Summary
Aksonal transport av BDNF, en neurotrofisk faktor, er kritisk for overlevelsen og funksjon av flere neuronale populasjoner. Noen degenerative lidelser er preget av forstyrrelser i aksonal struktur og funksjon. Vi demonstrerte teknikker som brukes til å undersøke levende smugling av QD-BDNF i microfluidic kamre med primær nevroner.
Abstract
BDNF spiller en viktig rolle i flere fasetter av neuronal overlevelse, differensiering og funksjon. Strukturelle og funksjonelle underskudd i axoner er i økende grad sett på som et tidlig trekk ved nevrodegenerative sykdommer, inkludert Alzheimers sykdom (AD) og Huntingtons sykdom (HD). Foreløpig uklart er mekanismen (e) der nerveskaden er indusert. Vi har rapportert utvikling av en ny teknikk for å produsere biologisk aktiv, monobiotinylated BDNF (mBtBDNF) som kan brukes til å spore aksonal transport av BDNF. Quantum dot-merket BDNF (QD-BDNF) ble produsert av konjugering quantum dot 655 til mBtBDNF. En mikrofluidenhet ble brukt til å isolere axoner fra neuron cellelegemer. Tilsetting av QD-BDNF til aksonal rommet tillot direkte avbildning av BDNF transport i axoner. Vi viste at QD-BDNF beveges i det vesentlige utelukkende retrogradely, med svært få pauser, med en hastighet på omkring 1,06 mikrometer / sek bevegelse. Dette systemet kan brukes til å undersøke megchanisms av aksonal forstyrret funksjon i AD eller HD, og andre degenerative lidelser.
Introduction
Nerveceller er sterkt polarisert celler der lenge og ofte svært utdypet prosesser er grunnleggende for å etablere og opprettholde struktur og funksjon av nevrale kretser. Axon spiller en viktig rolle i gjennomføringen last til og fra synapser. Proteiner og organeller syntetiseres i cellen soma trenger å bli transportert gjennom axoner å nå den presynaptiske terminalen for å støtte neuronal funksjon. På tilsvarende måte mottas signaler ved distale aksoner må være omformet, og transporteres til soma. Disse prosessene er avgjørende for nevronale overlevelse, differensiering og vedlikehold. I den aksonal transport i enkelte neuroner må gjennomføres gjennom avstander mer enn 1000 ganger diameteren av cellekroppen, er muligheten for lett for seg at selv små underskudd kunne utpreget innvirkning neuronal og kretsfunksjon.
Hjerne-avledet neurotrop faktor (BDNF), et medlem av Neurotrophin familien av vekstfaktorer er til stede i maNY hjerneregioner, inkludert hippocampus, cerebral cortex, og basal forebrain. BDNF spiller en avgjørende rolle i kognisjon og hukommelse formasjon ved å støtte overlevelse, differensiering og funksjon av nerveceller som deltar i kognitive kretser. BDNF binder seg til sin reseptor, tyrosinkinase TrkB ved axon terminal hvor den aktiverer TrkB-mediert signalveier inkludert mitogen aktivert proteinkinase / ekstracellulære signalregulerte proteinkinase (MAPK / ERK), fosfatidylinositol-3-kinase (PI3K) og fosfolipase C-gamma (PLCγ). De proteiner som deltar i disse signalveier er pakket inn endocytiske vesikulær struktur for å danne den BDNF / TrkB signale endosome 1-6 som deretter retrogradely transporteres til neuronal soma.
