Summary
El transporte axonal de BDNF, un factor neurotrófico, es crítico para la supervivencia y la función de varias poblaciones neuronales. Algunos trastornos degenerativos están marcadas por disrupción de la estructura y la función axonal. Hemos demostrado las técnicas utilizadas para examinar el tráfico directo de QD-BDNF en las cámaras de microfluidos que utilizan las neuronas primarias.
Abstract
BDNF juega un papel importante en varias facetas de la supervivencia neuronal, la diferenciación, y la función. Déficits estructurales y funcionales en los axones se consideran cada vez más como una característica temprana de enfermedades neurodegenerativas, incluyendo la enfermedad de Alzheimer (AD) y la enfermedad de Huntington (HD). Hasta el momento no está claro es el mecanismo (s) por el cual se induce lesión axonal. Se presenta el desarrollo de una nueva técnica para producir biológicamente activo, monobiotinylated BDNF (mBtBDNF) que se puede utilizar para rastrear el transporte axonal de BDNF. BDNF marcado con puntos cuánticos (QD-BDNF) fue producido por la conjugación de punto cuántico 655 a mBtBDNF. Un dispositivo de microfluidos se utilizó para aislar los axones de los cuerpos celulares de las neuronas. La adición de QD-BDNF al compartimiento axonal permite imágenes en vivo de transporte BDNF en los axones. Hemos demostrado que QD-BDNF movido esencialmente exclusivamente retrógradamente, con muy pocas pausas, a una velocidad de movimiento de alrededor de 1,06 m / seg. Este sistema se puede utilizar para investigar memecanis- de la función axonal alterada en la EA o HD, así como otros trastornos degenerativos.
Introduction
Las neuronas son células altamente cuyos procesos de largo ya menudo muy elaborado, son fundamentales para el establecimiento y mantenimiento de la estructura y función de los circuitos neuronales polarizados. El axón juega un papel vital en el que transporten cargas desde y hacia las sinapsis. Las proteínas y orgánulos sintetizados en el soma celular necesitan ser transportados a través de los axones para llegar a la terminal presináptica para apoyar la función neuronal. Correspondientemente, señales recibidas en los axones distales necesitan ser transducidas y se transportan a la soma. Estos procesos son esenciales para la supervivencia neuronal, diferenciación y mantenimiento. En que el transporte axonal en algunas neuronas debe llevarse a cabo a través de distancias más de 1000 veces el diámetro del cuerpo celular, la posibilidad se prevé fácilmente que incluso pequeños déficits podrían afectar notablemente la función neuronal y el circuito.
Brain-factor neurotrófico derivado (BDNF), un miembro de la familia de las neurotrofinas de factores de crecimiento, está presente en maregiones del cerebro ny, incluyendo el hipocampo, corteza cerebral, y el cerebro anterior basal. BDNF juega un papel crucial en la formación de la cognición y la memoria mediante el apoyo a la supervivencia, diferenciación y función de las neuronas que participan en circuitos cognitivos. BDNF se une a su receptor, el TrkB tirosina quinasa, en el axón terminal donde activa vías de señalización mediada por TrkB, incluyendo la proteína quinasa activada por mitógeno / regulada por señal extracelular de la proteína quinasa (MAPK / ERK), fosfatidilinositol-3-quinasa (PI3K) y la fosfolipasa C-gamma (PLCγ). Las proteínas que participan en estas vías de señalización están empaquetados en estructuras vesiculares endocítica para formar el BDNF / TrkB señalización endosoma 1-6 que luego son retrógradamente transportado al soma neuronal.
