Summary
En fremgangsmåte for å undersøke kapasiteten av en alkohol forbundet miljøsammenheng for å utløse fornyelse av alkohol-søkende adferd hos rotter, er beskrevet.
Abstract
Miljø sammenhenger der narkotika av misbruk er fortært kan utløse craving, en subjektiv Pavlovian-betinget reaksjon som kan legge til rette for narkotika-søkende atferd og rask tilbakefall i rusfrie narkotikabrukere. Vi har utviklet en prosedyre for å studere de atferdsmessige og nevrale prosesser som formidler virkningen av sammenheng på alkohol-søkende atferd hos rotter. Etter akklimatisering til smak og farmakologiske effekter av 15% etanol i hjemmet buret, mannlige Long-Evans rotter får Pavlovian diskriminering trening (PDT) i condition kamre. I hvert daglig (man-fre) PDT økt, 16 forsøk hver av to stimuli annerledes 10 sek auditiv klimaanlegg oppstå. I løpet av en stimulans, CS +, 0,2 ml av 15% etanol, overført i en fluidport for oralt inntak. Den andre stimulus, den CS-, er ikke koblet sammen med etanol. Tvers sesjoner, oppføringer i fluidport under CS + økning, mens innlegg under CS- stabilisere seg på et lavere nivå, som indikerer at en Predictive assosiasjon mellom CS + og etanol er ervervet. Under PDT hvert kammer er utstyrt med en bestemt konfigurasjon av visuelle, olfactory og taktile stimuli kontekstuelle. Etter PDT, er utryddelse treningen utføres i samme kammer som nå er utstyrt med en annen konfigurasjon av kontekstuelle stimuli. CS + og CS- presenteres som før, men etanol er holdt tilbake, noe som fører til en gradvis nedgang i havne innlegg under CS +. Ved test, blir rottene plassert tilbake i PDT sammenheng og presentert med CS + og CS- som før, men uten etanol. Dette manipulasjon utløser en robust og selektiv økning i antall havne oppføringer gjort i løpet av alkohol prediktiv CS +, med ingen endring i å svare i løpet av CS-. Denne effekten, referert til som forbindelse-indusert fornyelse, illustrerer den kraftige kapasiteten sammenhenger forbundet med alkohol for å stimulere alkohol økende oppførsel som reaksjon på Pavlovian alkohol signaler.
Introduction
Resterende edru er en betydelig utfordring for personer som lider av alkoholmisbruk lidelser. Avholdenhet er en tid med sårbarhet for de atferdsmessige, psykologiske og fysiologiske effekten av miljømessige stimuli som rutinemessig følger alkoholbruk, som kan, gjennom Pavlovian condition, blir assosiert med beruselse 1,2. Eksponering for alkohol prediktive signaler kan lokke fram betingede responser som alkohol craving, som kan fremme alkohol søker atferd som letter tilbakefall 3,4.
De stereotype sekvenser av atferd som fører til alkoholforbruk kan føre til visse typer stimuli som skal rutinemessig oppleves umiddelbart før de farmakologiske effektene av alkoholinntak. For eksempel, syn, lukt og smak av alkohol er sensoriske egenskaper av alkohol som pålitelig forut rus. I tillegg til slike signaler, som er referert til som 'diskret' eller 'Proximal 'signaler, miljø sammenhenger der narkotika brukes regelmessig kan også provosere craving 5,6. Eksponering for fysiske steder der narkotika tidligere har vært brukt kan derfor være en kritisk trigger for tilbakefall 7.
Dyremodeller har blitt utviklet for å studere nevrale mekanismer som medierer effekten av narkotika i forbindelse sammenhenger på narkotika-søkende atferd 8-13. Prosedyren beskrevet her åpner for etterforskningen av hvordan sammenhenger knyttet til alkoholforbruk kan modulere alkohol søkende atferd som er utløst av et diskret, alkohol prediktiv Pavlovian stikkordet.
Pavlovian diskriminering treningen foregår i en bestemt miljøsammenheng, hvor rotter er opplært til atferdsmessig skille mellom to auditive klimaanlegg stimuli, en CS + som er sammenkoblet med alkohol, og en CS- som ikke er det. Utryddelse sesjoner blir deretter utført i en annen sammenheng, der svarer til CS+ Avtar som et resultat av alkohol blir tilbakeholdt. Deretter gjenåpning til alkohol forbundet, Pavlovian trening sammenheng utløser en selektiv økning i alkohol-søkende atferd utløst av CS +, med ingen endring i å svare på CS-. Dette resultatet, som vi har konsekvent replikert 9,14-16, strekker funn fra instrument condition prosedyrer der narkotika sammenhenger har blitt funnet å stimulere fornyelse av operante responser i forbindelse med levering av legemidler 10,13.
Protocol
Alle prosedyrer er godkjent av forsøksdyrutvalget etiske komité ved Concordia University og stemme med anbefalinger fra den kanadiske Council on Animal Care.
1. Dyr
- Skaff mannlige Long-Evans rotter (220 - 240 g ved ankomst).
- Oppretthold rotter i en temperatur (21 ° C) og fuktighet (44%) som styres anlegget for dyrehold, på en 12 timers lys-mørke syklus med lys på på 7:00.
- Pair-huset rotter ved ankomst. Etter 3 dager, house rotter enkeltvis i plast skoeske merder med beta-chip sengetøy, en nylon bein, og fri tilgang til standard rotte chow og vann. Bruk bur lokk som har dobbelts maljer for å tillate den etterfølgende plassering av en andre flaske, i tillegg til den vann flaske. MERK: Rotter kan være individuelt plassert så snart de kommer i dyr omsorg anlegget.
- Begynn å håndtere rotter daglig. MERK: Som en guide, er en uke håndtering vanligvis tilstrekkelig til å akklimatisere dem til å være picked opp og håndteres av eksperimentator.
2. Intermitterende Etanol Tilgang i hjemmet buret
MERK: Gjennomføre periodisk etanol tilgang i hjemmet buret for å sikre at rotter vil drikke fysiologisk relevante mengder av etanol før atferdstreningsfasen av forsøket begynner 17-19. Initiere denne prosedyre under lett fase, selv om den kan initieres ved ethvert tidspunkt i løpet av den lyse eller mørke syklus.
- Forbered to flasker for hver rotte.
