Summary
Ett förfarande för att studera kapaciteten av en alkohol associerad miljösammanhang att utlösa förnyelse av alkoholsökande beteende hos råttor beskrivs.
Abstract
Miljö sammanhang där droger av missbruk konsumeras kan utlösa begäret, en subjektiv Pavlovian konditionerade svar som kan underlätta drogsökande beteende och snabba återfall i abstinent missbrukare. Vi har utvecklat en metod för att studera beteendemässiga och neurala processer som förmedlar effekterna av sammanhang alkoholsökande beteende hos råttor. Efter acklimatisering till smaken och farmakologiska effekter av 15% etanol i buren, manliga Long-Evans-råttor får Pavlovian diskriminering utbildning (PDT) i konditionekammare. I varje daglig (mån-fre) PDT session, 16 försök vardera av två olika 10 sek auditiv rade stimuli uppstår. Under ett stimulus, CS +, 0,2 ml 15% etanol avges in i en fluidöppning för oral konsumtion. Den andra stimulus, CS-, inte paras ihop med etanol. Över sessioner, inträden i vätskeporten under CS + ökning, medan poster under CS- stabiliseras på en lägre nivå, vilket indikerar att en Predictive association mellan CS + och etanol förvärvas. Under PDT varje kammare är utrustad med en specifik konfiguration av visuella, lukt och taktila kontextuella stimuli. Efter PDT, är utplåning träning genomföras i samma kammare som nu är försedd med en annan konfiguration av kontextuella stimuli. CS + och CS presenteras som tidigare, men etanol är undanhålls, vilket orsakar en gradvis nedgång i poster hamn under CS +. Vid testet är råttorna placeras tillbaka i PDT sammanhang och presenteras med CS + och CS som tidigare, men utan etanol. Denna manipulation utlöser en robust och selektiv ökning av antalet poster hamn gjorts under alkohol prediktiva CS +, utan någon förändring svara under CS. Denna effekt, som kallas kontext inducerad förnyelse, illustrerar den kraftfulla kapacitet sammanhang i samband med alkoholkonsumtion att stimulera alkoholsökande beteende som svar på Pavlovian alkohol ledtrådar.
Introduction
Återstående nykter är en stor utmaning med personer som lider av alkoholmissbruk störningar inför. Avhållsamhet är en tid av utsatthet för beteende, psykologiska och fysiologiska effekter miljö stimuli som rutinmässigt följer alkohol, vilket kan, genom Pavlovsk beting, blir i samband med berusning 1,2. Exponering för alkohol prediktiva ledtrådar kan framkalla betingade reaktioner som alkohol begäret, som kan främja alkohol söker beteenden som underlättar återfall 3,4.
De stereotypa sekvenser av beteenden som leder till alkoholkonsumtion kan orsaka vissa typer av stimuli för att rutinmässigt upplevt omedelbart före den farmakologiska effekten av alkoholintag. Till exempel syn, lukt och smak av alkohol är sensoriska egenskaper alkohol som tillförlitligt föregår berusning. Förutom sådana signaler, vilka betecknas som "diskret" eller "proximal 'cues, miljö sammanhang där droger regelbundet används kan också provocera begäret 5,6. Exponering för fysiska platser där droger har tidigare använts kan därför vara en kritisk utlösare för återfall 7.
Djurmodeller har utvecklats för att studera de neurala mekanismer som förmedlar effekterna av narkotika i samband sammanhang på drogsökande beteende 8-13. Det förfarande som beskrivs här gör det möjligt att undersöka hur sammanhang i samband med alkoholkonsumtion kan modulera alkoholsökande beteende som framkallas av en diskret, alkohol prediktiva Pavlovian kö.
Pavlovian diskrimineringsutbildning genomförs på en särskild miljö sammanhang där råttor är utbildade för att beteendemässigt skilja mellan två audirade stimuli, en CS + som är ihopkopplad med alkohol och ett CS som inte är. Extinction sessioner förs sedan i ett annat sammanhang, där svar på CS+ Minskar som ett resultat av alkohol undanhålls. Därefter förnyad exponering för alkohol i samband, Pavlovian utbildnings kontext utlöser en selektiv ökning av alkoholsökande beteende framkallas av CS +, utan någon förändring i att svara på CS. Detta resultat, som vi konsekvent har replik 9,14-16, sträcker fynd från instrumentkonditioneförfaranden där läkemedelssammanhang har visat sig stimulera förnyelse av operanta responser i samband med narkotikaleverans 10,13.
Protocol
Alla rutiner är godkända av djurforskningsetiska kommittén vid Concordia University och instämmer med rekommendationerna från den kanadensiska rådet om Animal Care.
1. Djur
- Skaffa hane Long-Evans-råttor (220 - 240 g vid ankomst).
- Behåll råttor i en temperatur (21 ° C) och luftfuktighet (44%) kontrollerad djurvård anläggning, på en 12 h ljus-mörker-cykel med lampor på 7:00.
- Pair-house råttor vid ankomst. Efter 3 dagar, hus råttorna individuellt i plast skokartong burar med beta-chip sängkläder, en nylon ben, och fri tillgång till standardråttfoder och vatten. Använd cage lock som har dubbla genomföringar för att möjliggöra den efterföljande placering av en andra flaska, förutom att vattenflaskan. OBS: Råttor kan inhysas individuellt så fort de anländer till djurvård anläggningen.
- Börja hantera råttor dagligen. OBS: Som en guide, räcker oftast en veckas hantering acklimatisera dem till att vara picked upp och hanteras av försöksledaren.
2. Intermittent Etanol Access i Home Cage
OBS: Conduct intermittent etanol tillgång i buren för att se till att råttor kommer att dricka fysiologiskt relevanta mängder av etanol innan beteendevetenskaplig utbildning fasen av experimentet börjar 17-19. Initiera denna procedur under den lätta fasen, även om den skall kunna initieras när som helst under den ljusa eller mörka cykeln.
- Bered två flaskor för varje råtta.