La cámara de cultivo de microfluidos es una plataforma muy útil para estudiar la biología axonal en condiciones normales, así como en el ajuste de la lesión y la enfermedad 7,8. Por axones de aislamientoa partir de los cuerpos celulares, el dispositivo ha permitido uno para estudiar el transporte específicamente en los axones 8-10. Las plataformas de microfluidos PDMS base con 450 micras barreras microsurco utilizados en este estudio fueron adquiridos comercialmente (ver Tabla de Materiales). Para examinar el transporte BDNF, hemos desarrollado una nueva tecnología para producir BDNF monobiotinylated (mBtBDNF). Aprovechamos el péptido aceptor de biotina, AP (también conocido como AviTag). Es una secuencia de 15 aminoácidos que contiene un residuo de lisina que puede ligarse específicamente a una biotina por la enzima ligasa de biotina coli Escherichia, BirA. Hemos fusionado el AviTag a la C-terminal de la pre-ratón proBDNF ADNc mediante PCR (Figura 1A). La construcción se clonó en el vector de expresión de mamífero, pcDNA3.1-myc su vector. También clonado el ADN bacteriana BirA en el pcDNA3.1-myc su vector. Los dos plásmidos se co-transfectaron transitoriamente en células HEK293FT para expresar ambas proteínas. BirA catalizó la ligadura de Bioten concreto a la lisina residen dentro del AviTag en el C-terminal de BDNF en una proporción de 1: 1 para producir monómero monobiotinylated BDNF. Biotinilado, BDNF maduro con una masa molecular de ~ 18 kDa fue recuperado y purificado a partir de los medios de comunicación utilizando resina de Ni-(Figura 1C). La biotinilación de BDNF era completa, como se juzga por la incapacidad de detectar sin modificar BDNF por inmunotransferencia (Figura 1D). Puntos cuánticos conjugados con estreptavidina, QD 655, se utilizan para etiquetar mBtBDNF hacer QD-BDNF. La presencia de la AviTag no interfiera con la actividad del BDNF como la mBtBDNF fue capaz de activar TrkB fosforilado (Figura 1E) y estimular el crecimiento de neuritas (Figura 1F) en la medida de BDNF humano recombinante (rhBDNF). Inmunotinción demostró que QD-BDNF colocalized con TrkB en los axones del hipocampo, lo que indica que QD-BDNF es bioactivo (Figura 1G). Para estudiar el transporte BDNF, QD-BDNF fue añadido al compartimento de axón distalculturas de microfluidos que contienen rata E18 neuronas del hipocampo (Figura 2A). QD-BDNF transporte retrógrado dentro de los axones fue capturado por el tiempo real de imágenes en vivo de la etiqueta fluorescente de color rojo (con soporte para vídeos S1, S2). Mediante el análisis de la quimógrafo generado, QD-BDNF se observó para ser transportado retrógradamente a una velocidad de movimiento de alrededor de 1,06 m / seg (Figura 3A). GFP o marcado con mCherry BDNF se han utilizado para seguir el movimiento axonal de BDNF. Los principales inconvenientes son que no son lo suficientemente brillantes para los estudios de una sola molécula. Además, la presencia de tanto anterógrada y retrógrada movimientos de BDNF hace que sea difícil evaluar si o no el BDNF retrógradamente transportado estaba en un complejo neurotrofina / receptor.
En este video, nos demuestran las técnicas que se utilizan para examinar el tráfico directo de QD-BDNF en las cámaras de microfluidos que utilizan las neuronas primarias. El ultrabrightness y excelente fotoestabilidad de los puntos cuánticos MAKes posible realizar el seguimiento a largo plazo del transporte BDNF. Estas técnicas pueden ser explotados para mejorar estudios de la función axonal en AD, HD, y otros trastornos neurodegenerativos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Los procedimientos quirúrgicos y animales se llevan a cabo estrictamente de acuerdo con la Guía del NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. Todos los experimentos que implican el uso de animales son aprobados por UCSD Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión.
1. plásmido de clonación, expresión y purificación de biotina-Mono BDNF (mBtBDNF)
NOTA: Construir pre-proBDNFavi y cDNA BirA en el vector pcDNA3.1 y coexpresan en células HEK293FT 10. Purificar mBtBDNF utilizando perlas de Ni-NTA según el método publicado previamente de la producción de factor de crecimiento nervioso monobiotinylated madura y biológicamente activa (mBtNGF) 10.
2 Preparación de microfluidos Cámaras
Dispositivo de cultivo de neuronas de microfluidos hace que sea posible para aislar de manera fluida los axones de los cuerpos celulares de las neuronas. Montar cámaras con cubreobjetos recubiertos recién justo antes de cada disección. Cámaras de microfluidos utilizadosen este protocolo se compran en el mercado (ver materiales y la mesa del equipo). Lavado a mano y reutilizados cámaras adquiridos comercialmente hasta 5-6 veces.
- Lavar a mano cámaras de microfluidos en 1% Alconox. Enjuague tres veces con agua Milli-Q durante 30 min cada uno. Cámaras de lavado a mano de nuevo en etanol al 70%.
- Coloque cámaras a secar en Parafilm en la campana de flujo laminar. Irradiar y esterilizar ambos lados de las cámaras durante 20 min bajo UV. Tienda esterilizado en un recipiente estéril cámaras 15 cm plato de sellado con Parafilm a temperatura ambiente.
- Coloque 24 x 40 mm N º 1 cubreobjetos de vidrio en un recipiente de vidrio. Remojar los cubreobjetos en ácido clorhídrico al 35% durante la noche en un rotador. Al día siguiente, enjuagar los cubreobjetos tres veces durante 30 minutos cada uno con agua.