- Bruk en 100 ml gradert sylinder av plast som etanol flaske og en 473 ml standard plastflaske. Bruk en forholdsvis liten kapasitet etanol flaske, fylt nesten til maksimal volumkapasitet, for å minimalisere tap av etanol på grunn av lekkasje og fordampning.
- Fyll en flaske med 15% etanol, laget ved å fortynne 95% etanol i vann fra springen. MERK: Andre etanolkonsentrasjoner, for eksempel 10% eller 20%, kan anvendes i stedet for 15% etanol.
- Fill den andre flasken med vann fra springen.
- Sett i en gummipropp, som med en sipper tube som inneholder et kulelager for å minimere lekkasje inn i hver flaske.
- Sett opp to kontroll bur, som ble behandlet identisk til hjemme mærer med unntak av at styre burene ikke inneholder rotter eller sengetøy.
- Forbered etanol og vann flasker for kontroll bur som spesifisert i trinn 2.1.1 - 2.1.4.
- Bruk måler oppnådd fra kontroll bur for å kontrollere for søl og / eller fordampning som måtte forekomme i løpet av etanolen tilgangssøkt (som beskrevet i trinn 2.8.1 - 2.8.2).
- Veie alle etanol og vannflasker. Registrere alle vekter.
- Vei alle rotter. Registrere alle vekter.
- Plasser flasken etanol og vann flasken på hver hjemmeburet og kontrollere bur på samme tid. Legg igjen både flasker på merdene for 24 hr.
- Ved slutten av 24-timers perioden, fjerner begge flasker frabur på samme tid.
- Veie alle etanol og vannflasker. Registrere alle vekter.
- For å bestemme hvor mye etanol og vann ble konsumert i løpet av 24-timers perioden, subtrahere vekten av hver flaske når den ble fjernet fra hjemmeburet fra vekten av flasken når den ble plassert på hjemmeburet 24 timer tidligere for hver rotte.
- Gjør det samme for de to kontroll bur, og deretter beregne gjennomsnittlig mengde utslipp for hver væske.
- Trekk fra det gjennomsnittlige beløpet av etanol og vann søl, henholdsvis fra tilsvarende etanol og vannforbruk tiltak for hver rotte.
- Bruk disse søl kontrollert forskjell tiltak for å beregne etanol forbruk i g / kg, forbruket av vann og etanol preferanse.
- For å beregne etanol forbruk (g / kg), først konvertere vekten (g) i etanoloppløsning forbrukes til volum (ml) basert på tettheten av den totale løsningen (etanol + vann-komponenter), i henholdtil formelen Volum (ml) = Vekt (g) / Tetthet (g / ml). MERK: tettheten av løsningen vil variere som en funksjon av etanolkonsentrasjon.
- Deretter multiplisere volumet (ml) av etanol-løsning forbrukes av densitet (g / ml) av etanol skalert for den bestemte prosent løsning som brukes, for å gi vekten (g) i etanol konsumeres.
- Del vekt (g) i etanol forbrukes av rottevekt (kg) for å oppnå g / kg måling av etanol forbruk.
- For å beregne etanol preferanse, uttrykke etanol inntak (ml) i prosent av total væske (etanol + vann, ml) inntak.
- Returnere vannflasken bare tilbake til rotte hjem buret. For de neste 24 timer, gi rotter adgang til vann, men ikke etanol. I stedet for en etanol flaske, plassere en forhånds-veid andre flaske på hjemmet buret.
- Ved slutten av 24-timers perioden, fjerner både vannflasker fra buret samtidig.
- Veie begge settene med vannflasker. Registrere alle weights.
- Trekk fra vekten av hver flaske når den ble fjernet fra hjemmeburet fra vekten av flasken når den ble plassert på hjemmeburet 24 timer tidligere, å trekke ut den gjennomsnittlige søl mål oppnådd fra kontroll bur som beskrevet i trinn 2.8.1 - 2.8.2.
- Bruk disse søl styrte forskjellen tiltak for å beregne forbruket av vann.
- Starte syklusen igjen ved å tilveiebringe både etanol og vann flasker til rotter, som beskrevet i trinn 2.1 til 2.14.
- Gjenta denne syklusen for flere (ca 12) økter å indusere høye og stabile nivåer av etanol forbruk. Se figur 1 for representative resultatene av etanol forbruk (g / kg) i hjemmet buret.
- Alternative den romlige posisjonen av etanol og vann flaske på buret lokket tvers sesjoner for å hindre utviklingen av en side preferanse.
- Foreta en frisk etanol-løsning en gang per uke for å sikre nøyaktig og stabil etanolkonsentrasjon på tversøkter. Minimere virkningen av fordampning av etanol over lengre perioder av gangen ved hjelp av denne tilnærmingen.
3. Apparat
- Hus hver conditioning kammer inne i en ventilert, lyd-demping bås.
- Konstruer hver conditioning kammer av rustfritt stål metall stang gulvet, en klar polykarbonat taket, klar polykarbonat bakveggen og inngangsdør, og aluminium metall panelvegger.
- Installer en fluidport sentralt nær bunnen av den høyre sidevegg av metall. Utstyre inngangen til væskeport med en infrarød fotocelle for å detektere oppføringer i porten.
- Koble polyetylenrør fra baksiden av fluidporten til en 20 ml sprøyte inneholdende etanol under anvendelse av en butt tupp kanyle. Plasser sprøyten i en sprøyte pumpe plassert utenfor lyden dempende bås. For Pavlovian diskriminering treningsøkter, laste etanol i sprøyten før du legger det inn i pumpen. Prime slangen by manuelt fremme pumpen, og deretter tørke bort overskytende etanol fra væskeporten.
- På den venstre sidevegg, sett inn en hvit houselight sentralt nær taket av kammeret.
- Installer en klikkeren (2 Hz syklus) og en hvit støy generator med høyttaler i øvre venstre hjørne av venstre sidevegg.
- Utstyre hver kondisjone kammer med en bestemt konfigurasjon av visuelle, olfaktoriske og taktile stimuli for å lage en karakteristisk sammenheng.
- Bruk to forskjellige sammenhenger, utpekt kontekst 1 og kontekst 2. Konfigurer halvparten av kondisjoneringskamre som kontekst 1 og den andre halvparten som Context to.
