीलीटर polypropylene ट्यूब ओ. रिजर्व बाद प्रोटीन मात्रा का ठहराव और कुल प्रोटीन अंश के पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर homogenate और दुकान के 100 μl.
4 कम स्पीड केन्द्रापसारण परमाणु अंश निकालें (पैदावार सतह पर तैरनेवाला S1)
- अपकेंद्रित्र 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 900 XG पर एक निश्चित कोण रोटर में homogenate. एक नया करने के लिए सतह पर तैरनेवाला (S1) स्थानांतरण, 13 मिलीलीटर ट्यूब लेबल और 0.32 एम HEPES बफर sucrose के 500 μl में परमाणु अंश गोली (P1) resuspend. नोट: (P1) अंश -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत और परमाणु अंश के पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
क्रूड Synaptosomal अंश के 5 संवर्धन (पैदावार गोली p2)
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 10,000 XG पर सतह पर तैरनेवाला (S1) अपकेंद्रित्र. एक microcentrifuge ट्यूब में 500 μl बाद प्रोटीन क्वांट के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करने के लिए सतह पर तैरनेवाला (S2) और रिजर्व निकालेंification और साइटोसोलिक / प्रकाश झिल्ली अंश के पश्चिमी धब्बा विश्लेषण. 0.32 एम HEPES बफर sucrose के समाधान के 1 मिलीलीटर में शेष कच्चे synaptosomal अंश गोली (p2) Resuspend और फिर एक और 3 मिलीलीटर 0.32 एम HEPES बफर sucrose के समाधान जोड़ें.
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 10,000 एक्स जी पर अपकेंद्रित्र. बाद में प्रोटीन मात्रा का ठहराव और साइटोसोलिक / प्रकाश झिल्ली अंश के पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करने के लिए एक microcentrifuge ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला (S2 ') और रिजर्व 500 μl निकालें. Polypropylene ट्यूब में धोया कच्चे synaptosomal गोली (p2 ') को बचाओ.
क्रूड Synaptosomal अंश के 6 lysing (Hypoosmotic शॉक)
- DDH 2 ओ के 1 मिलीलीटर में यह resuspending द्वारा polypropylene ट्यूब में Lyse कच्चे synaptosomal गोली (p2 ') DDH 2 हे की एक और 3 मिलीग्राम, 3 स्ट्रोक के साथ हाथ से एक गिलास Teflon ऊतक homogenizer को हस्तांतरण, और homogenize जोड़ें. नोट: यह महत्वपूर्ण हैजल्दी के रूप में तेजी से संभव के रूप में इस चरण को पूरा करने के लिए और 6.2 कदम आगे बढ़ना.
- वापस उसी 13 एमएल polypropylene ट्यूब में और तेजी homogenizer से स्थानांतरण के नमूने, 1 एम HEPES समाधान के 16 μl के साथ वापस 4 मिमी HEPES के लिए नमूना समायोजित मिश्रण को पलटना.
- 30 मिनट पूरा lysing सुनिश्चित करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूने घुमाएँ.
Synaptosomal झिल्ली अंश के 7 संवर्धन (पी 3)
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 25,000 एक्स जी पर अपकेंद्रित्र. कच्चे तेल vesicular अंश सतह पर तैरनेवाला (S3) निकालें और बाद में प्रोटीन मात्रा का ठहराव और पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करने के लिए एक 5 मिलीलीटर ट्यूब में यह सुरक्षित रखते हैं. 0.32 एम HEPES बफर sucrose के समाधान के 1 मिलीलीटर में synaptosomal झिल्ली अंश (पी 3) Resuspend.
टूटनेवाला सुक्रोज ढाल के 8 तैयारी
- Pipet बिल्कुल 3.5 मिलीलीटर 1.2 एम HEPES बफर sucrose के समाधान की और वास्तव में 3.0 मिलीलीटर प्रत्येक 1.0 एम और 0.8 एम HEPE कीअलग 6 मिलीलीटर में एस बफर sucrose के समाधान टोपी ट्यूब तस्वीर. नोट: यह सूक्रोज ढाल बनाने के लिए उपयोग किया जाता है कि बफ़र्स की मात्रा पूर्व मापने के लिए किया जाता है. संस्करणों की सटीक माप जिसके परिणामस्वरूप ढ़ाल ultracentrifugation के लिए संतुलित किया जाएगा कि यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है.
