Summary
BDNF，神经营养因子，对轴突运输是几个神经元群体的生存和功能是至关重要的。一些退行性疾病的标志是轴索结构和功能的破坏。我们展示了用于检查QD-BDNF在使用初级神经元微流控室现场贩卖的技术。
Abstract
BDNF在神经元存活，分化和功能的若干方面具有重要作用。结构和功能的缺陷在轴突日益被看作神经变性疾病，包括阿尔茨海默氏病（AD）和亨廷顿病（HD）的早期特征。尚不清楚是由轴索损伤诱导机制（S）。我们报道了一种新技术的发展，以产生具有生物活性，monobiotinylated BDNF（mBtBDNF），可以用来跟踪BDNF的轴突运输。量子点标记的BDNF（QD-BDNF）是由共轭量子点655到mBtBDNF制备。一种微流体装置被用于分离从神经元胞体的轴突。除了QD-BDNF的到轴突舱允许的BDNF运输轴突的实时成像。我们证明了QD-BDNF的移动基本上是完全逆行，除了极少数停顿，约为1.06微米/秒的移动速度。此系统可用于研究我的破坏轴突功能在AD或HD，以及其他退行性疾病chanisms。
Introduction
神经元是高度分化的细胞，其长，通常高度阐述的过程是基本建立和保持神经回路的结构和功能。轴突起着运载的货物和从突触至关重要的作用。蛋白质和细胞器的细胞胞体合成需要通过轴突运输到达突触前末梢，支持神经元功能。相应地，接收的信号在远端轴突需要被转并输送到体细胞。这些方法可用于神经元的存活，分化和维持所必需的。在某些神经元的轴突运输必须通过的距离超过1000倍的细胞体的直径进行，有可能容易地预想到，即使是很小的缺陷可显着影响神经元和电路功能。
脑源性神经营养因子（BDNF），生长因子的神经营养因子家族中的一员，是目前在马纽约州的大脑区域，包括海马，大脑皮层和基底前脑。 BDNF起着认知和记忆的形成所配套的存活，分化，并参与认知神经回路的功能至关重要的作用。 BDNF结合到其受体的酪氨酸激酶受体TrkB，在轴突终端那里它激活的TrkB介导的信号传导途径，包括有丝分裂原激活的蛋白激酶/细胞外信号调节蛋白激酶（MAPK / ERK），磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）和磷脂酶C-γ（PLCγ）。在参与这些信号传导途径的蛋白被包装到内吞囊泡结构，以形成BDNF / TrkB的信令内体1-6被再逆行转运到神经元胞体。
微流体培养室是研究在正常条件下，以及在损伤和疾病7,8的设定轴突生物学一个非常有用的平台。通过隔离轴突从细胞体，该装置允许一个具体研究运输中的轴突8-10。在与在该研究中使用450微米的微沟槽屏障基于PDMS的微流体平台进行商业购买（参见材料表）。为了研究BDNF的运输，我们开发了一种新的技术，生产monobiotinylated BDNF（mBtBDNF）。我们把生物素受体肽，美联社（又称重组蛋白质）的优势。它是一个包含一个赖氨酸残基，可以由大肠杆菌酶的生物素连接酶，BirA的具体连接到生物素15的氨基酸序列。我们融合的重组蛋白质的小鼠预先proBDNF基因的C末端，通过PCR（ 图1A）。该构建体被克隆到哺乳动物表达载体pcDNA3.1 myc基因-His载体。我们还克隆的细菌BirA的DNA导入的pcDNA3.1 myc基因-His载体。两个质粒瞬时共转染到HEK293FT细胞表达两种蛋白。 BirA的催化毕结扎在具体的赖氨酸驻留在重组蛋白质中的BDNF的在1的C末端：1的比例以产生monobiotinylated BDNF单体。生物素化的，成熟的BDNF与〜18kDa的分子质量，回收和使用的Ni-树脂（ 图1C）的介质纯化。 BDNF的生物素化是完全的，作为判断无法通过免疫印迹法（ 图1D），以检测未修饰BDNF。链霉亲和共轭量子点，量子点655，分别用来标明mBtBDNF使QD-BDNF。的重组蛋白质的存在下不与BDNF的活性干扰作为mBtBDNF能够激活磷酸化的TrkB（ 图1E）和刺激神经 突向外生长（ 图1F），以重组人BDNF（rhBDNF）的程度。免疫组化显示，QD-BDNF共定位与TrkB的海马神经轴突，表明QD-BDNF的生物活性（ 图1G）。研究了BDNF的运输，QD-BDNF加入到远端轴突隔室含E18大鼠海马神经元（ 图2A）微流控文化。在轴突QD-BDNF逆行运输被抓获的红色荧光标记（ 支持视频S1，S2）的实时现场图像。通过分析所产生的kymograph，QD-BDNF的观察可以在约1.06微米/秒（ 图3A）的移动速度逆向转移。 GFP或mCherry-标记的BDNF已被用于跟踪BDNF的神经轴突的运动。主要的缺点是，他们不是为单个分子的研究不够明亮。另外，无论是顺行性与逆行BDNF运动的存在使得难以评估的逆向转移BDNF是否是一种神经营养蛋白/受体复合体。