- Slik oppretter Kontekst 1, plasserer svarte papp paneler enn foran taket og og rygg veggene i kammeret, spray sitron lukt (10% v / v, laget ved å fortynne sitron olje i vann fra springen) i en petriskål og legg den i sentrum av en metallavfallsbrett under gulvet av kammeret, og sette inn en klar polykarbonat gulvpanel over metall rod gulvet. Linje avfall brett med absorberende papir håndkle eller benk liner.
- For å opprette Context 2, forlate og tak og foran bakvegger av kammeret avdekket, slik at de er klare, spray mandel lukt (10% v / v, laget ved å fortynne -benzaldehyd i vann fra springen) i en petriskål og plassere den sentralt i en metallavfallsbrett under gulvet av kammeret, og sette inn en perforert metallgulvpanel over metallstang gulvet. Linje avfall brett med absorberende papir håndkle eller benk liner.
4. Tilvenning
Tilvenne rotter til atferdstreningsrommet, og hver av de to sammenhenger innenfor condition kamre. For denne fasen av forsøket, må du ikke legge etanol i de 20 ml sprøyter.
- Tilvenne rotter til prosessen med å bli transportert fra dyret omsorg anlegget til atferdstreningsrommet i laboratoriet i to korte habituering økter.
- I den første økten, legger rottene jegn hjem bur mot en hjul vogn i dyret omsorg anlegget, og transportere dem til atferdstreningsrommet i laboratoriet. Belyse rommet lysene, slå på fans i hvert lyddempende bås, gå ut av rommet, lukke døren og la rottene tilpasse seg dette nye miljøet for 20 min, mens resterende i sine hjemme bur på handlevognen. På slutten av denne 20 minutters periode, tilbake rottene til anlegget for dyrehold.
- I den andre økten, ta med rottene til atferdstreningsrommet i laboratoriet. Som før, la lysene og cubicle fans på i rommet. Forbli i rommet, med døren lukket for å unngå distraksjoner, og håndtere og veie hver rotte i atferdstreningsrommet. Spill vektene, og deretter gå tilbake rottene til dyret omsorg anlegget.
- Tilvenne rotter til condition kamre i to korte habituering økter.
- Transportere rottene til atferdstreningsrommet, spille inn hver rotte vekt,og laste hver rotte i sin utpekte conditioning kammeret.
- I den første tilvenning økten satt opp halve kamre som kontekst 1 og resten som Context to.
- I den andre tilvenning sesjon satt opp hvert kammer med konteksten som ikke ble brukt i den foregående økt.
- Gjennomføre habituering økter i en motvekts mote, slik at halvparten av rottene er først utsatt for Context 1, etterfulgt av Context 2, og den andre halvparten er først utsatt for Context 2, etterfulgt av Context 1. Ideelt gjennomføre både habituering økter i samme dag, selv om de kan være spredt over to dager hvis nødvendig.
- For habituering økter, bruker et dataprogram for å belyse houselight 1 min etter at programmet har blitt utstedt. Spill det totale antall væskeport oppføringer gjort i løpet av en 20 min økt. På slutten av økten, programmere houselight å slå av. Ikke presentere noen etanol eller pekepinner under habituering økter.
- Rengjøre utstyret (f.eks etasje paneler, avfalls skuffer, petriskåler). Se trinn 5.7 for ytterligere detaljer.
5. Pavlovian Diskriminering Training (PDT)
Tog rotter til atferdsmessig skille mellom en auditiv cue som er sammenkoblet med etanol og en annen auditiv kø som ikke er det. For denne fase av forsøket, fyller de 20 ml sprøyter med 15% etanol.
- Utstyre hver kondisjone kammer med en bestemt konfigurasjon av visuell, olfactory, og taktile stimuli for å skape en karakteristisk sammenheng, som beskrevet i trinn 3.3.2 og 3.3.3
- Tildele halvparten av rottene i Context 1 og den andre halvparten i Context 2 i en Toyota motvektstrucker mote, basert på etanol forbruk og preferanser i gjennomsnitt over de siste to økter av hjemmet buret etanol tilgang prosedyre. Referer til fortsext brukt under PDT som Context A. MERK: Hver rotte bør bare oppleve én sammenheng i denne fasen av opplæringen.
- Pass på at lukte stimulus er den siste kontekstuell stimulus som skal legges til hvert conditioning kammeret. Lukke dørene i kammeret og lyd-demping avlukke å inneholde olfactory stimulus og minimere å blande sammen forskjellige lukt.
- Ta med rottene inn i atferdstreningsrommet, spille inn hver rotte vekt, og legg hver rotte inn i sin utpekte conditioning kammeret.
- Initiere dataprogrammet som styrer følgende sekvens av hendelser i løpet av hver PDT økt.
- På 5 min etter at programmet har blitt utstedt, belyse houselight.
- Presentere hvit støy stimulans og klikkeren stimulans 16 ganger hver. Utpeke en av disse lyd-inntrykk for å være den CS + og den andre til å være den CS-, i en motvektsmote over begge sammenhenger.
- Gjør hver CS + og CS- rettssaken last 10 sek.
- Lever 0,2 ml etanol inn i fluidporten under den siste 6 sekunder i CS +. Ikke leverer noen etanol under CS-.
- Gjør hver PDT session siste 58 min i gjennomsnitt. Presentere CS + og CS- hver på en variabel tid 67 sek tidsplan.
- Record væskeport oppføringer i løpet av 10 sek CS intervall (10 sekunder under CS presentasjon), er 10 sek pre-CS-intervallet (i 10 sek umiddelbart forut for innsett CS), og 10 sek etter-CS-intervallet (i 10 sek umiddelbart følgende CS offset) for både CS + og CS- presentasjoner, samt total væskeport oppføringer for hele økten. Også spille inn varigheten av hver port oppføring gjort i løpet av disse intervallene.
- På slutten av økten, slå houselight av.
- Fjern rotter fra kamrene, returnere dem til hjem bur, og frakte dem tilbake til dyret omsorg anlegget.
- Kontroller fluidportene for å sikre at de forbrukes rotter 3,2 ml etanol ble levert i hver PDT session.
- Skyll etanol ut av polyetylenrør med en 60 ml sprøyte inneholdende en liten mengde vann. Deretter passerer 60 ml luft gjennom slangen ved hjelp av et sekund, tom sprøyte, for å kontrollere at den er tørr.