- एक गिलास पाश्चर pipet और बल्ब का प्रयोग, 12 एमएल polyallomer ultracentrifuge ट्यूब को 1.2 एम HEPES बफर sucrose के समाधान के लिए स्थानांतरण. ध्यान से 1.2 एम HEPES बफर sucrose के समाधान के शीर्ष पर 1.0 एम HEPES बफर sucrose के समाधान परत. अंत में, 1.0 एम HEPES बफर sucrose के समाधान के शीर्ष पर 0.8 एम HEPES बफर sucrose के समाधान परत. प्रत्येक sucrose के समाधान के लिए एक ताजा पाश्चर pipet का प्रयोग करें और sucrose ढाल परेशान करने के लिए नहीं ख्याल रखना. एक बेंच भंवर या microcentrifuge से कंपन ढाल की अखंडता को परेशान नहीं करेगा.
- एक पाश्चर pipet का प्रयोग, तैयार टूटनेवाला sucrose ढाल के शीर्ष पर resuspended synaptosomal झिल्ली अंश (पी 3) परत.ढ़ाल झूल बाल्टी रोटर की बाल्टी के अंदर उन्हें वजन से संतुलित कर रहे हैं कि सुनिश्चित करें. बाल्टी संतुलित नहीं कर रहे हैं, तो ध्यान से रोटर बाल्टी ढाल के शीर्ष करने के लिए 0.32 एम HEPES बफर सूक्रोज जोड़ने और संतुलन के लिए एक P200 pipet का उपयोग करें.
Synaptic प्लाज्मा झिल्ली की 9 Fractionation (एसपीएम)
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए 150,000 XG पर एक झूलते बाल्टी रोटर में ultracentrifuge. ध्यान ultracentrifuge बाल्टी से सूक्रोज ढ़ाल हटा दें. एक 18 जी सुई और एक 1 मिलीलीटर सिरिंज का प्रयोग, 1.0 एम / 1.2 एम HEPES बफर sucrose के समाधान interphase के तल पर ट्यूब पंचर और synaptic प्लाज्मा झिल्ली परत (एसपीएम) वापस ले लें.
- प्रत्येक एसपीएम नमूना 1 मिलीलीटर सिरिंज में रह रहे हैं कि मात्रा का ध्यान करना. प्रत्येक नमूने समायोजित कर दिया गया है एक बार बिल्कुल 4 मिमी HEPES के 2.5 मात्रा 0.32 एम 1.2 एम से सूक्रोज एकाग्रता समायोजित करने के लिए जोड़ने के लिए, 3.5 मिलीग्राम मोटी दीवार ultracentrifuge ट्यूबों में एकत्र एसपीएम परत रखेंएड 0.32 एम sucrose के लिए, 0.32 एम HEPES बफर sucrose के समाधान के साथ ट्यूब संतुलन.
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 200.000 XG पर एक निश्चित कोण रोटर में ultracentrifuge. निकालें और सतह पर तैरनेवाला त्यागें. 50 मिमी HEPES / 2 मिमी EDTA समाधान के 300 μl में synaptic प्लाज्मा झिल्ली गोली (एसपीएम) Resuspend. -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर के नमूने पश्चिमी सोख्ता के लिए प्रयोग किया जाता है जब तक.
में postsynaptic घनत्व अंश के 10 तैयारी (PSD)
- बर्फ पर एसपीएम नमूने पिघलना.
- 50 मिमी HEPES / 2 मिमी EDTA समाधान में 0.54% ट्राइटन X-100 का समाधान करें.
- एक 5 एमएल polystyrene ट्यूब में ट्राइटन X-100 / HEPES / EDTA समाधान और 300 μl एसपीएम अंश के 2.7 मिलीलीटर गठबंधन और 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए नमूना बारी बारी
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 32,000 XG पर 3.5 मिलीलीटर मोटी दीवार ultracentrifuge ट्यूब और अपकेंद्रित्र नमूने के स्थानांतरण के नमूने.
- -80 में सतह पर तैरनेवाला (ट्राइटन X-100 घुलनशील अंश [टीएस]) और दुकान रिजर्वसी °. नोट: इस स्तर पर, गोली "PSD-1T" अंश का प्रतिनिधित्व करता है. साबुन के साथ एक दूसरा उपचार एक "PSD-2T" अंश का उत्पादन होगा. एक PSD-1T अंश वांछित है, 10.6 कदम आगे बढ़ना.
