Summary
Le transport axonal de BDNF, un facteur neurotrophique, est essentiel pour la survie et la fonction de plusieurs populations neuronales. Certaines maladies dégénératives sont marqués par la rupture de la structure et de la fonction axonale. Nous avons démontré les techniques utilisées pour examiner le trafic en direct de QD-BDNF dans des chambres microfluidiques utilisant neurones primaires.
Abstract
BDNF joue un rôle important dans plusieurs aspects de la survie neuronale, la différenciation et la fonction. Les déficits structurels et fonctionnels dans les axones sont de plus en plus considérés comme une caractéristique précoce des maladies neurodégénératives, dont la maladie d'Alzheimer (MA) et la maladie de Huntington (HD). Ne sait pas encore, c'est le mécanisme (s) par lequel des lésions axonales est induite. Nous avons signalé le développement d'une nouvelle technique pour produire biologiquement active, monobiotinylé BDNF (mBtBDNF) qui peut être utilisé pour tracer le transport axonal de BDNF. Quantum dot marqué BDNF (QD-BDNF) a été produit par la conjugaison de points quantiques 655 à mBtBDNF. Un dispositif microfluidique a été utilisé pour isoler les axones des corps cellulaires des neurones. Ajout de QD-BDNF dans le compartiment axonal permis imagerie en temps réel du transport du BDNF dans les axones. Nous avons démontré que QD-BDNF déplacé essentiellement exclusivement rétrograde, avec très peu de pauses, à une vitesse de l'ordre de 1,06 um / s en mouvement. Ce système peut être utilisé pour enquêter sur moicanismes de la fonction axonale perturbé dans AD ou HD, ainsi que d'autres maladies dégénératives.
Introduction
Les neurones sont des cellules dont la très processus long et souvent très élaborés sont fondamentales pour établir et maintenir la structure et la fonction des circuits neuronaux polarisés. L'axone joue un rôle essentiel dans le transport de cargaisons à destination et à partir de synapses. Les protéines et organites synthétisés dans le corps cellulaire doivent être transportés à travers les axones pour atteindre la terminaison présynaptique pour soutenir la fonction neuronale. De même, les signaux reçus à axones distaux doivent être transduites et transmis au soma. Ces processus sont essentiels pour la survie neuronale, la différenciation et la maintenance. Dans ce transport axonal dans certains neurones doit être effectuée sur des distances de plus de 1 000 fois le diamètre du corps de la cellule, la possibilité est envisagée facilement que même de petites déficits pourraient avoir une incidence nettement la fonction neuronale et circuit.
Brain-derived neurotrophic factor (BDNF), un membre de la famille des neurotrophines de facteurs de croissance, est présent en marégions du cerveau ny, y compris l'hippocampe, le cortex cérébral, et cerveau antérieur basal. BDNF joue un rôle crucial dans la cognition et la mémoire formation en soutenant la survie, la différenciation et la fonction des neurones qui participent à des circuits cognitifs. BDNF se lie à son récepteur, le TrkB tyrosine kinase, à la terminaison axonale où il active les voies de signalisation TrkB médiée dont le mitogène protéine kinase activée / extracellulaire de la protéine kinase régulée par un signal (MAPK / ERK), le phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K) et la phospholipase C-gamma (PLCy). Les protéines qui participent à ces voies de signalisation sont conditionnés sur des structures vésiculaires endocytose pour former l'endosome 1-6, qui sont ensuite transportées de façon rétrograde vers le soma neuronal signalisation BDNF / TrkB.