在这段视频中，我们展示了用于检查QD-BDNF在利用原代神经元的微流控室现场贩卖的技术。该ultrabrightness和量子点麦出色的耐光性ES能够进行BDNF传输的长期跟踪。这些技术可被利用来提高AD中，HD和其他神经变性疾病的轴突功能的研究。
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Protocol
手术和动物的程序进行了严格按照美国国立卫生研究院指南的护理和使用实验动物。所有涉及使用动物实验是由加州大学圣地亚哥分校机构动物照顾及使用委员会批准。
1质粒的克隆，单生物素BDNF的表达和纯化（mBtBDNF）
注：建设前期proBDNFavi和BirA的cDNA插入在HEK293FT细胞10 pcDNA3.1载体和共表达。使用Ni-NTA珠根据生产成熟的和生物活性monobiotinylated神经生长因子（mBtNGF）10的先前公布的方法mBtBDNF纯化。
2，制备微流控商会
微流体神经元培养装置，能够使流体流动的隔离神经元胞体的轴突。每个解剖前集会权与新涂盖玻片室。用于微流控室在这个协议是商业购买（见材料和设备的表）。手洗和重复购买商业腔高达5-6x。
- 手洗的1％Alconox清洁剂的微流控室。漂洗三次，用Milli-Q水用于各30分钟。再次手洗室70％的乙醇。
- 铺陈室晾干的封口膜的层流罩。辐射灭菌的腔两侧紫外光下20分钟。存放在无菌15cm培养皿在室温下用石蜡膜密封消毒室。
- 将24×40mm的1号盖玻片在玻璃容器中。浸泡过夜旋转器上在35％盐酸盖玻片。在第二天，冲洗盖玻片三次，每次加水30分钟。
- 浸渍每个盖玻片到100％的乙醇和燃烧过本生灯消毒盖玻片一个接一个。储存干盖玻片在无菌培养皿中，并保持在室温下直至涂层。
- 莱OU吨，15厘米的培养皿中的盖玻片。外套每个盖玻片用0.7ml的0.01％的聚-L-赖氨酸（PLL），并培育在通风橱中在室温下进行。
- 1小时后，冲洗盖玻片三次，用无菌水。干盖玻片真空和地方每个盖玻片成一块2.4英寸的培养皿。
- 组装微流体室中，放置与微沟槽侧的腔室的底部上的PLL涂覆的盖玻片小心不要接触到微槽。轻轻按下室用枪头，以确保室内进行密封。
3，神经解剖文化和板块上庭
- 放置两个E17-E18大鼠海马（一个脑）解剖在15ml锥形管中含2ml夹层缓冲液（HBSS，无钙无镁，用1％青霉素/链霉素和10mM HEPES。冲洗组织3倍用5ml每次清扫缓冲拆下清扫缓冲尽可能并添加900微升新鲜二ssection缓冲区。
- 消化组织，加入100μl的10X胰蛋白酶（2.5％）进夹层缓冲，使1个工作浓度。放置锥形管在37℃水浴。消化后的10分钟，加入100μl的10毫克/毫升的DNase I至约1毫克/毫升的最终浓度。
- 用火抛光的巴斯德玻璃吸管，轻轻地上下吹打5到10倍磨碎的组织。研磨后右，淬火用2ml平板培养基（神经基础有10％FBS，2mM的Glutamax的，2％B27）的胰蛋白酶。
- 留在引擎盖样品5分钟，使组织中的任何碎片落户到了谷底。小心地取出2毫升上清液倒入干净无菌的15毫升锥形管中，离心分离机，在200×g离心5分钟以沉淀细胞。悬浮颗粒在50微升电镀媒体
- 计数细胞与血球。负载15-20微升细胞悬浮液（〜40,000个细胞）到微流体室中的一个隔室。放置室在培养箱中培养10分钟，以使细胞附着在盖玻片上。 10分钟后，加入更多的镀介质来填充该腔室的两个室。
- 对解剖的第二天，完全（有2mM Glutamax的，2％B27的Neurobasal）在两个细胞体和轴突隔室更换电镀媒体与维护媒体。从海马神经元的轴突开始穿越微槽3天，达到5-7天之间的轴突舱。在这段时间内，用新鲜维持培养基，每24〜48小时，更换一半的培养介质。
