Summary
תחבורת axonal של BDNF, גורם neurotrophic, היא קריטית להישרדות והתפקוד של כמה אוכלוסיות נוירונים. כמה הפרעות ניווניות מסומנות על ידי שיבוש של מבנה ותפקוד עצב. אנחנו הדגמנו את הטכניקות המשמשות לבחינת סחר בחיות של QD-BDNF בתאי microfluidic באמצעות נוירונים עיקרי.
Abstract
BDNF ממלא תפקיד חשוב בכמה היבטים של הישרדות, בידול, ותפקוד עצביים. גירעונות מבניים ותפקודיים באקסונים נתפסים יותר ויותר כתכונה מוקדמת של מחלות ניווניות, כוללים מחלת אלצהיימר (AD) ומחלת הנטינגטון (HD). עדיין לא ברור הוא המנגנון (ים) שבו פציעת axonal מושרה. אנחנו דיווחו על ההתפתחות של שיטה חדשנית לייצור פעיל מבחינה ביולוגית, monobiotinylated BDNF (mBtBDNF) שניתן להשתמש בי להתחקות תחבורת axonal של BDNF. BDNF שכותרתו נקודה קוונטית (QD-BDNF) הופק על ידי והטה נקודה קוונטית 655 לmBtBDNF. מכשיר microfluidic שימש לבודד את האקסונים מגופי תא נוירון. תוספת של QD-BDNF לתא axonal אפשרה הדמיה חיה של תחבורת BDNF באקסונים. אנחנו הוכיחו כי QD-BDNF עבר בעצם באופן בלעדי retrogradely, עם מעט מאוד הפסקות, במהירות הנעה של כ 1.06 מיקרומטר / sec. מערכת זו יכולה לשמש כדי לחקור אותיchanisms של פונקציה שיבשו axonal בספירה או HD, כמו גם הפרעות ניווניות אחרות.
Introduction
נוירונים מקוטבים מאוד תאי תהליכים שארוכים, ולעתים קרובות הרחיב מאוד הם יסוד להקמה ולשמירה על המבנה והתפקוד של מעגלים עצביים. האקסון ממלא תפקיד חיוני בביצוע מטענים אל ומסינפסות. חלבונים ואברונים מסונתזים בסומה התא צריכים להיות מועברים דרך האקסונים להגיע מסוף presynaptic לתמוך תפקוד עצבי. במקביל, אותות המתקבלים באקסונים דיסטלי צריכים להיות transduced והועברו לסומה. תהליכים אלה הם חיוניים להישרדות עצבית, בידול, ותחזוקה. שבהובלת axonal בכמה נוירונים חייבת להתנהל דרך מרחקים יותר מ -1,000 פעמים הקוטר של גוף התא, את האפשרות שנחזתה בקלות שגם גירעונות קטנים יכולים במידה ניכרת להשפיע תפקוד עצבי ומעגל.
המופק ממוח גורם neurotrophic (BDNF), חבר של משפחת neurotrophin של גורמי גדילה, הוא בהווה בmaאזורי ניו יורק במוח, כולל ההיפוקמפוס, קליפת מוח, ומוח קדמי בסיסי. BDNF ממלא תפקיד מכריע בהיווצרות הכרה וזיכרון על ידי תמיכה בהישרדות, בידול, והתפקוד של תאי עצב המשתתפים במעגלים קוגניטיביים. BDNF נקשר לקולטן שלו, TrkB טירוזין קינאז, במסוף האקסון שבו מפעיל מסלולי איתות בתיווך TrkB כוללים חלבון קינאז מופעל mitogen / קינאז תאי מוסדר אות החלבון (MAPK / Erk), phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K) ופוספוליפאז C-gamma (PLCγ). החלבונים המשתתפים במסלולי איתות אלה ארוזים על גבי מבני לפוחי endocytic כדי ליצור את BDNF / TrkB איתות endosome 1-6 שלאחר מכן הובל retrogradely לסומה העצבית.