La chambre de culture microfluidique est une plate-forme très utile pour étudier la biologie des axones dans les conditions normales, ainsi que dans le cadre des lésions et des maladies 7,8. Par isoler les axonesde corps cellulaires, le dispositif a permis d'étudier un transport spécifiquement dans les axones 8-10. Les plates-formes microfluidiques PDMS base avec 450 um barrières microsillons utilisées dans cette étude ont été achetés dans le commerce (voir le tableau des matériaux). Pour d'étudier le transport du BDNF, nous avons développé une nouvelle technologie pour produire monobiotinylé BDNF (mBtBDNF). Nous avons profité du peptide biotine accepteur, AP (également connu sous le nom AviTag). Il s'agit d'une séquence d'acides 15 aminés qui contient un résidu de lysine qui peut être spécifiquement lié à un par la biotine ligase coli Escherichia enzyme biotine, BirA. Nous avons fusionné la AviTag à l'extrémité C-terminale de la souris pré-proBDNF ADNc par PCR (figure 1A). La construction a été clonée dans le vecteur d'expression de mammifère, pcDNA3.1-myc son vecteur. Nous avons également cloné l'ADN BirA bactérienne dans le pCDNA3.1 myc son vecteur. Les deux plasmides ont été transitoirement co-transfectées dans des cellules HEK293FT d'exprimer les deux protéines. BirA catalysé la ligature de Bioten particulier de la lysine résident dans le AviTag à l'extrémité C-terminale de BDNF dans un rapport de 1: 1 pour produire monobiotinylé monomère BDNF. Biotinylé, BDNF matures avec une masse moléculaire de ~ 18 kDa a été récupéré et purifié à partir du support à l'aide de résine Ni-(Figure 1C). La biotinylation du BDNF a été terminée, comme jugé par l'incapacité à détecter BDNF non modifié par immunoblot (Figure 1D). Streptavidine points quantiques conjugués, QD 655, ont été utilisés pour étiqueter mBtBDNF faire QD-BDNF. La présence de la AviTag n'interfère pas avec l'activité de BDNF comme le mBtBDNF était capable d'activer TrkB phosphorylée (figure 1E) et de stimuler la croissance des neurites (figure 1F), dans la mesure du BDNF humain recombinant (rhBDNF). Immunocoloration montré que QD-BDNF colocalisé avec TrkB dans les axones de l'hippocampe, ce qui indique que QD-BDNF est bioactif (figure 1G). Pour étudier le transport du BDNF, QD-BDNF a été ajouté à distale compartiment axone d'cultures microfluidiques contenant rat E18 neurones de l'hippocampe (figure 2A). QD-BDNF transport rétrograde dans les axones a été capturé par imagerie en temps réel en direct de l'étiquette fluorescente rouge (Soutien vidéos de S1, S2). En analysant le produit kymographe, QD-BDNF a été observée pour être transportée de manière rétrograde, à une vitesse de l'ordre de 1,06 um / sec (figure 3A) en mouvement. GFP ou mCherry étiqueté BDNF ont été utilisés pour suivre le mouvement des axones de BDNF. Les principaux inconvénients sont qu'ils ne sont pas assez brillant pour les études de molécules uniques. En outre, la présence à la fois antérograde et rétrograde BDNF mouvements, il est difficile d'évaluer si oui ou non le BDNF a été transportée de manière rétrograde dans un complexe neurotrophine / récepteur.
Dans cette vidéo, nous démontrons les techniques utilisées pour examiner le trafic en direct de QD-BDNF dans des chambres microfluidiques utilisant neurones primaires. Le ultrabrightness et une excellente photostabilité de points quantiques makes permettant d'effectuer un suivi à long terme du transport du BDNF. Ces techniques peuvent être exploitées pour améliorer les études de la fonction axonale dans AD, HD, et d'autres maladies neurodégénératives.
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Protocol
Les interventions chirurgicales et animales sont réalisées dans le strict respect de la NIH Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire. Toutes les expériences impliquant l'utilisation d'animaux sont approuvés par l'UCSD institutionnel de protection des animaux et l'utilisation Comité.
1. plasmide de clonage, expression et purification de Mono-biotinylé BDNF (mBtBDNF)
REMARQUE: construire pré-proBDNFavi et BirA ADNc dans le vecteur pcDNA3.1 et coexprimer dans les cellules HEK293FT 10. Purifiez mBtBDNF utilisant des billes de Ni-NTA selon la méthode précédemment publiée de la production du facteur de croissance nerveuse monobiotinylé mature et biologiquement active (mBtNGF) 10.
2 Préparation de microfluidiques Chambers
Dispositif microfluidique neurone de culture permet d'isoler fluidiquement axones des corps cellulaires des neurones. Assemblez chambres avec lamelles fraîchement enduites juste avant chaque dissection. Chambres microfluidiques utilisésdans ce protocole sont achetés dans le commerce (voir matériaux et la table de l'équipement). Lavage à la main et réutilisés chambres achetés dans le commerce jusqu'à 5-6x.
