Summary
Axonal transport af BDNF, en neurotrofisk faktor, er afgørende for overlevelse og funktion af flere neuronale populationer. Visse degenerative sygdomme er kendetegnet ved forstyrrelser af axonal struktur og funktion. Vi demonstrerede de anvendte teknikker til at undersøge levende handel med QD-BDNF i mikrofluide kamre anvender primære neuroner.
Abstract
BDNF spiller en vigtig rolle i flere facetter af neuronal overlevelse, differentiering og funktion. Strukturelle og funktionelle underskud i axoner i stigende grad ses som en tidlig træk ved neurodegenerative sygdomme, herunder Alzheimers sygdom (AD) og Huntingtons sygdom (HD). Endnu uklart er den mekanisme (r), hvorved axonal skade induceres. Vi rapporteret udvikling af en ny teknik til at fremstille biologisk aktivt monobiotinylated BDNF (mBtBDNF), der kan anvendes til at spore axonal transport af BDNF. Quantum dot-mærket BDNF (QD-BDNF) blev fremstillet ved konjugering kvantepunkt 655 til mBtBDNF. Mikrofluidisk indretning blev anvendt til at isolere axoner fra neuron cellelegemer. Tilsætning af QD-BDNF til axonale rum tillod levende billeddannelse af BDNF transport i axoner. Vi viste, at QD-BDNF flyttet væsentlige udelukkende retrogradt med meget få pauser på en bevægende hastighed på omkring 1,06 um / sek. Dette system kan bruges til at undersøge migchanisms af forstyrret axonal funktion i AD eller HD, samt andre degenerative sygdomme.
Introduction
Neuroner er stærkt polariserede celler, hvis lange og ofte meget udarbejdet processer er afgørende for etablering og vedligeholdelse af strukturen og funktionen af neurale kredsløb. Axon spiller en afgørende rolle i udførelsen gods til og fra synapser. Proteiner og organeller syntetiseret i cellen soma skal transporteres gennem axoner at nå den præsynaptiske terminal til at understøtte neuronal funktion. Tilsvarende modtager signaler på distale axoner skal transduceres og transporteres til soma. Disse processer er afgørende for neuronal overlevelse, differentiering og vedligeholdelse. I skal gennemføres, at axonal transport i nogle neuroner gennem afstande mere end 1.000 gange diameteren af cellen kroppen, er muligheden for let forestille sig, at selv små underskud markant kan påvirke neuronal og kredsløb funktion.
Hjerne-afledt neurotrofisk faktor (BDNF), et medlem af neurotrofinfamilien af vækstfaktorer, er til stede i maNY hjerne regioner, herunder hippocampus, hjernebark og basale forhjerne. BDNF spiller en afgørende rolle i erkendelse og hukommelse dannelse ved at støtte overlevelse, differentiering og funktion af neuroner, der deltager i kognitive kredsløb. BDNF binder til sin receptor, tyrosinkinase TrkB på Axon terminal, hvor det aktiverer TrkB-medierede signalveje herunder mitogenaktiveret proteinkinase / ekstracellulære signal-reguleret protein kinase (MAPK / ERK), phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K) og phospholipase C-gamma (PLCγ). De proteiner, der deltager i disse signalveje er pakket på endocytiske vesikulære strukturer til dannelse af BDNF / TrkB signalering endosom 1-6, som derefter retrogradt transporteres til den neuronale soma.