- Använd en 100 ml plast mätglas som etanol flaskan och en 473 ml standardplastvattenflaska. Använd en relativt liten kapacitet etanolflaska, fylld nästan till maximal volymkapacitet, för att minimera förlusten av etanol på grund av läckage och avdunstning.
- Fyll en flaska med 15% etanol, görs genom att späda 95% etanol i kranvatten. OBS: Andra etanolkoncentrationer, såsom 10% eller 20%, kan användas i stället för 15% etanol.
- Fill den andra flaskan med kranvatten.
- Sätt en gummipropp, med en sipper rör som innehåller ett kullager för att minimera läckage, i varje flaska.
- Ställ in två kontrollburar, behandlades identiskt med de hem burar med undantag att styr burarna inte innehåller råttor eller strö.
- Förbered etanol och vattenflaskor för styr burar enligt steg 2.1.1 - 2.1.4.
- Använd de åtgärder som erhållits från kontroll burar att kontrollera för spill och / eller avdunstning som kan uppstå under loppet av etanol tillgång session (som beskrivs i steg 2.8.1 - 2.8.2).
- Väg alla etanol och vattenflaskor. Spela in alla vikter.
- Väg alla råttorna. Spela in alla vikter.
- Placera etanolflaskan och vattenflaska på varje buren och kontrollera bur samtidigt. Låt båda flaskorna på burar för 24 tim.
- I slutet av 24-timmarsperiod, ta bort båda flaskor frånburar samtidigt.
- Väg alla etanol och vattenflaskor. Spela in alla vikter.
- För att bestämma hur mycket etanol och vatten förbrukas under 24 h perioden, subtrahera vikten på varje flaska när den togs bort från buren från vikten av flaskan när den placerades på buren 24 timmar tidigare för varje råtta.
- Gör samma sak för de två kontroll burarna, och sedan beräkna den genomsnittliga mängden spill för varje vätska.
- Subtrahera den genomsnittliga mängden etanol och vattenspill, respektive, från motsvarande etanol och vattenförbrukning åtgärder för varje råtta.
- Använd dessa spill kontrollerad skillnads åtgärder för att beräkna etanolkonsumtion ig / kg, förbrukning av vatten och etanol önskemål.
- För att beräkna etanolförbrukning (g / kg), först konvertera vikt (g) etanol som förbrukas i volym (ml) baserat på densiteten av den totala lösningen (etanol + vattenkomponenter), enligtformeln Volym (ml) = Vikt (g) / densitet (g / ml). OBSERVERA: Densiteten hos lösningen kommer att variera som en funktion av etanolkoncentrationen.
- Därefter multiplicerar volymen (ml) av etanol-lösning som förbrukas av densiteten (g / ml) av etanol skalas för den specifika procentuella lösning användes, för erhållande av den vikt (g) av etanol konsumeras.
- Dividera vikt (g) av etanol som förbrukas av råttans vikt (kg) för erhållande av g / kg mått på etanolkonsumtion.
- För att beräkna etanolpreferens, uttrycker etanolintag (ml) i procent av total vätska (etanol + vatten, ml) intag.
- Returnera vattenflaskan bara tillbaka till råttans buren. För nästa 24 timmar, ge råttorna tillgång till vatten men inte etanol. I stället för en etanolflaska, lägga en förhands vägs andra vattenflaska på buren.
- Vid slutet av den 24 h period, ta båda vattenflaskor från buren samtidigt.
- Väg båda uppsättningarna vattenflaskor. Spela alla weights.
- Subtrahera vikten på varje flaska när den togs bort från buren från vikten av flaskan när den placerades på buren 24 timmar tidigare, subtrahera ut den genomsnittliga spill åtgärden erhållits från kontrollburar som beskrivs i steg 2.8.1 - 2.8.2.
- Använd dessa spill-kontrollerade skillnads åtgärder för att beräkna förbrukningen av vatten.
- Börja cykeln igen genom att erbjuda både etanol och vattenflaskor till råttor, som beskrivs i steg 2.1 till 2.14.
- Upprepa denna cykel för flera (ca 12) sessioner för att inducera höga och stabila nivåer av etanolkonsumtion. Se Figur 1 för representativa resultaten av etanolkonsumtion (g / kg) i hemmaburen.
- Alternativa den spatiala positionen av etanol och vatten flaska på buren locket över arbetspass för att förhindra utvecklingen av en sidopreferens.
- Gör en ny etanollösning en gång per vecka för att säkerställa korrekt och stabil etanolkoncentration översessioner. Minimera effekterna av avdunstning av etanol under längre perioder med hjälp av denna metod.
3.Anordning
- Hus varje konditionekammare inuti en ventilerad, ljuddämpande skåp.
- Konstruera varje konditione kammare i en rostfri metallstav golv, ett tydligt tak polykarbonat, klar polykarbonat bakväggen och ytterdörren, och aluminiummetall panelsidoväggar.
- Montera en vätske port centralt nära basen av den högra metallsidovägg. Utrusta ingången till vätske hamn med en infraröd fotocell för att detektera poster i porten.
- Anslut polyetenslangen från baksidan av vätske port till en 20 ml spruta innehållande etanol med hjälp av en trubbig spets nål. Placera sprutan i en sprutpump belägen utanför ljuddämpande båset. För Pavlovian utbildning diskriminering tillfällen, ladda etanol i sprutan innan den placeras in i pumpen. Prime slangen by framåt manuellt pumpen och torka bort överflödigt etanol från vätskeporten.
- På vänster sidovägg, installera en vit houselight centralt nära taket i kammaren.
- Installera en klicker (2 Hz cykel) och en vit brusgenerator med högtalare i det övre vänstra hörnet av den vänstra sidoväggen.
- Utrusta varje konditionekammare med en specifik konfiguration av visuella, lukt och taktila stimuli för att skapa en tydlig kontext.
- Använd två olika sammanhang, som utsetts Context 1 och Context 2 Konfigurera hälften av konditionekamrarna som Context 1 och den andra hälften så Context 2.