Microfluidic kultur kammeret er et svært nyttig plattform for å studere axonal biologi under normale forhold, så vel som i innstillingen av skader og sykdom 7,8. Ved å isolere axonerfra cellelegemene, har anordningen tillot man studere transport spesifikt i axoner 8-10. De PDMS baserte microfluidic plattformer med 450 mikrometer microgroove barrierer brukt i denne studien ble kommersielt kjøpt (se Materialer tabell). For å undersøke BDNF transport, har vi utviklet en ny teknologi for å produsere monobiotinylated BDNF (mBtBDNF). Vi tok fordel av biotin akseptor peptid, AP (også kjent som AviTag). Det er en 15 aminosyre-sekvens som inneholder en lysin-rest som kan være spesielt bundet til et biotin av Escherichia coli-enzym biotin ligase, BIRA. Vi smeltet AviTag til C-terminalen av pre-mus proBDNF cDNA ved PCR (figur 1A). Konstruksjonen ble klonet inn i pattedyr-ekspresjonsvektor, pcDNA3.1 myc-His vektor. Vi har også klonet bakteriell Bira DNA inn i pcDNA3.1 myc-sin vektor. De to plasmider ble forbigående ko-transfektert inn i HEK293FT celler til å uttrykke begge proteiner. Bira katalysert ligation av bioti spesifikt til lysin ligge innenfor AviTag ved C-terminus av BDNF på en 1: 1-forhold for å produsere BDNF monobiotinylated monomer. Biotinylert, modne BDNF med en molekylvekt på ~ 18 kDa ble utvunnet og renset fra mediet ved hjelp av Ni-harpiks (figur 1C). Den biotinylering av BDNF var fullstendig, bedømt ved den manglende evne til å detektere umodifisert ved immuno BDNF (figur 1D). Streptavidin konjugerte kvanteprikker, QD 655, ble brukt til å merke mBtBDNF å gjøre QD-BDNF. Tilstedeværelsen av AviTag ikke forstyrrer aktiviteten til BDNF som mBtBDNF var i stand til å aktivere fosforylert TrkB (figur 1E) og stimulere utvekst neurite (figur 1F) i den utstrekning av rekombinant humant BDNF (rhBDNF). Farging vist at QD-BDNF colocalized med TrkB i hippocampus axoner, noe som indikerer at QD-BDNF er bioaktive (figur 1G). Å studere BDNF transport, ble QD-BDNF lagt til distal axon rommetmicrofluidic kulturer inneholder rotte E18 hippocampus nevroner (Figur 2A). QD-BDNF retrograd transport innen axoner ble tatt til fange av real-time levende avbildning av den røde fluorescerende tag (som støtter videoer S1, S2). Ved å analysere kymograph generert, ble QD-BDNF observert å bli transportert retrogradely med en hastighet på omkring 1,06 mikrometer / sek (figur 3A) i bevegelse. GFP eller mCherry-merket BDNF har blitt brukt til å spore aksonal bevegelse av BDNF. De største ulempene er at de er ikke skarpe nok for enkelt molekyl studier. Også tilstedeværelse av både antero og retrograd BDNF bevegelser som gjør det vanskelig å vurdere hvorvidt eller ikke retrogradely transporteres BDNF var i en Neurotrophin / reseptor-komplekset.
I denne videoen viser vi teknikker som brukes til å undersøke levende smugling av QD-BDNF i microfluidic kamre med primær nevroner. Den ultrabrightness og utmerket fotostabilitet av kvanteprikker makes det mulig å utføre langtids sporing av BDNF transport. Disse teknikker kan utnyttes for å forbedre undersøkelser av aksonal funksjon i AD, HD, og andre nevrodegenerative lidelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Kirurgiske og dyre prosedyrer utføres strengt i henhold til NIH Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr. Alle forsøk med bruk av dyr er godkjent av UCSD Institutional Animal Care og bruk komité.
1. Plasmid Cloning, Expression og rensing av Mono-biotinylert BDNF (mBtBDNF)
MERK: Konstruer pre-proBDNFavi og Bira cDNA inn pcDNA3.1 vektor og coexpress i HEK293FT celler ti. Rens mBtBDNF ved hjelp av Ni-NTA-perler i henhold til tidligere publiserte fremgangsmåte for fremstilling av modne og biologisk aktive monobiotinylated nervevekstfaktor (mBtNGF) 10.
2. Utarbeidelse av Microfluidic Chambers
Microfluidic nevron dyrking enheten gjør det mulig å fluidalt isolere axoner fra neuron celle organer. Monter kamre med fersk belagt dekkglass rett før hver disseksjon. Microfluidic kamre brukti denne protokollen er kommersielt kjøpt (se materialer og utstyr bord). Håndvask og gjenbrukes kommersielt kjøpt kamre opp til 5-6x.
- Håndvask microfluidic kamre i 1% Alconox. Skyll tre ganger med Milli-Q-vann i 30 minutter hver. Håndvask kamre igjen i 70% etanol.
- Utform kamre til tørk på Parafilm i laminær strømningshette. Utstråle og sterilisere begge sider av kamrene i 20 minutter under UV. Lagres sterilisert kammer i et sterilt 15 cm fatet forseglet med Parafilm ved romtemperatur.
- Plasser 24 x 40 mm nr. 1 glass Dekk i en glassbeholder. Bløtlegg Dekk i 35% saltsyre overnatter på en rotator. Dagen etter, skyll Dekk tre ganger i 30 min hver med vann.