חדר תרבות microfluidic הוא פלטפורמה מאוד שימושית לחקר הביולוגיה axonal בתנאים רגילים, כמו גם בהגדרה של 7,8 פציעה והמחלה. על ידי אקסונים בידודמהגופים התא, המכשיר אפשר אחד ללמוד תחבורה במיוחד באקסונים 8-10. פלטפורמות microfluidic מבוססות PDMS עם 450 מיקרומטר מחסומי microgroove שימשו במחקר זה נרכשו באופן מסחרי (ראה טבלת חומרים). כדי לבחון תחבורת BDNF, שפיתחנו טכנולוגיה חדשנית לייצור BDNF monobiotinylated (mBtBDNF). אנחנו ניצלנו את הפפטיד acceptor ביוטין, AP (הידוע גם בAviTag). זה רצף חומצות אמינו המכיל 15 שאריות ליזין שניתן ligated במיוחד כדי ביוטין על ידי האנזים Escherichia coli ביוטין האנזים, בירה. אנחנו התמזגו AviTag לC-הסופי של העכבר מראש proBDNF cDNA על ידי PCR (איור 1 א). המבנה שובט לתוך וקטור הביטוי של יונקים, myc-וקטור pcDNA3.1. אנחנו גם משובטים DNA בירה החיידקים לתוך myc-וקטור pcDNA3.1. שני פלסמידים היו זמניים במשותף transfected לתאי HEK293FT לבטא שני החלבונים. בירה הייתה זרז לקשירה של ביובאופן ספציפי ליזין מתגורר בתוך AviTag בC-הסופי של BDNF ב1: 1 יחס לתוצרת monobiotinylated מונומר BDNF. Biotinylated, להתבגר BDNF עם מסה מולקולרית של ~ 18 kDa היה התאושש ומטוהר מהתקשורת באמצעות Ni-שרף (איור 1 ג). Biotinylation של BDNF היה מלא, כמו להישפט על ידי חוסר היכולת לזהות BDNF ללא שינוי על ידי immunoblotting (1D איור). נקודות streptavidin מצומדות קוונטים, QD 655, שמשו לתייג mBtBDNF לעשות QD-BDNF. הנוכחות של AviTag לא להפריע לפעילות של BDNF כmBtBDNF הייתה מסוגלת להפעיל TrkB פוספורילציה (איור 1E) ולעורר תולדת neurite (איור 1F) בהיקף של BDNF רקומביננטי האנושי (rhBDNF). Immunostaining הראה כי QD-BDNF colocalized עם TrkB באקסונים בהיפוקמפוס, המצביע על כך QD-BDNF הוא ביו (איור 1G). ללמוד תחבורת BDNF, QD-BDNF התווסף לתא האקסון הדיסטלי שלתרבויות microfluidic מכילות חולדה נוירונים בהיפוקמפוס (איור 2 א) E18. תחבורה מדרדר QD-BDNF בתוך האקסונים נתפסה על ידי הדמיה חיה בזמן אמת של תג הניאון האדום (S1 תמיכת קטעי וידאו, S2). על ידי ניתוח רשם גלים שנוצרו, QD-BDNF נצפה להיות מועבר retrogradely במהירות מרגשת של כ 1.06 מיקרומטר / sec (איור 3 א). GFP או BDNF מתויג mCherry היה בשימוש כדי לעקוב אחר תנועת axonal של BDNF. החסרונות העיקריים הם שהם לא בהירים מספיק ללימודי מולקולה בודדים. כמו כן, הנוכחות של שני אנטרוגדית ותנועות BDNF המדרדר עושה את זה קשה להעריך האם או לא BDNF מועבר retrogradely היה במתחם neurotrophin / קולט.
בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את הטכניקות המשמשות לבחינת סחר בחיות של QD-BDNF בתאי microfluidic באמצעות נוירונים עיקרי. Ultrabrightness וphotostability מצוין של Mak נקודות קוונטיותes זה ניתן לבצע מעקב ארוך טווח של תחבורת BDNF. ניתן לנצל את הטכניקות הללו כדי לשפר את הלימודים של פונקצית axonal בספירה, HD, והפרעות ניווניות אחרות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הליכים כירורגיים ובעלי החיים מתבצעים אך ורק על פי מדריך NIH לטיפול ושימוש בחי מעבדה. כל הניסויים בתחום השימוש בבעלי החיים אושרו על ידי UCSD המוסדי טיפול בבעלי חיים ועדת שימוש.
.1 פלסמיד שיבוט, ביטוי וטיהור של BDNF biotinylated-Mono (mBtBDNF)
הערה: לבנות מראש proBDNFavi והבירה cDNA לתוך וקטור pcDNA3.1 וcoexpress בתאי HEK293FT 10. לטהר mBtBDNF באמצעות חרוזים Ni-נ.ת. ע על פי שיטה שפורסמה בעבר לייצר גורם בוגר ופעיל ביולוגי גדילה העצבית monobiotinylated (mBtNGF) 10.
2 הכנת לשכות Microfluidic
מכשיר culturing נוירון microfluidic מאפשר לבודד את fluidically האקסונים מגופי תא נוירון. להרכיב תאים עם coverslips טרי מצופה נכון לפני כל נתיחה. תאי microfluidic משמשיםבפרוטוקול זה נרכש באופן מסחרי (ראה חומרים ושולחן של הציוד). כביסה ביד ותאים לרכוש מסחרי לשימוש חוזר עד 5-6x.
- לשטוף ידיים תאי microfluidic ב1% Alconox. לשטוף שלוש פעמים עם מים מילי- Q ל30 דקות כל אחד. תאים לשטוף ידיים שוב ב70% אתנול.
- להוציא תאים לייבוש על Parafilm בזרימה למינרית. להקרין ולעקר את שני הצדדים של התאים עבור 20 דקות תחת UV. חנות מעוקרת תאים בצלחת 15 סנטימטר סטרילי החתומה עם Parafilm בטמפרטורת חדר.