- Rengjøre utstyret. For daglig rengjøring, vask gulvplatene, avfallsskuffer og petriskåler. En gang i uken, rydde hele kondisjoneringskammeret. Ikke bruk parfymerte rengjøringsprodukter for å unngå å introdusere uønsket lukt inn i den eksperimentelle apparater.
- Fortsett PDT økter daglig til rotter viser stabil diskriminering i sine anløp svar til CS + vs CS-. MERK: Port oppføringer gjort som reaksjon på CS + skulle øke over sesjoner, mens port oppføringer gjort som reaksjon på CS- bør være lav. Det nøyaktige antallet PDT økter nødvendig for å oppnå diskriminert betinget reagerer kan variere, men som en guide, har tenkt på ca 20 økter.
6. Extinction
- Utstyre hver conditioning chamber med visuell, olfactory, og taktile stimuli for å skape en kontekst som er atskilt fra den ene rottene opplevde under PDT økter. For eksempel, hvis Context 1 ble brukt i PDT, konfigurere kammeret som kontekst 2 for utryddelse økter. Se i sammenheng brukt under utryddelse som Context B.
- Gjennomføre utryddelse økter identisk til PDT økter, men ikke leverer noen etanol under CS +.
- Bruk samme dataprogram som ble brukt under PDT å presentere CS + og CS-.
- For å opprettholde konsistens tvers faser av forsøket, laste inn en tom sprøyte inn i sprøytepumpen, og forlater pumpen slått på. Kontroller at polyetylenrør ikke inneholder etanol før utryddelse økter.
- Fortsett utryddelse økter daglig til rotter ikke lenger showet diskriminert svarer mellom CS + og CS-. MERK: Port oppføringer gjort som svar på CS + bør gradvis avta over utryddelse økter, til det ikke er difference mellom port oppføringer gjort som reaksjon på CS + og port oppføringer gjort som reaksjon på CS-. Det nøyaktige antallet utryddelse økter nødvendig å slukke betinget reagerer kan variere, men som en guide, har tenkt på ca 8 økter.
- Rens utstyret ved slutten av hver sesjon, som beskrevet i trinn 5.7.
7. Kontekst-indusert Fornyelse Test
- Utstyre hver conditioning kammer med det visuelle, olfactory og taktile stimuli for å skape den konteksten som ble opplevd under PDT økter. For eksempel, hvis en gitt rotte opplevd Kontekst 1 i PDT økter, konfigurere sitt kammer som kontekst 1 i testen økten. Se i sammenheng brukt under fornyelse test som Context A.
- Gjennomføre den kontekst indusert fornyelse test identisk til PDT økter, men ikke leverer noen etanol under fornyelses test. Presentere
CS + og CS- som før løpet PDT økter, men holde tilbake etanol.- Bruk samme datamaskin prseismogrammet som ble brukt under PDT å presentere CS + og CS-.
- For å opprettholde konsistens på tvers av faser, legger en tom sprøyte inn sprøytepumpen, og la pumpen slått på. Kontroller at polyetylenrør ikke inneholder etanol før testen økten.
- Observer kontekst-indusert fornyelse av Pavlovian kondisjonerte alkohol-søkende atferd. Merk Denne fornyelse effekten vil være tydelig ved en selektiv økning i antallet av port oppføringer gjort som reaksjon på CS +, uten forandring i portinngangs oppførsel gjort som reaksjon på CS-, i forhold til CS + og CS- å reagere observert på slutten av utryddelse trening.
- Rens utstyret ved slutten av sesjonen, som beskrevet i trinn 5.7.
Representative Results
Intermitterende etanol tilgang i hjemmet buret: Etanol forbruk (g / kg) og etanol preferanse økning på tvers økter med intermitterende etanol tilgang i hjemmet buret, typisk når stabile nivåer innen 8 - 12 økter (figur 1). I datasettet vist i figur 1, i gjennomsnitt stabil etanolforbruk på tvers av de to siste sesjoner hjemmeburet etanol tilgang varierte 1,33 til 6,44 g / kg for individuelle rotter. Hjemmeburet etanol forbruk fase av eksperimentet kan stoppes når g / kg inntak har plateaued, og rottene blir opprettholdt på denne stabilt nivå av drikkevann for et antall sesjoner.
For å analysere data fra denne fasen, gjennomføre separat gjentatt tiltak for analyse av varians (ANOVA) over innen faget-faktor på sesjon for etanol forbruk (g / kg) og etanol preferanse.
Skjematisk av kontekst-indusert fornyelse prosedyre: Hver fase aveksperimentell prosedyre (PDT, utryddelse, fornyelse test) er illustrert i figur 2. Se figuren bildetekst for ytterligere detaljer.
Response tiltak og dataanalyse: I alle atferds faser beskrevet nedenfor, port-oppføring svar gjort under CS + og CS- er normalisert med henvisning til pre-CS baseline port-oppføring svar. Å skape de normaliserte CS tiltak, trekker antall havne oppføringer gjort under pre-CS baseline intervall (10 sek umiddelbart før CS debut) fra antall havne oppføringer gjort under presentasjoner av CS + og CS-. Normalisert CS + og normalisert CS- tiltak tjene som indikatorer for atferd fremkalte spesielt av CS presentasjoner, hevet over baseline nivå.
Gjennomføre separate gjentatt tiltak ANOVA med de gjentatte innen-lagt faktorer av økten og CS type (CS + vs CS-) for PDT og utryddelse faser. For sammenligninger på tvers av fase (PDT, utryddelse, fornyeal test), bruke data i gjennomsnitt over de to siste økter av PDT og utryddelse og én økt fornyelsestestdata i gjentatte-tiltak ANOVA. Å følge opp vesentlige hovedeffekter og interaksjon, bruk post hoc t-tester for uavhengige eller sammenkoblede prøver som Korrigert for multiple sammenligninger. Kriterium for signifikans er angitt ved α = 0,05.
PDT: port-oppføring svar til CS + økning over PDT økter, mens port-oppføring svar til CS- holde seg lav og stabil, samlet. Merk at port oppføring svar til CS- kan øke noe på begynnelsen av økter av PDT trening; imidlertid port oppføringer gjort som reaksjon på CS- stabilisere seg på et betydelig lavere nivå enn de som er laget i respons til CS +. Vellykket diskriminering er dokumentert av en statistisk signifikant økning i havne innlegg under CS + sammenlignet med CS- (figur 3). Dette resultatet indikerer at Pavlovian kondisjonerte alkohol-søkende atferd har væreen etablert til CS +, men ikke CS-.