QD-BDNF的4轴突运输
- 之前住QD-BDNF的轴突运输的成像，从微流体室中的两个细胞体和轴突隔室耗尽BDNF通过彻底冲洗两个室用BDNF无，无血清的Neurobasal介质，每30分钟2小时。
- 在BDNF的枯竭，准备QD-BDNF的结合物。搭配50纳米的单生物素化的BDNF二聚体用50nM的Neurobasal介质QD655-链霉抗生物共轭物和在冰上孵育60分钟。
- 在轴突舱取出介质，加入300μlQD-BDNF 0.25纳米的终浓度为4小时，在37℃。为了尽量减少QD-BDNF的漫射到细胞体隔室，这是很重要的，以始终保持介质中的细胞体隔室更高的水平比在轴突隔室。前实时成像孵育后洗去未结合的QD-BDNF。
- 使用倒置显微镜配有100X油物镜进行QD-BDNF运输的实时成像。预热的范围和附加到它的恒定温度（37℃）和CO 2（5％）的环境室中。使用一组德克萨斯红的激发/发射的多维数据集可视化的QD655信号。
- 获取和捕捉中间的轴突内的延时图像1帧/秒的速度，总共2分钟使用CCD摄像头。使用细微沟槽，无轴突塔吨有没有量子点，因此没有信号的渗透控制。
- 分析使用任何图像分析软件或NIH ImageJ的BDNF的运输。
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Representative Results
生产具有生物活性的单 - 生物素化的BDNF的纯化
BDNF的稠合有一个重组蛋白质序列（GGGLNDIFEAQKIEWHE）的表达载体，根据以前发表的协议10创建。全长融合蛋白的分子质量预测为〜32kDa的（ http://ca.expasy.org/tools/pi_tool.html ）Monobiotinylated成熟的BDNF为18 kDa的（ 图1A）的预测分子量制作在HEK293FT细胞和纯化的条件培养基中所描述的10。
不同的级分收集并分离在15％的SDS-PAGE。使用兔抗阿维标记抗体，用的〜18kDa的在所述第一部分（ 图1B）检测出的分子量的条带。为了测试制备的纯度，将样品通过SDS-PAGE和用s染色ilver染色。 如图1C所示 ，在18 kDa条带是主要的物种中的第一洗脱。链霉亲和琼脂糖珠下拉测定法进行评估mBtBDNF制备的生物素化的程度。以下下拉与链霉亲和琼脂糖珠，蛋白质保留在上清液中沉淀，用7％三氯乙酸（TCA）。这些样品通过SDS-PAGE分析，然后将印迹进行探测与抗阿维抗体（顶部）来检测总蛋白或HRP-链霉亲和来检测生物素化的蛋白。示出我们的结果，所有的信号都与珠相联系，而没有条带，在上清液中（ 图1D）进行检测。因此，我们得出结论，mBtBDNF生物素化在一个效率> 99.9％。
为了测试mBtBDNF的生物活性在结合和激活TrkB受体，我们处理的3T3细胞系表达的TrkB与任一rhBDNF（20毫微克/毫升）或PUR指明分数mBtBDNF（20毫微克/毫升）10分钟。未接受治疗的细胞也作为对照。裂解物中分离在4-12％SDS-PAGE和兔抗pTrkB抗体来探查磷酸化的TrkB。 如图1E所示 ，类似于rhBDNF，mBtBDNF能够诱导TrkB的磷酸化在同一水平。我们也处理过的大鼠海马神经元或者rhBDNF（20毫微克/毫升）或纯化mBtBDNF（20毫微克/毫升）48小时。纯净mBtBDNF能刺激海马神经突起生长到rhBDNF（ 图1F）的程度。审查的共定位QD-BDNF与TrkB受体，QD-BDNF的溶液中加入在37到大鼠海马轴突4小时 ℃。神经元，然后固定和免疫染色TrkB的。 如图1G，QD-BDNF的共定位和TrkB的。因此，我们得出结论，mBtBDNF是在其生物学功能充分有效。
QD-BDNF I的轴突运输的实时成像Ñ海马神经元
初级胚胎大鼠海马神经元（E17-18）进行解剖，并接种到微流体室中的细胞体隔室。在第4天或5，轴突穿过微槽延伸到轴突隔室。第7天，大多数轴突成长为轴突舱。 QD-BDNF是由培养的链霉亲和QD655与mBtBDNF以1:1的比例（QD：BDNF二聚体）在冰上1小时。 QD-BDNF（0.25纳米），然后加入到轴突隔室，并在37℃下在成像之前（ 图2A）孵育4小时。