- एक PSD-2T अंश का उत्पादन करने के लिए, 50 मिमी HEPES / 2 मिमी EDTA समाधान में 3 मिलीलीटर 0.5% की ट्राइटन में गोली एक्स 100 resuspend. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए नमूने घुमाएँ. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 32,000 XG पर अपकेंद्रित्र नमूने और 10.6 कदम आगे बढ़ना.
- सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 50 मिमी HEPES / 2 मिमी EDTA समाधान में पोस्टअन्तर्ग्रथनी (PSD) गोली resuspend. नोट: मेजबान मात्रा गोली के आकार पर निर्भर हो सकता है; 50-75 μl की एक मात्रा की सिफारिश की है. PSD अंश एक डिटर्जेंट अघुलनशील अंश है, क्योंकि यह प्रोटीन का पूरा मेजबान सक्षम करने के लिए 0.5% एसडीएस के 1-2 μl जोड़ने के लिए अक्सर आवश्यक है. -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर के नमूने पश्चिमी सोख्ता के लिए प्रयोग किया जाता है जब तक.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
सुक्रोज घनत्व ढाल की तैयारी सुक्रोज (0.8, 1.0, और 1.2 एम sucrose) की तीन दाढ़ के समाधान का एक स्पष्ट विभाजन में परिणाम चाहिए. प्रोटीन नमूना जोड़ा जाता है पहले ढाल का एक उदाहरण के लिए चित्रा 3A देखें. ढाल अग्रिम में बहुत ज्यादा तैयार किया जाता है, या यह अन्य उपकरणों से कंपन के साथ एक बेंच सतह पर तैयार किया जाता है, तो ढाल समझौता हो जाएगा और उचित जुदाई हासिल नहीं किया जाएगा. तीन समाधान की एक स्पष्ट विभाजन दिखाई नहीं देता है, तो यह प्रोटीन नमूना जोड़ने से पहले एक नया ढाल बनाने के लिए सलाह दी जाती है. सुक्रोज ढाल प्रोटीन नमूना जोड़ा जाता है जब (काला तीर) का एक उदाहरण के लिए चित्रा 3B देखें.
Centrifugation के बाद, प्रत्येक interphase में प्रोटीन अंशों की स्पष्ट बैंड होना चाहिए (0.32 / 0.8 / 1.0 0.8, 1.0 / 1.2). इसके अलावा एक गोली ट्यूब के नीचे दिखाई जानी चाहिए. एक उदाहरण के लिए चित्रा 3C देखेंultracentrifugation के बाद अंश बैंड की. भिन्न ही interphase पर diffusely मौजूद हैं, तो यह ढाल समझौता किया गया था और आगे की प्रक्रिया सलाह नहीं दी है कि संभावना है.
माउस स्ट्रिएटम से कुल, एसपीएम और PSD1T प्रोटीन के नमूने के पश्चिमी सोख्ता चित्रा 2 में प्रदर्शन किया है. GluR1, PSD95, और CaMKII तरह synaptic प्रोटीन का संवर्धन, कुल, एसपीएम से प्रोटीन (10 माइक्रोग्राम) के एक निरंतर राशि लोड करके देखे जा सकते हैं , और PSD भिन्न. डोपामाइन ट्रांसपोर्टर (DAT) की तरह Perisynaptic प्रोटीन एसपीएम अंश में समृद्ध कर रहे हैं, लेकिन PSD संवर्धन प्रक्रिया के बाद डिटर्जेंट चरणों में समाप्त हो जाते हैं.
बराबर लोड हो रहा है यह सुनिश्चित करने के लिए, प्रोटीन का स्तर काकरेज़ी रंग लाल 26 से धुंधला द्वारा पश्चिमी धब्बा झिल्ली पर देखे जा सकते हैं. एंटीबॉडी आधारित "लोडिंग नियंत्रण" अक्सर साहित्य में रिपोर्ट कर रहे हैं, लेकिन synaptic प्रोटीन अन्तर हो सकता है क्योंकि यह एक मिथ्या हो सकता हैerentially प्रयोगात्मक उपचार समूहों में विनियमित. एक एंटीबॉडी आधारित "लोडिंग नियंत्रण" वांछित है, यह पहली काकरेज़ी रंग धुंधला द्वारा बराबर प्रोटीन लोडिंग का निर्धारण, और फिर विभिन्न प्रयोगात्मक समूहों में बदल नहीं है कि उन लोगों की पहचान करने के लिए कई संदर्भ प्रोटीन का परीक्षण करने की सलाह दी जाती है.