- Lavage à la main des chambres microfluidiques en 1% Alconox. Rincer trois fois avec de l'eau Milli-Q pendant 30 min chacun. chambres à nouveau dans 70% d'éthanol de lavage des mains.
- Disposez chambres à sécher sur du parafilm dans la hotte à flux laminaire. Irradier et stériliser les deux côtés des chambres de 20 minutes sous UV. Magasin chambres stérilisée en 15 cm plat stérile scellée avec du parafilm à la température ambiante.
- Placer 24 x 40 mm n ° 1 des lamelles de verre dans un récipient en verre. Tremper les lamelles de 35% de l'acide chlorhydrique nuit sur un agitateur. Le jour suivant, les lamelles rincer trois fois pendant 30 minutes chacune avec de l'eau.
- Stériliser les lamelles couvre-objet, un par un en trempant chaque lamelle couvre-objet dans de l'éthanol à 100% et plus de flammes d'un brûleur Bunsen. Rangez les lamelles sèches dans une boîte de Pétri stérile et le laisser à température ambiante jusqu'à ce que le revêtement.
- Poser oust les lamelles dans une boîte de culture de 15 cm. Manteau de chaque lamelle avec 0,7 ml de 0,01% de poly-L-lysine (PLL) et incuber à la hotte à température ambiante.
- Après 1 heure, rincez les lamelles à trois reprises avec de l'eau stérile. Lamelles sèches avec vide et le lieu de chaque lamelle dans une boîte de culture de 6 cm.
- Pour assembler la chambre microfluidique, placez la chambre à côté microsillon en bas sur la lamelle enduit PLL avec prudence pour ne pas toucher les microsillons. Doucement pressé vers le bas dans la chambre avec une pointe de pipette afin d'assurer la chambre est hermétiquement scellée.
3. Dissection neuronale Culture et plaque sur les chambres
- Placez deux hippocampes E17-E18 rat (un cerveau) disséqués dans un tube conique de 15 ml contenant 2 ml de tampon de dissection (HBSS, sans calcium, pas de magnésium, avec 1% stylo / angine et HEPES 10 mM. Rincer les tissus 3x avec 5 ml dissection tampon à chaque fois. Retirez le tampon de dissection autant que possible et ajouter 900 ul de di fraisssection tampon.
- Pour digérer le tissu, ajouter 100 pl de 10x la trypsine (2,5%) dans le tampon de dissection à faire 1x concentration de travail. Placer le tube conique dans un bain d'eau à 37 C °. Après 10 minutes de digestion, ajouter 100 ul de 10 mg / ml de DNase I à une concentration finale d'environ 1 mg / ml.
- En utilisant une pipette en verre de Pasteur polie au feu, triturer doucement les tissus par aspiration et refoulement 5-10x. Juste après trituration, étancher la trypsine avec 2 ml de placage milieu Neurobasal (avec 10% de FBS, 2 mM de Glutamax, 2% de B27).
- Laisser l'échantillon dans la hotte pendant 5 minutes pour permettre à tous les débris des tissus de s'installer au fond. Retirez délicatement 2 ml de surnageant dans un tube de 15 ml conique stérile et centrifuger à 200 g pendant 5 min pour sédimenter les cellules. Reprendre le culot dans 50 ul placage médias
- Compter les cellules avec un hémocytomètre. Charge de 15 à 20 ul de suspension cellulaire (~ 40 000 cellules) dans un compartiment de la chambre microfluidique. Placer la chambredans l'incubateur pendant 10 min pour permettre aux cellules de se fixer à la lamelle. Après 10 min, ajouter des médias plus placage de remplir les deux compartiments de la chambre.
- Le deuxième jour de la dissection, remplacer complètement les milieux d'étalement avec support de maintien (Neurobasal avec Glutamax 2 mM, 2% de B27) à la fois dans le corps de la cellule et le compartiment de l'axone. Les axones des neurones de l'hippocampe commencent à traverser les microsillons dans les jours 3 et atteindre le compartiment axone entre le jour 5-7. Au cours de cette période de temps, remplacer la moitié du milieu de culture avec des milieux d'entretien frais tous les 24 ~ 48 h.