- Sterilisere Dekk en etter en ved å dyppe hver dekkglass i 100% etanol og flammende over en Bunsen-brenner. Lagres tørt Dekk i en steril petriskål og holde den i romtemperatur til belegg.
- Lay out Dekk i en 15 cm kultur parabolen. Coat hver dekkglass med 0,7 ml av 0,01% poly-L-lysin (PLL) og inkuberes i hetten ved romtemperatur.
- Etter 1 time, skyll Dekk tre ganger med sterilt vann. Tørre Dekk med vakuum og sted hver dekkglass til en 6 cm kultur parabolen.
- Å montere mikrofluidkammeret, plasserer kammeret med microgroove side nederst på PLL belagt dekkglass med forsiktighet så du ikke berører microgrooves. Forsiktig presset ned i kammeret med en pipette for å sikre kammeret ble tett tillukket.
3. Disseksjon av Neuronal Kultur og Plate på Chambers
- Plasser to E17-E18 rotte hippocampi (ett hjernen) dissekert i en 15 ml konisk rør som inneholder 2 ml disseksjon buffer (HBSS, ingen kalsium, ingen magnesium, med 1% penn / strep og 10 mm HEPES. Skyll vev 3x med 5 ml disseksjon buffer hver gang. Fjern disseksjon buffer så mye som mulig og tilsett 900 ul av frisk dissection buffer.
- For å fordøye vevet, tilsett 100 pl av 10x trypsin (2,5%) i disseksjon buffer for å gjøre 1x arbeidskonsentrasjon. Plasser konisk rør i et 37 ° C vannbad. Etter 10 min med fordøyelsen, tilsett 100 pl av 10 mg / ml DNase I til en sluttkonsentrasjon i området rundt 1 mg / ml.
- Ved hjelp av en brann-polert Pasteur glass pipette, forsiktig Triturer vev ved å pipettere opp og ned 5-10x. Rett etter utgnidning, slukke trypsin med 2 ml plating medium (Neurobasal med 10% FBS, 2 mm GlutaMax, 2% B27).
- La prøven i hetten i 5 min for å tillate eventuelle rester av vev til å slå seg ned til bunnen. Fjern forsiktig 2 ml supernatant til et rent sterilt 15 ml konisk rør og sentrifuger ved 200 xg i 5 minutter for å pelletere cellene. Resuspender pelleten i 50 ul plating medier
- Telle celler med hemocytometer. Laste 15-20 pl cellesuspensjon (~ 40 000 celler) i én avdeling av en mikrofluidkammeret. Plasser kammereti kuvøse i 10 min for å la cellene å feste til dekkglass. Etter 10 min, tilsett mer plating medier for å fylle opp begge avdelinger av kammeret.
- På den andre dagen av disseksjon, helt erstatte plating medier med vedlikehold media (Neurobasal med 2 mM GlutaMax, 2% B27) i både cellekroppen og axon rommet. Axoner fra hippocampus nevroner begynner å krysse microgrooves i dag 3 og nå axon rommet mellom dag 5-7. I løpet av denne periode, å erstatte halvparten av dyrkning mediet med friskt media hver vedlikeholds 24 ~ 48 timer.
4. aksonale Transport av QD-BDNF
- Før leve avbildning av QD-BDNF aksonal transport, utarme BDNF fra begge cellekroppen og axon avdelinger av mikrofluidkammeret ved å skylle begge lommer med BDNF-frie, serum-frie medier Neurobasal hvert 30 min i 2 timer.
- Under BDNF utarming, forberede QD-BDNF konjugater. Bland 50 nM av mono-biotinylated BDNF dimer med 50 Nm QD655-streptavidin konjugater i Neurobasal media og inkuberes på is i 60 min.
- Fjern mediet i axon rommet og tilsett 300 ul QD-BDNF med en endelig konsentrasjon på 0,25 nM i 4 timer ved 37 ° C. For å minimere Diffusorelementene av QD-BDNF inn i cellekroppen rommet, er det meget viktig å alltid opprettholde et høyere nivå av mediet i cellekroppen rommet enn i axon rommet. Vask av ubundet QD-BDNF etter inkubasjon før live-bildebehandling.
- Gjennomføre direkte avbildning av QD-BDNF transport ved hjelp av en invertert mikroskop utstyrt med en 100X olje objektiv. Varm opp omfanget og miljøkammeret er festet til det til en konstant temperatur (37 ° C) og CO2 (5%). Bruke et sett med Texas Red eksitasjon / utslipps kuber å visualisere QD655 signal.