Subcellular fractionation की संख्या 1 कार्यप्रवाह एसपीएम और PSD प्रोटीन अंशों को समृद्ध करने के लिए.
माउस स्ट्रिएटम से चित्रा 2 प्रतिनिधि पश्चिमी कुल, एसपीएम का धब्बा, और PSD1T प्रोटीन. प्रोटीन निकालने के ग्राम एसडीएस अप्राकृतिकरण पर सुलझाया गया 10, 10% acrylएमाइड जैल, और PVDF झिल्ली को हस्तांतरित. इसके बाद इन blots बाद synaptic घनत्व के सभी घटक हैं जो αCaMKII, GluR1, PSD-93, और PSD-95 के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ incubated रहे थे. तदनुसार, इन प्रोटीनों एसपीएम और PSD भागों में समृद्ध कर रहे हैं. वैकल्पिक रूप से, blots स्ट्रिएटम में प्रीसानेप्टिक झिल्ली में स्थित है जो डैट के लिए एक प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ incubated रहे थे. डैट एसपीएम अंश में समृद्ध है, यह PSD परिसर का हिस्सा नहीं है, और immunoreactivity PSD अंश में नहीं मनाया जाता है. कुछ प्रयोगात्मक शर्तों के रूप में अच्छी तरह से इन प्रोटीन के स्तर को प्रभावित कर सकता है, हालांकि actin या सोडियम पोटेशियम / ATPase (ना / कश्मीर पंप) के खिलाफ एंटीबॉडी, लोडिंग नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है और इसलिए उपयुक्त लोडिंग नियंत्रण अनुभव से निर्धारित किया जाना चाहिए.
चित्रा 3. sucrose ढाल के प्रतिनिधि उदाहरण से पहले और ultracentrifugation के बाद. ढाल तैयार है ए करने के बाद, ट्यूब लाइट अप करने के लिए आयोजित किया जाता है जब दिखाई दे रहे हैं कि तीन चरणों होना चाहिए. सफेद तीर 0.8 / 1.0 एम sucrose के समाधान और 1.0 / 1.2 एम sucrose के समाधान के बीच interphase संकेत मिलता है. बी नमूना ढाल के शीर्ष पर लोड किया जाता है, यह एक 0.32 एम sucrose के समाधान में है और 0.8 के शीर्ष पर आराम करेंगे एम सूक्रोज परत. सी centrifugation के बाद, homogenate कई भागों में अलग कर देगा. 0.8 / 1.0 एम sucrose के समाधान के interphase पर चल अंश माइलिन झिल्ली में समृद्ध होगा. 1.0 / 1.2 एम sucrose के समाधान के interphase में अंश एक सुई और सिरिंज के साथ एकत्र किया जाता है कि एसपीएम अंश का प्रतिनिधित्व करता है. ट्यूब के नीचे गोली mitochondrial प्रोटीन के लिए समृद्ध है.