- הנח 24 x 40 coverslips מ"מ זכוכית מס '1 במכל זכוכית. משרים את coverslips ב35% חומצת hydrochloride לילה על הכתף. ביום למחרת, לשטוף את coverslips שלוש פעמים ל30 דקות כל אחד עם מים.
- לעקר את coverslips אחד אחד על ידי טבילת כל coverslip ל100% אתנול ובוער מעל מבער בונזן. אחסן coverslips היבש בצלחת פטרי סטרילית ולשמור אותו בטמפרטורת חדר עד ציפוי.
- הנח out coverslips בצלחת תרבות 15 סנטימטר. מעיל כל coverslip עם 0.7 מ"ל של 0.01% פולי-L-ליזין (PLL) ו דגירה במכסת המנוע בטמפרטורת חדר.
- אחרי שעה 1, לשטוף את coverslips שלוש פעמים עם מים סטריליים. coverslips יבש עם ואקום ומקום כל coverslip לתוך צלחת תרבות 6 סנטימטר.
- כדי להרכיב את תא microfluidic, למקם את החדר עם צד microgroove בתחתית על coverslip המצופה PLL בזהירות לא לגעת בmicrogrooves. לחץ בעדינות את התא עם קצה פיפטה כדי להבטיח את התא היה סגור היטב.
.3 Dissection עצבי תרבות ופלייט על צ'יימברס
- מניחים שתי hippocampi E17-E18 חולדה (מוח אחד) גזור בצינור חרוטי 15 מ"ל המכיל 2 מ"ל חיץ דיסקציה (HBSS, אין סידן, לא מגנזיום, עם 1% עט / סטרפטוקוקוס ו10 HEPES מ"מ. שוטפים את הרקמות 3x עם 5 מ"ל נתיחת חיץ בכל פעם. הסר את החוצץ לנתיחה ככל האפשר ולהוסיף 900 μl של di הטריחיץ ssection.
- כדי לעכל את הרקמה, להוסיף של 10x טריפסין (2.5%) 100 μl למאגר לנתיחה כדי להפוך את ריכוז העבודה 1x. מניחים את צינור חרוטי באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. לאחר 10 דקות של עיכול, להוסיף 10 מ"ג / מ"ל DNase אני 100 μl לריכוז סופי סביב 1 מ"ג / מ"ל.
- בעזרת פיפטה זכוכית פסטר אש מלוטשת, בעדינות triturate הרקמות על ידי pipetting למעלה ולמטה 5-10x. מייד לאחר טחינה דקה, להרוות את טריפסין עם 2 מ"ל ציפוי בינוני (Neurobasal עם 10% FBS, 2 מ"מ Glutamax, B27 2%).
- השאר את המדגם במכסת המנוע למשך 5 דקות כדי לאפשר לכל פסולת של הרקמות להתיישב לתחתית. מוציא בזהירות 2 מ"ל של supernatant לתוך צינור נקי סטרילי 15 מ"ל חרוטי ו צנטריפוגות ב XG 200 במשך 5 דקות עד גלולה התאים. Resuspend גלולה ב50 תקשורת μl ציפוי
- ספירת התאים עם hemocytometer. עומס 15-20 השעיה μl תא (~ 40,000 תאים) לתוך תא אחד של חדר microfluidic. מניחים את החדרבחממה במשך 10 דקות, כדי לאפשר לתאים לצרף לcoverslip. לאחר 10 דקות, להוסיף מדיה ציפוי יותר כדי למלא את שני התאים של החדר.
- ביום השני של נתיחה, להחליף לחלוטין את תקשורת הציפוי עם תקשורת תחזוקה (Neurobasal עם 2 מ"מ Glutamax, B27 2%) בשני גוף התא ותא האקסון. האקסונים מתאי העצב בהיפוקמפוס להתחיל לחצות את microgrooves ביום 3 ולהגיע לתא האקסון בין היום 5-7. בתקופה זו של זמן, להחליף מחצית תקשורת culturing עם תקשורת תחזוקה טריות בכל שעה 24 ~ 48.
.4 Axonal תחבורה של QD-BDNF
- לפני גר הדמיה תחבורת axonal QD-BDNF, לרוקן BDNF משני גוף התא והאקסון תאים של חדר microfluidic על ידי ביסודיות לשטוף את שני התאים עם תקשורת BDNF ללא, סרום חופשית Neurobasal כל 30 דקות לשעה 2.
- במהלך דלדול BDNF, להכין conjugates QD-BDNF. מערבבים 50 ננומטר של BD מונו biotinylatedדימר NF עם 50 conjugates QD655-streptavidin ננומטר בתקשורת neurobasal ולדגור על קרח למשך 60 דקות.
- הסר את המדיה בתא האקסון ולהוסיף 300 μl QD-BDNF עם ריכוז סופי של 0.25 ננומטר במשך 4 שעות על 37 מעלות צלזיוס. כדי למזער את לשדר של QD-BDNF לתוך תא גוף תא, זה מאוד חשוב תמיד לשמור על רמה גבוהה יותר של תקשורת בתא גוף תא מאשר בתא האקסון. לשטוף QD-BDNF מאוגד לאחר דגירה לפני ההדמיה לחיות.