- Tilegne seg og fange time-lapse bilder i de midterste axoner med en hastighet på en ramme / sek for totalt 2 min ved hjelp av et CCD-kamera. Bruk microgrooves uten axoner that har ingen QD og dermed ikke noe signal som en kontroll for infiltrasjon.
- Analyser BDNF transport ved hjelp av noen bildeanalyse programvare eller NIH ImageJ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Produksjon og rensing av biologisk aktive Mono-biotinylated BDNF
Uttrykket vektor av BDNF smeltet sammen med en AviTag sekvens (GGGLNDIFEAQKIEWHE) ble opprettet i henhold til en tidligere utgitt protokoll 10. Molekylmassen for den fulle lengde fusjonsproteinet ble anslått til å være ~ 32 kDa ( http://ca.expasy.org/tools/pi_tool.html ) Monobiotinylated moden BDNF med en anslått molekylvekt på 18 kDa (figur 1A) ble produsert i HEK293FT-celler og renset fra conditioned media som beskrevet 10.
Forskjellige fraksjoner ble samlet og separert på en 15% SDS-PAGE. Ved hjelp av et kanin anti-tag antistoff Avi, vil et bånd med en molekylvekt på ~ 18 kDa ble påvist i den første fraksjon (figur 1B). For å teste renheten av preparatet, ble prøvene separert på SDS-PAGE, og ble farget ved å silver-farging. Som vist på figur 1C, ble 18 kDa-båndet de dominerende artene i den første eluering. Streptavidin-agarose perler mater assayer ble utført for å vurdere omfanget av biotinylering av mBtBDNF preparatet. Etter nedtrekk med streptavidin-agarose-perler, ble proteiner som forble i supernatanten utfelles med 7% trikloreddiksyre (TCA). Disse prøver ble analysert ved SDS-PAGE og de blots ble probet med enten anti-Avi antistoffer (øverst) for å detektere det totale protein eller HRP-streptavidin for å påvise biotinylerte proteiner. Våre resultater viser at alle de signaler som var forbundet med perlene mens ingen bånd ble påvist i supernatanten (figur 1D). Vi konkluderer dermed at mBtBDNF ble biotinylert på en effektivitet> 99,9%.
For å teste den biologiske aktivitet av mBtBDNF i binding og aktivering av reseptoren TrkB, behandlet vi en 3T3 cellelinje som uttrykker TrkB med enten rhBDNF (20 ng / ml) eller purified mBtBDNF (20 ng / ml) i 10 min. Celler som mottok ingen behandling ble også oppsamlet som kontroll. Lysater ble separert på en 4-12% SDS-PAGE, og et kanin-anti-pTrkB antistoff ble anvendt for å undersøke den fosforylert TrkB. Som vist i figur 1E, lik rhBDNF, var mBtBDNF i stand til å indusere fosforylering av TrkB ved et tilsvarende nivå. Vi har også behandlet rotte hippocampus-neuroner med enten rhBDNF (20 ng / ml) eller renset mBtBDNF (20 ng / ml) i 48 timer. Renset mBtBDNF var i stand til å stimulere hippocampal neurite utvekst til omfanget av rhBDNF (figur 1F). For å undersøke samlokalisering av QD-BDNF med TrkB reseptoren, ble QD-BDNF lagt til rotte hippocampus axon i 4 timer ved 37 ° C. Nevronene ble deretter fast og immunostained for TrkB. Som vist på figur 1G, QD-BDNF samlokalisert med TrkB. Vi konkluderer dermed at mBtBDNF er fullt aktiv i sin biologiske funksjon.
Levende Imaging av aksonal Transport av QD-BDNF in Hippocampus Neuroner
Primære embryoniske rotte hippocampus-neuroner (E17-18) ble dissekert og belagt i cellekroppen rommet i mikrofluidkammeret. På dag 4 eller 5, axoner forlenget på tvers av microgrooves inn axon rommet. På dag 7, de fleste axoner vokste inn i axon rommet. QD-BDNF ble gjort ved å inkubere streptavidin QD655 med mBtBDNF ved en 1: 1-forhold (QD: BDNF dimer) på is i 1 time. QD-BDNF (0,25 nM) ble deretter tilsatt til axon kammeret og inkubert i 4 timer ved 37 ° C før avbildning (figur 2A).
