Summary
O transporte axonal de BDNF, um factor neurotrófico, é crítico para a sobrevivência e função de várias populações neuronais. Algumas desordens degenerativas são marcadas pela ruptura da estrutura e função axonal. Nós demonstramos as técnicas utilizadas para examinar o tráfico ao vivo do QD-BDNF em câmaras microfluídicos usando neurônios primários.
Abstract
BDNF desempenha um papel importante em vários aspectos da sobrevivência neuronal, diferenciação e função. Défices funcionais e estruturais no axônios são cada vez mais vistos como uma característica precoce de doenças neurodegenerativas, incluindo a doença de Alzheimer (AD) e a doença de Huntington (DH). Como ainda é pouco claro o mecanismo (s) pelo qual é induzida lesão axonal. Nós relataram o desenvolvimento de uma nova técnica para produzir biologicamente activo, monobiotinylated BDNF (mBtBDNF) que pode ser utilizado para rastrear o transporte axonal de BDNF. Quantum dot marcado BDNF (QD-BDNF) foi produzido pela conjugação de ponto quântico 655 a mBtBDNF. Um dispositivo de microfluidos foi usada para isolar axónios de corpos celulares de neurónios. A adição de QD-BDNF ao compartimento axonal permitiu imagens ao vivo de transporte BDNF nos axônios. Nós demonstramos que QD-BDNF movido essencialmente exclusivamente retrogradamente, com muito poucas pausas, a uma velocidade de deslocamento de cerca de 1,06 pM / seg. Este sistema pode ser utilizado para me investigarcanismos de função axonal interrompido no AD ou HD, bem como outras doenças degenerativas.
Introduction
Os neurônios são as células cujos processos longos e muitas vezes altamente elaborados são fundamentais para estabelecer e manter a estrutura ea função dos circuitos neurais altamente polarizada. O axônio desempenha um papel vital no que transportam cargas de e para as sinapses. As proteínas e organelas sintetizados no soma célula necessita de ser transportado por axónios para chegar ao terminal pré-sináptico para suportar a função neuronal. Do mesmo modo, os sinais recebidos pelo axónios distais devem ser transduzidas e transportado para o soma. Estes processos são essenciais para a sobrevivência neuronal, diferenciação e manutenção. Em que o transporte axonal em neurónios algumas deve ser conduzida através de distâncias mais do que 1000 vezes o diâmetro do corpo da célula, a possibilidade é facilmente imaginado que mesmo pequenos défices pode impactar significativamente a função neuronal e o circuito.
Derivado de factor neurotrófico cerebral (BDNF), um membro da família da neurotrofina de factores de crescimento, está presente na maregiões do cérebro, incluindo ny hipocampo, córtex cerebral, e do prosencéfalo basal. BDNF desempenha um papel crucial na formação da memória e cognição, através do apoio da sobrevivência, diferenciação e função de neurónios que participam em circuitos cognitivos. BDNF se liga ao seu receptor, a tirosina-cinase TrkB, no terminal axonal em que activa as vias de sinalização mediadas por TrkB, incluindo a proteína quinase activada por mitógeno / regulada por sinal extracelular da proteína cinase (MAPK / ERK), fosfatidilinositol-3-quinase (PI3K) e fosfolipase C-gama (PLCy). As proteínas que participam nestas vias de sinalização são empacotados em vesículas de endocitose para formar o BDNF / TrkB sinalização endosome 1-6 que são, então, transportado retrogradamente à soma neuronal.