Den mikrofluid kultur kammer er en meget nyttig platform for at studere axonal biologi under normale forhold samt i fastlæggelsen af skade og sygdom 7,8. Ved isolerer axonerfra cellelegemerne, enheden har tilladelse til at studere specifikt transporten i axoner 8-10. PDMS baseret mikrofluide platforme med 450 um Microgroove barrierer, der anvendes i denne undersøgelse, blev købt i handlen (se Materialer tabel). At undersøge BDNF transport, vi udviklet en ny teknologi til at producere monobiotinylated BDNF (mBtBDNF). Vi tog fordel af biotin acceptor-peptid, AP (også kendt som AviTag). Det er en 15 aminosyresekvens, der indeholder en lysinrest som specifikt kan ligeret til et biotin af Escherichia coli-enzym biotin-ligase, BirA. Vi fusionerede den AviTag til den C-terminale ende af muse-præ-proBDNF cDNA ved PCR (figur 1A). Konstruktionen blev klonet ind i den mammale ekspressionsvektor pcDNA3.1 myc-sin vektor. Vi klonede også det bakterielle BirA DNA i pcDNA3.1 myc-sin vektor. De to plasmider blev transient cotransficeret ind HEK293FT celler til at udtrykke begge proteiner. BirA katalyserede ligering af bioti specifikt til lysin opholde sig AviTag ved C-terminalen af BDNF ved en 1: 1-forhold at producere monobiotinylated BDNF monomer. Biotinyleret, modne BDNF med en molekylmasse på ~ 18 kDa blev udvundet og oprenset fra medierne under anvendelse af Ni-harpiks (figur 1C). Biotinylering BDNF var fuldstændig, bedømt ved manglende evne til at detektere modificeret BDNF ved immunoblotting (figur 1D). Streptavidin konjugerede kvantepunkter, QD 655, blev brugt til at mærke mBtBDNF at gøre QD-BDNF. Tilstedeværelsen af AviTag ikke interfererer med aktiviteten af BDNF som mBtBDNF var i stand til at aktivere phosphoryleret TrkB (figur 1E) og stimulere neuritudvækst (figur 1F) i det omfang af rekombinant humant BDNF (rhBDNF). Immunfarvning viser, at QD-BDNF colocalized med TrkB i hippocampus axoner, hvilket indikerer, at QD-BDNF er bioaktivt (figur 1G). At studere BDNF transport blev QD-BDNF tilføjes distale Axon rummikrofluide kulturer indeholdende rotte E18 hippocampale neuroner (figur 2A). QD-BDNF retrograd transport inden axonerne blev erobret af real-time levende billeder af den røde fluorescerende tag (Supporting videoer S1, S2). Ved at analysere kymograph genereret var QD-BDNF observeret at blive transporteret retrogradt på en bevægende hastighed på omkring 1,06 um / sek (figur 3A). GFP eller mCherry-mærkede BDNF er blevet anvendt til at spore axonal bevægelse BDNF. De vigtigste ulemper er, at de ikke er lyse nok til enkelt molekyle studier. Også tilstedeværelsen af både anterograd og retrograd BDNF bevægelser gør det vanskeligt at vurdere, hvorvidt retrogradt transporteres BDNF var i en neurotrophin / receptor-kompleks.
I denne video viser vi, de anvendte teknikker til at undersøge levende handel med QD-BDNF i mikrofluide kamre anvender primære neuroner. Den ultrabrightness og fremragende fotostabilitet af quantum dots makes det muligt at udføre langsigtet sporing BDNF transport. Disse teknikker kan udnyttes til at forbedre undersøgelser af axonal funktion i AD, HD og andre neurodegenerative lidelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Kirurgiske og dyreforsøg udføres i nøje overensstemmelse med NIH Guide til Pleje og anvendelse af forsøgsdyr. Alle forsøg med brug af dyr er godkendt af UCSD Institutional Animal Care og brug Udvalg.
1. Plasmid Kloning, ekspression og oprensning af Mono-biotinyleret BDNF (mBtBDNF)
BEMÆRK: Konstruere præ-proBDNFavi og BirA cDNA ind pcDNA3.1 vektor og coudtrykke i HEK293FT celler 10. Renses mBtBDNF anvendelse af Ni-NTA-perler ifølge tidligere offentliggjorte fremgangsmåde til fremstilling af modne og biologisk aktive monobiotinylated nervevækstfaktor (mBtNGF) 10.
2. Fremstilling af Mikrofluid Chambers
Mikrofluid neuron dyrkning anordning gør det muligt at fluidmæssigt isolere axoner fra neuron cellelegemer. Saml kamre med frisk belagte dækglas lige før hver dissektion. Mikrofluide kamre anvendtei denne protokol kommercielt købt (se materialer og udstyr tabel). Håndvask og genbruges kommercielt indkøbte kamre op til 5-6x.
- Håndvask mikrofluide kamre i 1% Alconox. Skyl tre gange med Milli-Q-vand i 30 minutter hver. Hånd vaskekamrene igen i 70% ethanol.
- Udlæg kamre til tørre på Parafilm i laminar flow hætte. Udstråle og sterilisere begge sider af kamrene i 20 minutter under UV. Opbevares steriliseret kamre i en steril 15 cm skål forseglet med Parafilm ved stuetemperatur.
- Anbring 24 x 40 mm nr 1 dækglas i en glasbeholder. Soak dækglassene i 35% saltsyre natten over på en rotator. Den følgende dag skylles dækglassene tre gange i 30 minutter hver med vand.