温育后，QD-BDNF中发现特异性结合的轴突隔室的轴突。在单元主体隔室，QD的信号被累积在最近端的轴突和指示QD-BDNF被内化在轴突和逆行运输到细胞体的细胞体。轴突内隔时图像系列QD-BDNF信号，进行了微槽。 QDŠignals观察到，在大多数的微槽与轴突而没有QD信号可在轴突，指示QD信号从轴突隔室的单元主体隔室（ 图2B），很少或没有扩散的缺席可以看出在微槽。
在图2C，海马神经元轴突的80微米长的段被荧光记录100秒。共有6 QD-BDNF信号的视频录制过程中清楚地看到。记录三个QD信号单向地移向细胞体（左侧）。量子点的事件标记的白色箭头（T：31秒〜T：101秒）移动顺利的电池主体横过在〜70秒的整场。另一个量子点标记事件由绿色箭头（T：1秒到T：61秒）逆行转移第一。在t：21秒，在QD-BDNF的移动顺行10至20秒，然后再次改变方向朝向细胞体。量子点标记事件由黄色箭头（T：1秒到T：71秒）也搬到retrograd伊利，但运动期间暂停〜20秒。 QD-BDNFs那未这100秒期间移动被认为是静止的。只移动物体，其后进行分析，以计算移动速度，平均速度，和时间暂停。
在QD-BDNF运输Kymograph数据分析
Kymographs从记录每部电影使用的Metamorph软件创建的。如图QD-BDNF运输（ 图3A）的代表kymographs，分别在120秒中轴突的80微米长的段记录QD-BDNF的动作。在代表kymograph 1，QD-BDNF的快速移动，顺利地向左（胞体），交叉领域（80微米）在〜60秒，用很短的停顿（ 支持视频S1）。而在代表kymograph 2，QD-BDNF的旅行〜50微米的120秒逆行，与较长的停顿至少三段（用箭头表示）（ 支持视频S2）。
内容“> 图3B是移动速度，平均速度的散点图，并暂停各单一QD-BDNF的时间。的QD-BDNF的移动速度是比较快的，范围从0.47-1.97微米/秒的平均1.06±0.05微米/秒。QD-BDNF的平均速度计算为行驶中使用的距离/时间，而且由于BDNF其在运输过程中暂停时，平均速度比移动速度为0.48±0.03微米/秒平均低得多（测距从0.17-1.59微米/秒）。暂停时间进行了分析与BDNF运动的表征。停顿的平均时间为15.88±1.30秒（从6-33秒）（ 表1）。
图1纯化生物活性，monobiotinylated BDNF（mBtBDNF）。 （一）一个示意图显示了生产mBtBDNF的。两个预proBDNFavi和BirA的克隆入pcDNA3.1myc-His载体所描述的10。由Ni-树脂洗脱（B）的不同部分收集并分离出在15％SDS-PAGE凝胶。兔抗阿维标记抗体用于印迹。与〜18kDa的的表观分子量的条带是在洗脱，与预测的分子量为成熟mBtBDNF蛋白一致认可。 （C）银染凝胶显示了18kDa的mBtBDNF是最主要的物种中的洗脱级分。 （D）纯化mBtBDNF物与链霉亲和琼脂糖珠。将珠洗涤并煮沸，在SDS上样缓冲液，同时将上清液先进行SDS-PAGE分析沉淀用TCA。探测印迹与抗阿维抗体或与HRP-链霉亲和。 （ 五）20毫微克/毫升的纯mBtBDNF或rhBDNF加入到3T3细胞系，电子xpresses TrkB的10分钟。裂解物收获和分离在4-12％SDS-PAGE。对照细胞裂解物进行分析。印迹探测与兔抗pTrkB抗体。用小鼠抗TrkB的抗体总的TrkB透露。纯化mBtBDNF或rhBDNF（F）的 20毫微克/毫升，加入到大鼠海马神经元48小时。 DIC图像被送往分析突起生长。 （G）的 QD-BDNF的培养与大鼠海马神经元的轴突4小时（比例尺为5μm）。神经元，然后固定和免疫染色TrkB的。