A câmara de cultura de microfluidos é uma plataforma muito útil para estudar a biologia axonal, em condições normais, bem como na definição de lesões e doenças 7,8. Por axônios isolandodos corpos celulares, o dispositivo tem permitido um para estudar o transporte especificamente em axônios 8-10. As plataformas microfluídicos baseados PDMS com 450 mM barreiras microgroove utilizados neste estudo foram adquiridos comercialmente (ver tabela de materiais). Para examinar o transporte BDNF, desenvolvemos uma nova tecnologia para produzir monobiotinylated BDNF (mBtBDNF). Tiramos proveito do peptídeo biotina aceitante, AP (também conhecido como AviTag). É uma sequência de 15 aminoácidos que contém um resíduo de lisina, que pode ser especificamente ligado a uma biotina pela Escherichia coli enzima biotina ligase, BirA. Nós fundido a AviTag para o C-terminal do rato pré-proBDNF cDNA por PCR (Figura 1A). A construção foi clonada no vector de expressão de mamífero, pcDNA3.1 Myc-His vector. Nós também clonado o DNA bacteriano BirA na pcDNA3.1 Myc-His vector. Os dois plasmídeos foram co-transfectadas transientemente em células HEK293FT para expressar ambas as proteínas. BirA catalisou a ligadura da biotaem que especificamente a lisina residir no AviTag no C-terminal do BDNF a uma razão de 1: 1 para produzir monobiotinylated monómero BDNF. Biotinilado, BDNF madura com uma massa molecular de ~ 18 kDa foi recuperada e purificada a partir dos meios utilizando Ni-resina (Figura 1C). A biotinilação de FNDC estava completa, conforme avaliado pela incapacidade para detectar o BDNF não modificado por imunotransferência (Figura 1E). Estreptavidina conjugada pontos quânticos, QD 655, foram utilizados para marcar mBtBDNF fazer QD-BDNF. A presença do AviTag não interferir com a actividade do BDNF como o mBtBDNF foi capaz de activar TrkB fosforilada (Figura 1E) e estimular o crescimento de neurites (Figura 1F) até ao ponto de BDNF recombinante humano (rhBDNF). Acms mostrado que QD-BDNF colocalized com TrkB em axónios do hipocampo, indicando que QD-BDNF é bioactivo (Figura 1G). Para estudar o transporte de BDNF, QD-BDNF foi adicionado ao compartimento do axónio distaiculturas de microfluidos contendo rato E18 neurónios do hipocampo (Figura 2A). QD-BDNF transporte retrógrado dentro de axônios foi capturado por em tempo real imagens ao vivo da etiqueta fluorescente vermelha (apoiando vídeos S1, S2). Ao analisar o quimógrafo gerado, QD-BDNF foi observada a ser transportados retrogradamente a uma velocidade de deslocamento de cerca de 1,06 pM / seg (Figura 3A). GFP ou mCherry-BDNF com etiquetas ter sido usado para controlar o movimento axonal de BDNF. As principais desvantagens são que eles não são brilhantes o suficiente para os estudos de moléculas individuais. Além disso, a presença de ambos os movimentos anterógrada e retrógrada BDNF torna difícil avaliar se ou não o BDNF transportado retrogradamente era um complexo de neurotrofina / receptor.
Neste vídeo, demonstramos as técnicas utilizadas para examinar o tráfico ao vivo do QD-BDNF em câmaras microfluídicos usando neurônios primários. O ultrabrightness e excelente fotoestabilidade de pontos quânticos makes-se possível realizar de seguimento a longo prazo de transporte BDNF. Estas técnicas podem ser explorados para reforçar estudos de função axonal em AD, HD, e outras desordens neurodegenerativas.
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Protocol
Os procedimentos cirúrgicos e de animais são realizadas estritamente de acordo com o Guia do NIH para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. Todos os experimentos que envolvem o uso de animais são aprovados por UCSD Animal Care Institucional e Comitê de Uso.
1. plasmídeo Clonagem, expressão e purificação do mono-biotinilado BDNF (mBtBDNF)
NOTA: Construir pré-proBDNFavi e BirA cDNA em vetor pcDNA3.1 e co-expressar em células HEK293FT 10. Purificar mBtBDNF utilizando pérolas de Ni-NTA de acordo com o método previamente publicado de produzir factor de crescimento do nervo monobiotinylated madura e biologicamente activa (mBtNGF) 10.
2 Preparação de microfluídicos Chambers
Microfluídicos dispositivo neurônio cultura torna possível isolar fluidicamente axônios de corpos celulares neurônio. Montar câmaras com lamelas recentemente pintadas direito antes de cada dissecção. Câmaras microfluídicos usadosneste protocolo são comercialmente adquirido (ver materiais e tabela do equipamento). Lave à mão e reutilizados câmaras adquiridas comercialmente até 5-6x.