- Steriliser dækglassene én efter én ved at dyppe hvert dækglas i 100% ethanol og flammende over en bunsenbrænder. Opbevar tørre dækglas i en steril petriskål og holde det ved stuetemperatur, indtil belægning.
- Lay Out dækglas i en 15 cm dyrkningsskål. Coat hvert dækglas med 0,7 ml af 0,01% poly-L-lysin (PLL), og der inkuberes i hætten ved stuetemperatur.
- Efter 1 time, skylles dækglassene tre gange med sterilt vand. Tørre dækglas med vakuum og sted hvert dækglas i en 6 cm dyrkningsskål.
- For at samle mikrofluid kammer, placere kammer med Microgroove side nederst på PLL belagt dækglas med forsigtighed for ikke at røre mikroriller. Forsigtigt presses ned i kammeret med en pipettespids til at sikre kammeret var tæt forseglet.
3. Dissektion af neuronal Kultur og Plate på Chambers
- Placer to E17-E18 rotte hippocampus (en hjerne) dissekeret i en 15 ml konisk rør indeholdende 2 ml dissektion puffer (HBSS uden calcium, ingen magnesium, med 1% pen / strep og 10 mM HEPES. Skyl vævet 3x med 5 ml dissektion buffer hver gang. Fjern dissektion buffer så meget som muligt, og der tilsættes 900 ul frisk dissection puffer.
- At fordøje væv, tilsættes 100 pi 10x trypsin (2,5%) i dissektion buffer til at 1x brugskoncentration. Placer konisk rør i et 37 ° C vandbad. Efter 10 minutter af fordøjelsen, tilsættes 100 pi 10 mg / ml DNase I til en endelig koncentration på omkring 1 mg / ml.
- Ved hjælp af en brand-poleret Pasteur glas pipette forsigtigt udriv væv ved pipettering op og ned 5-10x. Lige efter triturering, slukke trypsin med 2 ml udpladningsmedium (Neurobasal med 10% FBS, 2 mM Glutamax, 2% B27).
- Lad prøven i hætten i 5 min for at tillade eventuelle rester af væv til at slå sig ned til bunden. Fjern forsigtigt 2 ml af supernatanten i et rent sterilt 15 ml konisk rør og centrifugeres ved 200 xg i 5 minutter for at pelletere cellerne. Pellet resuspenderes i 50 medier ul plating
- Tæl cellerne med hæmocytometer. Load 15-20 pi cellesuspension (~ 40.000 celler) i en rum i mikrofluid kammer. Placer kammereti inkubatoren i 10 min for at tillade cellerne at fastgøre til dækglasset. Efter 10 minutter tilsættes mere plating medier til at fylde begge rum af kammeret.
- På andendagen af dissektion, helt erstatte klædningen medier med vedligeholdelse medier (Neurobasal med 2 mM Glutamax, 2% B27) i både cellen kroppen og Axon rum. Axoner fra hippocampusneuroner begynder at krydse mikroriller i dag 3 og nå Axon rummet mellem dag 5-7. I løbet af denne periode, udskifte halvdelen af dyrkningen medier med friske vedligeholdelse medier hver 24 ~ 48 timer.
4. aksonale Transport af QD-BDNF
- Før leve billeddannelse af QD-BDNF axonal transport, nedbryder BDNF fra både celle krop og Axon rum i mikrofluid kammer ved skyl begge rum med BDNF-fri, serum frie Neurobasal medier hver 30 min i 2 timer.
- Under BDNF udtømning, forberede QD-BDNF-konjugater. Bland 50 nM af mono-biotinyleret BDNF dimer med 50 Nm QD655-streptavidin konjugater i Neurobasal medier og inkuberes på is i 60 min.
- Fjern mediet i Axon rum og tilføje 300 pi QD-BDNF med en endelig koncentration på 0,25 nM i 4 timer ved 37 ° C. For at minimere det spredende af QD-BDNF i cellen organ rum, er det meget vigtigt altid at opretholde et højere niveau af medier i cellen kroppen rum end i Axon rum. Skyl ubundet QD-BDNF efter inkubation før direkte billedvisning.
- Udføre levende billeddannelse af QD-BDNF transport ved hjælp af et omvendt mikroskop udstyret med en 100X olie objektiv. Varm op omfanget og miljøkammeret knyttet til det til en konstant temperatur (37 ° C) og CO 2 (5%). Brug et sæt af Texas Red excitation / emission terninger at visualisere QD655 signalet.