Etter inkubasjon, ble QD-BDNF funnet å binde spesifikt til axoner i axon rommet. I cellekroppen rommet, ble QD signaler akkumulert i de fleste av de proksimale axoner og cellelegemer som indikerer QD-BDNF ble internalisert ved axoner og retrogradely transportert til cellelegemer. Time-lapse bildeserie av QD-BDNF signaler innenfor axoner ble utført i microgrooves. QD signals ble observert i de fleste av microgrooves med axoner mens ingen QD signal kan sees i microgrooves i fravær av aksoner, indikerer liten eller ingen spredning av QD-signalet fra axon kammeret til cellen kroppsrommet (figur 2B).
I figur 2C, ble en 80 um lange segment av aksoner i hippocampale neuroner fluorescensmerket målt for 100 sek. Totalt 6 QD-BDNF signalene ble tydelig frem under videoopptak. Tre QD-signaler som er tatt opp beveget ensrettet mot cellelegemet (venstre side). QD hendelsen merket med hvit pil (t: 31 sek til t: 101 sek) flyttet jevnt til cellen kroppen krysset hele feltet i ~ 70 sek. En annen QD hendelsen merket med grønn pil (t: 1 sek til t: 61 sek) flyttet retrogradely først. Ved t: 21 sek, QD-BDNF beveget anterogradely etter 10 til 20 sekunder, og deretter forandret retning igjen mot cellelegemet. QD hendelsen merket med gul pil (t: 1 sek til t: 71 sek) også flyttet Retrograd Ely, men satt på pause for ~ 20 sek under bevegelsen. QD-BDNFs som ikke var i bevegelse i løpet av denne 100 sek ble vurdert stasjonær. Bare bevegelige objekter ble senere analysert for å beregne flytting hastighet, gjennomsnittlig hastighet, og tid stanset.
Dataanalyse i QD-BDNF Transport Kymograph
Kymographs ble opprettet fra hver film tatt opp med Metamorph programvare. I en 80 um lange segment av axoner Som vist i de representative kymographs av QD-BDNF transport (figur 3A), QD-BDNF bevegelser ble registrert i løpet av 120 sek. I representative kymograph 1, QD-BDNF flyttes raskt og jevnt mot venstre (cellekroppen), krysset feltet (80 mikrometer) i ~ 60 sek, med svært korte pauser (støtter Video S1). Mens i representative kymograph 2, en QD-BDNF reiste ~ 50 mikrometer i 120 sek retrogradely, med minst tre segmenter av lengre pauser (angitt med piler) (Støtte Video S2).
innhold "> Figur 3B er punktplottet flytte hastighet, gjennomsnittlig hastighet, og pauset tiden for hver enkelt QD-BDNF. Den bevegelige hastigheten på QD-BDNF var relativt rask, alt 0,47 til 1,97 mikrometer / sek med gjennomsnittet av 1.06 ± 0.05 mikrometer / sek. Den gjennomsnittlige hastigheten til QD-BDNF ble beregnet som reiseavstand / tid brukt. Og fordi BDNF pauset i løpet av sin transport, gjennomsnittlig hastighet var mye lavere enn å flytte hastighet med gjennomsnitt på 0,48 ± 0,03 mikrometer / sek (spenner 0,17 til 1,59 mikrometer / sek). pauset tid ble også analysert som en karakterisering av BDNF bevegelse. Gjennomsnittlig varighet av pauser var 15.88 ± 1.30 sek (som strekker seg 6-33 sek) (tabell 1).
Figur 1. Rensing av biologisk aktive, monobiotinylated BDNF (mBtBDNF). (A) En skjematisk tegning som viser fremstilling av mBtBDNF. Både pre-proBDNFavi og Bira ble klonet inn i pcDNA3.1myc-hans vektor som beskrevet 10. (B) Forskjellige fraksjoner ble eluert fra Ni-harpiks ble oppsamlet og separert på en 15% SDS-PAGE gel. Et kanin anti-Avi tag antistoff ble anvendt i blot. Et band med en tilsynelatende molekylvekt på ~ 18 kDa ble anerkjent i Elute, i samsvar med den anslåtte molekylmasse for den modne mBtBDNF protein. (C) En sølvfarging Gel viser den 18 kDa mBtBDNF var de dominerende artene i elueringsfraksjon. (D) Renset mBtBDNF ble inkubert med streptavidin-agarose perler. Perlene ble vasket og kokt i SDS loading buffer mens supernatanten ble utfelt med TCA før SDS-PAGE-analyse. Den blot ble analysert med enten anti-Avi antistoff eller med HRP-streptavidin. (E) 20 ng / ml renset mBtBDNF eller rhBDNF ble tilsatt til en 3T3 cellelinje som expresses TrkB for 10 min. Lysater ble høstet og separert på en 4-12% SDS-PAGE. Kontroll cellelysat ble også analysert. Den blot ble probet med kanin anti-pTrkB antistoff. Total TrkB ble avslørt ved hjelp av en mus anti-TrkB antistoff. (C) 20 ng / ml renset mBtBDNF eller rhBDNF ble tilsatt til rotte hippocampus-neuroner i 48 timer. DIC bildene ble tatt for å analysere neurite utvekst. (G) QD-BDNF ble inkubert med rotte hippocampus nevroner axoner for 4 timers (skala bar 5 mikrometer). Nevronene ble deretter fast og immunostained for TrkB.