Extinction: port-oppføring svar til CS + gradvis avta over utryddelse økter. Port-oppføring svar til CS- holde seg lav og stabil over utryddelse økter. Ideelt sett diskriminert svare er avskaffet innen utgangen av utryddelse trening, noe som gjenspeiles av mangelen på en statistisk signifikant forskjell mellom havne oppføringer til CS + og CS-. Imidlertid er det ikke uvanlig for en viss grad av diskriminert reagerer til å forbli, selv ved slutten av utryddelse trening. I dette tilfellet er det viktig å verifisere at portinngangssvar til CS + ved utgangen av utryddelse trening er statistisk lavere enn portinngangssvar til CS + ved starten av utryddelse, samt ved utgangen av PDT (Figur 3) . Dette mønsteret av resultatene indikerer at Pavlovian kondisjonerte alkohol-søkende atferd har blitt betydelig slukket.
Kontekst-indusert fornyelse test: Portinngangssvar til CS + økning i sammenheng-indusert fornyelse test, i forhold til CS + port oppføringer observert ved slutten av utryddelse opplæring. Denne økningen er selektiv til CS +, som havne oppføringer til CS- forbli uendret. I tillegg port oppføringer til CS + er statistisk forhøyet i forhold til port oppføringer til CS- i sammenheng-indusert fornyelses testen (figur 4). Statistiske bekreftelse på sammenligninger av CS + port oppføringer mellom utryddelse og test, samt sammenligninger av CS + og CS- havne oppføringer i testen, indikerer en selektiv fornyelse av Pavlovian kondisjonerte alkohol-søkende atferd indusert av alkohol forbundet sammenheng på test.
Figur 1. Opptrapping av etanol forbruk og preferanse indusert av intermitterende etanol tilgang i hjemmet buret. Betyr &# 177; SEM (A) etanol forbruk (g / kg) og (B) etanol preferanse over 12 økter av intermitterende etanol tilgang i hjemmet buret. Begge tiltakene vanligvis øker over økter og deretter stabilisere seg. Stabil etanol forbruket i gjennomsnitt over de to siste økter hjemme bur etanol tilgang varierte 1,33 til 6,44 g / kg for individuelle rotter. Disse data ble oppnådd ved bruk av hann Long-Evans rotter drikker 15% (v / v) etanol.
. Figur 2. En skjematisk av den eksperimentelle fremgangsmåte Fremgangsmåten består av tre faser: Pavlovian diskriminering trening (PDT), utryddelse, og sammenhengen-indusert fornyelses test. Under hver PDT økt, rotter får 16 forsøk med en auditiv betinget stimulus (CS +) som signaliserer levering av etanol og 16 studier medet sekund auditiv stimulus (CS-) som ikke er forbundet med etanol levering. PDT økter skje i sammenheng A, bestående av en bestemt konfigurasjon av visuell, olfactory, og taktile stimuli. Under utryddelse økter, som gjennomføres i Context B, består av et annet sett med visuelle, olfactory, og taktile stimuli, er CS + og CS- presentert, men etanol holdes tilbake. For den kontekst indusert fornyelse test, er rotter tilbake til Context A, og CS + og CS- presenteres uten etanol. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Erverv og utryddelse av diskriminert Pavlovian kondisjonerte svare for etanol. Mean ± SEM normalisert port innlegg made under CS + og CS- tvers PDT (økter 1 - 18) i Context A og utryddelse (økter 19-26) i Context B. Disse data ble innhentet ved hjelp av mannlige Long-Evans rotter, trente med 10% (v / v) etanol som ubetinget stimulus (US) som ble presentert i forbindelse med CS + under PDT. * P <0,05, CS + versus CS-. Figur opprinnelig publisert i Chaudhri, Sahuque, og Janak (2008). Brukt med tillatelse fra Elsevier.
Figur 4. Kontekst-indusert fornyelse av Pavlovian kondisjonerte svare for etanol. Mean ± SEM normalisert havne oppføringer gjort i løpet av CS + og CS- i PDT økter i Context A, Utryddelses økter i Context B og fornyelse test in Context A. Dataene er midlet over de to siste øktene for PDT og utryddelse; fornyelses test er en enkelt økt. DisseDataene ble oppnådd ved å bruke hann Long-Evans rotter trenet med 10% (v / v) etanol som ubetinget stimulus (US) som ble presentert i forbindelse med CS + løpet av PDT. * P <0,05; ** P <0,001, CS + versus CS-. #p <0,05, CS + PDT versus CS + utryddelse. ^ P <0,05, CS + utryddelse versus CS + test. Figur opprinnelig publisert i Chaudhri, Sahuque, og Janak (2008). Brukt med tillatelse fra Elsevier.
Discussion
Resultater fra denne prosedyren viser at diskrete miljømessige stimuli som rutinemessig følger alkohol levering kan skaffe kapasitet til å drive alkohol-søkende atferd. De viser også at kontekstuelle stimuli assosiert med tidligere tilgjengelighet eller fravær av alkohol kan veilede betinget atferdsmessige reaksjoner til diskrete alkohol prediktiv signaler.
Kritiske trinnene i protokollen
Sammenhenger i den foreliggende oppgave innlemme stimuli som er ekstern i forhold til rotte. Imidlertid kan den interoceptive state of the rat ved test også utgjøre en "sammenheng" som kan påvirke fornyelse 20. Det er derfor viktig å tilvenne rotter til alle prosedyrer som kan oppstå før fornyelsen test og endre sine interoceptive tilstand, som intrakranielle microinfusions eller systemiske injeksjoner. Videre bør tilvenning til microinfusions eller systemiske injeksjoner bli gjennomført før både utryddelse og PDT sessions, for å forhindre at slike prosedyrer fra å bli assosiert med en bestemt fase av eksperimentet.
Timelige parametere, slik som CS varighet, CS-US intervall, og intertrial intervall (ITI), har lenge vært kjent for å påvirke betinget reagerer i en rekke condition paradigmer 21-26. Likeledes kan tidsmessige parametere påvirker observasjon av fornyelseseffekten i vår fremgangsmåte. Ethvert sett av andre enn dem som er angitt i protokollen parametere bør eksperimentelt validert i pilotstudier før du fortsetter å bruke disse i større undersøkelser.