- Skapa Context 1, placera svarta pappskivor över taket och främre och bakre kammarens väggar, sprut citron doft (10% v / v, genom att späda citronolja i kranvatten) i en petriskål och placera den i mitten av en metallavfall fack under golvet i kammaren, och sätt en klar polykarbonat golvpanel över metall rOD våningen. Linje spillfacket med absorberande pappershandduk eller bänk liner.
- För att skapa sammanhang 2, lämna taket och främre och bakre väggar av kammaren utan lock, så att de är tydliga, spraya mandel lukt (10% v / v, genom att späda bensaldehyd i kranvatten) i en petriskål och placera den centralt i en metallavfall fack under golvet i kammaren, och sätt en perforerad metallgolvpanel över metallstaven golvet. Linje spillfacket med absorberande pappershandduk eller bänk liner.
4. Tillvänjning
Vänja råttor till beteende träningsrum och var och en av de två kontext inom konditionekammare. För denna fas av experimentet, inte fylla på etanol i de 20 ml sprutor.
- Vänja råttorna på väg att transporteras från djurvård anläggningen till beteende träningsrum i laboratoriet i två korta tillvänjningssessioner.
- Under den första sessionen, ladda råttorna in deras hem burar på ett hjulförsett varukorg i djurvård anläggning och transportera dem till beteende träningsrum i laboratoriet. Belys rum lampor, slå på fläktarna i varje ljuddämpande skåp, lämna rummet, stänga dörren och låta råttorna anpassa sig till denna nya miljö i 20 min, samtidigt som den är i deras hem burar på vagnen. Vid slutet av denna 20 minuters period, återgår råttorna till djurvårdsanläggning.
- I den andra sessionen, ta med råttorna i beteende träningsrum i laboratoriet. Som tidigare, lämna lamporna och skåp fläktar i rummet. Sitt kvar i rummet, med dörren stängd för att minimera distraktioner, och hantera och väger varje råtta i beteende träningsrum. Spela vikterna, och sedan tillbaka råttorna till djurvård anläggningen.
- Vänja råttorna till kamrarna konditione i två korta tillvänjningssessioner.
- Transportera råttorna till beteende träningsrum, spela in varje råtta vikt,och ladda varje råtta i dess utsedda konditionekammaren.
- I den första tillvänjning sessionen inrättas hälften kamrarna som Context 1 och resten som Context 2.
- I den andra sessionen tillvänjning ställa in varje kammare med sammanhanget som inte användes i den tidigare sessionen.
- Genomföra tillvänjningssessioner i en motvikts sätt, så att hälften av råttorna först utsätts för Context 1, följt av Context 2, och den andra hälften är först utsätts för Context 2, följt av Context 1 Helst genomföra både tillvänjnings sessioner i samma dag, även om de skulle kunna spridas över två dagar om det behövs.
- För tillvänjningssessioner, använda ett datorprogram för att belysa houselight 1 min efter att programmet har utfärdats. Notera den totala antalet poster fluidöppning som görs under en 20 min session. Vid slutet av sessionen, programmera houselight att stänga av. Inte utgör någon etanol eller ledtrådar under tillvänjningssessioner.
- Rengör utrustningen (t.ex. golv paneler, avfallskorgar, petriskålar). Se steg 5.7 för ytterligare detaljer.
5. Pavlovian Diskriminering Training (PDT)
Tåg råttor till beteendemässigt skilja mellan en auditiv kö som är ihopkopplad med etanol och en andra hörsel kö som inte är. För denna fas av experimentet, fyller 20 ml sprutor med 15% etanol.
- Utrusta varje konditionekammare med en specifik konfiguration av visuell, lukt, och taktila stimuli för att skapa en tydlig sammanhang som beskrivs i steg 3.3.2 och 3.3.3
- Tilldela hälften av råttorna till Context 1 och den andra hälften till Context 2 i en motvikts sätt, baserat på etanol konsumtion och preferenser i genomsnitt över de senaste 2 sessioner buren etanol tillgång förfarande. Läs i fortsext används under PDT som Context A. OBS: Varje råtta bör bara uppleva ett sammanhang i denna fas av utbildningen.
- Kontrollera att det olfaktoriska stimulus är den sista kontextuella stimulans som skall läggas till varje konditioneringskammaren. Stäng dörrarna till kammaren och ljuddämpande skåp att innehålla lukt stimulans och minimera hoppass olika lukter.
- Ta med råttorna i den beteende träningsrum, spela in varje råtta vikt, och läsa varje råtta i dess utsedda konditionekammaren.
- Initiera datorprogram som styr följande sekvens av händelser under varje PDT session.
- Vid 5 minuter efter att programmet har utfärdats, belysa houselight.
- Presentera vitt brus stimulans och klickern stimulans 16 gånger vardera. Utse ett av dessa auditiva stimuli vara CS + och den andra för att vara CS-, i en motvikts mode över båda sammanhang.
- Gör varje CS + och CS rättegången last 10 sek.
- Leverera 0,2 ml etanol i vätske hamn under de sista 6 sekunder i CS +. Levererar inte någon etanol under CS.
- Gör varje PDT session sista 58 minuter i genomsnitt. Presentera CS + och CS var på en variabel tid 67 sek schema.
- Spela vätskeposter hamn under 10 sek CS intervall (10 sek under CS presentation), på 10 sek före CS-intervall (10 sek omedelbart före CS debut), och 10 sek efter CS-intervall (10 sek omedelbart efter CS offset) för både CS + och CS-presentationer samt total poster vätske port för hela sessionen. Spelar även längden på varje port inmatning under dessa intervall.
- Vid slutet av sessionen, stänga av houselight av.
- Ta bort råttor från kamrarna, återlämna dem till deras hem burar, och transportera dem tillbaka till djurvård anläggningen.
- Kontrollera vätskeportarna så att råttorna konsumerade de 3,2 ml etanol som levereras i varje PDT session.
- Spola etanol ur polyeten slangen med en 60 ml spruta innehållande en liten mängd vatten. Därefter passerar 60 ml luft genom slangen med hjälp av en andra, tomma sprutan, för att se till att den är torr.