- לבצע הדמיה חיה של תחבורת QD-BDNF באמצעות מיקרוסקופ הפוכה מצוידת בעדשה אובייקטיבית שמן 100X. לחמם את ההיקף והתא הסביבתי קשור אליו לטמפרטורה קבועה (37 מעלות צלזיוס) וCO 2 (5%). השתמש בסט של קוביות עירור / פליטה האדומה טקסס כדי להמחיש את אות QD655.
- לרכוש וללכוד זמן לשגות תמונות בתוך האקסונים האמצע במהירות של 1 מסגרת / שנייה עבור הסכום כולל של 2 דקות באמצעות מצלמת CCD. microgrooves שימוש ללא האקסונים thaלא צריכים שום QD ולכן אין אות כביקורת לחדירה.
- לנתח תחבורת BDNF באמצעות כל תוכנת ניתוח תמונה או NIH ImageJ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ייצור וטיהור של BDNF מונו biotinylated פעיל ביולוגית
וקטור הביטוי של BDNF התמזגו עם רצף AviTag (GGGLNDIFEAQKIEWHE) נוצר על פי פרוטוקול שפורסם בעבר 10. המסה המולקולרית של חלבון היתוך באורך המלא הייתה צפויה להיות ~ 32V kDa (http://ca.expasy.org/tools/pi_tool.html) Monobiotinylated הבוגר BDNF עם מסה מולקולרית חזויה של 18 kDa (איור 1 א) הופק בתאי HEK293FT ומטוהר מתקשורת המותנה כפי שתואר 10.
שברים שונים נאספו והפרידו ב15% SDS-PAGE. באמצעות נוגדן ארנב נגד אבי תג, להקה עם משקל מולקולרי של ~ 18 kDa זוהו בחלק הראשון (איור 1). כדי לבדוק את טוהר של ההכנה, דגימות הופרדו על SDS-PAGE והוכתמו על ידי יםilver מכתים. כפי שניתן לראות בתרשים 1C, להקת kDa 18 הייתה המין השולט בelution הראשון. מבחני הנפתח חרוזים streptavidin-agarose בוצעו על מנת להעריך את היקף biotinylation של הכנת mBtBDNF. בעקבות הנפתח עם חרוזים streptavidin-agarose, חלבונים שנותרו בsupernatant היו זירז עם 7% חומצת trichloroacetic (TCA). דגימות אלה נותחו על ידי SDS-PAGE והכתמים נבדקו עם או נגד אבי נוגדנים (למעלה) כדי לזהות את החלבון המלא או HRP-streptavidin כדי לזהות חלבוני biotinylated. התוצאות שלנו הראו כי כל האותות היו קשורים עם חרוזים ואילו לא להקה התגלתה בsupernatant (1D איור). כך אנו מסיקים כי mBtBDNF היה biotinylated ביעילות> 99.9%.
כדי לבדוק את פעילותו הביולוגית של mBtBDNF במחייב והפעלת קולטן TrkB, התייחסנו שורת 3T3 תא שמבטאת TrkB עם או rhBDNF (20 ng / ml) או פורified mBtBDNF (20 ng / ml) עבור 10 דקות. תאים שלא קיבלו כל טיפול גם נאספו כשליטה. Lysates הופרד על 4-12% SDS-PAGE ונוגדן אנטי pTrkB ארנב שימש כדי לחקור את TrkB פוספורילציה. כפי שניתן לראות באיור 1E, דומה לrhBDNF, mBtBDNF היה מסוגלת לגרום לזירחון של TrkB ברמה דומה. אנחנו גם טופלו תאי עצב בהיפוקמפוס העכברוש עם או rhBDNF (20 ng / ml) או mBtBDNF מטוהר (20 ng / ml) ל48 שעות. המטוהר mBtBDNF הצליח לעורר תוצאה neurite בהיפוקמפוס בהיקף של rhBDNF (איור 1F). כדי לבחון את שיתוף הלוקליזציה של QD-BDNF עם קולט TrkB, QD-BDNF התווסף לעכברוש האקסון בהיפוקמפוס במשך 4 שעות ב 37 מעלות צלזיוס. נוירונים אז היו קבועים immunostained לTrkB. כפי שניתן לראות באיור 1G, QD-BDNF שיתוף מקומי עם TrkB. כך אנו מסיקים כי mBtBDNF הוא פעיל באופן מלא בתפקוד הביולוגי שלה.
הדמיה חיה של axonal תחבורה של QD-BDNF in נוירונים בהיפוקמפוס
נוירונים בהיפוקמפוס העכברוש עובריים ראשוניים (E17-18) נותחו ומצופים לתוך תא גוף תא של תא microfluidic. ביום 4 או 5, האקסונים השתרעו על פני microgrooves לתוך תא האקסון. ביום 7, רוב האקסונים גדלו לתוך תא האקסון. QD-BDNF נעשה על ידי דוגרים QD655 streptavidin עם mBtBDNF ב1: 1 (QD: דימר BDNF) על קרח במשך שעה 1. QD-BDNF (0.25 ננומטר) נוספו לאחר מכן לתא האקסון וטופחו במשך 4 שעות על 37 מעלות צלזיוס להדמיה (איור 2 א) לפני.