Modifikasjoner og feilsøking
Tidligere forskning har funnet at mengden av etanol som rotter forbruker i hjemmet buret kan variere som en funksjon av den leverandøren som rotter er kjøpt 17,27. Leverandør er derfor en viktig faktor for denne fasen av studien. Likeledes bør valget av rotte belastning være considered nøye, da det er mange rapporter om belastningsskader forskjeller i etanolforbruket 28-31.
Før arbeid i en motvilje conditioning paradigmet har vist at utviklings alder av rotter påvirker observasjon av fornyelse av Pavlovian betinget frykt respons 32. Mangelen på en fornyelse effekt i meget unge rotter (yngre enn postnatal dag 20) har blitt foreslått å skyldes nedsatt koding av kontekstuell informasjon 33. Den utviklingsalder rotter som skal brukes i foreliggende fremgangsmåte bør derfor tas i betraktning.
Fornyelse av Pavlovian betinget alkohol-søkende atferd har blitt observert når 10% 9,16, 15% 14, eller 20% 15 etanol løsninger ble brukt under hjemmet buret etanol tilgang og PDT faser av eksperimentet. Forskere kan bruke en hvilken som helst av disse konsentrasjoner av etanol, for det formål å etablere denne prosedyren i sin laboratoritallet.
Under oppkjøpet av Pavlovian diskriminering trening er det viktig å sjekke væske havner etter hver økt for å sikre at all etanol som ble levert har blitt konsumert. Leaving rotter i kondisjoneringskamrene i ytterligere 10 - 15 min etter hver sesjon kan gjøres tidlig i PDT for å oppmuntre til forbruk av en hvilken som helst etanol som ikke er forbrukt i løpet av sesjonen. Antallet rotter forlater unconsumed etanol i havnene bør reduseres som PDT utvikler seg. Hvis det ved utgangen av PDT rotter er enten (a) ikke forbruke all etanol og / eller (b) ikke svarer til CS + da disse fagene skal bli utelatt fra studien. De fleste rotter pålitelig reagerer mer på CS + enn CS-. Imidlertid kan noen rotter svare på et høyt nivå til begge signaler, og dermed ikke viser tegn på diskriminering. Rotter som har høy grad svarer til både CS + og CS- løpet PDT er ikke tatt ut av studien. Vår erfaring er disse fagene viser bemerkelsesverdig diskrimineringunder den første utryddelse økt i fravær av etanol, noe som tyder på at deres høye nivåer av å reagere på CS- under PDT blir drevet av nærvær av etanol i fluidporten. Disse fagene har også en tendens til å vise robuste fornyelses effekter.
Begrensninger ved prosedyren
Fordi fornyelsen prøven utføres i fravær av etanol, betinget port oppføringer fremkalt av CS + gradvis avta over testsesjon. Derfor er den totale mengde av virkemåten genereres ved testen, mot hvilken eksperimentelt induserte endringer kan bli vurdert, er ganske lav. Fordi i denne oppgaven å reagere en tendens til å være høyere ved begynnelsen versus slutten av testsesjon, er det viktig å undersøke effekten av eksperimentelle manipulasjoner på kondisjonert reagerer på en prøve-til-prøvebasis.
Oppføringer i fluidbeholder gi hoved avhengige tiltak i denne oppgaven. Imidlertid kan en feilaktig port oppføringen være registered hvis et dyr er nær nok til det fluidbeholder for å bryte den infrarøde strålen på tvers av åpningen av væskeport med sine værhår. Mens sjeldne, feilaktige svar er opplagt som en dramatisk økning i total port oppføringer i forhold til motivets adferd på tidligere økter. Videoopptak dyrene ville lette påvisning av mulige feilaktige responser, og gir mulighet for en mer raffinert analyse av de virkemåter som frembringes av rottene gjennom trening og testing.
Betydningen av teknikken med hensyn til eksisterende / alternative metoder
Kontekst-indusert fornyelse av narkotika-søkende atferd er i stor grad studert ved hjelp av en instrumental conditioning oppgave der den primære avhengige variabelen er en operant respons, for eksempel en spak trykk 8,34 eller nesen rote 12. I den foreliggende fremgangsmåte, er stoffet økende reaksjon 'betinget tilnærming' til væskeport som er utløst ved hjelp av presentasjoner avCS +. Dette svaret er sannsynligvis ervervet gjennom Pavlovian læring, som er den læringsprosess som formidler dannelsen av assosiasjoner mellom miljømessige stimuli og de farmakologiske effektene av narkotika av misbruk hos mennesker.
Fremtidige søknader
Denne oppgaven kan brukes i kombinasjon med neuropharmacology, optogenetics og neurochemistry å studere nevrale mekanismer som er involvert i kontekst-indusert fornyelse av Pavlovian kondisjonerte alkohol-søkende atferd 16. I tillegg kan atferdsmessige og nevrale mekanismer som regulerer kjøp og utryddelse av Pavlovian kondisjonerte alkohol-søkende atferd undersøkes. Til slutt, kan denne oppgaven brukes til å utforske manipulasjoner av utryddelse som kan hindre fornyelse, en viktig retning for translasjonell forskning rettet mot å redusere virkningen av stoffet assosiert miljømessige sammenhenger på reaktivitet til narkotika prediktive signaler etter cue eksponeringsterapi i menneskelig AddiCTS.