4. axonale Transport de QD-BDNF
- Avant de vivre l'imagerie de QD-BDNF transport axonal, épuiser BDNF à la fois du corps cellulaire et l'axone compartiments de la chambre microfluidique par rincer soigneusement les deux compartiments avec BDNF-libres, du milieu sans sérum Neurobasal toutes les 30 min pendant 2 h.
- Au cours de BDNF épuisement, préparer les conjugués QD-BDNF. Mélanger 50 nM de mono-biotinylé BDNF dimère avec 50 nM conjugués QD655-streptavidine dans les médias Neurobasal et incuber sur de la glace pendant 60 min.
- Retirez le support dans le compartiment axone et ajouter 300 ul QD-BDNF avec une concentration finale de 0,25 nM pendant 4 heures à 37 ° C. Pour réduire au minimum le diffuseur de QD-BDNF dans le compartiment du corps de la cellule, il est très important de maintenir toujours un niveau supérieur de support dans le compartiment du corps de la cellule que dans le compartiment de l'axone. Laver non lié QD-BDNF après incubation avant l'imagerie en direct.
- Faire de l'imagerie en temps réel des transports QD-BDNF l'aide d'un microscope inversé équipé d'une huile 100X objectif. Chauffer le cadre et la chambre de l'environnement qui s'y rattachent à une température constante (37 ° C) et CO 2 (5%). Utilisez un ensemble de Texas cubes rouge d'excitation / émission de visualiser le signal de QD655.
- Acquérir et capturer des images en accéléré dans les axones moyen à la vitesse de 1 image / s pour un total de 2 min à l'aide d'une caméra CCD. Utilisez microsillons sans axones that n'ont pas QD et donc aucun signal de contrôle pour l'infiltration.
- Analyser le transport du BDNF utilisant n'importe quel logiciel d'analyse d'image ou NIH ImageJ.
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Representative Results
Production et purification de biologiquement active BDNF Mono-biotinylé
Le vecteur d'expression de BDNF fusionnée avec une séquence AviTag (GGGLNDIFEAQKIEWHE) a été réalisé selon un protocole précédemment publié 10. La masse moléculaire de la protéine de fusion pleine longueur a été prévue pour être ~ 32 kDa ( http://ca.expasy.org/tools/pi_tool.html ) monobiotinylé BDNF mûr avec une masse moléculaire prédite de 18 kDa (Figure 1A) a été produit dans les cellules HEK293FT et purifiée à partir de milieux conditionnés comme décrit 10.
Les différentes fractions ont été recueillies et séparées sur SDS-PAGE à 15%. Utilisation d'un anticorps anti-Avi d'étiquette de lapin, une bande ayant un poids moléculaire d'environ 18 kDa a été détectée dans la première fraction (figure 1B). Pour tester la pureté de la préparation, les échantillons ont été séparés sur SDS-PAGE et ont été colorées par deilver-coloration. Comme le montre la figure 1C, la bande de 18 kDa était l'espèce prédominante dans la première élution. Perles de streptavidine-agarose essais déroulants ont été réalisées pour évaluer l'ampleur de biotinylation de la préparation mBtBDNF. Suite déroulant avec des billes de streptavidine-agarose, les protéines qui restaient dans le surnageant ont été précipités avec de l'acide trichloroacétique à 7% (TCA). Ces échantillons ont été analysés par SDS-PAGE et les transferts ont été sondés avec un anticorps anti-anticorps Avi (en haut) à détecter la protéine totale ou de la streptavidine-HRP pour détecter les protéines biotinylées. Les résultats présentés que tous les signaux sont associés à des perles tandis qu'aucune bande n'a été détectée dans le surnageant (Figure 1D). Nous concluons donc que mBtBDNF a été biotinylé à une efficacité> 99,9%.