לאחר דגירה, QD-BDNF נמצא להיקשר באופן ספציפי לאקסונים בתא האקסון. בתא גוף תא, אותות QD נצברו ברוב האקסונים הפרוקסימלית וגופי תא המציינים את QD-BDNF הופנם באקסונים וretrogradely מועבר לגופי התא. סדרת זמן לשגות תמונה של אותות QD-BDNF בתוך האקסונים בוצעה בmicrogrooves. QD שלignals נצפה ברוב microgrooves עם אקסונים בזמן שאין אות QD ניתן לראות בmicrogrooves בנעדר של אקסונים, המצביעים על דיפוזיה מועטת או ללא אות QD מתא האקסון לתא גוף תא (איור 2).
באיור 2 ג, קטע ארוך 80 מיקרומטר של האקסונים של תאי עצב בהיפוקמפוס נרשם fluorescently ל100 שניות. סך הכל של 6 אותות QD-BDNF היה לראות בבירור בהקלטת וידאו. שלושה QD אותות נרשמו עברו בכיוון אחד לכיוון גוף התא (בצד שמאל). אירוע QD שכותרתו על ידי חץ לבן (t: ביום 31 בשניות לt: 101 שניות) עבר בצורה חלקה אל גוף התא חוצה את כל השדה ב~ 70 שניות. אירוע נוסף QD שכותרתו על ידי חץ ירוק (t: 1 שניות לt: 61 שניות) עבר retrogradely ראשונה. ב t: 21 שניות, QD-BDNF עבר anterogradely ל10 עד 20 שניות, ולאחר מכן שינה את הכיוון שוב לכיוון גוף התא. אירוע QD שכותרתו על ידי חץ צהוב (t: 1 שניות לt: 71 שניות) עבר גם retrograd איליי, אבל עצר ל~ 20 שניות במהלך התנועה. QD-BDNFs שלא זזו במהלך 100 שניות זה נחשבו נייח. רק עצמים נעים היו מאוחר יותר נותחו כדי לחשב את מהירות העברה, מהירות ממוצעת, והזמן מושהה.
ניתוח נתונים בQD-BDNF תחבורה רשם גלים
Kymographs נוצר מכל סרט שהוקלט באמצעות תוכנת Metamorph. כפי שניתן לראות בkymographs הנציג של תחבורת QD-BDNF (איור 3 א), תנועות QD-BDNF נרשמו במהלך 120 שניות בקטע ארוך 80 מיקרומטר של אקסונים. ברשם גלי נציג 1, QD-BDNF נע מהר וחלק לכיוון שמאל (גוף תא), חצה את השדה (80 מיקרומטר) ב~ 60 שניות, עם הפסקות קצרות מאוד (תמיכת וידאו S1). בעוד שברשם גלי נציג 2, נסע QD-BDNF ~ 50 מיקרומטר ב120 שניות retrogradely, עם לפחות שלושה מגזרים של הפסקות ארוכות יותר (מסומן בחצים) (תמיכה בווידאו S2).
תוכן "> איור 3 הוא עלילת הפיזור של נע מהירות, מהירות ממוצעת, ועצרו לרגע בזמן של כל QD-BDNF היחיד. המהירות המרגשת של QD-BDNF הייתה מהירה יחסית, הנע .47-1.97 מיקרומטר / sec עם הממוצע של 1.06 ± 0.05 מיקרומטר / sec. המהירות הממוצעת של QD-BDNF חושב שכנסע מרחק / זמן שימוש. ובגלל BDNF עצר במהלך הובלתה, מהירות ממוצעת הייתה נמוכה בהרבה ממהירות העברה עם ממוצע של 0.48 ± 0.03 מיקרומטר / שניות (הנע .17-1.59 מיקרומטר / sec). זמן מושהה גם ניתח כאפיון של תנועת BDNF. משך הממוצע של הפסקות היה 15.88 שניות ± 1.30 (החל 6-33 שניות) (טבלה 1).