. Figur 2. Enkelt molekyl avbildning av retrograd transport av QD-BDNF i axoner (A) ovenfra: En skjematisk tegning av mikrofluidkammer med primære neuroner belagt i cellekroppen rommet. Axoner vokste over microgrooves inn i axon rommet. QD655 merket BDNF ble lagt til axon rommet. Sett fra siden: Mediene nivået i axon rommet ble holdt lavere enn cellekroppen rommet for å minimere spredning av QD-signal. (B) Røde fluorescens bilder og DIC bilder av cellekroppen rommet, microgrooves og axon rommet. QD-BDNF bundet spesifikt til axoner, internalisert, og retrogradely transportert til cellelegemer langs axoner. Ingen QD signal ble observert i microgrooves fraværende av axoner. (C) Time-lapse video bildeserie av QD-BDNF transport langs aksonet. Både rørende og stasjonære QD-BDNF signalene var til stede i de fleste av filmene. På tidspunktet t: 1 sek, kan minst fire QDS sees. Etter 10 sek, er to QDS (angitt med grønne og gule piler) går mot cellen kroppen (venstre på bildet). Disse to QDS flytte og pause i de første par bilder, og til slutt flytte ut av bildene til venstre (på ~ 70 sek). En annen QD beveget inn i banenved t: 31 sek (angitt med hvit pil) og flyttet raskt uten mye pauser til venstre.
Figur 3. QD-BDNF transport kymograph og dataanalyse. (A) Representative kymographs av QD-BDNF transport i primær hippocampus nevroner. I Kymo 1, flyttet en lys QD tvers av feltet ved relativt høy hastighet med bare noen få korte pauser. I Kymo 2, var de bevegelige hastigheten på QDS tregere, og bevegelsen ble avbrutt med hyppigere og lengre pauser. (B) Scatter plott av QD-BDNF flytte hastighet, gjennomsnittlig hastighet (beregnet som reiser avstand / tid brukt) og pauset tid. Gjennomsnittet bevegelse hastighet av QD-BDNF var 1,06 ± 0,05 mikrometer / sek (varierer 0,47 til 1,97 mikrometer / sek. Den gjennomsnittlige hastigheten til QD-BDNF var 0,48 ± 0,03 mikrometer / sek (varierer fra 0. 17 til 1,59 pm / sek). Gjennomsnittlig varighet av pauser var 15.88 ± 1.30 sek (som strekker seg 6-33 sek).
Støtte Video S1 . Representant QD-BDNF transport video 1. Flere QD-BDNF bevege seg raskt mot venstre side (cellekroppen) med svært få korte pauser.
Støtte Video S2 . Representant QD-BDNF transport video 2. Flere QD-BDNF flytte relativt treg mot venstre side (cellekroppen) med hyppige og lange pauser.
| Minimum | Maksimal | Mean | 88px;. "> Std feil||
| Moving hastighet (micron / sek) | 0.47 | 1.97 | 1.06 | 0,05 |
| Gjennomsnittlig hastighet (mikron / sek) | 0,17 | 1.59 | 0,48 | 0,03 |
| Pauset (sek) | 6 | 33 | 15.88 | 1.30 |
Tabell 1. Dataanalyse av QD-BDNF transport.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne studien rapporterer vi utviklingen av en ny teknikk for å produsere biologisk aktive, monobiotinylated BDNF (mBtBDNF) som kan brukes til å spore aksonal transport av BDNF. Ved å konjugere protein til quantum dot streptavidin, og anvendelse av en mikrofluidkammeret, muliggjør fremgangsmåten at en for å detektere aksonal transport av BDNF i primære neuroner med enkelt molekyl følsomhet, i sanntid, og med romlige og tidsmessige oppløsninger. Verktøyene som brukes her gi et middel som å studere molekylære maskiner som formidler aksonal transport av BDNF / TrkB signale endosomes i nevroner i helse og sykdom.