- Esterilizar los cubreobjetos uno a uno por inmersión cada cubreobjetos en etanol al 100% y en llamas sobre un mechero Bunsen. Guarde cubreobjetos secos en una placa de Petri estéril y mantenerlo a temperatura ambiente hasta recubrimiento.
- Coloque out los cubreobjetos en una placa de cultivo de 15 cm. Escudo cada cubreobjetos con 0,7 ml de 0,01% de poli-L-lisina (PLL) y se incuba en la campana a temperatura ambiente.
- Después de 1 hora, enjuague los cubreobjetos tres veces con agua estéril. Cubreobjetos secos con vacío y el lugar cada cubreobjetos en una placa de cultivo de 6 cm.
- Para montar la cámara de microfluidos, coloque la cámara con el lado microsurco en la parte inferior en el cubreobjetos recubiertos PLL con precaución de no tocar los microsurcos. Presionado suavemente la cámara con una punta de pipeta para asegurar la cámara se cerró herméticamente.
3. Disección de cultivos neuronales y Placa en Cámaras
- Coloque dos hipocampos E17-E18 de rata (un cerebro) disecados en un tubo cónico de 15 ml que contiene 2 ml de tampón de disección (HBSS, sin calcio, magnesio no, con 1% penicilina / estreptomicina y HEPES 10 mM. Enjuagar los tejidos 3 veces con 5 ml disección tampón cada vez. eliminar el tampón de disección tanto como sea posible y añadir 900 l de di frescatampón ssection.
- Para digerir el tejido, se añaden 100 l de 10x tripsina (2,5%) en el tampón de disección para hacer concentración de trabajo 1x. Coloque el tubo cónico en un baño a 37 ° C. Después de 10 min de la digestión, añadir 100 l de 10 mg / ml de DNasa I a una concentración final de alrededor de 1 mg / ml.
- Utilizando una pipeta Pasteur de vidrio pulida al fuego, se tritura suavemente los tejidos pipeteando arriba y abajo 5-10x. Justo después de la trituración, se extingue la tripsina con 2 ml chapado medio (Neurobasal con 10% de FBS, 2 mM de GlutaMax, 2% B27).
- Deja la muestra en la campana durante 5 minutos para permitir que todos los residuos de los tejidos para establecerse en la parte inferior. Retire cuidadosamente 2 ml de sobrenadante en un tubo limpio y estéril 15 ml cónico y centrifugar a 200 xg durante 5 min para sedimentar las células. Resuspender el precipitado en 50 l chapado medios
- Contar las células con un hemocitómetro. Load 15-20 l de suspensión de células (~ 40.000 células) en un compartimiento de la cámara de microfluidos. Coloque la cámaraen la incubadora durante 10 minutos para permitir que las células se unan a la cubreobjetos. Después de 10 minutos, agregue los medios más chapado a llenar los dos compartimentos de la cámara.
- En el segundo día de la disección, reemplazar completamente los medios de comunicación de placas con medio de mantenimiento (Neurobasal con 2 mM de GlutaMax, 2% B27) tanto en el cuerpo de la célula y el compartimento del axón. Los axones de las neuronas del hipocampo empiezan a cruzar los microsurcos en el día 3 y alcanzar el compartimiento axón entre los días 5-7. Durante este período de tiempo, reemplace la mitad de los medios de cultivo con medio de mantenimiento fresco cada 24 ~ 48 hr.
4. Axonal Transporte de QD-BDNF
- Antes de imagen en directo de QD-BDNF transporte axonal, agotar BDNF tanto desde el cuerpo celular y el axón compartimentos de la cámara de microfluidos por enjuague a fondo ambos compartimentos con BDNF-libres, suero libre de los medios de comunicación Neurobasal cada 30 min durante 2 horas.
- Durante el agotamiento de BDNF, preparar los conjugados QD-BDNF. Mezclar 50 nM de mono-biotina BDDímero NF con 50 nM conjugados de estreptavidina-QD655 en medios Neurobasal e incubar en hielo durante 60 min.
- Retire el medio en el compartimiento de axón y añadir 300 l QD-BDNF con una concentración final de 0,25 nM durante 4 horas a 37 ° C. Para minimizar el difusora de QD-BDNF en el compartimento de cuerpo celular, es muy importante mantener siempre un nivel más alto de los medios en el compartimiento de cuerpo de la célula que en el compartimiento de axón. Lavar sin unir QD-BDNF después de la incubación antes de imágenes en directo.