איור 1 טיהור ביולוגית פעיל, BDNF monobiotinylated (mBtBDNF). () ציור סכמטי מציג את הייצור של mBtBDNF. שני מראש proBDNFavi והבירה היו משובט לתוך pcDNA3.1myc-הווקטור כ10 תיארו. (ב) שברים שונים של elutes מNi-שרף נאספו ומופרדים על 15% ג'ל SDS-PAGE. נוגדן תג ארנב נגד אבי היה בשימוש בכתם. להקה עם משקל מולקולרי לכאורה של ~ 18 kDa הוכרה בelute, עולה בקנה אחד עם המסה המולקולרית חזתה לחלבון הבוגר mBtBDNF. ג'ל צביעה (C) כסף מראה את 18 kDa mBtBDNF היה המין השולט בחלק elution. (ד) מזוקק mBtBDNF הודגרה עם חרוזים streptavidin-agarose. חרוזים נשטפו ומבושל בחיץ טעינת SDS בעוד supernatant היה זירז עם TCA לפני ניתוח SDS-PAGE. הכתם נבדק עם או נגד אבי נוגדן או עם HRP-streptavidin. (E) 20 ng / ml של mBtBDNF מטוהר או rhBDNF התווסף לשורת 3T3 תא שדוארxpresses TrkB עבור 10 דקות. Lysates נקצרו ומופרד על 4-12% SDS-PAGE. lysate תא הבקרה גם ניתח. הכתם נבדק עם נוגדן אנטי pTrkB ארנב. TrkB סה"כ נחשף באמצעות נוגדן אנטי TrkB עכבר. (F) 20 ng / ml של mBtBDNF מטוהר או rhBDNF התווסף לעכברוש נוירונים בהיפוקמפוס ל48 שעות. תמונות דסק"ש נלקחו לנתח תולדת neurite. (G) QD-BDNF הודגרה עם אקסונים נוירון היפוקמפוס חולדה ל4 שעה (סרגל קנה מידה 5 מיקרומטר). נוירונים אז היו קבועים immunostained לTrkB.
תצוגת איור 2 הדמיה מולקולה בודדת של תחבורה המדרדר של QD-BDNF באקסונים () למעלה:. ציור סכמטי של תא microfluidic עם נוירונים עיקרי המצופה בתא גוף תא. אקסונים גדלו על פני microgשגגות לתוך תא האקסון. BDNF QD655 שכותרתו התווסף לתא האקסון. מבט מצד: רמת התקשורת בתא האקסון נשמר נמוך מתא גוף תא כדי למזער דיפוזיה של אות QD. (ב) תמונות הקרינה אדומות ותמונות דסק"ש של תא גוף תא, microgrooves ותא האקסון. QD-BDNF קשור באופן ספציפי לאקסונים, הפנים, וretrogradely מועבר לגופי התא לאורך האקסונים. אין אות QD נצפתה בmicrogrooves היעדר של אקסונים. סדרת תמונת וידאו זמן לשגות של תחבורת QD-BDNF לאורך האקסון (C). מרגש ואותות QD-BDNF נייחים שניהם היו נוכחים ברוב הסרטים. בזמן t: 1 שניות, ניתן לראות לפחות 4 QDs. לאחר 10 שניות, שתי QDs (מסומן בחצים ירוקים וצהובים) נע לעבר גוף התא (משמאל בתמונה). שני QDs אלה לעבור ולהשהות בכמה תמונות הראשונות וסופו של דבר לעזוב את התמונות בצד השמאל (ב ~ 70 שניות). QD נוסף עבר לשדהב t: ביום 31 בשניות (מצויינים על ידי חץ לבן) ונע במהירות בלי הרבה הפסקות לשמאל.
איור 3 ניתוח רשם גלים תחבורה ונתונים QD-BDNF. () Kymographs נציג של תחבורת QD-BDNF בתאי עצב בהיפוקמפוס עיקרי. בkymo 1, QD בהיר עבר על פני השדה במהירות מהירה יחסית עם רק כמה הפסקות קצרות. בkymo 2, המהירות המרגשת של QDs הייתה איטית יותר, והתנועה נקטעה עם הפסקות תכופות יותר וארוכות יותר. העלילה (B) פיזור של QD-BDNF נעה מהירות, מהירות ממוצעת (מחושבת כנוסע מרחק / זמן בשימוש) ועצרה לרגע בזמן. מהירות ההעברה הממוצעת של QD-BDNF הייתה 1.06 ± 0.05 מיקרומטר / שניות (החל .47-1.97 מיקרומטר / sec. המהירות הממוצעת של QD-BDNF הייתה 0.48 ± 0.03 מיקרומטר / שניות (טווח שבין 0. 17-1.59 מיקרומטר / sec). משך הממוצע של הפסקות היה 15.88 שניות ± 1.30 (החל 6-33 שניות).
תמיכת וידאו S1. נציג QD-BDNF וידאו תחבורה .1 QD-BDNF כמה לנוע מהר לכיוון צד שמאל (גוף תא) עם מעט מאוד הפסקות קצרות.