- Anskaf og fange time-lapse billeder i midten axoner ved en hastighed på 1 billede / sek for i alt 2 minutter ved hjælp af en CCD-kamera. Brug mikroriller uden axoner that har ingen QD og dermed intet signal som en kontrol for infiltration.
- Analyser BDNF transport ved hjælp af en billedanalyse software eller NIH ImageJ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Produktion og oprensning af biologisk aktivt mono-biotinyleret BDNF
Ekspressionsvektoren BDNF fusioneret med en AviTag sekvens (GGGLNDIFEAQKIEWHE) blev skabt efter en tidligere offentliggjort protokol 10. Den molekylære masse af fuldlængde fusionsproteinet blev forudsagt til at være ~ 32 kDa ( http://ca.expasy.org/tools/pi_tool.html ) Monobiotinylated modne BDNF med en forudsagt molekylmasse på 18 kDa (figur 1A) blev fremstillet i HEK293FT celler og oprenset fra konditionerede medier som beskrevet 10.
Forskellige fraktioner blev opsamlet og separeret på en 15% SDS-PAGE. Ved hjælp af et kanin-anti-Avi-tag antistof, et bånd med en molekylvægt på ~ 18 kDa blev påvist i den første fraktion (figur 1B). For at teste renheden af præparatet blev prøver separeret på SDS-PAGE og blev farvet af sIlver-farvning. Som vist i figur 1C, 18 kDa-båndet var de dominerende arter i første eluering. Streptavidin-agaroseperler pulldown assays blev udført for at vurdere omfanget af biotinylering af mBtBDNF præparatet. Efter nedkøling med streptavidin-agarose-perler, blev proteiner, der forblev i supernatanten udfældet med 7% trichloreddikesyre (TCA). Disse prøver blev analyseret ved SDS-PAGE og blottene blev probet med enten anti-Avi antistoffer (øverst) til at detektere det totale protein eller HRP-streptavidin til påvisning af biotinylerede proteiner. Vores resultater viser, at alle signaler er associeret med perlerne, mens ingen bånd blev påvist i supernatanten (figur 1D). Vi konkluderer derfor, at mBtBDNF blev biotinyleret ved en effektivitet på> 99,9%.
For at teste den biologiske aktivitet af mBtBDNF i binding og aktivering af TrkB receptoren behandlede vi en 3T3-cellelinie, der udtrykker TrkB med enten rhBDNF (20 ng / ml) eller purficeret mBtBDNF (20 ng / ml) i 10 min. Celler, der ikke modtog behandling, blev også opsamlet som kontrol. Lysater blev separeret på en 4-12% SDS-PAGE og et kanin-anti-pTrkB antistof blev anvendt til at probe det phosphorylerede TrkB. Som vist i figur 1E, svarende til rhBDNF, mBtBDNF var i stand til at inducere phosphorylering af TrkB på et lignende niveau. Vi behandlede også rotte hippocampale neuroner med enten rhBDNF (20 ng / ml) eller oprenset mBtBDNF (20 ng / ml) i 48 timer. Renset mBtBDNF var i stand til at stimulere hippocampus neuritudvækst til omfanget af rhBDNF (figur 1F). For at undersøge co-lokalisering af QD-BDNF med TrkB-receptor blev QD-BDNF tilsat til rotte hippocampale Axon i 4 timer ved 37 ° C. Neuroner blev derefter fikseret og immunfarvet for TrkB. Som vist i figur 1G, QD-BDNF co-lokaliseret med TrkB. Vi derfor konkludere, at mBtBDNF er fuldt aktiv i sin biologiske funktion.
Live-Imaging af axonal Transport af QD-BDNF in hippocampusneuroner
Primære embryoniske rotte hippocampusneuroner (E17-18) blev dissekeret og belagt ind i cellen kroppen rum mikrofluide kammer. På dag 4 eller 5, axoner udvidet på tværs af mikroriller i Axon rum. På dag 7, voksede de fleste axoner i Axon rum. QD-BDNF blev fremstillet ved inkubering af streptavidin QD655 med mBtBDNF ved en 1: 1-forhold (QD: BDNF-dimer) på is i 1 time. QD-BDNF (0,25 nM) blev derefter tilsat til Axon rum og inkuberet i 4 timer ved 37 ° C forud for billeddannelse (figur 2A).