- Somente lavagem à mão câmaras microfluídicos em 1% Alconox. Lavar três vezes com água Milli-Q durante 30 min cada. Câmaras de lavagem de mão novamente em etanol 70%.
- Coloque para fora câmaras para secar em Parafilm na capela de fluxo laminar. Irradiar e esterilizar ambos os lados das câmaras, durante 20 min sob UV. Loja câmaras esterilizadas numa estéril 15 centímetros prato selado com Parafilm à temperatura ambiente.
- Coloque 24 x 40 mm No. 1 lamínulas de vidro em um recipiente de vidro. Mergulhe as lamelas em ácido clorídrico a 35% durante a noite em um rotador. No dia seguinte, lavar as lamelas três vezes, durante 30 min cada, com água.
- Esterilizar as lamelas, um por um, mergulhando cada lamela em etanol a 100% e ardor sobre um bico de Bunsen. Armazenar lamelas secas numa placa de Petri estéril e mantê-lo à temperatura ambiente até o revestimento.
- Coloque UOt as lamelas em um 15 centímetros prato de cultura. Bata de cada lamela com 0,7 ml de 0,01% de poli-L-lisina (PLL) e incuba-se na capa, à temperatura ambiente.
- Após 1 h, lavar as lamelas três vezes com água estéril. Lamelas secos com vácuo e coloque cada lamela em um prato de cultura 6 centímetros.
- Para montar a câmara de microfluídica, coloque a câmara com o lado microgroove na parte inferior para a lamela PLL revestido com cuidado para não tocar nas estrias. Gentilmente pressionado a câmara com uma ponteira para garantir a câmara foi hermeticamente fechado.
3. Dissecção da Neuronal Cultura e Placa em Chambers
- Coloque dois hipocampos E17-E18 rato (um cérebro) dissecados em um tubo de 15 ml contendo 2 ml de tampão de dissecção (HBSS, sem cálcio, magnésio não, com 1% pen / strep e HEPES 10 mM. Lavar os tecidos 3x com 5 ml dissecção de tampão de cada vez. Remover o tampão de dissecção, tanto quanto possível, e adicionar 900 ul de di frescotampão ssection.
- Para digerir o tecido, adicionar 100 ul de tripsina 10x (2,5%) no tampão de dissecção para tornar a concentração de trabalho 1x. Colocar o tubo cónico de 37 ° C Banho de água. Após 10 minutos de digestão, adicionar 100 ul de 10 mg / ml de ADNase I a uma concentração final de cerca de 1 mg / ml.
- Usando uma pipeta Pasteur de vidro polido-fogo, triturar suavemente os tecidos pipetando para cima e para baixo 5-10x. Logo após a trituração, extinguir a tripsina com 2 ml de meio (chapeamento Neurobasal com 10% de FBS, 2 mM de GlutaMax, 2% B27).
- Deixar a amostra na capa por 5 minutos para permitir que todos os restos dos tecidos para se estabelecer para o fundo. Remover cuidadosamente 2 mL de sobrenadante para um tubo de 15 ml estéril cónico limpo e centrifugar a 200 xg durante 5 min para sedimentar as células. Ressuspender o sedimento em 50 mídia ul chapeamento
- Contar as células com hemocitômetro. Carga 15-20 ul de suspensão de células (~ 40.000 células) em um compartimento da câmara de microfluidos. Coloque a câmarana incubadora durante 10 minutos para permitir que as células se fixem à lamela. Após 10 min, adicionar mídia mais chapeamento para encher ambos os compartimentos da câmara.
- No segundo dia da dissecção, substituir completamente os meios de chapeamento com meio de manutenção (Neurobasal com GlutaMax 2 mM, 2% B27), tanto no corpo da célula e o compartimento do axónio. Os axônios dos neurônios do hipocampo começa a atravessar as estrias no dia 3 e atingir o compartimento do axônio entre os dias 5-7. Durante este período de tempo, substitua metade da media cultura com meio de manutenção fresco todos os 24 ~ 48 horas.