- Llevar a cabo formación de imágenes en vivo de transporte QD-BDNF usando un microscopio invertido equipado con un aceite lente objetivo 100X. Calentar el alcance y la cámara ambiental que se le atribuye a una temperatura constante (37 ° C) y CO 2 (5%). Utilice un conjunto de cubos de Texas excitación rojo / emisión de visualizar la señal QD655.
- Adquirir y capturar imágenes con lapso de tiempo dentro de los axones media a la velocidad de 1 fotograma / seg para un total de 2 min usando una cámara CCD. Use microsurcos sin axones that no tienen QD y por lo tanto no hay señal como un control para la infiltración.
- Analizar transporte BDNF usando cualquier software de análisis de imagen o NIH ImageJ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Producción y purificación de biológicamente activos BDNF Mono-biotina
El vector de expresión de BDNF fusionado con una secuencia de AviTag (GGGLNDIFEAQKIEWHE) fue creado de acuerdo con un protocolo previamente publicado 10. La masa molecular de la proteína de fusión de longitud completa se predijo a ser ~ 32 kDa ( http://ca.expasy.org/tools/pi_tool.html ) fue producido Monobiotinylated BDNF maduro con una masa molecular predicha de 18 kDa (Figura 1A) en las células HEK293FT y purificado de medio acondicionado como se ha descrito 10.
Diferentes fracciones se recogieron y se separaron en un 15% SDS-PAGE. El uso de un anticuerpo anti-Avi conejo, una banda con un peso molecular de ~ 18 kDa se detectó en la primera fracción (Figura 1B). Para probar la pureza de la preparación, las muestras se separaron en SDS-PAGE y se tiñeron por silver-tinción. Como se muestra en la Figura 1C, la banda de 18 kDa era la especie predominante en la primera elución. Se realizaron perlas de estreptavidina-agarosa menú desplegable ensayos para evaluar el grado de biotinilación de la preparación mBtBDNF. Después de pulldown con perlas de estreptavidina-agarosa, las proteínas que permanecieron en el sobrenadante se precipitaron con ácido tricloroacético al 7% (TCA). Estas muestras se analizaron por SDS-PAGE y las transferencias se probaron con anticuerpos anti-Avi anticuerpos (la parte superior) para detectar la proteína total o HRP-estreptavidina para detectar las proteínas biotiniladas. Nuestros resultados muestran que todas las señales se asociaron con las perlas, mientras que la banda no se detectó en el sobrenadante (Figura 1D). Por lo tanto, concluimos que mBtBDNF se biotiniló a una eficiencia> 99,9%.
Para probar la actividad biológica de mBtBDNF en la unión y activación del receptor TrkB, se trataron una línea celular 3T3 que expresa TrkB, ya sea con rhBDNF (20 ng / ml) o purified mBtBDNF (20 ng / ml) durante 10 min. Las células que no recibieron ningún tratamiento, también se recogieron como control. Los lisados se separaron en un 4-12% SDS-PAGE y un anticuerpo de conejo anti-pTrkB se utilizó para sondear el TrkB fosforilado. Como se muestra en la Figura 1E, similar a rhBDNF, mBtBDNF fue capaz de inducir la fosforilación de TrkB en un nivel similar. También trataron neuronas de hipocampo de rata, ya sea con rhBDNF (20 ng / ml) o mBtBDNF purificada (20 ng / ml) durante 48 h. MBtBDNF purificada fue capaz de estimular el crecimiento de neuritas del hipocampo en la medida de rhBDNF (Figura 1F). Para examinar la co-localización de QD-BDNF con el receptor TrkB, se añadió BDNF QD-axón del hipocampo de rata durante 4 horas a 37 ° C. Las neuronas se fijaron y se inmunotiñeron para TrkB. Como se muestra en la Figura 1G, QD-BDNF co-localizada con TrkB. Por lo tanto, concluimos que mBtBDNF es totalmente activo en su función biológica.
Imágenes en vivo de Axonal Transporte de QD-BDNF in las neuronas del hipocampo
Neuronas de hipocampo de rata embrionarias primarias (E17-18) se diseccionaron y se sembraron en el compartimiento cuerpo celular de la cámara de microfluidos. En el día 4 o 5, los axones extendidos a través de las micro ranuras en el compartimiento de axón. En el día 7, la mayoría de los axones crecieron en el compartimiento de axón. QD-BDNF se realizó mediante la incubación de la estreptavidina con QD655 mBtBDNF en una proporción 1: 1 (QD: BDNF dímero) en hielo durante 1 hr. QD-BDNF (0,25 nM) y luego se añadió al compartimiento de axón y se incubó durante 4 horas a 37 ° C antes de la imagen (Figura 2A).