Efter inkubation blev QD-BDNF fundet at binde specifikt til axoner i Axon rum. I cellen organ rum blev QD signaler akkumuleret i de fleste af de proksimale axoner og cellelegemer angiver QD-BDNF blev internaliseret i axoner og retrogradt transporteres til cellelegemer. Time-lapse foto serie af QD-BDNF-signaler inden axoner blev udført i mikroriller. QD signals blev observeret i de fleste af mikroriller med axoner mens ingen QD signal kan ses i mikroriller i fraværende af axoner, hvilket indikerer ringe eller ingen diffusion af QD signal fra Axon rum til cellen organ rum (figur 2B).
I figur 2C blev en 80 um lange segment af axoner hippocampusneuroner fluorescens registreres for 100 sek. I alt 6 QD-BDNF signaler blev tydeligt set under videooptagelsen. Tre QD signaler optaget bevæget ensrettet mod cellen kroppen (venstre side). QD begivenhed mærket med hvid pil (t: 31 sek til t: 101 sek) flyttede jævnt til cellen organ krydser hele feltet i ~ 70 sek. En anden QD begivenhed mærket ved grøn pil (t: 1 sek til t: 61 sek) flyttede retrogradt først. Ved t: 21 sek, QD-BDNF flyttede anterogradely i 10 til 20 sek, og derefter ændret retning igen mod cellen kroppen. QD begivenhed mærket med gul pil (t: 1 sek til t: 71 sek) også flyttet Retrograd Ely, men standsede ~ 20 sek under flytningen. QD-BDNFs, der ikke bevæger sig i løbet af denne 100 sek blev betragtet stationær. Kun bevægelige objekter blev senere analyseret for at beregne bevægelige hastighed, gennemsnitlig hastighed, og tid på pause.
Dataanalyse i QD-BDNF Transport Kymograph
Kymographs blev skabt fra hver film optaget ved hjælp Metamorph software. Som vist i de repræsentative kymographs af QD-BDNF-transporten (figur 3A) blev QD-BDNF bevægelser registreres i 120 sekunder i en 80 um lange segment af axoner. I repræsentative kymograph 1 QD-BDNF flyttede hurtigt og gnidningsløst mod venstre (celle kroppen), krydsede marken (80 um) i ~ 60 sek, med meget korte pauser (understøtter video S1). Mens der i repræsentative kymograph 2, en QD-BDNF rejste ~ 50 um i 120 sek retrogradt, med mindst tre segmenter af længere pauser (angivet med pile) (Støtte til video S2).
indhold "> Figur 3B er scatter plot af bevægelige hastighed, gennemsnitlig hastighed og pause for hver enkelt QD-BDNF. bevægelseshastigheden af QD-BDNF var relativt hurtigt, der spænder fra 0,47 til 1,97 um / sek med gennemsnittet af 1,06 ± 0,05 um / sek. Den gennemsnitlige hastighed på QD-BDNF blev beregnet som rejser afstand / tid anvendes. Og fordi BDNF pause under transporten, gennemsnitlig hastighed var meget lavere end at flytte hastighed med gennemsnit på 0,48 ± 0,03 um / sek (lige 0,17-1,59 um / sek). Pause tid blev også analyseret som en karakteristik af BDNF bevægelsen. Den gennemsnitlige varighed af pauser var 15,88 ± 1,30 sek (lige 6-33 sek) (tabel 1).
Figur 1. Oprensning af biologisk aktiv, monobiotinylated BDNF (mBtBDNF). (A) Skematisk viser fremstillingen af mBtBDNF. Både præ-proBDNFavi og BirA blev klonet ind i pcDNA3.1myc-sin vektor som beskrevet 10. (B) forskellige fraktioner af elueres fra Ni-harpiks blev opsamlet og separeret på en 15% SDS-PAGE-gel. En kanin-anti-Avi tag-antistof blev anvendt i blottet. Et bånd med en tilsyneladende molekylvægt på ~ 18 kDa blev anerkendt i eluatet, i overensstemmelse med den forudsagte molekylmasse for det modne mBtBDNF protein. (C) En sølvfarvning gel viser 18 kDa mBtBDNF var de dominerende arter i elueringsfraktionen. (D) Renset mBtBDNF blev inkuberet med streptavidin-agaroseperler. Perlerne blev vasket og kogt i SDS loadingpuffer mens supernatanten blev udfældet med TCA før SDS-PAGE-analyse. Blottet blev probet med enten anti-Avi antistof eller med HRP-streptavidin. (E) 20 ng / ml oprenset mBtBDNF eller rhBDNF blev tilsat til en 3T3-cellelinie, at expresses TrkB i 10 min. Lysater blev høstet og separeret på en 4-12% SDS-PAGE. Kontrol cellelysat blev også analyseret. Blottet blev probet med et kanin-anti-pTrkB antistof. Samlet TrkB blev afsløret ved anvendelse af en muse-anti-TrkB antistof. (D) 20 ng / ml oprenset mBtBDNF eller rhBDNF sattes til rotte hippocampale neuroner i 48 timer. DIC billeder blev taget for at analysere neuritudvækst. (G) QD-BDNF blev inkuberet med rotte-hippocampus neuron axoner til 4 timer (Målestokken 5 um). Neuroner blev derefter fikseret og immunfarvet for TrkB.