| समाधानमाहौल | HEPES बफर सूक्रोज | Protease inhibitors | * Phophatase अवरोधकों |
| 1 एम HEPES 7.4 पीएच | 0.32 एम sucrose 4 मिमी HEPES (7.4 पीएच) में | 0.25 मिमी PMSF (शेयर इथेनॉल में 250 मिमी, 1,000x) | 10 मिमी सोडियम फ्लोराइड (शेयर 500 मिमी, 50x) |
| 4 मिमी HEPES 7.4 पीएच | 0.8 एम sucrose 4 मिमी HEPES (7.4 पीएच) में | 1.5 माइक्रोग्राम / एमएल Aprotinin (शेयर 1.5 मिलीग्राम / एमएल, 1,000x) | 2.5 मिमी सोडियम पाइरोफॉस्फेट (शेयर 250 मिमी, 100x) |
| DDH 2 हे | 1.0 एम sucrose 4 मिमी HEPES (7.4 पीएच) में | 10 माइक्रोग्राम / एमएल Leupeptin (शेयर 10 मिलीग्राम / एमएल, 1,000x) | 1.0 मिमी बी glycerophosphate (शेयर 200 मिमी, 200x) |
| 50 मिमी HEPES (7.4 पीएच) 2 मिमी EDTA | 1.2 एम sucrose 4 मिमी HEPES (7.4 पीएच) में | 0.1 मिलीग्राम / एमएल Benzamidine (शेयर 100 मिलीग्राम / एमएल, 1,000x) | 5.0मिमी सोडियम Orthovanadate (शेयर 500 मिमी, 100x) |
| 10 माइक्रोग्राम / एमएल Pepstatin (शेयर 5 मिलीग्राम / इथेनॉल में मिलीलीटर, 500x) |
तालिका 1 आवश्यक अभिकर्मकों
| अंश | प्रोटीन अंश | प्रोटीन मार्कर |
| P1 | परमाणु | हिस्टोन एच 1 27 |
| S1 | cytosol / झिल्ली | calnexin 28 (endoplasmic जालिका), एक ट्यूबिलिन 29 (cytoskeleton), GAPDH 30 (cytosol), 58K Golgi समर्थकTein 31 (Golgi तंत्र) |
| इस p2 और p2 ' | कच्चे तेल synaptosomes | AMPA और NMDA रिसेप्टर सब यूनिटों 32 |
| S2 और S2 ' | cytosol / प्रकाश झिल्ली | nNOS1 29 (cytosol), GAPDH (cytosol), LAMP1 33 (लाइसोसोम), PEX14 34 (peroxisome) |
| पी 3 | synaptosome / माइटोकॉन्ड्रिया | VDAC 35 (माइटोकॉन्ड्रिया), AMPA और NMDA रिसेप्टर सब यूनिटों (synaptosome) |
| S3 | अन्तर्ग्रथनी पुटिका | SV2 8, synaptophysin 8 |
| 0.8 एम / 1.0 एम | एम yelin | माइलिन बुनियादी प्रोटीन 36 |
| 1.0 एम / 1.2 एम | एसपीएम | AMPA और NMDA रिसेप्टर सब यूनिटों, presynaptic मार्कर (SNAP25 8), neurexin 32, neuroligin 32 |
| 1.2 सांसद | माइटोकॉन्ड्रिया | VDAC 35 |
| PSD (1T) | PSD | PSD93 32, PSD95 32, AMPA और NMDA रिसेप्टर सब यूनिटों, neuroligin, PICK1 32, CaMKII 32 |
| टीएस | प्रीसानेप्टिक झिल्ली | SNAP25, Munc18 37, अलगोजा 38, neurexin |
| समृद्ध PSD | PSD95, AMPA और NMDA रिसेप्टर सब यूनिटों, PICK1, CaMKII |
प्रोटीन मार्कर की तालिका 2 सूची subcellular भिन्न भेद करने के लिए
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
एक सफल परिणाम के लिए महत्वपूर्ण हैं कि प्रक्रिया में कई कदम उठाए हैं. चरण 3 में, यह homogenization के अनुरूप एक डिग्री प्रत्येक नमूने के लिए हासिल की है कि महत्वपूर्ण है. मोटर चालित homogenizer साथ ऊतक homogenizing, जब एक स्थिर गति मूसल के रोटेशन के लिए, लेकिन यह भी स्ट्रोक की संख्या के साथ न केवल प्रयोग किया जाता है. hypotonic समाधान में विस्तारित homogenization या ऊष्मायन माइटोकॉन्ड्रिया lyse और एसपीएम नमूने दूषित होगा क्योंकि आसमाटिक सदमे दौरान ऊष्मायन समय, सटीक होना चाहिए.
एक और महत्वपूर्ण कदम अभिकर्मकों, विशेष रूप से sucrose के समाधान की तैयारी में है; sucrose के समाधान के molarity गलत है अगर प्रक्रिया से काम नहीं चलेगा. इसलिए, सूक्रोज समाधान तो सटीक अंतिम मात्रा 4 मिमी HEPES जोड़ने 4 मिमी HEPES समाधान में भंग, सूक्रोज वजन द्वारा तैयार किया जाना चाहिए. समस्या निवारण टिप: एन के लिए तैयार sucrose के समाधान के साथ एक परीक्षण ढाल का निर्माणढाल ठीक से इकट्ठा किया है कि सुनिश्चित करें. Bromophenol नीले रंग के अलग सांद्रता तीन sucrose के समाधान के दो तीन अलग परतों के दृश्य में सहायता करने के लिए (0.005% v / डब्ल्यू -0.02% के उदाहरण के लिए, अंतिम एकाग्रता) जोड़ें.