Después de la incubación, QD-BDNF fue encontrado para unirse específicamente a los axones en el compartimiento de axón. En el compartimiento del cuerpo de la célula, las señales de QD se acumularon en la mayoría de los axones proximales y cuerpos celulares que indican la QD-BDNF se internaliza en los axones y retrógradamente transportado a los cuerpos celulares. Time-lapse serie de imágenes de señales QD-BDNF dentro de los axones se llevaron a cabo en los microsurcos. QD sSe observaron ignals en la mayoría de las micro ranuras con los axones, mientras que no hay señal de QD se puede ver en los microsurcos en el ausentes de los axones, lo que indica poca o ninguna difusión de señal QD desde el compartimiento de axón al compartimento cuerpo celular (Figura 2B).
En la Figura 2C, un segmento de 80 m de largo de los axones de las neuronas del hipocampo se registraron con fluorescencia para 100 seg. Total de 6 señales QD-BDNF se ve claramente durante la grabación de vídeo. Tres QD señales registradas se movieron unidireccionalmente hacia el cuerpo celular (lado izquierdo). El evento QD marcada por la flecha blanca (t: 31 seg a t: 101 seg) se movió suavemente al cuerpo celular de cruzar todo el campo en ~ 70 seg. Otro evento QD marcada por la flecha verde (t: 1 segundo para t: 61 seg) trasladó retrogradely primero. En t: 21 seg, la QD-BDNF se trasladó anterogradely de 10 a 20 seg, y luego cambió de dirección de nuevo hacia el cuerpo de la célula. El evento QD marcada por la flecha amarilla (t: 1 segundo para t: 71 seg) también se trasladó Retrograd ely, pero se detuvo para ~ 20 segundos durante el movimiento. QD-BDNFs que no se mueva durante este 100 segundos se consideraron estacionaria. Sólo los objetos en movimiento se analizaron posteriormente para calcular la velocidad de movimiento, velocidad media, y el tiempo se detuvo.
Análisis de datos en QD-BDNF Transporte quimógrafo
Kymographs fueron creados de cada película grabada utilizando el software Metamorph. Como se muestra en las kymographs representativos de transporte QD-BDNF (figura 3A), los movimientos QD-BDNF se registraron durante 120 seg en un segmento largo de los axones 80 micras. En quimógrafo representante 1, QD-BDNF movió rápido y sin problemas hacia la izquierda (cuerpo celular), cruzó el campo (80 micras) en ~ 60 segundos, con pausas muy breves (de apoyo Vídeo S1). Mientras que en quimógrafo representante 2, un QD-BDNF viajó ~ 50 micras en 120 seg retrógradamente, con al menos tres segmentos de pausas más largas (indicado por flechas) (vídeo favorable S2).
contenido "> Figura 3B es la gráfica de dispersión de la velocidad, la velocidad media móvil, y se detuvo el tiempo de cada sola QD-BDNF. La velocidad de movimiento de la QD-BDNF era relativamente rápido, que van desde 0,47 hasta 1,97 m / seg con la media de 1,06 ± 0,05 m / seg. La velocidad media de QD-BDNF se calculó como la distancia de viaje / tiempo utilizado. Y porque BDNF pausa durante su transporte, la velocidad media fue mucho menor que la velocidad de movimiento con una media de 0,48 ± 0,03 m / seg (que van 0,17 a 1,59 m / seg). tiempo de pausa también se analizó como una caracterización del movimiento BDNF. La duración media de las pausas era 15,88 ± 1,30 seg (que van desde 6 hasta 33 seg) (Tabla 1).
Figura 1. purificación de biológica activa, BDNF monobiotinylated (mBtBDNF). (A) Un dibujo esquemático que muestra la producción de mBtBDNF. Tanto pre-proBDNFavi y BirA se clonaron en el vector de-su pcDNA3.1myc como se ha descrito 10. (B) las diferentes fracciones de eluye de la resina Ni-se recogieron y se separaron en un gel de SDS-PAGE 15%. Una etiqueta de anticuerpos anti-Avi conejo se utilizó en la transferencia. Una banda con un peso molecular aparente de ~ 18 kDa fue reconocida en el eluido, consistente con la masa molecular predicha para la proteína madura mBtBDNF. Gel de tinción (C) Una plata muestra el 18 kDa mBtBDNF fue la especie predominante en la fracción de elución. (D) purificada mBtBDNF se incubó con perlas de estreptavidina-agarosa. Las perlas se lavaron y se hirvieron en tampón de carga SDS mientras que el sobrenadante se precipitó con TCA antes del análisis SDS-PAGE. La transferencia se sondeó con el anticuerpo anti-Avi o con HRP-estreptavidina. Se añadió (E) 20 ng / ml de purificado mBtBDNF o rhBDNF a una línea celular 3T3 que el correoxpresses TrkB durante 10 min. Los lisados se recogieron y se separaron en un 4-12% SDS-PAGE. También se analizó el lisado celular de control. La transferencia se sondeó con un anticuerpo de conejo anti-pTrkB. TrkB total se reveló usando un ratón de anticuerpos anti-TrkB. Se añadió (F) 20 ng / ml de purificado mBtBDNF o rhBDNF a las neuronas del hipocampo de rata durante 48 horas. DIC imágenes fueron tomadas para analizar la extensión de axones. (G) QD-BDNF se incubó con los axones de las neuronas de hipocampo de rata para 4 hr (barra de escala 5 micras). Las neuronas se fijaron y se inmunotiñeron para TrkB.