BDNF-GFP, eller -mCherry har blitt brukt til å spore aksonal bevegelse av BDNF i forskjellige neuronale kulturer in vitro. Disse reagenser tilby ett alternativ for å undersøke antero transport og, muligens, for å undersøke autokrint aktivering av TrkB. Men det er store ulemper for å studere retrograd transport, den mest fremtredende av which er at GFP eller mCherry er ikke skarpe nok for enkelt molekyl studier. Tidligere undersøkelser har vist at under fysiologiske konsentrasjoner av NGF, ble en enkelt NGF dimer internalisert 11 og retrogradely transporteres 8.. Viktigere, tillater bruk av QD BDNF også at man kan definere den subcellulære beliggenheten der BDNF binder dets TrkB reseptorer. Ved å bruke GFP eller mCherry-merkede proteiner, vil Somal uttrykk resultere i nærvær innenfor axon av proteiner som gjennomgår antero og vel som retrograd transport. Som sådan, kan det være vanskelig å vurdere hvorvidt eller hvor retrogradely transporteres BDNF støtt dens reseptor forut for retrograd transport. Faktisk, som en spekulasjon, retrograd transport innen axoner av BDNF-GFP eller BDNF-mCherry produsert i samme nervecellen kan avvike fra det følgende binding av BDNF i målet av innervasjon.
Selv om kjemisk tverrbinding er blitt anvendt for produksjon av biologisk aktivt nervevekstfaktor(NGF), der fremgangsmåten innføres heri er overlegne. For det første er det vanskelig å kontrollere nøyaktig graden av biotinylering; For eksempel ble hver NGF merket med 5-9 biotin-rester 8,9,12. For det andre, kan tverrbinding inaktivere proteinet. I tilfelle av NGF, tverrbinding nødvendiggjort feste til karboksylgrupper 13. I tilfelle av BDNF er aktiviteten ofte tapt følgende kjemiske tverrbindings til biotin. Endelig vil graden av tverrbinding være ufullstendig. En fersk rapport viste at ~ 0.8 biotin / BDNF molekylet ble produsert ved kjemisk kryssbinding; som sådan ~ 20% av BDNF ble ikke merket 9. Tilstedeværelsen av umerket BDNF kan komplisere tolkningen av resultatene.
Vår teknikk tilbyr unike fordeler som BDNF molekyler er alle merket med et enkelt biotin på samme sted, og dermed utgjør en homogen utarbeidelse av biotinylert BDNF. Ved konjugering til nanofluorescent partikler som kvanteprikker, kan mBtBDNF værebrukes til sporing trasé og prosesser som BDNF er internalisert, trafikk innenfor nevroner: i dendritter, i axoner samt i celle organer. Denne metoden gjør det mulig med bruk av alternative koder for BDNF. Utvikling av andre typer nanopartikler lover ekstra fordeler.