4. axonal Transporte de QD-BDNF
- Antes da imagiologia de viver QD-BDNF transporte axonal, esgotar o BDNF, tanto do corpo da célula e os compartimentos de axónios da câmara de microfluidos por enxaguar ambos os compartimentos com o BDNF-livre, livre de soro mídia Neurobasal cada 30 min durante 2 horas.
- Durante a depleção de BDNF, preparar os conjugados QD-BDNF. Misturar 50 nM de mono-biotinilado BDNF dímero com 50 nM QD655 conjugados com estreptavidina em meio Neurobasal e incubar em gelo durante 60 min.
- Retirar mídia no compartimento axonal e adicionar 300 ul QD-BDNF com uma concentração final de 0,25 nM durante 4 horas a 37 ° C. Para minimizar a difusão de QD-BDNF no compartimento do corpo da célula, é muito importante para manter sempre um nível mais elevado de meios no compartimento do corpo de célula do que no compartimento do axónio. Lavar desvinculado QD-BDNF após incubação antes de imagem ao vivo.
- Realizar imagens ao vivo de transporte QD-BDNF usando um microscópio invertido equipado com uma lente objectiva de óleo 100X. Aquecer o escopo e a câmara ambiental a ela ligada a uma temperatura constante (37 ° C) e de CO 2 (5%). Uso de um conjunto de cubos Texas excitação / emissão de vermelho para visualizar o sinal de QD655.
- Adquirir e capturar imagens de lapso de tempo dentro dos axônios média na velocidade de um quadro / segundo para um total de 2 min usando uma câmera CCD. Use microgrooves sem axônios that não têm QD e, portanto, nenhum sinal de controlo para a infiltração.
- Analisar transporte BDNF usando qualquer software de análise de imagem ou NIH ImageJ.
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Representative Results
Produção e Purificação de BDNF Mono-biotinilado Biologicamente Activo
O vector de expressão de BDNF fundida com uma sequência de AviTag (GGGLNDIFEAQKIEWHE) foi criado de acordo com um protocolo previamente publicado 10. A massa molecular da proteína de fusão de comprimento completo foi previsto para ser ~ 32 kDa ( http://ca.expasy.org/tools/pi_tool.html ) Monobiotinylated BDNF maduro com uma massa molecular estimada de 18 kDa (Figura 1A) foi produzido em células HEK293FT e purificada a partir de meio condicionado, tal como descrito 10.
Diferentes fracções foram recolhidas e separadas em 15% SDS-PAGE. Usando um anticorpo de coelho anti-Avi anticorpo etiqueta, uma banda com um peso molecular de ~ 18 kDa, foi detectada na primeira fracção (Figura 1B). Para testar a pureza da preparação, as amostras foram separadas em SDS-PAGE e foram coradas por silver-coloração. Como mostrado na Figura 1C, a banda de 18 kDa é a espécie predominante na primeira eluição. Contas de estreptavidina-agarose ensaios suspensos foram realizados para avaliar a extensão da biotinila��o da preparação mBtBDNF. Seguindo suspenso com contas de estreptavidina-agarose, proteínas que permaneceram no sobrenadante foram precipitadas com 7% de ácido tricloroacético (TCA). Estas amostras foram analisadas por SDS-PAGE e as manchas foram sondadas com anticorpos anti-Avi anticorpos (topo), para detectar a proteína total ou HRP-estreptavidina para detectar proteínas biotiniladas. Os nossos resultados mostraram que todos os sinais estão associados com os grânulos enquanto nenhuma banda foi detectada no sobrenadante (Figura 1E). Temos, assim, concluir que mBtBDNF foi biotinilado a uma eficiência> 99,9%.