. Figura 2. Una molécula de imágenes de transporte retrógrado de QD-BDNF en los axones (A) Vista superior: Un dibujo esquemático de la cámara de microfluidos con neuronas primarias chapadas en el compartimiento del cuerpo celular. Los axones crecieron en todo el microgtejados en el compartimiento de axón. QD655 etiquetados BDNF se añadió al compartimiento axón. Vista lateral: El nivel de medios de comunicación en el compartimiento de axón se mantuvo inferior al compartimento cuerpo celular para minimizar la difusión de la señal de QD. (B) imágenes de fluorescencia roja y DIC imágenes de compartimiento cuerpo celular, microsurcos y compartimiento de axón. QD-BDNF se unía específicamente a los axones, internalizado y transportado retrógradamente a los cuerpos de las células a lo largo de los axones. No se observó ninguna señal de QD en los microsurcos ausentes de los axones. (C) Time-lapse vídeo serie de imágenes de transporte QD-BDNF a lo largo del axón. Ambas señales QD-BDNF estacionarios y en movimiento estuvieron presentes en la mayoría de las películas. En el tiempo t: 1 seg, por lo menos 4 puntos cuánticos se pueden ver. Después de 10 segundos, dos puntos cuánticos (indicadas por flechas verdes y amarillos) se están moviendo hacia el cuerpo celular (a la izquierda de la imagen). Estos dos puntos cuánticos se mueven y se detienen en las primeras imágenes de pareja y, finalmente, salir de las imágenes a la izquierda (en ~ 70 seg). Otra QD movió en el campoen t: 31 seg (indicada por la flecha blanca) y movido rápidamente sin mucho pausas a la izquierda.
Figura 3. QD-BDNF quimógrafo transporte y análisis de datos. (A) kymographs representativos de transporte QD-BDNF en las neuronas del hipocampo primaria. En kymo 1, un brillante QD mueve a través del campo a una velocidad relativamente rápida con sólo unas pocas pausas cortas. En kymo 2, la velocidad de movimiento de los puntos cuánticos fue más lento, y el movimiento se interrumpió con pausas más frecuentes y más largas. (B) Diagrama de dispersión de QD-BDNF velocidad en movimiento, velocidad media (calculada como la distancia de viaje / tiempo utilizado) y se detuvo el tiempo. La velocidad de movimiento media de QD-BDNF fue de 1,06 ± 0,05 m / seg (que van desde 0,47 hasta 1,97 m / seg. La velocidad media de QD-BDNF era 0,48 ± 0,03 m / seg (que van desde 0. 17 a 1,59 m / seg). La duración media de las pausas fue 15,88 ± 1,30 seg (rango 6-33 seg).
Apoyar vídeo S1 . Representante QD-BDNF vídeo transporte 1. Varios QD-BDNF mueve rápido hacia el lado izquierdo (cuerpo celular) con muy pocas pausas cortas.
Apoyar vídeo S2 . Representante QD-BDNF vídeo transporte 2. Varios QD-BDNF mueven relativamente lento hacia el lado izquierdo (cuerpo celular) con pausas frecuentes y largas.
| Mínimo | Máxima | La media | 88px; ".> Std error||
| Velocidad de movimiento (micrones / seg) | 0.47 | 1.97 | 1.06 | 0.05 |
| Velocidad media (micrones / seg) | 0.17 | 1.59 | 0.48 | 0.03 |
| Tiempo de pausa (sec) | 6 | 33 | 15.88 | 1.30 |
Tabla 1 Análisis de los datos de transporte QD-BDNF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En este estudio, se presenta el desarrollo de una nueva técnica para producir biológicamente activa, monobiotinylated BDNF (mBtBDNF) que se puede utilizar para rastrear el transporte axonal de BDNF. Por la conjugación de la proteína a la estreptavidina punto cuántico, y el uso de una cámara de microfluidos, el método permite una para detectar el transporte axonal de BDNF en las neuronas primarias con sensibilidad única molécula, en tiempo real y con las resoluciones espaciales y temporales. Las herramientas utilizadas en el presente documento proporcionan un medio por el cual para estudiar las máquinas moleculares que median en el transporte axonal de BDNF / TrkB señalización endosomas en las neuronas en la salud y la enfermedad.