Defekter i aksonal trafficking og signalering av BDNF har vært innblandet i nevrodegenerative sykdommer. Sterke bevis har knyttet defekt transport av BDNF til kortikale-striatal atrofi i Huntingtons sykdom 14,15. Mutant huntingtin protein forstyrrer samspillet mellom huntingtin-assosiert protein-1 (HAP1) og dynein motor i sympatiske nerveceller, hemmer BDNF transport, og resulterer i tap av neurotrophic støtte og nevronale toksisitet 16-18. Våre teknikker for å spore bevegelse av aksonal BDNF kan tjene som et verdifullt verktøy for å studere aksonal funksjon i neurodegenerative lidelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke Yue (Pauline) Hu, Rachel Sinit for deres teknisk assistanse. Studien er støttet av NIH stipend (PN2 EY016525) og med midler fra Down syndrom forskning og behandling Foundation og Larry L. Hillblom Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Platinum pfx DNA polymerase | Invitrogen | 11708021 | |
| EcoRI | Fermentas | FD0274 | |
| BamHI | Fermentas | FD0054 | |
| HEK293FT cells | Invitrogen | R70007 | |
| DMEM-high glucose media | Mediatech | 10-013-CV | |
| D-biotin | Sigma | B4639 | |
| TurboFect | Fermentas | R0531 | |
| PMSF | Sigma | P7626 | |
| Aprotinin | Sigma | A6279 | |
| Ni-NTA resins | Qiagen | 30250 | |
| Protease inhibitors cocktail | Sigma | S8820 | |
| Silver staining kit | G-Biosciences | 786-30 | |
| Human recombinant BDNF | Genentech | ||
| Microfluidic chambers | Xona | SND450 | |
| 24 x 40 mm No. 1 glass coverslips | VWR | 48393-060 | |
| Poly-L-Lysine | Cultrex | 3438-100-01 | |
| HBSS | Gibco | 14185-052 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| FBS | Invitrogen | 16000-044 | |
| GlutaMax | Invitrogen | 35050-061 | |
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| QD655-streptavidin conjugates | Invitrogen | Q10121MP | |
| anti-Avi tag antibody | GenScript | A00674 | |
| streptavidin-agarose beads | Life Technology | SA100-04 | |
| Trichloroacetic acid | Sigma | T6399 | |
| HRP-streptavidin | Thermo Scientific | N100 | |
| anti-pTrkB antibody | a generous gift from Dr M. Chao of NYU | ||
| anti-TrkB antibody | BD Science | 610101 |
References
- Wu, C., et al. A functional dynein-microtubule network is required for NGF signaling through the Rap1/MAPK pathway. Traffic. 8, 1503-1520 (2007).
- Wortzel, I., Seger, R. The ERK Cascade: Distinct Functions within Various Subcellular Organelles. Genes & cancer. 2, 195-209 (2011).
- Huang, E. J., Reichardt, L. F. Trk receptors: roles in neuronal signal transduction. Annual review of biochemistry. 72, 609-642 (2003).
- Nonomura, T., et al. Signaling pathways and survival effects of BDNF and NT-3 on cultured cerebellar granule cells. Brain research. Developmental brain research. 97, 42-50 (1996).
- Weissmiller, A. M., Wu, C. Current advances in using neurotrophic factors to treat neurodegenerative disorders. Translational neurodegeneration. 1, 14 (2012).
- Zhang, K., et al. Defective axonal transport of Rab7 GTPase results in dysregulated trophic signaling. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 7451-7462 (2013).
- Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nature methods. 2, 599-605 (2005).
- Cui, B., et al. One at a time, live tracking of NGF axonal transport using quantum dots. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 13666-13671 (2007).
- Xie, W., Zhang, K., Cui, B. Functional characterization and axonal transport of quantum dot labeled BDNF. Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. 4, 953-960 (2012).
- Sung, K., Maloney, M. T., Yang, J., Wu, C. A novel method for producing mono-biotinylated, biologically active neurotrophic factors: an essential reagent for single molecule study of axonal transport. Journal of neuroscience methods. 200, 121-128 (2011).
- Tani, T., et al. Trafficking of a ligand-receptor complex on the growth cones as an essential step for the uptake of nerve growth factor at the distal end of the axon: a single-molecule analysis. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 2181-2191 (2005).
- Bronfman, F. C., Tcherpakov, M., Jovin, T. M., Fainzilber, M. Ligand-induced internalization of the p75 neurotrophin receptor: a slow route to the signaling endosome. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 3209-3220 (2003).
- Kruttgen, A., Heymach, J. V., Kahle, P. J., Shooter, E. M. The role of the nerve growth factor carboxyl terminus in receptor binding and conformational stability. The Journal of biological chemistry. 272, 29222-29228 (1997).
- Zuccato, C., Cattaneo, E. Brain-derived neurotrophic factor in neurodegenerative diseases. Nature reviews. Neurology. 5, 311-322 (2009).
- Gharami, K., Xie, Y., An, J. J., Tonegawa, S., Xu, B. Brain-derived neurotrophic factor over-expression in the forebrain ameliorates Huntington's disease phenotypes in mice. Journal of neurochemistry. 105, 369-379 (2008).
- Gauthier, L. R., et al. Huntingtin controls neurotrophic support and survival of neurons by enhancing BDNF vesicular transport along microtubules. Cell. 118, 127-138 (2004).
- Her, L. S., Goldstein, L. S. Enhanced sensitivity of striatal neurons to axonal transport defects induced by mutant huntingtin. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 13662-13672 (2008).
- Rong, J., et al. Regulation of intracellular trafficking of huntingtin-associated protein-1 is critical for TrkA protein levels and neurite outgrowth. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 26, 6019-6030 (2006).