. Figur 2. Enkelt molekyle billeddannelse af retrograd transport af QD-BDNF i axoner (A) oppefra: En skematisk tegning af mikrofluide kammer med primære neuroner forgyldt i cellen kroppen rum. Axoner steg over mikrogramrooves ind Axon rum. QD655 mærket BDNF blev tilsat til Axon rum. Side view: Medierne niveau i Axon rum blev holdt lavere end cellen kroppen rummet for at minimere spredningen af QD-signal. (B) rød fluorescens billeder og DIC billeder af cellen kroppen rum, mikroriller og Axon rum. QD-BDNF bundet specifikt til axoner, internaliseres og retrogradt transporteres til cellelegemer langs axoner. Ingen QD signal blev observeret i mikroriller fraværende af axoner. (C) Time-lapse videobillede serie af QD-BDNF transport langs Axon. Både bevægende og stationære QD-BDNF-signaler var til stede i de fleste af de film. På tidspunktet t: 1 sek, kan mindst 4 QDs ses. Efter 10 sek, er to QDs (angivet med grønne og gule pile) bevæger sig mod cellen kroppen (venstre i billedet). Disse to QDs flytte og holde pause i de første par billeder, og til sidst flytter ud af billederne til venstre (på ~ 70 sek). Endnu en gang dagligt flyttede ind i feltetved t: 31 sek (angivet med hvid pil) og flyttede hurtigt uden megen pauser til venstre.
Figur 3. QD-BDNF transport kymograph og dataanalyse. (A) Repræsentative kymographs af QD-BDNF transport i de primære hippocampusneuroner. I kymo 1, flyttede en lys QD over marken ved relativt hurtig hastighed med kun et par korte pauser. I kymo 2, de bevægelige hastighed QDs var langsommere, og bevægelsen blev afbrudt med hyppigere og længere pauser. (B) Scatter plot af QD-BDNF flytter hastighed, gennemsnitlig hastighed (beregnet som rejser afstand / tid brugt) og pause tid. Den gennemsnitlige flytter hastighed QD-BDNF var 1,06 ± 0,05 um / sek (lige 0,47-1,97 um / sek. Den gennemsnitlige hastighed på QD-BDNF var 0,48 ± 0,03 um / sek (fra 0. 17 til 1,59 um / sek). Den gennemsnitlige varighed af pauser var 15,88 ± 1,30 sek (lige 6-33 sek).
Støtte video S1 . Repræsentant QD-BDNF transport video 1. Adskillige QD-BDNF bevæger sig hurtigt i retning af venstre side (celle kroppen) med meget få korte pauser.
Støtte video S2 . Repræsentant QD-BDNF transport video 2. Adskillige QD-BDNF bevæger forholdsvis langsom mod venstre side (celle kroppen) med hyppige og lange pauser.
| Minimum | Maksimal | Mean | 88px;. "> Std fejl||
| Flytning hastighed (micron / sek) | 0,47 | 1,97 | 1.06 | 0.05 |
| Gennemsnitlig hastighed (micron / sek) | 0,17 | 1,59 | 0,48 | 0.03 |
| Midlertidigt standset (sek) | 6 | 33 | 15.88 | 1.30 |
Tabel 1. Dataanalyse af QD-BDNF transport.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne undersøgelse rapporterer vi udviklingen af en ny teknik til at fremstille biologisk aktivt monobiotinylated BDNF (mBtBDNF), der kan anvendes til at spore axonal transport af BDNF. Ved konjugering af proteinet til kvantepunktet streptavidin, og ved hjælp af en mikrofluid kammer metoden gør det muligt at detektere axonal transport af BDNF i ubearbejdet neuroner med enkelt molekyle følsomhed, i realtid og med rumlige og tidslige resolutioner. De værktøjer, der anvendes heri, tilvejebringe et middel til at undersøge de molekylære maskiner, der medierer axonal transport af BDNF / TrkB signalering endosomer i neuroner i sundhed og sygdom.