Para testar a actividade biológica de mBtBDNF na ligação e activação do receptor de TrkB, tratámos uma linha de células 3T3 que expressam TrkB com qualquer rhBDNF (20 ng / ml) ou purficada mBtBDNF (20 ng / ml) durante 10 min. As células que não receberam o tratamento também foram recolhidos como controlo. Os lisados foram separados em 4-12% SDS-PAGE e um anticorpo de coelho anti-pTrkB foi utilizado para sondar o TrkB fosforilada. Como mostrado na Figura 1E, semelhante ao rhBDNF, mBtBDNF foi capaz de induzir a fosforilação de TrkB a um nível semelhante. Também neurónios do hipocampo de ratos tratados com ou rhBDNF (20 ng / ml) ou mBtBDNF purificado (20 ng / ml) durante 48 horas. Purificada mBtBDNF foi capaz de estimular o crescimento de neurites do hipocampo para o grau de rhBDNF (Figura 1F). Para analisar a co-localização de QD-BDNF com o receptor de TrkB, QD-BDNF de ratazana foi adicionado ao axónio do hipocampo durante 4 horas a 37 ° C. Os neurônios foram então fixadas e histoquímica para TrkB. Como mostrado na figura 1G, QD-BDNF co-localizada com TrkB. Concluímos daí que mBtBDNF é totalmente ativo em sua função biológica.
Imagens ao vivo da axonal Transporte de QD-BDNF in neurônios do hipocampo
Embrionárias neurónios primários do hipocampo de ratos (E17-18) foram dissecados e semeados no compartimento do corpo celular de câmara de microfluidos. No dia 4 ou 5, os axônios estendidos através das estrias no compartimento do axônio. No dia 7, a maioria dos axónios cresceu para dentro do compartimento do axónio. QD-BDNF foi feita através da incubação da QD655 estreptavidina com mBtBDNF numa proporção 1: 1 (QD: BDNF dímero) em gelo durante 1 hr. QD-BDNF (0,25 nM) foi então adicionado ao compartimento do axónio e incubadas durante 4 horas a 37 ° C antes da imagiologia (Figura 2A).
Após a incubação, QD-BDNF foi encontrada para se ligarem especificamente a axónios no compartimento axonal. No compartimento do corpo da célula, sinais QD foram acumulados na maioria dos axónios e corpos celulares proximais indicando o QD-BDNF foi internalizada para os axónios e transportado retrogradamente para os corpos celulares. Lapso de tempo de séries de sinais de imagem QD-BDNF dentro de axónios foram realizadas nas micro-ranhuras. QD signals foram observados na maioria das microranhuras com axónios enquanto nenhum sinal QD pode ser visto nas estrias na ausência de axónios, o que indica pouca ou nenhuma difusão do sinal QD do compartimento do axónio para o compartimento do corpo celular (Figura 2B).
Na Figura 2C, um de 80 um longo segmento de axônios dos neurônios do hipocampo foram fluorescente gravado durante 100 segundos. Total de 6 sinais QD-BDNF foram claramente visto durante a gravação de vídeo. Três QD sinais gravados movido unidireccionalmente no sentido de o corpo da célula (lado esquerdo). O evento QD marcado pela seta branca (t: 31 seg a t: 101 seg) movida suavemente para o corpo da célula atravessando todo o campo de ~ 70 segundos. Outro evento QD marcado pela seta verde (t: 1 segundo para t: 61 sec) mudou-se retrogradamente primeiro. No instante t: 21 seg, QD-BDNF anterogradamente movido por 10 a 20 segundos, e, em seguida, mudou de direcção de novo para o corpo da célula. O evento QD marcado pela seta amarela (t: 1 segundo para t: 71 sec) também mudou retrograd Ely, mas fez uma pausa para ~ 20 segundos durante o movimento. Qd-BDNFs que não se moviam durante este 100 segundos foram consideradas estacionárias. Apenas objetos em movimento que posteriormente foram analisados para calcular a velocidade em movimento, velocidade média e tempo de pausa.