- Rengör utrustningen. För daglig rengöring, tvätta golvpanelerna, avfallsfack och petriskålar. En gång i veckan, rengöra hela konditioneringskammaren. Använd inte parfymerade rengöringsmedel för att undvika att införa oönskade lukter i den experimentella apparaten.
- Fortsätt PDT sessioner dagligen tills råttor visar stabila diskriminering i sina hamninträdes svar på CS + vs CS. OBS: Hamn noteringar som görs som svar på CS + bör öka under sessioner, medan hamn noteringar som görs som svar på CS bör förbli låga. Det exakta antalet PDT sessioner krävs för att uppnå diskriminerade rade svarar kan variera, men, som en guide, planerar att cirka 20 sessioner.
6. Extinction
- Utrusta varje konditione chamber med visuell, lukt, och taktila stimuli för att skapa ett sammanhang som skiljer sig från den som råttorna upplevde under PDT sessioner. Till exempel, om Context 1 användes i PDT, konfigurera kammaren som Context 2 för utplåning sessioner. Läs i sammanhanget används under utrotning som Context B.
- Genomföra utrotning sessioner identiskt med PDT sessioner, men inte levererar någon etanol under CS +.
- Använd samma datorprogram som användes under PDT för att presentera CS + och CS.
- För att bibehålla överensstämmelse mellan faser av försöket, ladda ett tomt sprutan i sprutpumpen, och lämnar pumpen påslagen. Se till att slangen polyeten inte innehåller etanol innan utrotning sessioner.
- Fortsätt utrotning sessioner dagligen tills råttorna inte längre show diskrimineras svarar mellan CS + och CS. OBS: Hamn noteringar som görs som svar på CS + bör gradvis sjunka över utrotning sessioner, tills ingen difference mellan posterna hamn gjorts som svar på CS + och poster hamn gjorts som svar på CS. Det exakta antalet släck sessioner krävs för att släcka rade svarar kan variera, men som en guide, planera om cirka 8 sessioner.
- Rengör utrustningen i slutet av varje session, som beskrivs i steg 5.7.
7 Context-inducerad Förnyelse Test
- Utrusta varje konditionekammare med de visuella, lukt och taktila stimuli för att skapa sammanhang som upplevdes under PDT sessioner. Till exempel, om en given råtta upplevt Context 1 i PDT sessioner, konfigurera sin kammare som Context 1 i testsessionen. Läs i sammanhanget används under förnyelsetestet som Context A.
- Genomför den sammanhangs inducerade förnyelse testet identiskt med PDT sessioner, men inte leverera något etanol under förnyelsetest. Presentera
CS + och CS som tidigare under PDT sessioner, men undan etanolen.- Använd samma dator program som användes under PDT för att presentera CS + och CS.
- För att bibehålla överensstämmelse mellan faser, ladda ett tomt sprutan i sprutpumpen, och lämnar pumpen påslagen. Se till att slangen polyeten inte innehåller etanol före testsessionen.
- Beakta kontext inducerad förnyelse av Pavlovian konditionerade alkoholsökande beteende. OBS: Denna förnyelse effekten kommer att märkas genom en selektiv ökning av antalet poster hamn gjorts som svar på CS +, utan någon förändring i hamn posten beteende som svar på CS, i förhållande till CS + och CS svarande observeras vid slutet av utrotning utbildning.
- Rengör utrustningen i slutet av sessionen, enligt beskrivningen i steg 5.7.
Representative Results
Intermittent etanol tillgång i buren: Etanol förbrukning (g / kg) och etanol preferensökning mellan sessioner intermittent etanol tillgång i hemmet buren, oftast nå stabila nivåer inom 8-12 sessioner (Figur 1). I datauppsättning som visas i figur 1, i genomsnitt stabil etanolförbrukning över de två senaste sessionerna i buren etanol tillgång varierade från 1,33 till 6,44 g / kg för enskilda råttor. Den hembur etanolkonsumtion fas av experimentet kan stoppas så snart g / kg har konsumtionen plateaued och råttor bibehålls vid denna stabil nivå av dricksvatten under ett antal sessioner.
För att analysera data från denna fas, genomföra separata upprepade-åtgärder variansanalys (ANOVA) över inom individer faktor session för etanolförbrukning (g / kg) och etanol önskemål.
Schematisk bild av sammanhang-inducerad förnyelseförfarande: Varje fas iexperimentell förfarande (PDT, utplåning, förnyelsetest) illustreras i figur 2. Se figuren bildtext för ytterligare information.
Response åtgärder och dataanalys: I alla beteende faser som beskrivs nedan, hamninträdessvar som gjorts under CS + och CS är normaliserade med hänvisning till tidigare CS baseline hamninträdes svar. För att skapa de normaliserade CS åtgärder, subtrahera antalet poster hamn gjorts under pre-CS baslinjen Intervallet (10 sek omedelbart före CS debut) från antalet poster hamn gjorts under presentationerna av CS + och CS. Den normaliserade CS + och normaliserade CS åtgärder fungerar som indikatorer på beteendet framkallade specifikt av CS presentationer, förhöjda över basnivåer.
Genomföra separata upprepade-mätningar ANOVA med upprepade inom-ämnesfaktorer session och CS typ (CS + vs CS) för PDT och utrotning faserna. För jämförelser mellan fas (PDT, utplåning, förnyaal-test), i genomsnitt uppgifter användnings över de två sista mötena i PDT och utrotning och en session av förnyelse testdata i upprepade-åtgärder ANOVA. För att följa upp betydande huvudsakliga effekter och interaktioner, använder post hoc t-test för oberoende eller parade prover som korrigerats för multipla jämförelser. Kriterium för signifikans är inställd vid α = 0,05.
PDT: Port inträde svar på ökningen CS + över PDT sessioner, medan hamninträdes svar på CS förblir låg och stabil, övergripande. Observera att hamn inträde svar på CS kan öka något under de första mötena i PDT utbildning; Men hamn noteringar som görs som svar på CS stabiliseras på en betydligt lägre nivå än de som gjorts som svar på CS +. Framgångsrik diskriminering framgår av en statistiskt signifikant ökning av poster hamn under CS + jämfört med CS (Figur 3). Detta resultat indikerar att Pavlovian konditionerade alkoholsökande beteende har varasv etablerad till CS +, men inte CS-.