תמיכת וידאו S2. נציג QD-BDNF וידאו תחבורה .2 QD-BDNF כמה להעביר איטי יחסית לכיוון צד שמאל (גוף תא) עם הפסקות תכופות וארוכות.
| מינימום | מקסימום | אומר | 88px; ".> Std שגיאה||
| נע מהירות (מיקרון / sec) | 0.47 | 1.97 | 1.06 | 0.05 |
| מהירות ממוצעת (מיקרון / sec) | 0.17 | 1.59 | 0.48 | 0.03 |
| זמן מושהה (שניות) | 6 | 33 | 15.88 | 1.30 |
טבלת 1 ניתוח נתונים של תחבורת QD-BDNF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במחקר זה, אנו מדווחים על הפיתוח של שיטה חדשנית לייצור פעיל מבחינה ביולוגית, monobiotinylated BDNF (mBtBDNF) שניתן להשתמש בי להתחקות תחבורת axonal של BDNF. על ידי להטות את החלבון לstreptavidin נקודה קוונטית, ובאמצעות תא microfluidic, השיטה מאפשרת לאדם לזהות תחבורת axonal של BDNF בנוירונים עיקרי עם רגישות מולקולה בודדת, בזמן אמת ועם רזולוציות מרחב ובזמן. הכלים המשמשים במסמך זה מספקים אמצעי שבאמצעותו כדי ללמוד את המכונות מולקולריות אשר מתווכות תחבורת axonal של BDNF / endosomes TrkB איתות בתאי עצב בבריאות ובחוליים.
BDNF-GFP, או -mCherry היה בשימוש כדי לעקוב אחר תנועת axonal של BDNF בתרבויות עצביות שונות במבחנה. ריאגנטים אלה מציעים אפשרות אחת לבחינת תחבורת אנטרוגדית ו, אולי, לבחינת הפעלת autocrine של TrkB. עם זאת, יש חסרונות עיקריים ללימוד תחבורה מדרדר, הבולטים ביותר של WHIch הוא שGFP או mCherry אינו בהיר מספיק ללימודי מולקולה בודדים. מחקרים קודמים הראו כי בריכוזים פיסיולוגיים של NGF, דימר NGF יחיד הופנם 11 והועבר 8 retrogradely. חשוב לציין, השימוש בQD BDNF גם מאפשר לאדם להגדיר את מיקום subcellular בי BDNF נקשר קולטנים TrkB. בבאמצעות GFP או חלבונים מתויגים mCherry, ביטוי somal יגרום נוכחות בתוך האקסון של חלבונים עוברים אנטרוגדית וגם תחבורת מדרדר. ככזה, הוא עלול להיות קשה להעריך האם או לא או שבו BDNF מועבר retrogradely נתקל קולטה לפני מדרדר תחבורה. ואכן, כספקולציה, תחבורה מדרדר בתוך האקסונים של BDNF-GFP או BDNF-mCherry מיוצרת באותו תא העצב יכולה להיות שונה מכי בעקבות מחייב של BDNF ביעד של עצבוב.
למרות crosslinking כימי נעשה שימוש לייצור גורם גדילה עצבית פעיל ביולוגי(NGF), השיטה הציגה במסמך זה הוא מעולה. ראשית, קשה לשלוט במדויק את היקף biotinylation; למשל, כל NGF תויג עם 5-9 moieties ביוטין 8,9,12. שנית, crosslinking יכול להשבית את החלבון. במקרה של NGF, crosslinking חייבו את הקובץ המצורף לקבוצות carboxyl 13. במקרה של BDNF, פעילות לעתים קרובות איבדה הבא crosslinking כימי לביוטין. לבסוף, היקף crosslinking עשוי להיות חלקי. דו"ח שפורסם לאחרונה הראה כי ~ 0.8 ביוטין / מולקולת BDNF הופקה על ידי crosslinking כימי; ככזה ~ 20% מBDNF לא שכותרתו 9. הנוכחות של BDNF ללא תווית עלולה לסבך את הפרשנות של תוצאות.
הטכניקה שלנו מציעה את היתרונות הייחודיים שמולקולות BDNF כל מתויגות עם ביוטין יחיד באותו האתר, ובכך הם מהוות הכנה הומוגנית של BDNF biotinylated. על ידי והטה לחלקיקי nanofluorescent כגון נקודות קוונטיות, mBtBDNF יכול להיותהמשמש למעקב אחר המסלולים והתהליכים שBDNF מופנם, נסחרים בתוך תאי עצב: בדנדריטים, אקסונים, כמו גם בגופי תא. שיטה זו מאפשר את השימוש בתגים חלופיים לBDNF. הפיתוח של סוגים אחרים של חלקיקים מבטיח הטבות נוספות.