BDNF-GFP, o -mCherry se han utilizado para seguir el movimiento axonal de BDNF en diversos cultivos neuronales in vitro. Estos reactivos ofrecen una opción para examinar transporte anterógrado y, posiblemente, para el examen de la activación autocrina de TrkB. Sin embargo, existen grandes inconvenientes para el estudio de transporte retrógrado, los más sobresalientes de which es que las buenas prácticas agrarias o mCherry no son lo suficientemente brillante como para los estudios de una sola molécula. Estudios anteriores mostraron que en concentraciones fisiológicas de NGF, un solo dímero NGF fue internalizada 11 y retrógradamente transportado 8. Es importante destacar que el uso de QD BDNF también permite definir la localización subcelular en la que se une BDNF sus receptores TrkB. En el uso de GFP o proteínas etiquetadas-mCherry, la expresión Somal dará lugar a la presencia dentro del axón de las proteínas se someten a anterógrada y retrógrada así como el transporte. Como tal, puede ser difícil evaluar si o no, o donde retrógradamente transportado BDNF encontró su receptor antes de la retrógrado transporte. De hecho, como la especulación, el transporte retrógrado dentro de los axones de BDNF-GFP o BDNF-mCherry produce en la misma neurona puede diferir de la continuación de la unión de BDNF en el objetivo de la inervación.
Aunque la reticulación química se ha utilizado para la producción de factor de crecimiento nervioso biológicamente activa(NGF), el método introducido en el presente documento es superior. En primer lugar, es difícil de controlar con precisión el grado de biotinilación; Por ejemplo, cada NGF se marcó con 5-9 grupos de biotina 8,9,12. En segundo lugar, la reticulación puede inactivar la proteína. En el caso de NGF, la reticulación necesaria la fijación a 13 grupos carboxilo. En el caso de BDNF, la actividad se pierde a menudo después de la reticulación química a la biotina. Por último, el grado de reticulación puede ser incompleta. Un informe reciente mostró que ~ 0.8 biotina / BDNF molécula fue producido por entrecruzamiento químico; como tal, ~ 20% de BDNF no se marcó 9. La presencia de no etiquetado BDNF podría complicar la interpretación de los resultados.
Nuestra técnica ofrece las ventajas únicas que las moléculas de BDNF están etiquetados con una única biotina en el mismo lugar, constituyendo de este modo una preparación homogénea de BDNF biotinilado. Conjugando a partículas nanofluorescent tales como puntos cuánticos, mBtBDNF puede serutilizado para el seguimiento de las vías y procesos que el BDNF se internaliza, la trata dentro de las neuronas en: dendritas, axones en, así como en los cuerpos celulares. Este método hace posible el uso de etiquetas alternativas para BDNF. El desarrollo de otros tipos de nanopartículas promete beneficios adicionales.