Utrotning: Port inträde svar på CS + minska gradvis över utdöendesessioner. Port inträdes svar på CS fortsatt låga och stabila över utrotning sessioner. Helst diskriminerade svara avskaffas i slutet av utrotning utbildning, vilket framgår av att det saknas en statistiskt signifikant skillnad mellan poster hamn till CS + och CS. Emellertid är det inte ovanligt att en viss grad av diskriminerade svara att förbli, även i slutet av utplåningen träning. I det här fallet är det viktigt att kontrollera att hamn inträde svar på CS + i slutet av utrotning utbildning är statistiskt lägre än hamninträdes svar på CS + i början av utrotning, liksom i slutet av PDT (Figur 3) . Detta mönster av resultat indikerar att Pavlovian konditionerade alkoholsökande beteende har betydligt släckt.
Context-inducerad förnyelse test: Portinträdes svar på CS + ökning i samband framkallade förnyelsetest i förhållande till CS + hamn poster som observerats i slutet av utrotning utbildning. Denna ökning är selektiv till CS +, som poster hamn till CS förblir oförändrade. Dessutom hamn poster till CS + är statistiskt förhöjda jämfört med poster hamn till CS i samband framkallade förnyelsetest (Figur 4). Statistisk bekräftelse på jämförelser av CS + hamnposter mellan utrotning och tester, samt jämförelser av CS + och CS poster hamn inom provning, visar en selektiv förnyelse av Pavlovian konditionerade alkoholsökande beteende inducerad av alkohol i samband sammanhang vid test.
Figur 1 Upptrappning av etanolkonsumtion och önskemål inducerad av intermittent etanol tillgång i hemmet buren. Står för och# 177; SEM (A) etanolförbrukning (g / kg) och (B) etanol företräde över 12 sessioner intermittent etanol tillgång i buren. Båda åtgärderna ökar vanligtvis mellan sessioner och sedan stabiliseras. Stabil etanolförbrukningen i genomsnitt över de senaste två sessionerna i buren etanol tillgång varierade från 1,33 till 6,44 g / kg för enskilda råttor. Dessa data erhölls med användning av handjur av Long-Evans råttor dricker 15% (v / v) etanol.
. Figur 2 En schematisk bild av den experimentella proceduren Proceduren består av tre faser: Pavlovian diskriminering utbildning (PDT), utplåning, och kontext inducerad förnyelsetest. Under varje PDT session, råttor erhåller 16 försök med en auditiv rade stimulus (CS +) som signalerar leveransen av etanol och 16 försök meden andra auditiv stimulus (CS) som inte är förknippad med etanol leverans. PDT sessioner äger rum i Context A, bestående av en specifik konfiguration av visuell, lukt, och taktila stimuli. Under släck sessioner, som bedrivs i Context B, som består av en annan uppsättning visuella, lukt, och taktila stimuli, är CS + och CS presenterade men etanol är inne. För den sammanhangs inducerad förnyelse testet är råttorna återvände till Context A, samt CS + och CS presenteras utan etanol. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 Förvärv och utrotning av diskriminerade Pavlovian konditione svara för etanol. Medelvärde ± SEM poster normaliserad hamn made under CS + och CS över PDT (session 1 - 18) i Context A och utrotning (sessioner 19-26) i Context B. Dessa data erhölls med hjälp av manliga Long-Evans-råttor, tränade med 10% (v / v) etanol som det obetingat stimulus (US), som presenterades i samband med CS + under PDT. * P <0,05, CS + kontra CS. Figur publicerades ursprungligen i Chaudhri, Sahuque, & Janak (2008). Används med tillstånd från Elsevier.
Figur 4 Context-inducerad förnyelse av ± SEM normaliserade portposter Pavlovian konditione svara för etanol. Mean gjorts under CS + och CS i PDT sessioner i Context A, utdöende sessioner i Context B och förnyelsetest i Context A. Uppgifterna är medelvärde över de senaste två sessioner för PDT och utrotning; förnyelse test är en enda session. Dessadata erhölls med användning av handjur av Long-Evans-råttor, utbildad med 10% (volym / volym) etanol som obetingat stimulus (US), som presenterades i samband med CS + under PDT. * P <0,05; ** P <0,001, CS + kontra CS. #p <0,05, CS + PDT kontra CS + utrotning. ^ P <0,05, CS + utrotning kontra CS + test. Figur publicerades ursprungligen i Chaudhri, Sahuque, & Janak (2008). Används med tillstånd från Elsevier.
Discussion
Resultat från detta förfarande visar att diskreta miljö stimuli som rutinmässigt följer alkoholleverans kan förvärva förmågan att köra alkoholsökande beteende. De visar också att kontextuella stimuli i samband med förhands tillgänglighet eller avsaknad av alkohol kan vägleda rade beteende svar på diskreta alkohol prediktiva ledtrådar.
Kritiska steg i protokollet
Sammanhang i nuvarande uppgift införliva stimuli som ligger utanför råttan. Däremot kan interoceptive tillstånd råtta vid testet också utgöra ett "sammanhang" som kan påverka förnyelsen 20. Det är därför viktigt att vänja råttorna till eventuella förfaranden som kan inträffa innan förnyelsetest och ändrar sin interoceptive tillstånd, liksom intrakraniella microinfusions eller systemiska injektioner. Dessutom bör tillvänjning till microinfusions eller systemiska injektioner genomföras före både utrotning och PDT sessions, för att förhindra att sådana förfaranden från att bli förknippad med en specifik fas av försöket.
Temporal parametrar, såsom CS varaktighet, CS-US-intervallet, och intertrial intervall (ITI), har länge varit kända för att påverka rade reagera i en mängd olika konditioneringsparadigm 21-26. På samma sätt kan tidsparametrarna påverka observation av förnyelse effekt i vårt förfarande. Varje uppsättning som inte anges i protokollet parametrar bör experimentellt valideras i pilotstudier innan du fortsätter att använda dem i större utredningar.