यह ढाल इकट्ठा होता है और जब ट्यूबों centrifuged हैं जब बीच के समय की राशि को सीमित करने के लिए महत्वपूर्ण है. सामान्य प्रसार समय के साथ ढाल को नष्ट कर देगा, और ढाल संग्रहीत किया जाता है, जहां बेंच पर कंपन अगर वहाँ इस त्वरित है. सटीक मात्रा में एक गिलास पाश्चर pipet साथ pipetted जा करने के लिए व्यक्तिगत aliquots में समाधान की पूर्व pipetting की अनुमति देता है. यह भी ढाल विधानसभा और ultracentrifugation के बीच समय कम हो जाती है. समस्या निवारण टिप: प्रयोग के लिए सूक्रोज ढ़ाल के रूप में एक ही समय में ऊपर वर्णित के रूप में bromophenol नीले रंग के साथ एक "परीक्षण ढाल" का निर्माण. ढाल की अखंडता इस प्रकार समय के साथ नजर रखी जा सकता है. परीक्षण ढाल के रूप में काम करेगाप्रसार का सूचक ढ़ाल अग्रिम में बहुत दूर इकट्ठा कर रहे हैं या कंपन को उजागर कर रहे हैं.
अंत में, यह यह बाद में पानी की 2.5 संस्करणों के साथ नमूना पतला करने के लिए आवश्यक है, जितना संभव हो छोटा एक मात्रा में एसपीएम नमूना एकत्र करने के लिए महत्वपूर्ण है. आदर्श नमूना एक 1 सीसी सिरिंज का उपयोग 0.4-0.7 मिलीग्राम की मात्रा में एकत्र किया जाना चाहिए. यह ढाल विधानसभा और ultracentrifugation के बीच के समय को सीमित करने के चरण 7 में अंतिम 20 मिनट स्पिन दौरान टूटनेवाला ढ़ाल का निर्माण करने की सलाह दी जाती है.
प्रोटोकॉल विभिन्न भागों के सभी आरक्षण और बाद के विश्लेषण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर इन स्टोर करने की सिफारिश भी शामिल है. हम इन अंशों के कुछ ही में चित्रा 2 में बाद synaptic प्रोटीन के संवर्धन का प्रदर्शन किया है. हालांकि, यह इसके वितरण को समझने के लिए भिन्न में से प्रत्येक में एक प्रोटीन के हित के स्तर को मापने के लिए उचित है. Distrib मुकाबलेअन्य subcellular मार्कर प्रोटीन के साथ भागों में एक प्रोटीन की ution भी प्रयोगात्मक शर्तों वांछित विभाजन हासिल किया है कि इस बात की पुष्टि करने में मदद मिलेगी. तालिका 2 विभाजन के चरणों के लिए संकेतक के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है कि सामान्य रूप से प्रयुक्त प्रोटीन मार्कर का सार 8,27- 38.
टूटनेवाला sucrose ढाल का उपयोग व्यापक रूप से synaptic प्लाज्मा झिल्ली को समृद्ध करने के लिए प्रयोग किया जाता है. इस विधि बनाने के लिए आसान कर रहे हैं और विशेष उपकरणों की आवश्यकता नहीं है कि टूटनेवाला सूक्रोज ढ़ाल में निरंतर Percoll ढ़ाल से अधिक लाभ है. हालांकि, इस पद्धति ठीक ब्याज की एक प्रोटीन स्थानीयकरण करने के लिए पर्याप्त नहीं हो सकता है, और इन आवेदनों के लिए एक Percoll ढाल पसंद किया जा सकता.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M HEPES, pH 7.4 | BioShop | HEP003.100 | |
| HEPES | BioShop | HEP001.500 | |
| Sucrose | BioShop | SUC507.1 | |
| EDTA | BioBasic | EB0185 | |
| PMSF | BioShop | PMS123.5 | |
| Aprotinin | BioShop | APR600.1 | |
| Leupeptin | BioShop | LEU001.1 | |
| Pepstatin | BioShop | PEP605.5 | |
| Benzamidine | BioShop | BEN601.25 | |
| Sodium fluoride | BioShop | SFL001.100 | |
| Sodium pyrophosphate | BioShop | SPP310.100 | |
| Sodium orthovanadate | BioShop | SOV664.10 | |
| β-glycerophosphate | BioShop | GYP001.10 | |
| Triton X-100 | BioShop | TRX506.500 | |
| 18 G x 1 ½” needle | BD | 305196 | |
| 1 cc syringe | BD | 309659 | |
| Glass Teflon homogenizer Kontes Duall 23 | VWR | KT885450-0023 | |
| IKA Model RW 16 basic stirrer | IKA Works | 2572100 | |
| Sorvall SM-24 fixed angle rotor | ThermoScientific | 29017 | |
| Sorvall RC 6 Plus centrifuge | ThermoScientific | 46910 | |
| Thinwall polyallomer tubes (13.2 ml) | Beckman Coulter | 331372 | |
| SW 41 Ti rotor swinging bucket | Beckman Coulter | 331362 | |
| Beckman L-80 floor ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Thickwall polycarbonate tubes (3.5 ml) | Beckman Coulter | 349622 | |
| TLA-100.3 fixed angle rotor | Beckman Coulter | 349481 | |
| Beckman TL-100 tabletop ultracentrifuge | Beckman Coulter |
References
- Delint-Ramirez, I., et al. In vivo composition of NMDA receptor signaling complexes differs between membrane subdomains and is modulated by PSD-95 and PSD-93. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 30, 8162-8170 (2010).