Los defectos en el tráfico axonal y la señalización de BDNF han sido implicados en las enfermedades neurodegenerativas. Fuerte evidencia ha vinculado el transporte defectuoso de BDNF a la atrofia córtico-estriatal en la enfermedad de Huntington 14,15. Proteína huntingtina mutada interfiere con la interacción entre asociado Huntingtin-proteína-1 (HAP1) y dineína motor en las neuronas simpáticas, inhibe el transporte de BDNF, y resulta en la pérdida de soporte neurotrófico y la toxicidad neuronal 16-18. Nuestras técnicas de seguimiento de movimiento axonal de BDNF pueden servir como una herramienta valiosa para estudiar la función axonal en enfermedades neurodegenerativas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Nos gustaría dar las gracias a Yue (Pauline) Hu, Rachel Sinit por su asistencia técnica. El estudio está apoyado por el NIH subvención (PN2 EY016525) y por la financiación de Síndrome de Down y la Fundación de Investigación de Tratamiento y la Fundación Larry L. Hillblom.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Platinum pfx DNA polymerase | Invitrogen | 11708021 | |
| EcoRI | Fermentas | FD0274 | |
| BamHI | Fermentas | FD0054 | |
| HEK293FT cells | Invitrogen | R70007 | |
| DMEM-high glucose media | Mediatech | 10-013-CV | |
| D-biotin | Sigma | B4639 | |
| TurboFect | Fermentas | R0531 | |
| PMSF | Sigma | P7626 | |
| Aprotinin | Sigma | A6279 | |
| Ni-NTA resins | Qiagen | 30250 | |
| Protease inhibitors cocktail | Sigma | S8820 | |
| Silver staining kit | G-Biosciences | 786-30 | |
| Human recombinant BDNF | Genentech | ||
| Microfluidic chambers | Xona | SND450 | |
| 24 x 40 mm No. 1 glass coverslips | VWR | 48393-060 | |
| Poly-L-Lysine | Cultrex | 3438-100-01 | |
| HBSS | Gibco | 14185-052 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| FBS | Invitrogen | 16000-044 | |
| GlutaMax | Invitrogen | 35050-061 | |
| B27 | Gibco | 17504-044 | |
| QD655-streptavidin conjugates | Invitrogen | Q10121MP | |
| anti-Avi tag antibody | GenScript | A00674 | |
| streptavidin-agarose beads | Life Technology | SA100-04 | |
| Trichloroacetic acid | Sigma | T6399 | |
| HRP-streptavidin | Thermo Scientific | N100 | |
| anti-pTrkB antibody | a generous gift from Dr M. Chao of NYU | ||
| anti-TrkB antibody | BD Science | 610101 |
References
- Wu, C., et al. A functional dynein-microtubule network is required for NGF signaling through the Rap1/MAPK pathway. Traffic. 8, 1503-1520 (2007).
- Wortzel, I., Seger, R. The ERK Cascade: Distinct Functions within Various Subcellular Organelles. Genes & cancer. 2, 195-209 (2011).
- Huang, E. J., Reichardt, L. F. Trk receptors: roles in neuronal signal transduction. Annual review of biochemistry. 72, 609-642 (2003).
- Nonomura, T., et al. Signaling pathways and survival effects of BDNF and NT-3 on cultured cerebellar granule cells. Brain research. Developmental brain research. 97, 42-50 (1996).
- Weissmiller, A. M., Wu, C. Current advances in using neurotrophic factors to treat neurodegenerative disorders. Translational neurodegeneration. 1, 14 (2012).
- Zhang, K., et al. Defective axonal transport of Rab7 GTPase results in dysregulated trophic signaling. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 7451-7462 (2013).
- Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nature methods. 2, 599-605 (2005).
- Cui, B., et al. One at a time, live tracking of NGF axonal transport using quantum dots. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 13666-13671 (2007).
- Xie, W., Zhang, K., Cui, B. Functional characterization and axonal transport of quantum dot labeled BDNF. Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. 4, 953-960 (2012).
- Sung, K., Maloney, M. T., Yang, J., Wu, C. A novel method for producing mono-biotinylated, biologically active neurotrophic factors: an essential reagent for single molecule study of axonal transport. Journal of neuroscience methods. 200, 121-128 (2011).
- Tani, T., et al. Trafficking of a ligand-receptor complex on the growth cones as an essential step for the uptake of nerve growth factor at the distal end of the axon: a single-molecule analysis. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 2181-2191 (2005).
- Bronfman, F. C., Tcherpakov, M., Jovin, T. M., Fainzilber, M. Ligand-induced internalization of the p75 neurotrophin receptor: a slow route to the signaling endosome. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 3209-3220 (2003).
- Kruttgen, A., Heymach, J. V., Kahle, P. J., Shooter, E. M. The role of the nerve growth factor carboxyl terminus in receptor binding and conformational stability. The Journal of biological chemistry. 272, 29222-29228 (1997).
- Zuccato, C., Cattaneo, E. Brain-derived neurotrophic factor in neurodegenerative diseases. Nature reviews. Neurology. 5, 311-322 (2009).
- Gharami, K., Xie, Y., An, J. J., Tonegawa, S., Xu, B. Brain-derived neurotrophic factor over-expression in the forebrain ameliorates Huntington's disease phenotypes in mice. Journal of neurochemistry. 105, 369-379 (2008).
- Gauthier, L. R., et al. Huntingtin controls neurotrophic support and survival of neurons by enhancing BDNF vesicular transport along microtubules. Cell. 118, 127-138 (2004).
- Her, L. S., Goldstein, L. S. Enhanced sensitivity of striatal neurons to axonal transport defects induced by mutant huntingtin. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 13662-13672 (2008).
- Rong, J., et al. Regulation of intracellular trafficking of huntingtin-associated protein-1 is critical for TrkA protein levels and neurite outgrowth. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 26, 6019-6030 (2006).