Análise de Dados em QD-BDNF Transporte quimógrafo
Kymographs foram criadas a partir de cada filme gravado usando software Metamorph. Como mostrado nas kymographs representativos de transporte QD-BDNF (Figura 3A), os movimentos QD-BDNF foram registados durante 120 segundos em um 80 um segmento longo de axónios. Em quimógrafo representante 1, QD-BDNF moveu rápido e suavemente para a esquerda (corpo celular), atravessou o campo (80 mm) em ~ 60 seg, com breves pausas (Apoio vídeo S1). Enquanto em quimógrafo representante 2, um QD-BDNF viajou ~ 50 mm em 120 seg retrogradamente, com pelo menos três segmentos de pausas maiores (indicado por setas) (Apoiando vídeo S2).
conteúdo "> Figura 3B é o gráfico de dispersão de velocidade, a velocidade média móvel, e uma pausa de tempo de cada um dos QD-BDNF. A velocidade de movimento da QD-BDNF foi relativamente rápida, que varia 0,47-1,97 um / seg, com a média de 1,06 ± 0,05 um / seg. A velocidade média de QD-BDNF foi calculada como viajando a distância / tempo utilizado. E porque o BDNF pausa durante o seu transporte, a velocidade média era muito menor do que a velocidade de movimento com uma média de 0,48 ± 0,03 ^ M / seg (variando 0,17-1,59 um / seg). tempo em pausa também foi analisada como uma caracterização do movimento de BDNF. A média de duração das pausas foi 15,88 ± 1,30 seg (variando 6-33 seg) (Tabela 1).
Figura 1 purificação biológica ativa, monobiotinylated BDNF (mBtBDNF). (A) Um desenho esquemático mostra a produção de mBtBDNF. Tanto a pré-proBDNFavi BirA e foram clonados no vector de pcDNA3.1myc-a, tal como descrito 10. (B) diferentes fracções de eluídos de Ni-resina foram recolhidas e separadas num gel de 15% SDS-PAGE. Um anticorpo de coelho anti-Avi anticorpo tag foi utilizado no blot. Uma banda com um peso molecular aparente de ~ 18 kDa foi reconhecida na eluir, consistente com a massa molecular prevista para a proteína madura mBtBDNF. Gel coloração (C) A prata mostra a 18 kDa mBtBDNF foi a espécie predominante na fração de eluição. (D) mBtBDNF purificada foi incubada com contas de estreptavidina-agarose. As esferas foram lavadas e fervidas em tampão de carga de SDS quando o sobrenadante foi precipitado com TCA, antes da análise de SDS-PAGE. O blot foi sondado com anticorpo anti-Avi ou com HRP-estreptavidina. (E) de 20 ng / ml de purificado mBtBDNF ou rhBDNF foi adicionado a uma linha de células 3T3 que oexpresses TrkB durante 10 min. Os lisados foram colhidos e separados em 4-12% SDS-PAGE. Ligado de células de controlo também foi analisada. A mancha foi sondada com um anticorpo de coelho anti-pTrkB. TrkB total foi revelada usando um mouse anticorpo anti-TrkB. (F) 20 ng / ml de purificado mBtBDNF ou rhBDNF foi adicionada a neurónios do hipocampo de rato, durante 48 h. Imagens DIC foram levados para analisar o crescimento de neurites. (L)-QD BDNF foi incubada com axónios dos neurónios do hipocampo de rato durante 4 horas (barra de escala de 5 um). Os neurônios foram então fixadas e histoquímica para TrkB.
. Figura 2 molécula de imagem única de transporte retrógrado de QD-BDNF nos axônios (A) Vista de cima: Um desenho esquemático da câmara microfluídicos com neurônios primários banhado no compartimento do corpo celular. Os axônios cresceu em todo o microgrooves no compartimento do axônio. QD655 BDNF marcado foi adicionado ao compartimento do axónio. Vista lateral: O nível de mídia no compartimento do axônio foi mantida inferior do compartimento do corpo celular para minimizar a difusão do sinal de QD. (B) imagens de fluorescência vermelha e imagens DIC de compartimento corpo celular, estrias e compartimento axônio. QD-BDNF vinculados especificamente à axônios, internalizado, e transportado retrogradamente para os corpos celulares ao longo dos axônios. Não há sinal de QD foi observada nos microgrooves ausentes dos axônios. (C) Time-lapse video série imagem do transporte QD-BDNF ao longo do axônio. Ambos os sinais de QD-BDNF estacionárias em movimento e estavam presentes na maioria dos filmes. No tempo t: 1 segundo, pelo menos, 4 QDs pode ser visto. Depois de 10 segundos, duas QDs (indicadas pelas setas verdes e amarelos) estão se movendo em direção ao corpo celular (à esquerda da imagem). Estes dois QDs mover e fazer uma pausa nas primeiras imagens casal e, eventualmente, sair das imagens para a esquerda (em ~ 70 seg). Outra QD mudou-se para o campoa t: 31 seg (indicado pela seta branca) e moveu-se rapidamente, sem pausas tanto para a esquerda.