Disclosures
Alle eksperimentelle prosedyrer ble godkjent av Concordia University Animal forskningsetiske komité og er i samsvar med retningslinjer fra den kanadiske Council on Animal Care. Den åpne-access publisering av denne artikkelen ble gjort mulig ved sponsing fra Med Associates Inc.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heavy-duty utility cart | Rubbermaid | #4520-88 | Used to transport rats in their home cage from the colony room to the behavior room or other facilities |
| Rats, Long-Evans | Harlan | Rats weighed 220-240 g on arrival | |
| Ohaus scale | Fisher | #S402421 | For weighing rats; tare the bottom of a plastic container first, then put the rat in it to weigh it |
| Beta-chips, aspen | Harlan | #7090A | Bedding for home cage |
| Nylabone | Bio-Serv | #K3580 | Enrichment provided in the home cage |
| Autoclavable rodent chow | Agribrands, Charles River | #5075 | For feeding rats |
| Wire bar cage lid | Ancare | #R20SS2B | Custom made with two slots for bottles |
| Cage bottom | Ancare | #R20PC | To house rats |
| Stoppers | Ancare | #8.5 | Rubber stoppers to occlude opening in water bottles & graduated cylinders; goes with ball point sipper tubes |
| Ball point tubes, 1.5" length | Ancare | #TD-99 | Inserted in stoppers, enables rats to drink from water bottles and graduated cylinders |
| Water bottles | Ancare | #FSPC8HT | 473 ml (16 oz) capacity, needs to be occluded with stopper |
| Graduated cylinders, 100 ml | Fisher | #0300741 | To contain ethanol during alcohol exposure in the home cage; spouted end needs to be cut off to enable occlusion with stoppers |
| Mettler scale | Mettler Toledo | #MS6001S | For weighing water bottles and ethanol cylinders |
| Polyethylene tubing, 1/32" inner diameter, 1/32" wall thickness, 3/32" outside diameter | Fisher | #14-169-1A | To connect 20 ml ethanol syringe to fluid port |
| Needle, 18 g, 1.5" length | Fisher | #B305199 | To connect polyethylene tubing to ethanol syringes; needs to be filed |
| Syringes, 20 ml, Luer-Lok non-sterile | Fisher | #1482316J | To contain ethanol on the fluid pumps; needs to be connected to the polyethylene tubing by a 18 G 1 1/2 needle |
| Syringes, 60 ml, Luer-Lok non-sterile | Fisher | #14-820-11 | To flush polyethylene tubing after PDT sessions |
| Single speed syringe pump, 3.33 rpm | Med Associates Inc. | #ENV-018MD | To hold 20 ml ethanol syringes and deliver ethanol |
| Fluid port | Med Associates Inc. | #ENV-254-CB | To enable ethanol delivery during PDT sessions; connected to ethanol syringes with polyethylene tubing |
| Port entry infrared detector | Med Associates Inc. | #ENV-215M | Fixed on both sides of fluid port; need 2 per fluid port |
| Houselight, 28 V, 100 mA | Med Associates Inc. | #ENV-135M | Provides general lighting in conditioning chamber |
| Clicker module | Med Associates Inc. | #ENV-225SM | Auditory stimulus for conditioning chamber |
| White noise generator with speaker | Med Associates Inc. | #PHM-100 | Auditory stimulus for conditioning chamber |
| Bar floor | Med Associates Inc. | #ENV-009A-GF | To go with modular test chamber |
| Bench coat, absorbent | VWR | #89126-790 | Absorbent paper to put in metal tray, needs to be cut to fit the metal tray |
| Polycarbonate sheet, 1/8" thick, 12-5/8" x 10" | Johnston Plastics | #30102515 | To make smooth transparent floor insert used for context 1. Needs to be cut in 11.5" x 12.25" pieces |
| Aluminium sheet perforated, 0.063" thick, 48" x 96", 0.250" holes x 0.375" centers | Anica Steel | To make perforated floor insert used for context 2. Needs to be cut in 11.5" x 12.25" pieces | |
| Black cardboard, 0.053" thick, 28" x 44" | Omer DeSerres | #P1909 | To construct panels covering the ceiling, door and back wall of the conditioning chamber in context 1. Needs to be cut to size. Each chamber needs three panels measuring approximately 11.5" x 13.25". The panels can be joined by the narrower side using duct tape. |
| All-purpose strength duct tape, 1.88" x 45 yd. | Duck Tape | Adhesive material to connect the black cardboard panels used to cover the back wall, ceiling and door in context 1. | |
| Modular test chamber | Med Associates Inc. | #ENV-009A | Conditioning chamber |
| Sound attenuating cubicles | Med Associates Inc. | #ENV-200R3AM | Comes with installed 28 V DC fan (#ENV-025F) |
| Petri dish | Fisher | #08748B | Bottom only, to contain the sprayed solution that provides the odor stimulus; needs to be centered in the metal tray in conditioning chambers |
| PCI interface package | Med Associates Inc. | #DIG-700P2-R2 | Connects tabletop interface cabinet to computer; includes 1 interface card, 1 Decode card, 1 ribbon cable and 1 28 V DC power cable |
| Large tabletop cabinet and power supply | Med Associates Inc. | #SG-6510D | Used to contain the 12 cards included in the SmartCrtrl 8 Input, 16 Output package |
| SmartCtrl 8 Input, 16 Output package | Med Associates Inc. | #DIG-716P2 | Used to connect and control the devices in the conditioning chamber. The package includes all the cables, the interface module and the connection panel. |
| Med PC IV software | Med Associates Inc. | #SOF-735 | Software to run programs. Needs to be installed on the computer. |
| Monitor LG, 19" LCD | Concordia computer store | #W1942TQ-BF | Computer monitor; to go with computer running Med PC IV |
| HP Z200 tower workstation | Concordia computer store | #BZ788US#ABA | Computer on which Med PC IV is run |
| Benzaldehyde, ≥99% | Les produits chimiques OMEGA Chemical Company Inc. | #B37-50 | Dilute in tap water for almond context odor |
| Lemon oil, cold pressed, California | Sigma Aldrich | #W262528-1KG-K | Dilute in tap water for lemon context odor |
| Ethyl alcohol, 95% | Commercial Alcohols | Dilute in tap water to desired concentration |
References
- Field, M., Duka, T. Cues paired with a low dose of alcohol acquire conditioned incentive properties in social drinkers. Psychopharmacology (Berl). 159, 325-334 (2002).
- Litt, M. D., Cooney, N. L., Morse, P. Reactivity to alcohol-related stimuli in the laboratory and in the field: predictors of craving in treated alcoholics). Addiction. 95, 889-900 (2000).
- Pomerleau, O. F., Fertig, J., Baker, L., Cooney, N. Reactivity to alcohol cues in alcoholics and non-alcoholics: implications for a stimulus control analysis of drinking. Addict Behav. 8, 1-10 (1983).
- Sinha, R. New findings on biological factors predicting addiction relapse vulnerability. Curr Psychiatry Rep. 13, 398-405 (2011).