- Wang, Q., et al. The psychiatric disease risk factors DISC1 and TNIK interact to regulate synapse composition and function. Mol Psychiatry. 16, (2010).
- Ehlers, M. D. Reinsertion or degradation of AMPA receptors determined by activity-dependent endocytic sorting. Neuron. 28, 511-525 (2000).
- Tomita, S., Fukata, M., Nicoll, R. A., Bredt, D. S. Dynamic interaction of stargazin-like TARPs with cycling AMPA receptors at synapses. Science. 303, 1508-1511 (2004).
- Ehlers, M. D., Heine, M., Groc, L., Lee, M. C., Choquet, D. Diffusional trapping of GluR1 AMPA receptors by input-specific synaptic activity. Neuron. 54, 447-460 (2007).
- Bats, C., Groc, L., Choquet, D. The interaction between Stargazin and PSD-95 regulates AMPA receptor surface trafficking. Neuron. 53, 719-734 (2007).
- Ehlers, M. D. Activity level controls postsynaptic composition and signaling via the ubiquitin-proteasome system. Nat Neurosci. 6, 231-242 (2003).
- Cartier, E. A., et al. A biochemical and functional protein complex involving dopamine synthesis and transport into synaptic vesicles. J Biol Chem. 285, 1957-1966 (2010).
- Rodriguez de Lores, A., Alberici, M., De Robertis, E. Ultrastructural and enzymic studies of cholinergic and non-cholinergic synaptic membranes isolated from brain cortex. Journal of Neurochemistry. 14, 215-225 (1967).
- Gray, E. G., Whittaker, V. P. The isolation of nerve endings from brain: an electron-microscopic study of cell fragments derived by homogenization and centrifugation. J Anat. 96, 79-88 (1962).
- Cotman, C. W., Taylor, D. Isolation and structural studies on synaptic complexes from rat brain. J Cell Biol. 55, 696-711 (1972).
- Cotman, C. W., Banker, G., Churchill, L., Taylor, D. Isolation of postsynaptic densities from rat brain. The Journal of Cell Biology. 63, 441-455 (1974).
- Carlin, R. K., Grab, D. J., Cohen, R. S., Siekevitz, P. Isolation and characterization of postsynaptic densities from various brain regions: enrichment of different types of postsynaptic densities. The Journal of Cell Biology. 86, 831-845 (1980).
- Jones, D. H., Matus, A. I. Isolation of synaptic plasma membrane from brain by combined flotation-sedimentation density gradient centrifugation. Biochim Biophys Acta. 356, 276-287 (1974).
- Kennedy, M. B., Bennett, M. K., Erondu, N. E. Biochemical and immunochemical evidence that the "major postsynaptic density protein" is a subunit of a calmodulin-dependent protein kinase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 80, 7357-7361 (1983).
- Moon, I. S., Apperson, M. L., Kennedy, M. B. The major tyrosine-phosphorylated protein in the postsynaptic density fraction is N-methyl-D-aspartate receptor subunit 2B. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 3954-3958 (1994).
- Cho, K. O., Hunt, C. A., Kennedy, M. B. The rat brain postsynaptic density fraction contains a homolog of the Drosophila discs-large tumor suppressor protein. Neuron. 9, 929-942 (1992).