Pour tester l'activité biologique de mBtBDNF à lier et d'activer le récepteur de TrkB, nous avons traité une lignée 3T3 cellulaire qui exprime TrkB avec soit rhBDNF (20 ng / ml) ou purified mBtBDNF (20 ng / ml) pendant 10 min. Les cellules qui n'ont pas reçu de traitement ont également été recueillies dans le contrôle. Les lysats ont été séparés sur SDS-PAGE à 4-12% et un anticorps anti-lapin pTrkB a été utilisé pour sonder la TrkB phosphorylée. Comme le montre la figure 1E, semblable à rhBDNF, mBtBDNF était capable d'induire la phosphorylation de TrkB à un niveau similaire. On a également traité les neurones hippocampiques de rat avec soit rhBDNF (20 ng / ml) ou mBtBDNF purifié (20 ng / ml) pendant 48 heures. MBtBDNF purifiée était capable de stimuler la croissance des neurites de l'hippocampe dans la mesure de rhBDNF (Figure 1F). Pour examiner la co-localisation de BDNF avec QD-récepteur de TrkB, QD-BDNF a été ajouté à axone hippocampe de rat pendant 4 h à 37 ° C. Les neurones ont ensuite été fixées et immunocolorées pour TrkB. Comme représenté sur la figure 1G, QD-BDNF co-localisée avec TrkB. Nous concluons donc que mBtBDNF est pleinement active dans sa fonction biologique.
Imagerie en direct de axonal transport des QD-BDNF in neurones de l'hippocampe
Neurones hippocampiques de rat embryonnaires primaires (E17-18) ont été disséqués et étalées dans le compartiment du corps de la cellule de la chambre microfluidique. Au jour 4 ou 5, les axones étendus à travers les micro-rainures dans le compartiment de l'axone. Au jour 7, la plupart des axones ont augmenté dans le compartiment de l'axone. QD-BDNF a été faite par incubation de la streptavidine avec QD655 mBtBDNF à un rapport 1: 1 (QD: BDNF dimère) sur de la glace pendant 1 heure. QD-BDNF (0,25 nM) a été ensuite ajouté au compartiment de l'axone et incubé pendant 4 heures à 37 ° C avant d'imagerie (figure 2A).
Après l'incubation, QD-BDNF a été trouvé à se lier spécifiquement à des axones dans le compartiment de l'axone. Dans le compartiment de corps de la cellule, des signaux QD ont été accumulés dans la plupart des axones proximaux et les corps cellulaires indiquant le QD-BDNF a été internalisé dans les axones et transport rétrograde de corps cellulaires. Time-lapse série d'images de signaux QD-BDNF dans les axones ont été réalisées dans les microsillons. QD signals ont été observés dans la plupart des micro-rainures avec les axones en l'absence de signal QD peut être vu dans les micro-rainures à l'absence d'axones, indiquant peu ou pas de diffusion de signaux une fois par jour à partir du compartiment des axones dans le compartiment du corps de la cellule (figure 2B).
Dans la figure 2C, un long segment de 80 um d'axones des neurones de l'hippocampe ont été fluorescence enregistré pendant 100 secondes. Total de 6 signaux QD-BDNF ont été clairement vu lors de l'enregistrement vidéo. Trois fois par jour de manière unidirectionnelle des signaux enregistrés déplacés vers le corps de la cellule (côté gauche). L'événement QD marqué par la flèche blanche (t: 31 sec à t: 101 sec) déplacé sans à-coup sur le corps de la cellule en traversant la totalité du champ de ~ 70 sec. Un autre événement QD marqué par la flèche verte (t: 1 s à t: 61 sec) propose rétrograde en premier. A t: 21 sec, la QD-BDNF déplacé anterogradely pendant 10 à 20 secondes, et ensuite de nouveau modifié direction vers le corps de la cellule. L'événement QD marqué par la flèche jaune (t: 1 s à t: 71 sec) également déplacé rétrograde ely, mais s'arrêta ~ 20 sec pendant le mouvement. QD-BDNF qui ne bougent pas pendant cette 100 secondes ont été considérés comme stationnaire. Seuls les objets mobiles ont ensuite été analysés pour calculer vitesse de déplacement, la vitesse moyenne et le temps s'arrêta.