- Conklin, C. A. Environments as cues to smoke: implications for human extinction-based research and treatment. Exp Clin Psychopharmacol. 14, 12-19 (2006).
- Conklin, C. A., Robin, N., Perkins, K. A., Salkeld, R. P., McClernon, F. J. Proximal versus distal cues to smoke: the effects of environments on smokers' cue-reactivity. Exp Clin Psychopharmacol. 16, 207-214 (2008).
- Janak, P. H., Chaudhri, N. The potent effect of environmental context on relapse to alcohol-seeking after extinction. Open Addict J. 3, 76-87 (2010).
- Chaudhri, N., Sahuque, L. L., Cone, J. J., Janak, P. H. Reinstated ethanol-seeking in rats is modulated by environmental context and requires the nucleus accumbens core. Eur J Neurosci. 28, 2288-2298 (2008).
- Chaudhri, N., Sahuque, L. L., Janak, P. H. Context-induced relapse of conditioned behavioral responding to ethanol cues in rats. Biol Psychiatry. 64, 203-210 (2008).
- Crombag, H. S., Shaham, Y. Renewal of drug seeking by contextual cues after prolonged extinction in rats. Behav Neurosci. 116, 169-173 (2002).
- Fuchs, R. A., Eaddy, J. L., Su, Z. I., Bell, G. H. Interactions of the basolateral amygdala with the dorsal hippocampus and dorsomedial prefrontal cortex regulate drug context-induced reinstatement of cocaine-seeking in rats. Eur J Neurosci. 26, 487-498 (2007).
- Marchant, N. J., Hamlin, A. S., McNally, G. P. Lateral hypothalamus is required for context-induced reinstatement of extinguished reward seeking. J Neurosci. 29, 1331-1342 (2009).
- Zironi, I., Burattini, C., Aicardi, G., Janak, P. H. Context is a trigger for relapse to alcohol. Behav Brain Res. 167, 150-155 (2006).
- Sciascia, J. M., Mendoza, J., Chaudhri, N. Blocking dopamine D1-like receptors attenuates context-induced renewal of Pavlovian-conditioned alcohol-seeking in rats. Alcohol Clin Exp Res. 38, 418-427 (2014).
- Chaudhri, N., Woods, C. A., Sahuque, L. L., Gill, T. M., Janak, P. H. Unilateral inactivation of the basolateral amygdala attenuates context-induced renewal of Pavlovian-conditioned alcohol-seeking. Eur J Neurosci. 38, 2751-2761 (2013).
- Chaudhri, N., Sahuque, L. L., Schairer, W. W., Janak, P. H. Separable roles of the nucleus accumbens core and shell in context- and cue-induced alcohol-seeking. Neuropsychopharmacology. 35, 783-791 (2010).
- Sparks, L. M., Sciascia, J. M., Ayorech, Z., Chaudhri, N. Vendor differences in alcohol consumption and the contribution of dopamine receptors to Pavlovian-conditioned alcohol-seeking in Long-Evans rats. Psychopharmacology (Berl). 231, 753-764 (2014).
- Simms, J. A., et al. Intermittent access to 20% ethanol induces high ethanol consumption in Long-Evans and Wistar rats. Alcohol Clin Exp Res. 32, 1816-1823 (2008).
- Wise, R. A. Voluntary ethanol intake in rats following exposure to ethanol on various schedules. Psychopharmacologia. 29, 203-210 (1973).
- Bouton, M. E., Westbrook, R. F., Corcoran, K. A., Maren, S. Contextual and temporal modulation of extinction: behavioral and biological mechanisms. Biol Psychiatry. 60, 352-360 (2006).
- Pavlov, I. Conditioned reflexes: an investigation of the physiological activity of the cerebral cortex. , Oxford University Press. Oxford, England. (1927).
- Gibbon, J., Baldock, M. D., Locurto, C., Gold, L., Terrace, H. S. Trial and intertrial durations in autoshaping. J Exp Psychol Anim Behav Process. 3, 264-284 (1977).
- Holland, P. C. CS-US interval as a determinant of the form of Pavlovian appetitive conditioned responses. J Exp Psychol Anim Behav Process. 6, 155-174 (1980).
- Stein, L., Sidman, M., Brady, J. V. Some effects of two temporal variables on conditioned suppression. J Exp Anal Behav. 1, 153-162 (1958).
- Coleman, D. A., Hemmes, N. S., Brown, B. L. Relative durations of conditioned stimulus and intertrial interval in conditioned suppression. J Exp Anal Behav. 46, 51-66 (1986).
- Schwarz-Stevens, K. S., Cunningham, C. L. Pavlovian conditioning of heart rate and body temperature with morphine: effects of CS duration. Behav Neurosci. 107, 1039-1048 (1993).
- Palm, S., Roman, E., Nylander, I. Differences in voluntary ethanol consumption in Wistar rats from five different suppliers. Alcohol. 45, 607-614 (2011).
- Gauvin, D. V., Moore, K. R., Holloway, F. A. Do rat strain differences in ethanol consumption reflect differences in ethanol sensitivity or the preparedness to learn. Alcohol. 10, 37-43 (1993).
- Goodwin, F. L., Amit, Z. Relative taste thresholds for ethanol, saccharin, and quinine solutions in three strains of rats nonselected for ethanol: a comparative study. Exp Clin Psychopharmacol. 8, 216-224 (2000).
- Goodwin, F. L., Bergeron, N., Amit, Z. Differences in the consumption of ethanol and flavored solutions in three strains of rats. Pharmacol Biochem Behav. 65, 357-362 (2000).
- Wilson, A. W., Neill, J. C., Costall, B. Strain differences in ethanol preference and reinforced behaviour: a comparison of two-bottle choice and operant self-administration paradigms. Behav Pharmacol. 8, 37-46 (1997).
- Yap, C. S., Richardson, R. Extinction in the developing rat: an examination of renewal effects. Dev Psychobiol. 49, 565-575 (2007).
- Carew, M. B., Rudy, J. W. Multiple functions of context during conditioning: a developmental analysis. Dev Psychobiol. 24, 191-209 (1991).
- Chaudhri, N., Sahuque, L. L., Janak, P. H. Ethanol seeking triggered by environmental context is attenuated by blocking dopamine D1 receptors in the nucleus accumbens core and shell in rats. Psychopharmacology (Berl). 207, 303-314 (2009).