- Salahpour, A., et al. Increased amphetamine-induced hyperactivity and reward in mice overexpressing the dopamine transporter. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 4405-4410 (2008).
- Ma, D. K., et al. Neuronal activity-induced Gadd45b promotes epigenetic DNA demethylation and adult neurogenesis. Science. 323, 1074-1077 (2009).
- Budreck, E. C., Scheiffele, P. Neuroligin-3 is a neuronal adhesion protein at GABAergic and glutamatergic synapses. The European Journal of Neuroscience. 26, 1738-1748 (2007).
- Wu, J., et al. Arc/Arg3.1 regulates an endosomal pathway essential for activity-dependent beta-amyloid generation. Cell. 147, 615-628 (2011).
- Huttner, W. B., Schiebler, W., Greengard, P., De Camilli, P. Synapsin I (protein I), a nerve terminal-specific phosphoprotein. III. Its association with synaptic vesicles studied in a highly purified synaptic vesicle preparation. J Cell Biol. 96, 1374-1388 (1983).
- Nagy, A., Baker, R. R., Morris, S. J., Whittaker, V. P. The preparation and characterization of synaptic vesicles of high purity. Brain Res. 109, 285-309 (1976).
- Cheng, D., et al. Relative and absolute quantification of postsynaptic density proteome isolated from rat forebrain and cerebellum. Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 5, 1158-1170 (2006).
- Sheng, M., Hoogenraad, C. C. The postsynaptic architecture of excitatory synapses: a more quantitative view. Annu Rev Biochem. 76, 823-847 (2007).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning : a Laboratory Manual. , 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
- Eggena, M., et al. Identification of histone H1 as a cognate antigen of the ulcerative colitis-associated marker antibody pANCA. J Autoimmun. 14, 83-97 (2000).
- Salahpour, A., et al. Homodimerization of the beta2-adrenergic receptor as a prerequisite for cell surface targeting. J Biol Chem. 279, 33390-33397 (2004).
- Bernocco, S., et al. Sequential detergent fractionation of primary neurons for proteomics studies. Proteomics. 8, 930-938 (2008).
- Grunewald, T. G., et al. Nuclear localization and cytosolic overexpression of LASP-1 correlates with tumor size and nodal-positivity of human breast carcinoma. BMC Cancer. 7, 198 (2007).
- Heimann, K., Percival, J. M., Weinberger, R., Gunning, P., Stow, J. L. Specific isoforms of actin-binding proteins on distinct populations of Golgi-derived vesicles. J Biol Chem. 274, 10743-10750 (1999).
- Neff, R. A. 3rd, Gomez-Varela, D., Fernandes, C. C., Berg, D. K. Postsynaptic scaffolds for nicotinic receptors on neurons. Acta Pharmacol Sin. 30, 694-701 (2009).
- Cella, N., Cornejo-Uribe, R. R., Montes, G. S., Hynes, N. E., Chammas, R. The lysosomal-associated membrane protein LAMP-1 is a novel differentiation marker for HC11 mouse mammary epithelial cells. Differentiation. 61, 113-120 (1996).
- Otera, H., et al. Peroxisomal targeting signal receptor Pex5p interacts with cargoes and import machinery components in a spatiotemporally differentiated manner: conserved Pex5p WXXXF/Y motifs are critical for matrix protein import. Mol Cell Biol. 22, 1639-1655 (2002).
- Goubaeva, F., et al. Cardiac mitochondrial connexin 43 regulates apoptosis. Biochem Biophys Res Commun. 352, 97-103 (2007).
- Lamers, K. J., et al. Protein S-100B, neuron-specific enolase (NSE), myelin basic protein (MBP) and glial fibrillary acidic protein (GFAP) in cerebrospinal fluid (CSF) and blood of neurological patients. Brain Res Bull. 61, 261-264 (2003).
- Arunachalam, L., et al. Munc18-1 is critical for plasma membrane localization of syntaxin1 but not of SNAP-25 in PC12 cells. Mol Biol Cell. 19, 722-734 (2008).
- Brandstatter, J. H., Fletcher, E. L., Garner, C. C., Gundelfinger, E. D., Wassle, H. Differential expression of the presynaptic cytomatrix protein bassoon among ribbon synapses in the mammalian retina. Eur J Neurosci. 11, 3683-3693 (1999).