Figura 3 QD-BDNF quimógrafo transporte e análise de dados. (A) kymographs representativa do transporte QD-BDNF em neurónios do hipocampo primários. Em kymo 1, a QD brilhante atravessou o campo em velocidade relativamente rápida, com apenas algumas pausas curtas. Em kymo 2, a velocidade de movimento dos QDs foi mais lenta, e a circulação foi interrompida com pausas mais frequentes e mais longas. (B) gráfico de dispersão de QD-BDNF velocidade em movimento, velocidade média (calculada como viajar a distância / tempo utilizado) e parou tempo. A velocidade de movimento significativo de QD-BDNF foi de 1,06 ± 0,05 um / seg (variando 0,47-1,97 um / seg. A velocidade média de QD-BDNF foi de 0,48 ± 0,03 ^ M / seg (que varia de 0. 17-1,59 um / seg). A duração média das pausas foi 15,88 ± 1,30 seg (variando 6-33 seg).
Apoio vídeo S1 . Representante QD-BDNF vídeo transporte 1 Vários QD-BDNF mover-se rapidamente para o lado esquerdo (corpo celular) com muito poucas pausas curtas.
Apoiar Vídeo S2 . Representante QD-BDNF vídeo transporte 2 Vários QD-BDNF mover relativamente lento em direção ao lado esquerdo (corpo celular), com frequentes e longas pausas.
| Mínimo | Máxima | A média | 88px; "> Std erro.||
| Velocidade de movimento (mícron / seg) | 0,47 | 1.97 | 1,06 | 0,05 |
| Velocidade média (micron / sec) | 0,17 | 1.59 | 0,48 | 0,03 |
| Tempo de pausa (seg) | 6 | 33 | 15.88 | 1.30 |
Tabela 1 A análise dos dados de transporte QD-BDNF.
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Discussion
Neste estudo, descrevemos o desenvolvimento de uma nova técnica para produzir biologicamente activo, monobiotinylated BDNF (mBtBDNF) que podem ser utilizados para rastrear o transporte axonal de BDNF. Conjugando a proteína a estreptavidina quantum dot, e usando uma câmara de microfluidos, o método permite detectar o transporte axonal de BDNF nos neurónios primários com sensibilidade única molécula, em tempo real e com resolução espacial e temporal. As ferramentas aqui utilizadas fornecer um meio pelo qual a estudar as máquinas moleculares que medeiam o transporte axonal de BDNF / TrkB sinalização endosomes nos neurônios na saúde e na doença.
BDNF-GFP, ou -mCherry têm sido utilizados para controlar o movimento axonal de BDNF em várias culturas de neurónios in vitro. Estes reagentes oferecer uma opção para analisar o transporte anterógrado e, possivelmente, para o exame de activação autócrina de TrkB. No entanto, existem grandes inconvenientes para o estudo de transporte retrógrado, o mais salientes de which é que GFP ou mCherry não são brilhantes o suficiente para os estudos de moléculas individuais. Estudos anteriores mostraram que, em concentrações fisiológicas de NGF, uma única dimero de NGF foi internalizado 11 e transportado retrogradamente 8. É importante notar que o uso de QD BDNF também permite definir a localização subcelular em que o BDNF se liga seus receptores TrkB. Ao utilizar GFP ou proteínas mCherry-tag, expressão Somal resultará na presença dentro do axônio de proteínas submetidos anterógrada e bem como transporte retrógrado. Como tal, pode ser difícil avaliar se ou não, ou, onde transportado retrogradamente BDNF encontrou seu receptor antes de transporte retrógrado. Na verdade, como uma especulação, transporte retrógrado axónios dentro de BDNF-GFP ou o BDNF-mCherry produzido no mesmo neurónio pode ser diferente da que se segue a ligação de BDNF no alvo de inervação.