Analyse des données dans QD-BDNF Transports kymographe
Kymographs ont été créés à partir de chaque vidéo enregistrée en utilisant un logiciel Metamorph. Comme le montrent les kymographs représentatifs de transport QD-BDNF (figure 3A), les mouvements QD-BDNF ont été enregistrés pendant 120 sec à 80 um d'un long segment des axones. Dans kymographe représentant 1, QD-BDNF s'est déplacé rapidement et en douceur vers la gauche (corps cellulaire), a traversé le terrain (80 pm) en ~ 60 sec, avec de très courtes pauses (supportant la vidéo S1). Alors que dans kymographe représentant 2, un QD-BDNF voyage ~ 50 um de 120 secondes de façon rétrograde, avec au moins trois segments de pauses plus longues (indiqué par des flèches) (Vidéo appui S2).
contenu "> Figure 3B est le diagramme de dispersion de la vitesse de déplacement, vitesse moyenne, et s'arrêta le temps de chaque unique QD-BDNF. La vitesse de déplacement de la QD-BDNF a été relativement rapide, allant de 0,47 à 1,97 um / s à la moyenne des 1,06 ± 0,05 um / s. La vitesse moyenne de QD-BDNF a été calculé comme la distance de déplacement / temps utilisé. Et parce que le BDNF pause pendant son transport, la vitesse moyenne est beaucoup plus faible que la vitesse de déplacement avec une moyenne de 0,48 ± 0,03 um / s (allant 0,17 à 1,59 um / s). temps pause a également été analysé comme une caractérisation du mouvement BDNF. La durée moyenne des pauses était de 15,88 ± 1,30 s (allant de 6 à 33 sec) (tableau 1).
Figure 1 Purification de la diversité biologique actif, monobiotinylé BDNF (mBtBDNF). (A) Une représentation schématique montre la production de mBtBDNF. Les deux pré-proBDNFavi et BirA ont été clonés dans le pcDNA3.1myc-son vecteur tel que décrit 10. (B) différentes fractions d'éluats de Ni-résine ont été recueillis et séparés sur un gel SDS-PAGE à 15%. Un anticorps anti-étiquette Avi lapin a été utilisé dans le transfert. Une bande ayant un poids moléculaire apparent d'environ 18 kDa a été reconnu dans l'éluat, en accord avec la masse moléculaire prédite de la protéine mature mBtBDNF. Gel de coloration (C) A d'argent indique la 18 kDa mBtBDNF était l'espèce prédominante dans la fraction d'élution. (D) purifiée mBtBDNF a été incubé avec des billes de streptavidine-agarose. Les billes ont été lavées et bouillies dans du tampon de charge SDS tandis que le surnageant a été précipité avec du TCA avant l'analyse SDS-PAGE. L'empreinte a été sondée avec soit l'anticorps anti-Avi ou avec HRP-streptavidine. A été ajouté (e) 20 ng / ml de mBtBDNF purifié rhBDNF ou à une ligne de cellules 3T3 qui expresses TrkB pendant 10 min. Les lysats ont été recueillis et séparés sur SDS-PAGE à 4-12%. Contrôle de lysat cellulaire a également été analysée. L'empreinte a été sondée avec un anticorps anti-lapin pTrkB. TrkB total a été révélée en utilisant un anticorps anti-TrkB souris. A été ajouté (F) 20 ng / ml de mBtBDNF purifié ou rhBDNF de neurones de l'hippocampe de rat pendant 48 heures. Images DIC ont été prises pour analyser la croissance des neurites. (G) QD-BDNF a été incubée avec l'hippocampe de rat axones des neurones pour 4 heures (barre d'échelle 5 um). Les neurones ont ensuite été fixées et immunocolorées pour TrkB.
. Figure 2 molécule unique d'imagerie de transport rétrograde de QD-BDNF dans les axones (A) Vue d'en haut: Un dessin schématique de la chambre microfluidique avec les neurones primaires plaqués dans le compartiment du corps cellulaire. Les axones ont grandi à travers le microgtoits dans le compartiment de l'axone. QD655 BDNF marqué a été ajouté au compartiment de l'axone. Vue de côté: le niveau de support dans le compartiment axone a été maintenu plus bas que le compartiment de corps de la cellule afin de minimiser la diffusion d'un signal QD. (B) des images de fluorescence rouge et des images DIC compartiment de corps de la cellule, microsillons et le compartiment de l'axone. QD-BDNF lié spécifiquement aux axones, intériorisé, et transport rétrograde des corps cellulaires le long des axones. Pas de signal de QD a été observée dans les microsillons absents des axones. (C) Time-lapse image vidéo série de transports QD-BDNF long de l'axone. Les deux signaux stationnaires QD-BDNF déplacement et étaient présents dans la plupart des films. A l'instant t: 1 sec, au moins 4 points quantiques peuvent être vus. Après 10 secondes, deux boîtes quantiques (indiqués par des flèches vertes et jaunes) se déplacent vers le corps cellulaire (à gauche de l'image). Ces deux points quantiques se déplacent et s'arrêtent dans les deux premières images et finalement à sortir des images vers la gauche (à ~ 70 sec). Un autre QD déplacé dans le champà t: 31 sec (indiqué par la flèche blanche) et agi rapidement sans trop de pauses à gauche.