图2 QD-BDNF在轴突逆行运输的单分子成像（A）俯视图：微流控室与接种于细胞体舱初级神经元的示意图。轴突穿过微克增长rooves到轴突隔室。 QD655标记BDNF加入到轴突隔室。侧视图：在轴突隔媒体水平比胞体隔不断降低，以减少量子信号的传播。 （二）红色荧光图像和胞体舱，细微沟槽和轴突舱DIC图像。 QD-BDNF的特异性结合的轴突，内化，并逆向转移到沿着轴突胞体。没有QD信号中观察到不存在轴突的微槽。 （ 三）时间推移视频图像系列QD-BDNF运输沿轴突。在大多数的电影无论是移动和固定QD-BDNF信号出席了会议。在时间t：1秒，至少有4个量子点可以看出。后10秒，2量子点（由绿色和黄色的箭头表示）正朝着所述单元主体（图像的左侧）。这两个量子点移动，停留在第一对夫妇的图像，并最终走出图像左侧（在约70秒）。另外QD搬进场在t：31秒（由白色箭头指示），并迅速移动而没有多少停顿到左边。
图3：QD-BDNF运输kymograph和数据分析。（一）QD-BDNF的运输原代海马神经元代表kymographs。在kymo 1，明亮的QD移动穿过田野的速度也比较快，只有短短的停顿。在kymo如图2所示，量子点的移动速度较慢，并且移动与更频繁的和较长的暂停而中断。 QD-BDNF的（B）散点图移动速度，平均速度（换算为行驶用距离/时间）和暂停时间。 QD-BDNF的平均移动速度为1.06±0.05微米/秒（范围从0.47-1.97微米/秒。QD-BDNF的平均流速为0.48±0.03微米/秒（范围从0。 17-1.59微米/秒）。暂停的平均时间为15.88±1.30秒（从6-33秒）。
支持视频S1 。代表QD-BDNF的交通视频1。几个QD-BDNF的快速移动向左侧（胞体）与极少数的短暂停。
支持视频S2 。代表QD-BDNF的交通视频2，一些QD-BDNF朝左侧（胞体）频繁和长时间的停顿比较慢。
| 最低 | 最大 | 意思 | 88px;“>标准错误||
| 移动速度（微米/秒） | 0.47 | 1.97 | 1.06 | 0.05 |
| 平均速度（微米/秒） | 0.17 | 1.59 | 0.48 | 0.03 |
| 暂停时间（秒） | 6 | 33 | 15.88 | 1.30 |
QD-BDNF运输的表1中的数据分析。
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Discussion
在这项研究中，我们报道了一种新技术的发展，以产生具有生物活性，monobiotinylated BDNF（mBtBDNF），可以用来跟踪BDNF的轴突运输。通过缀合的蛋白质，以量子点的链霉亲和使用的微流体腔室，该方法允许一个检测BDNF在与单个分子的灵敏度，在实时的和具有空间分辨率和时间分辨率原代神经元的轴突运输。这里所使用的工具提供了由研究介导的BDNF / TrkB的信号内吞体的健康和疾病的神经元轴突运输的分子机器的一种手段。
BDNF-GFP，或-mCherry已被用于在体外的各种神经元培养跟踪BDNF的神经轴突的运动。这些试剂提供一个选项，用于检查顺行传输，并有可能用于检查的TrkB的自分泌活化。但是，也有主要缺点为研究逆行运输，最突出的WHICH是GFP或mCherry不是为单个分子的研究不够明亮。此前的研究表明，生理浓度的NGF下，单一的NGF二聚体内在11和逆向转移8。重要的是，使用量子点的BDNF也允许定义的亚细胞定位在该BDNF结合的受体TrkB受体。在使用GFP或mCherry标记的蛋白质，常染色体的表达会导致蛋白质发生顺行的轴突中存在和以及逆行运输。因此，它可能难以评估逆向转移BDNF与否或在遇到其受体之前逆行运输。事实上，作为一种炒作，BDNF-GFP或BDNF-mCherry的轴突内逆行运输在同一个神经元产生的可能不同于以下绑定BDNF在神经支配的对象。
虽然化学交联已经被用于生产生物活性神经生长因子（NGF），本文中介绍的方法是优越的。首先，很难精确控制生物素化的程度;例如，每个NGF被标以5-9生物素基8,9,12。其次，交联可以使蛋白质失活。在NGF的情况中，交联的必要的附着到羧基13。在BDNF的情况下，活动经常丢失以下化学交联到生物素。最后，交联的程度可以是不完整的。最近的一份报告显示，0.8〜生物素/ BDNF分子通过化学交联生产的;作为这样〜BDNF的20％没有被标记9。未标记的BDNF的存在可能导致复杂的解释。