BDNF-GFP eller -mCherry er blevet anvendt til at spore axonal bevægelse BDNF i forskellige neuronale kulturer in vitro. Disse reagenser tilbyder en mulighed for at behandle anterograd transport og eventuelt for behandlingen autocrin aktivering af TrkB. Der er dog store ulemper for at studere retrograd transport, den mest iøjnefaldende af WHICH er, at GFP eller mCherry ikke er lyst nok til enkelt molekyle studier. Tidligere undersøgelser har vist, at under fysiologiske koncentrationer af NGF blev en enkelt NGF dimer internaliseres 11 og retrogradt transporteres 8. Det er vigtigt, at anvendelsen af QD BDNF giver også en til at definere den subcellulære sted, hvor BDNF binder sine TrkB-receptorer. Ved hjælp af GFP eller mCherry-mærkede proteiner, vil somal udtryk medfører tilstedeværelse inden Axon af proteiner undergår anterograd og samt retrograd transport. Som sådan, kan det være vanskeligt at vurdere, hvorvidt eller ikke hvor retrogradt transporteres BDNF stødt dets receptor før retrograd transport. Som en spekulation, retrograd transport inden axoner af BDNF-GFP eller BDNF-mCherry produceret i samme neuron kan afvige fra det følgende binding af BDNF i målet for innervation.
Selv om kemisk tværbinding er blevet anvendt til fremstilling af biologisk aktivt nervevækstfaktor(NGF), hvilken fremgangsmåde er indført heri er overlegen. For det første er det vanskeligt at styre præcist omfanget af biotinylering; for eksempel, blev hver NGF mærket med 5-9 biotin dele 8,9,12. For det andet kan tværbinding inaktivere proteinet. I tilfældet af NGF, tværbinding nødvendiggjort fastgørelse til carboxylgrupper 13. I tilfælde af BDNF er aktivitet ofte tabt følgende kemiske tværbinding til biotin. Endelig kan omfanget af tværbinding være ufuldstændig. En nylig rapport viste, at ~ 0,8 biotin / BDNF molekyle blev produceret af kemisk krydsbinding; som sådan ~ 20% BDNF blev ikke mærket 9. Tilstedeværelsen af umærket BDNF kunne vanskeliggøre fortolkningen af resultaterne.
Vores teknik giver de unikke fordele, at BDNF-molekyler alle er mærket med en enkelt biotin på det samme sted, og dermed udgør et homogent præparat af biotinyleret BDNF. Ved konjugering til nanofluorescent partikler, såsom kvantepunkter kan mBtBDNF værebruges til sporing veje og processer, BDNF internaliseres, handlede inden neuroner: i dendritter i axoner samt i celle organer. Denne metode gør det muligt at anvende alternative tags for BDNF. Udviklingen af andre typer af nanopartikler lover yderligere fordele.