Figure 3 QD-BDNF kymographe et les données de transport analyse. (A) kymographs représentatifs de transport QD-BDNF dans les neurones hippocampiques primaires. Dans KYMO 1, un QD lumineux a traversé le terrain à une vitesse relativement rapide avec seulement quelques courtes pauses. Dans KYMO 2, la vitesse de déplacement des boîtes quantiques a été plus lente, et le mouvement a été interrompu par des pauses plus fréquentes et plus longues. (B) nuage de points de QD-BDNF la vitesse de déplacement, la vitesse moyenne (calculée comme la distance de déplacement / temps utilisé) et une pause de temps. La vitesse de déplacement moyenne de QD-BDNF a été de 1,06 ± 0,05 um / s (allant de 0,47 à 1,97 um / s. La vitesse moyenne de QD-BDNF était de 0,48 ± 0,03 um / s (allant de 0. 17 à 1,59 um / sec). La durée moyenne des pauses était de 15,88 ± 1,30 s (allant de 6 à 33 sec).
Soutenir Vidéo S1 . Représentant QD-BDNF transports vidéo 1 Plusieurs QD-BDNF déplacer rapidement vers le côté gauche (corps cellulaire) avec très peu de courtes pauses.
Soutenir vidéo S2 . Représentant QD-BDNF transports vidéo 2 Plusieurs QD-BDNF déplacer relativement lente vers le côté gauche (corps cellulaire) avec des pauses fréquentes et longues.
| Minimum | Maximum | Signifier | 88px; ".> Std erreur||
| Vitesse de déplacement (microns / s) | 0,47 | 1,97 | 1,06 | 0,05 |
| La vitesse moyenne (micron / sec) | 0,17 | 1,59 | 0,48 | 0,03 |
| Temps de pause (s) | 6 | 33 | 15,88 | 1,30 |
Tableau 1 Analyse des données du transport QD-BDNF.
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Discussion
Dans cette étude, nous rapportons le développement d'une nouvelle technique pour produire biologiquement active, monobiotinylé BDNF (mBtBDNF) qui peut être utilisé pour tracer le transport axonal de BDNF. En conjuguant la protéine de quantum dot de la streptavidine, et en utilisant une chambre microfluidique, le procédé permet de détecter le transport axonal de BDNF dans les neurones primaires avec sensibilité molécule unique, en temps réel et avec une résolution spatiale et temporelle. Les outils utilisés dans ce document fournissent un moyen par lequel l'étude des machines moléculaires qui interviennent dans le transport axonal de BDNF / TrkB endosomes de signalisation dans les neurones dans la santé et la maladie.
BDNF-GFP, ou -mCherry ont été utilisées pour suivre les mouvements des axones de BDNF dans diverses cultures neuronales in vitro. Ces réactifs offrent une option pour l'examen de transport antérograde et, éventuellement, de l'examen d'activation autocrine de TrkB. Cependant, il ya des inconvénients majeurs pour étudier le transport rétrograde, la plus marquants de which est que la GFP ou mCherry sont pas assez brillant pour les études de molécules uniques. Des études antérieures ont montré que dans des concentrations physiologiques de NGF, un seul dimère de NGF a été intériorisée 11 et transport rétrograde 8. Surtout, l'utilisation de BDNF QD permet également de définir la localisation sous-cellulaire à laquelle se lie le BDNF ses récepteurs TrkB. En utilisant la GFP ou des protéines mCherry-marqués, expression autosomique se traduira par la présence au sein de l'axone des protéines subissant antérograde et rétrograde ainsi que le transport. En tant que tel, il peut être difficile d'évaluer si oui ou non ou si rétrograde transporté BDNF a rencontré son récepteur avant de rétrograder transport. En effet, tant que la spéculation, le transport rétrograde à l'intérieur des axones de BDNF-GFP ou BDNF mCherry-produit de la même neurone peut différer de celle qui suit la liaison de BDNF dans la cible de l'innervation.