我们的技术提供了独特优势的BDNF分子在同一站点中的所有标记单个生物素，从而构成生物素化的BDNF均匀的准备。通过缀合到nanofluorescent粒子例如量子点，mBtBDNF可用于跟踪该BDNF被内化的通路和过程，神经元内贩卖：在树突，轴突，以及在细胞体。这种方法使得有可能使用替代标记的BDNF。其他类型的纳米粒子的发展承诺额外的好处。
轴突贩运和BDNF的信号缺陷被认为与神经退行性疾病。强有力的证据已经挂BDNF的缺陷运输皮质-纹状体萎缩亨廷顿氏病14,15。突变亨廷顿蛋白干扰亨廷顿相关蛋白-1（HAP1）和交感神经元动力蛋白马达之间的相互作用，抑制BDNF的运输，并导致神经营养支持和神经毒性16-18损失。我们的BDNF的跟踪轴突运动的技术可作为在神经退行性疾病的研究轴突功能的有价值的工具。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们要感谢岳（保罗）胡锦涛，雷切尔SINIT为他们提供技术援助。这项研究是由美国国立卫生研究院资助（PN2 EY016525），并从唐氏综合症的研究与治疗基金会和拉里·L.希尔布鲁姆基金会的资助支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Platinum pfx DNA polymerase | Invitrogen | 11708021 | |
| EcoRI | Fermentas | FD0274 | |
| BamHI | Fermentas | FD0054 | |
| HEK293FT cells | Invitrogen | R70007 | |
| DMEM-high glucose media | Mediatech | 10-013-CV | |
| D-biotin | Sigma | B4639 | |
| TurboFect | Fermentas | R0531 | |
| PMSF | Sigma | P7626 | |
| Aprotinin | Sigma | A6279 | |
| Ni-NTA resins | Qiagen | 30250 | |
| Protease inhibitors cocktail | Sigma | S8820 | |
| Silver staining kit | G-Biosciences | 786-30 | |
| Human recombinant BDNF | Genentech | ||
| Microfluidic chambers | Xona | SND450 | |
| 24 x 40 mm No. 1 glass coverslips | VWR | 48393-060 | |
| Poly-L-Lysine | Cultrex | 3438-100-01 | |
| HBSS | Gibco | 14185-052 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| FBS | Invitrogen | 16000-044 | |
| GlutaMax | Invitrogen | 35050-061 | |
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| QD655-streptavidin conjugates | Invitrogen | Q10121MP | |
| anti-Avi tag antibody | GenScript | A00674 | |
| streptavidin-agarose beads | Life Technology | SA100-04 | |
| Trichloroacetic acid | Sigma | T6399 | |
| HRP-streptavidin | Thermo Scientific | N100 | |
| anti-pTrkB antibody | a generous gift from Dr M. Chao of NYU | ||
| anti-TrkB antibody | BD Science | 610101 |
References
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