Ändringar och felsökning
Tidigare forskning har funnit att mängden etanol som råttor konsumerar i buren kan variera som en funktion av leverantören som råttor köps 17,27. Leverantören är därför en viktig faktor för denna fas av studien. Likaså bör valet av råttstam vara considered noga, eftersom det finns många rapporter om stamskillnader i etanolförbrukning 28-31.
Tidigare arbete i en aversiv konditione paradigm har visat att utvecklingsålder av råttor påverkar observation av förnyelse av en Pavlovsk betingad rädsla svar 32. Avsaknaden av en förnyelse effekt hos mycket unga råttor (yngre än postnatal dag 20) har föreslagits bero på nedsatt kodning av kontextuell information 33. Den utvecklingsålder av råttor som skall användas i föreliggande förfarande bör därför beaktas.
Förnyelse av Pavlovian konditionalkoholsökande beteende har observerats vid 10% 9,16, 15% 14, eller 20% 15 etanollösningar användes under buren etanol åtkomst och PDT faser av försöket. Forskare kan använda någon av dessa koncentrationer av etanol för att fastställa detta förfarande i sin laboratortalet.
Under förvärv av Pavlovian diskriminering träning är det viktigt att kontrollera vätskeportar efter varje session för att säkerställa att all etanol som levererades har förbrukats. Lämnar råttor i kamrarna konditione för ytterligare 10 - 15 min efter varje session kan ske i början av PDT för att uppmuntra konsumtion av något etanol som inte förbrukades under sessionen. Antalet råttor som lämnar oförbrukat etanol i hamnarna bör minska när PDT skrider. Om vid utgången av PDT råttor är antingen (a) inte konsumerar all etanol och / eller (b) som inte svarar på CS + då dessa ämnen skall tas bort från studien. De flesta råttor tillförlitligt svara mer till CS + än CS. Men vissa råttor reagerar på höga nivåer för både ledtrådar och därmed inte visar tecken på diskriminering. Råttor som uppvisar höga svarar på både CS + och CS under PDT är inte bort från studien. Vår erfarenhet är dessa ämnen visar anmärkningsvärd diskrimineringunder den första utsläckningssession i frånvaro av etanol, vilket antyder att de har höga nivåer av att svara på CS- under PDT drivs av närvaro av etanol i vätskeporten. Dessa ämnen tenderar också att visa robusta förnyelseeffekter.
Begränsningar av förfarandet
Eftersom förnyelse provningen utförs i frånvaro av etanol, poster rade hamnframkallas av CS + gradvis minskar över testsessionen. Därför det totala beloppet av beteende som genereras vid test mot vilka experimentellt inducerade förändringar kan bedömas, är ganska låg. För i denna uppgift svarar tenderar att vara högre i början kontra slutet av testsessionen, är det viktigt att undersöka effekterna av experimentella manipulationer på kondition svara på försök-för-försök.
Noteringar i vätskebehållaren ger huvudberoende mått i denna uppgift. Dock kan en felaktig port post vara registrerat om ett djur är tillräckligt nära i vätskebehållaren för att bryta den infraröda strålen tvärs öppningen av fluidöppning med sina morrhår. Även sällsynta, felaktiga svar är självklart som en dramatisk ökning av den totala port poster i förhållande till ämnet beteende på tidigare sessioner. Videotaping djuren skulle underlätta upptäckt av eventuella felaktiga svar, och möjliggöra en mer ingående analys av de beteenden som uppvisas av råttorna i hela träning och testning.
Betydelsen av teknik i förhållande till befintliga / alternativa metoder
Context-inducerad förnyelse av narkotikasökande beteende är till stor del studeras med hjälp av en instrumental conditioning uppgift där den primära beroende variabeln är en operant respons, till exempel som en hävstång press 8,34 eller näsa peta 12. I föreliggande förfarande, är det läkemedel som söker svar "rade strategin" för vätske port som framkallas av presentationer avCS +. Detta är sannolikt förvärvas genom Pavlovian lärande, vilket är inlärningsprocessen som förmedlar bildandet av associationer mellan stimuli från omgivningen och den farmakologiska effekten av droger av missbruk hos människor.
Framtida applikationer
Denna uppgift kan användas i kombination med neurofarmakologi, optogenetik och neurokemi att studera neurala mekanismer som är involverade i sammanhanget-inducerad förnyelse av Pavlovian konditionerade alkoholsökande beteende 16. Dessutom kan beteendemässiga och neurala mekanismer som reglerar förvärv och utrotning av Pavlovian konditionerade alkoholsökande beteende undersökas. Slutligen kan denna uppgift användas för att utforska manipulationer av utrotning som kan förhindra förnyelse, en viktig inriktning för translationell forskning som syftar till att minska effekterna av drogen i samband miljösammanhang på reaktivitet mot narkotika prediktiva ledtrådar efter cue exponeringsterapi i mänsklig ytterlict.