Bien que la réticulation chimique a été utilisé pour produire biologiquement active du facteur de croissance de nerf(NGF), le procédé présenté ici est supérieure. Tout d'abord, il est difficile de contrôler avec précision le degré de biotinylation; par exemple, chaque NGF a été marqué avec de la biotine 5-9 groupements 8,9,12. Deuxièmement, la réticulation peut inactiver la protéine. Dans le cas de NGF, la réticulation a nécessité la fixation de groupes carboxyle 13. Dans le cas de BDNF, l'activité est souvent perdue suivant la reticulation chimique de la biotine. Enfin, le degré de reticulation peut être incomplète. Un rapport récent a montré que ~ 0,8 biotine / molécule BDNF a été produit par réticulation chimique; en tant que tel ~ 20% de BDNF n'a pas été marqué 9. La présence de non marquée BDNF pourrait compliquer l'interprétation des résultats.
Notre technique offre des avantages uniques qui sont tous des molécules de BDNF marqué avec une biotine unique sur le même site, ce qui constitue une préparation homogène de BDNF biotinylé. En conjuguant à des particules de nanofluorescent tels que des points quantiques, peut être mBtBDNFutilisé pour le suivi des voies et des processus que le BDNF est internalisée, victimes de la traite dans les neurones: dans les dendrites, axones ainsi que dans les corps cellulaires. Ce procédé rend possible l'utilisation de mots-clés de rechange pour le BDNF. Le développement d'autres types de nanoparticules promet des avantages supplémentaires.
Des défauts dans le trafic axonal et la signalisation du BDNF ont été impliqués dans les maladies neurodégénératives. Des preuves solides a lié le transport défectueux de BDNF à une atrophie corticale-striatale dans la maladie de Huntington 14,15. Protéine huntingtine mutante interfère avec l'interaction entre la huntingtine-associated protein-1 (HAP1) et le moteur de la dynéine dans les neurones sympathiques, inhibe le transport du BDNF, et entraîne une perte de support neurotrophique et la toxicité neuronale de 16 à 18. Nos techniques de suivi des déplacements axonale de BDNF peut servir comme un outil précieux pour étudier la fonction axonale dans les maladies neurodégénératives.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier Yue (Pauline) Hu, Rachel Sinit pour leur assistance technique. L'étude est soutenue par de subvention du NIH (PN2 EY016525) et par le financement de la recherche et du syndrome de Down Treatment Foundation et la Fondation Larry L. Hillblom.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Platinum pfx DNA polymerase | Invitrogen | 11708021 | |
| EcoRI | Fermentas | FD0274 | |
| BamHI | Fermentas | FD0054 | |
| HEK293FT cells | Invitrogen | R70007 | |
| DMEM-high glucose media | Mediatech | 10-013-CV | |
| D-biotin | Sigma | B4639 | |
| TurboFect | Fermentas | R0531 | |
| PMSF | Sigma | P7626 | |
| Aprotinin | Sigma | A6279 | |
| Ni-NTA resins | Qiagen | 30250 | |
| Protease inhibitors cocktail | Sigma | S8820 | |
| Silver staining kit | G-Biosciences | 786-30 | |
| Human recombinant BDNF | Genentech | ||
| Microfluidic chambers | Xona | SND450 | |
| 24 x 40 mm No. 1 glass coverslips | VWR | 48393-060 | |
| Poly-L-Lysine | Cultrex | 3438-100-01 | |
| HBSS | Gibco | 14185-052 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| FBS | Invitrogen | 16000-044 | |
| GlutaMax | Invitrogen | 35050-061 | |
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| QD655-streptavidin conjugates | Invitrogen | Q10121MP | |
| anti-Avi tag antibody | GenScript | A00674 | |
| streptavidin-agarose beads | Life Technology | SA100-04 | |
| Trichloroacetic acid | Sigma | T6399 | |
| HRP-streptavidin | Thermo Scientific | N100 | |
| anti-pTrkB antibody | a generous gift from Dr M. Chao of NYU | ||
| anti-TrkB antibody | BD Science | 610101 |
References
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