פגמים בסחר ובאיתות של BDNF axonal היו מעורבים במחלות ניווניות. עדויות חזקות למקושרות תחבורה פגומה של BDNF לניוון קליפת המוח-striatal במחלת הנטינגטון 14,15. חלבון Huntingtin מוטציה מפריע לאינטראקציה בין קשורים Huntingtin החלבון-1 (HAP1) ומנוע dynein בנוירונים אוהד, מעכב תחבורת BDNF, ותוצאות באובדן תמיכת neurotrophic ורעילות עצבית 16-18. הטכניקות של תנועת axonal מעקב של BDNF שלנו יכולות לשמש ככלי רב ערך ללימוד פונקצית axonal בהפרעות ניווניות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
ברצוננו להודות ליואה (פאולין) הו, רחל Sinit לקבלת הסיוע הטכני שלהם. המחקר נתמך על ידי מענק NIH (EY016525 PN2) ועל ידי מימון מחקר תסמונת דאון וטיפול הקרן ולארי L. Hillblom הקרן.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Platinum pfx DNA polymerase | Invitrogen | 11708021 | |
| EcoRI | Fermentas | FD0274 | |
| BamHI | Fermentas | FD0054 | |
| HEK293FT cells | Invitrogen | R70007 | |
| DMEM-high glucose media | Mediatech | 10-013-CV | |
| D-biotin | Sigma | B4639 | |
| TurboFect | Fermentas | R0531 | |
| PMSF | Sigma | P7626 | |
| Aprotinin | Sigma | A6279 | |
| Ni-NTA resins | Qiagen | 30250 | |
| Protease inhibitors cocktail | Sigma | S8820 | |
| Silver staining kit | G-Biosciences | 786-30 | |
| Human recombinant BDNF | Genentech | ||
| Microfluidic chambers | Xona | SND450 | |
| 24 x 40 mm No. 1 glass coverslips | VWR | 48393-060 | |
| Poly-L-Lysine | Cultrex | 3438-100-01 | |
| HBSS | Gibco | 14185-052 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| FBS | Invitrogen | 16000-044 | |
| GlutaMax | Invitrogen | 35050-061 | |
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| QD655-streptavidin conjugates | Invitrogen | Q10121MP | |
| anti-Avi tag antibody | GenScript | A00674 | |
| streptavidin-agarose beads | Life Technology | SA100-04 | |
| Trichloroacetic acid | Sigma | T6399 | |
| HRP-streptavidin | Thermo Scientific | N100 | |
| anti-pTrkB antibody | a generous gift from Dr M. Chao of NYU | ||
| anti-TrkB antibody | BD Science | 610101 |
References
- Wu, C., et al. A functional dynein-microtubule network is required for NGF signaling through the Rap1/MAPK pathway. Traffic. 8, 1503-1520 (2007).
- Wortzel, I., Seger, R. The ERK Cascade: Distinct Functions within Various Subcellular Organelles. Genes & cancer. 2, 195-209 (2011).
- Huang, E. J., Reichardt, L. F. Trk receptors: roles in neuronal signal transduction. Annual review of biochemistry. 72, 609-642 (2003).
- Nonomura, T., et al. Signaling pathways and survival effects of BDNF and NT-3 on cultured cerebellar granule cells. Brain research. Developmental brain research. 97, 42-50 (1996).
- Weissmiller, A. M., Wu, C. Current advances in using neurotrophic factors to treat neurodegenerative disorders. Translational neurodegeneration. 1, 14 (2012).
- Zhang, K., et al. Defective axonal transport of Rab7 GTPase results in dysregulated trophic signaling. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 7451-7462 (2013).
- Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nature methods. 2, 599-605 (2005).
- Cui, B., et al. One at a time, live tracking of NGF axonal transport using quantum dots. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 13666-13671 (2007).
- Xie, W., Zhang, K., Cui, B. Functional characterization and axonal transport of quantum dot labeled BDNF. Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. 4, 953-960 (2012).
- Sung, K., Maloney, M. T., Yang, J., Wu, C. A novel method for producing mono-biotinylated, biologically active neurotrophic factors: an essential reagent for single molecule study of axonal transport. Journal of neuroscience methods. 200, 121-128 (2011).
- Tani, T., et al. Trafficking of a ligand-receptor complex on the growth cones as an essential step for the uptake of nerve growth factor at the distal end of the axon: a single-molecule analysis. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 2181-2191 (2005).
- Bronfman, F. C., Tcherpakov, M., Jovin, T. M., Fainzilber, M. Ligand-induced internalization of the p75 neurotrophin receptor: a slow route to the signaling endosome. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 3209-3220 (2003).
- Kruttgen, A., Heymach, J. V., Kahle, P. J., Shooter, E. M. The role of the nerve growth factor carboxyl terminus in receptor binding and conformational stability. The Journal of biological chemistry. 272, 29222-29228 (1997).
- Zuccato, C., Cattaneo, E. Brain-derived neurotrophic factor in neurodegenerative diseases. Nature reviews. Neurology. 5, 311-322 (2009).
- Gharami, K., Xie, Y., An, J. J., Tonegawa, S., Xu, B. Brain-derived neurotrophic factor over-expression in the forebrain ameliorates Huntington's disease phenotypes in mice. Journal of neurochemistry. 105, 369-379 (2008).
- Gauthier, L. R., et al. Huntingtin controls neurotrophic support and survival of neurons by enhancing BDNF vesicular transport along microtubules. Cell. 118, 127-138 (2004).
- Her, L. S., Goldstein, L. S. Enhanced sensitivity of striatal neurons to axonal transport defects induced by mutant huntingtin. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 13662-13672 (2008).
- Rong, J., et al. Regulation of intracellular trafficking of huntingtin-associated protein-1 is critical for TrkA protein levels and neurite outgrowth. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 26, 6019-6030 (2006).