Disclosures
Samtliga experimentella procedurer godkändes av Concordia University Animal Research etikkommitté och i enlighet med riktlinjer från den kanadensiska rådet om Animal Care. Den öppna tillgång publiceringen av denna artikel möjliggjorts genom sponsring från Med Associates Inc.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heavy-duty utility cart | Rubbermaid | #4520-88 | Used to transport rats in their home cage from the colony room to the behavior room or other facilities |
| Rats, Long-Evans | Harlan | Rats weighed 220-240 g on arrival | |
| Ohaus scale | Fisher | #S402421 | For weighing rats; tare the bottom of a plastic container first, then put the rat in it to weigh it |
| Beta-chips, aspen | Harlan | #7090A | Bedding for home cage |
| Nylabone | Bio-Serv | #K3580 | Enrichment provided in the home cage |
| Autoclavable rodent chow | Agribrands, Charles River | #5075 | For feeding rats |
| Wire bar cage lid | Ancare | #R20SS2B | Custom made with two slots for bottles |
| Cage bottom | Ancare | #R20PC | To house rats |
| Stoppers | Ancare | #8.5 | Rubber stoppers to occlude opening in water bottles & graduated cylinders; goes with ball point sipper tubes |
| Ball point tubes, 1.5" length | Ancare | #TD-99 | Inserted in stoppers, enables rats to drink from water bottles and graduated cylinders |
| Water bottles | Ancare | #FSPC8HT | 473 ml (16 oz) capacity, needs to be occluded with stopper |
| Graduated cylinders, 100 ml | Fisher | #0300741 | To contain ethanol during alcohol exposure in the home cage; spouted end needs to be cut off to enable occlusion with stoppers |
| Mettler scale | Mettler Toledo | #MS6001S | For weighing water bottles and ethanol cylinders |
| Polyethylene tubing, 1/32" inner diameter, 1/32" wall thickness, 3/32" outside diameter | Fisher | #14-169-1A | To connect 20 ml ethanol syringe to fluid port |
| Needle, 18 g, 1.5" length | Fisher | #B305199 | To connect polyethylene tubing to ethanol syringes; needs to be filed |
| Syringes, 20 ml, Luer-Lok non-sterile | Fisher | #1482316J | To contain ethanol on the fluid pumps; needs to be connected to the polyethylene tubing by a 18 G 1 1/2 needle |
| Syringes, 60 ml, Luer-Lok non-sterile | Fisher | #14-820-11 | To flush polyethylene tubing after PDT sessions |
| Single speed syringe pump, 3.33 rpm | Med Associates Inc. | #ENV-018MD | To hold 20 ml ethanol syringes and deliver ethanol |
| Fluid port | Med Associates Inc. | #ENV-254-CB | To enable ethanol delivery during PDT sessions; connected to ethanol syringes with polyethylene tubing |
| Port entry infrared detector | Med Associates Inc. | #ENV-215M | Fixed on both sides of fluid port; need 2 per fluid port |
| Houselight, 28 V, 100 mA | Med Associates Inc. | #ENV-135M | Provides general lighting in conditioning chamber |
| Clicker module | Med Associates Inc. | #ENV-225SM | Auditory stimulus for conditioning chamber |
| White noise generator with speaker | Med Associates Inc. | #PHM-100 | Auditory stimulus for conditioning chamber |
| Bar floor | Med Associates Inc. | #ENV-009A-GF | To go with modular test chamber |
| Bench coat, absorbent | VWR | #89126-790 | Absorbent paper to put in metal tray, needs to be cut to fit the metal tray |
| Polycarbonate sheet, 1/8" thick, 12-5/8" x 10" | Johnston Plastics | #30102515 | To make smooth transparent floor insert used for context 1. Needs to be cut in 11.5" x 12.25" pieces |
| Aluminium sheet perforated, 0.063" thick, 48" x 96", 0.250" holes x 0.375" centers | Anica Steel | To make perforated floor insert used for context 2. Needs to be cut in 11.5" x 12.25" pieces | |
| Black cardboard, 0.053" thick, 28" x 44" | Omer DeSerres | #P1909 | To construct panels covering the ceiling, door and back wall of the conditioning chamber in context 1. Needs to be cut to size. Each chamber needs three panels measuring approximately 11.5" x 13.25". The panels can be joined by the narrower side using duct tape. |
| All-purpose strength duct tape, 1.88" x 45 yd. | Duck Tape | Adhesive material to connect the black cardboard panels used to cover the back wall, ceiling and door in context 1. | |
| Modular test chamber | Med Associates Inc. | #ENV-009A | Conditioning chamber |
| Sound attenuating cubicles | Med Associates Inc. | #ENV-200R3AM | Comes with installed 28 V DC fan (#ENV-025F) |
| Petri dish | Fisher | #08748B | Bottom only, to contain the sprayed solution that provides the odor stimulus; needs to be centered in the metal tray in conditioning chambers |
| PCI interface package | Med Associates Inc. | #DIG-700P2-R2 | Connects tabletop interface cabinet to computer; includes 1 interface card, 1 Decode card, 1 ribbon cable and 1 28 V DC power cable |
| Large tabletop cabinet and power supply | Med Associates Inc. | #SG-6510D | Used to contain the 12 cards included in the SmartCrtrl 8 Input, 16 Output package |
| SmartCtrl 8 Input, 16 Output package | Med Associates Inc. | #DIG-716P2 | Used to connect and control the devices in the conditioning chamber. The package includes all the cables, the interface module and the connection panel. |
| Med PC IV software | Med Associates Inc. | #SOF-735 | Software to run programs. Needs to be installed on the computer. |
| Monitor LG, 19" LCD | Concordia computer store | #W1942TQ-BF | Computer monitor; to go with computer running Med PC IV |
| HP Z200 tower workstation | Concordia computer store | #BZ788US#ABA | Computer on which Med PC IV is run |
| Benzaldehyde, ≥99% | Les produits chimiques OMEGA Chemical Company Inc. | #B37-50 | Dilute in tap water for almond context odor |
| Lemon oil, cold pressed, California | Sigma Aldrich | #W262528-1KG-K | Dilute in tap water for lemon context odor |
| Ethyl alcohol, 95% | Commercial Alcohols | Dilute in tap water to desired concentration |
References
- Field, M., Duka, T. Cues paired with a low dose of alcohol acquire conditioned incentive properties in social drinkers. Psychopharmacology (Berl). 159, 325-334 (2002).
- Litt, M. D., Cooney, N. L., Morse, P. Reactivity to alcohol-related stimuli in the laboratory and in the field: predictors of craving in treated alcoholics). Addiction. 95, 889-900 (2000).
- Pomerleau, O. F., Fertig, J., Baker, L., Cooney, N. Reactivity to alcohol cues in alcoholics and non-alcoholics: implications for a stimulus control analysis of drinking. Addict Behav. 8, 1-10 (1983).
- Sinha, R. New findings on biological factors predicting addiction relapse vulnerability. Curr Psychiatry Rep. 13, 398-405 (2011).
- Conklin, C. A. Environments as cues to smoke: implications for human extinction-based research and treatment. Exp Clin Psychopharmacol. 14, 12-19 (2006).