Embora a reticulação química foi utilizada para a produção de factor de crescimento do nervo biologicamente activa(NGF), o método aqui introduzido é superior. Primeiro, é difícil de controlar com precisão o grau de biotinilação; por exemplo, cada um de NGF foi marcado com 5-9 unidades de biotina 8,9,12. Em segundo lugar, a reticulação podem inactivar a proteína. No caso de NGF, a reticulação necessária para a ligação 13 grupos carboxilo. No caso do BDNF, a actividade está frequentemente perdido após a reticulação química de biotina. Finalmente, o grau de reticulação pode ser incompleta. Um relatório recente mostrou que ~ 0,8 biotina / molécula de BDNF foi produzido por reticulação química; tal como ~ 20% de BDNF não foi marcado 9. A presença de BDNF não marcado poderá complicar a interpretação dos resultados.
Nossa técnica oferece vantagens únicas que as moléculas de BDNF estão todos marcados com uma única biotina no mesmo local, constituindo, assim, uma preparação homogénea de biotinilado BDNF. Por conjugação de partículas nanofluorescent como quantum dots, pode ser mBtBDNFutilizado para rastrear as vias e os processos que o BDNF é internalizado, de tráfico dentro de neurónios: em dendritos, em axónios, bem como nos corpos celulares. Este método torna possível o uso de tags alternativas para BDNF. O desenvolvimento de outros tipos de nanopartículas promete benefícios adicionais.
Defeitos no tráfico axonal e sinalização de BDNF foram implicados em doenças neurodegenerativas. Fortes evidências ligou transporte defeituoso de BDNF à atrofia cortical-estriatal na doença de Huntington 14,15. Proteína mutante interfere com a interacção entre a proteína associada Huntingtina-1-(HAP1) e motor dineína em neurónios simpáticos, inibe o transporte de BDNF, e resulta em perda de apoio neurotrófico e toxicidade neuronal 16-18. As nossas técnicas de seguimento movimento axonal de BDNF pode servir como uma ferramenta valiosa para estudar a função axonal em doenças neurodegenerativas.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer a Yue (Pauline) Hu, Rachel Sinit por sua assistência técnica. O estudo foi financiado pelo NIH concessão (PN2 EY016525) e pelo financiamento da Síndrome de Down Research Foundation e Tratamento eo Larry L. Fundação Hillblom.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Platinum pfx DNA polymerase | Invitrogen | 11708021 | |
| EcoRI | Fermentas | FD0274 | |
| BamHI | Fermentas | FD0054 | |
| HEK293FT cells | Invitrogen | R70007 | |
| DMEM-high glucose media | Mediatech | 10-013-CV | |
| D-biotin | Sigma | B4639 | |
| TurboFect | Fermentas | R0531 | |
| PMSF | Sigma | P7626 | |
| Aprotinin | Sigma | A6279 | |
| Ni-NTA resins | Qiagen | 30250 | |
| Protease inhibitors cocktail | Sigma | S8820 | |
| Silver staining kit | G-Biosciences | 786-30 | |
| Human recombinant BDNF | Genentech | ||
| Microfluidic chambers | Xona | SND450 | |
| 24 x 40 mm No. 1 glass coverslips | VWR | 48393-060 | |
| Poly-L-Lysine | Cultrex | 3438-100-01 | |
| HBSS | Gibco | 14185-052 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| FBS | Invitrogen | 16000-044 | |
| GlutaMax | Invitrogen | 35050-061 | |
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| QD655-streptavidin conjugates | Invitrogen | Q10121MP | |
| anti-Avi tag antibody | GenScript | A00674 | |
| streptavidin-agarose beads | Life Technology | SA100-04 | |
| Trichloroacetic acid | Sigma | T6399 | |
| HRP-streptavidin | Thermo Scientific | N100 | |
| anti-pTrkB antibody | a generous gift from Dr M. Chao of NYU | ||
| anti-TrkB antibody | BD Science | 610101 |
References
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