Defekter i axonal menneskehandel og signalering af BDNF har været impliceret i neurodegenerative sygdomme. Stærke beviser har kædet defekt transport af BDNF til cortical-striatal atrofi i Huntingtons sygdom 14,15. Mutant huntingtinprotein interfererer med interaktionen mellem Huntingtin-associeret protein-1 (Hap1) og dynein motor sympatiske neuroner, hæmmer BDNF transport og resulterer i tab af neurotrofisk støtte og neuronal toksicitet 16-18. Vores teknikker til sporing axonal transport af BDNF kan tjene som et værdifuldt redskab til at studere axonal funktion i neurodegenerative sygdomme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Yue (Pauline) Hu, Rachel SINIT for deres tekniske bistand. Undersøgelsen er støttet af NIH tilskud (PN2 EY016525) og ved finansiering fra Down Syndrom forskning og behandling Fond og Larry L. Hillblom Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Platinum pfx DNA polymerase | Invitrogen | 11708021 | |
| EcoRI | Fermentas | FD0274 | |
| BamHI | Fermentas | FD0054 | |
| HEK293FT cells | Invitrogen | R70007 | |
| DMEM-high glucose media | Mediatech | 10-013-CV | |
| D-biotin | Sigma | B4639 | |
| TurboFect | Fermentas | R0531 | |
| PMSF | Sigma | P7626 | |
| Aprotinin | Sigma | A6279 | |
| Ni-NTA resins | Qiagen | 30250 | |
| Protease inhibitors cocktail | Sigma | S8820 | |
| Silver staining kit | G-Biosciences | 786-30 | |
| Human recombinant BDNF | Genentech | ||
| Microfluidic chambers | Xona | SND450 | |
| 24 x 40 mm No. 1 glass coverslips | VWR | 48393-060 | |
| Poly-L-Lysine | Cultrex | 3438-100-01 | |
| HBSS | Gibco | 14185-052 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| FBS | Invitrogen | 16000-044 | |
| GlutaMax | Invitrogen | 35050-061 | |
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| QD655-streptavidin conjugates | Invitrogen | Q10121MP | |
| anti-Avi tag antibody | GenScript | A00674 | |
| streptavidin-agarose beads | Life Technology | SA100-04 | |
| Trichloroacetic acid | Sigma | T6399 | |
| HRP-streptavidin | Thermo Scientific | N100 | |
| anti-pTrkB antibody | a generous gift from Dr M. Chao of NYU | ||
| anti-TrkB antibody | BD Science | 610101 |
References
- Wu, C., et al. A functional dynein-microtubule network is required for NGF signaling through the Rap1/MAPK pathway. Traffic. 8, 1503-1520 (2007).
- Wortzel, I., Seger, R. The ERK Cascade: Distinct Functions within Various Subcellular Organelles. Genes & cancer. 2, 195-209 (2011).
- Huang, E. J., Reichardt, L. F. Trk receptors: roles in neuronal signal transduction. Annual review of biochemistry. 72, 609-642 (2003).
- Nonomura, T., et al. Signaling pathways and survival effects of BDNF and NT-3 on cultured cerebellar granule cells. Brain research. Developmental brain research. 97, 42-50 (1996).
- Weissmiller, A. M., Wu, C. Current advances in using neurotrophic factors to treat neurodegenerative disorders. Translational neurodegeneration. 1, 14 (2012).
- Zhang, K., et al. Defective axonal transport of Rab7 GTPase results in dysregulated trophic signaling. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 7451-7462 (2013).
- Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nature methods. 2, 599-605 (2005).
- Cui, B., et al. One at a time, live tracking of NGF axonal transport using quantum dots. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 13666-13671 (2007).
- Xie, W., Zhang, K., Cui, B. Functional characterization and axonal transport of quantum dot labeled BDNF. Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. 4, 953-960 (2012).
- Sung, K., Maloney, M. T., Yang, J., Wu, C. A novel method for producing mono-biotinylated, biologically active neurotrophic factors: an essential reagent for single molecule study of axonal transport. Journal of neuroscience methods. 200, 121-128 (2011).
- Tani, T., et al. Trafficking of a ligand-receptor complex on the growth cones as an essential step for the uptake of nerve growth factor at the distal end of the axon: a single-molecule analysis. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 2181-2191 (2005).
- Bronfman, F. C., Tcherpakov, M., Jovin, T. M., Fainzilber, M. Ligand-induced internalization of the p75 neurotrophin receptor: a slow route to the signaling endosome. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 3209-3220 (2003).
- Kruttgen, A., Heymach, J. V., Kahle, P. J., Shooter, E. M. The role of the nerve growth factor carboxyl terminus in receptor binding and conformational stability. The Journal of biological chemistry. 272, 29222-29228 (1997).
- Zuccato, C., Cattaneo, E. Brain-derived neurotrophic factor in neurodegenerative diseases. Nature reviews. Neurology. 5, 311-322 (2009).
- Gharami, K., Xie, Y., An, J. J., Tonegawa, S., Xu, B. Brain-derived neurotrophic factor over-expression in the forebrain ameliorates Huntington's disease phenotypes in mice. Journal of neurochemistry. 105, 369-379 (2008).
- Gauthier, L. R., et al. Huntingtin controls neurotrophic support and survival of neurons by enhancing BDNF vesicular transport along microtubules. Cell. 118, 127-138 (2004).
- Her, L. S., Goldstein, L. S. Enhanced sensitivity of striatal neurons to axonal transport defects induced by mutant huntingtin. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 13662-13672 (2008).
- Rong, J., et al. Regulation of intracellular trafficking of huntingtin-associated protein-1 is critical for TrkA protein levels and neurite outgrowth. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 26, 6019-6030 (2006).