- Conklin, C. A., Robin, N., Perkins, K. A., Salkeld, R. P., McClernon, F. J. Proximal versus distal cues to smoke: the effects of environments on smokers' cue-reactivity. Exp Clin Psychopharmacol. 16, 207-214 (2008).
- Janak, P. H., Chaudhri, N. The potent effect of environmental context on relapse to alcohol-seeking after extinction. Open Addict J. 3, 76-87 (2010).
- Chaudhri, N., Sahuque, L. L., Cone, J. J., Janak, P. H. Reinstated ethanol-seeking in rats is modulated by environmental context and requires the nucleus accumbens core. Eur J Neurosci. 28, 2288-2298 (2008).
- Chaudhri, N., Sahuque, L. L., Janak, P. H. Context-induced relapse of conditioned behavioral responding to ethanol cues in rats. Biol Psychiatry. 64, 203-210 (2008).
- Crombag, H. S., Shaham, Y. Renewal of drug seeking by contextual cues after prolonged extinction in rats. Behav Neurosci. 116, 169-173 (2002).
- Fuchs, R. A., Eaddy, J. L., Su, Z. I., Bell, G. H. Interactions of the basolateral amygdala with the dorsal hippocampus and dorsomedial prefrontal cortex regulate drug context-induced reinstatement of cocaine-seeking in rats. Eur J Neurosci. 26, 487-498 (2007).
- Marchant, N. J., Hamlin, A. S., McNally, G. P. Lateral hypothalamus is required for context-induced reinstatement of extinguished reward seeking. J Neurosci. 29, 1331-1342 (2009).
- Zironi, I., Burattini, C., Aicardi, G., Janak, P. H. Context is a trigger for relapse to alcohol. Behav Brain Res. 167, 150-155 (2006).
- Sciascia, J. M., Mendoza, J., Chaudhri, N. Blocking dopamine D1-like receptors attenuates context-induced renewal of Pavlovian-conditioned alcohol-seeking in rats. Alcohol Clin Exp Res. 38, 418-427 (2014).
- Chaudhri, N., Woods, C. A., Sahuque, L. L., Gill, T. M., Janak, P. H. Unilateral inactivation of the basolateral amygdala attenuates context-induced renewal of Pavlovian-conditioned alcohol-seeking. Eur J Neurosci. 38, 2751-2761 (2013).
- Chaudhri, N., Sahuque, L. L., Schairer, W. W., Janak, P. H. Separable roles of the nucleus accumbens core and shell in context- and cue-induced alcohol-seeking. Neuropsychopharmacology. 35, 783-791 (2010).
- Sparks, L. M., Sciascia, J. M., Ayorech, Z., Chaudhri, N. Vendor differences in alcohol consumption and the contribution of dopamine receptors to Pavlovian-conditioned alcohol-seeking in Long-Evans rats. Psychopharmacology (Berl). 231, 753-764 (2014).
- Simms, J. A., et al. Intermittent access to 20% ethanol induces high ethanol consumption in Long-Evans and Wistar rats. Alcohol Clin Exp Res. 32, 1816-1823 (2008).
- Wise, R. A. Voluntary ethanol intake in rats following exposure to ethanol on various schedules. Psychopharmacologia. 29, 203-210 (1973).
- Bouton, M. E., Westbrook, R. F., Corcoran, K. A., Maren, S. Contextual and temporal modulation of extinction: behavioral and biological mechanisms. Biol Psychiatry. 60, 352-360 (2006).
- Pavlov, I. Conditioned reflexes: an investigation of the physiological activity of the cerebral cortex. , Oxford University Press. Oxford, England. (1927).
- Gibbon, J., Baldock, M. D., Locurto, C., Gold, L., Terrace, H. S. Trial and intertrial durations in autoshaping. J Exp Psychol Anim Behav Process. 3, 264-284 (1977).
- Holland, P. C. CS-US interval as a determinant of the form of Pavlovian appetitive conditioned responses. J Exp Psychol Anim Behav Process. 6, 155-174 (1980).
- Stein, L., Sidman, M., Brady, J. V. Some effects of two temporal variables on conditioned suppression. J Exp Anal Behav. 1, 153-162 (1958).
- Coleman, D. A., Hemmes, N. S., Brown, B. L. Relative durations of conditioned stimulus and intertrial interval in conditioned suppression. J Exp Anal Behav. 46, 51-66 (1986).
- Schwarz-Stevens, K. S., Cunningham, C. L. Pavlovian conditioning of heart rate and body temperature with morphine: effects of CS duration. Behav Neurosci. 107, 1039-1048 (1993).
- Palm, S., Roman, E., Nylander, I. Differences in voluntary ethanol consumption in Wistar rats from five different suppliers. Alcohol. 45, 607-614 (2011).
- Gauvin, D. V., Moore, K. R., Holloway, F. A. Do rat strain differences in ethanol consumption reflect differences in ethanol sensitivity or the preparedness to learn. Alcohol. 10, 37-43 (1993).
- Goodwin, F. L., Amit, Z. Relative taste thresholds for ethanol, saccharin, and quinine solutions in three strains of rats nonselected for ethanol: a comparative study. Exp Clin Psychopharmacol. 8, 216-224 (2000).
- Goodwin, F. L., Bergeron, N., Amit, Z. Differences in the consumption of ethanol and flavored solutions in three strains of rats. Pharmacol Biochem Behav. 65, 357-362 (2000).
- Wilson, A. W., Neill, J. C., Costall, B. Strain differences in ethanol preference and reinforced behaviour: a comparison of two-bottle choice and operant self-administration paradigms. Behav Pharmacol. 8, 37-46 (1997).
- Yap, C. S., Richardson, R. Extinction in the developing rat: an examination of renewal effects. Dev Psychobiol. 49, 565-575 (2007).
- Carew, M. B., Rudy, J. W. Multiple functions of context during conditioning: a developmental analysis. Dev Psychobiol. 24, 191-209 (1991).
- Chaudhri, N., Sahuque, L. L., Janak, P. H. Ethanol seeking triggered by environmental context is attenuated by blocking dopamine D1 receptors in the nucleus accumbens core and shell in rats. Psychopharmacology (Berl). 207, 303-314 (2009).
