Summary
提示されたマウス背側皮下脂肪チャンバーのウィンドウには、筋皮弁の急性永続的虚血のゾーンを可視化する。微小血管系および血行動態の定量化の直接的かつ反復的な評価のための生体エピ蛍光顕微鏡許す。形態学的および血行動態の結果は、さらに組織学的および分子解析と相関させることができる。
Abstract
深い専門知識と高度な外科技術にもかかわらず、大規模な組織壊死に巻か内訳に至るまで、虚血誘発性の合併症はまだ特に再建フラップ手術で、発生している。複数の実験的なフラップモデルが根本的な原因およびメカニズムを分析し、虚血性合併症を予防するための治療戦略を調査するために開発されてきた。ほとんどのモデルの制限要因は、直接かつ繰り返し微小血管のアーキテクチャと血行動態を可視化する欠け可能性である。プロトコールの目的は、これらの前述の要素を欠いて提携する十分に確立されたマウスモデルを提示することであった。ハーダーらは、未処理保つ場合、10日後に50％の壊死〜急性永続的虚血および結果を受けてランダム灌流パターン筋皮弁のモデルを開発した。生体落射蛍光顕微鏡を用いて、このチャンバモデルは、反復的な可視化を可能にする時間の経過とともに関心の異なる領域における形態および血行動態。アポトーシス、炎症、微小血管漏出および血管新生などの関連プロセスを検討し、免疫組織化学、分子、タンパク質アッセイに相関させることができる。現在までに、モデルは虚血挑戦組織の前、閉経期の影響とポストコンディショニングを調査いくつかの公表の実験的研究で実現可能性と再現性を証明しています。
Introduction
再建手術でさらさ腱、骨とインプラント材料の被覆率は、フラップの使用に依存している。フラップは、動脈流入および静脈流出を保証し、その血管茎上で転送された組織のブロックです。幅広い知識と転送されるフラップの様々な利用可能性にもかかわらず、創傷の破壊からの全組織喪失に至る虚血誘発性の合併症がまだ遭遇している。二意思による保存的治療と治癒がマイナー組織壊死後に期待することができるが、かなりのフラップ壊死は通常デブリードマンを含め、外科的改正が必要で、エアコン、二次再建を巻か。これは、罹患率が増加し入院を延長し、その結果、増加した医療費につながる。
動脈流入から最も離れた遠位のゾーン内の血管系の未定義のパターン、またはランダムに灌流領域を有するフラップが虚血性損傷を特に受けやすい。 ACCO rdingly、多数の実験的及び臨床的研究は、軸方向のパターンフラップ（定義された血液供給）及びランダムパターンフラップ（未定義の血液供給）1-3両方に壊死の進行を評価した。主な結果は、一般的に壊死領域のサイズの巨視的評価に基づいている。より詳細には組織壊死の原因とメカニズムを評価するために、いくつかの研究は、微小循環の分析に焦点を当てた。別の技法は、ポーラログラフ電極4-5と同様に、レーザードップラーフローメトリ6-7、染料拡散8、およびミクロスフェア9-10を使用して血流の測定を用いて組織の酸素分圧の分析を含む、組織潅流を測定するために使用されてきた。これらの技術は、しかし、唯一の組織灌流の間接的なパラメータを測定可能にし、フラップの関心のある個々の領域内microhemodynamicプロセスのいずれかの形態学的分析を可能にしない。
T ">サンディソンは、彼がウサギ11で行われるin vivo試験において 、長期化のための透明容器を使用した最初の人であることが知られている1943年- 。約20年後- Algireは適用可能であることがこのような透明チャンバーを適合させることが第一号だった腫瘍細胞は12のマイクロインプラントの挙動を研究するために、マウスにおける。によりマウスがたるんだ皮膚動物いわゆるされ、次の数年にわたって、いくつかの技術的改良の後、レアーおよび共同研究者は、適合させることができたという事実に小型·軽量チタンチャンバーを開発して背側皮下脂肪チャンバーは、このチャンバーは、生体内蛍光顕微鏡、形態学的および微小循環機能の数と異なる生理学的および病態生理学的条件の下で時間をかけてその変化の直接的かつ反復的な可視化を可能にする技術、そのようなを用いた評価を可能に虚血再灌流障害として13。PEの研究では正常および病的条件下では皮膚、筋肉や骨フラップのrfusionは2つの傾向が発生しました。まず、マウス14で有茎耳フラップとして背側皮下脂肪チャンバーを使用しない「急性」フラップモデル、横方向に基づいて、島皮弁をハムスター15及びラット16における有茎複合フラップで。第二に、背側皮下脂肪チャンバー許可反復微小循環とフラップの組み合わせが生体内蛍光顕微鏡で数日にわたって分析して「慢性」フラップモデル。それは、マウス17の皮下脂肪チャンバー内に統合されて、ランダムに灌流さ筋皮弁で構成されています。その幅対長さの比は、急性持続性の虚血の状況が一貫して10〜14日フラップ上昇した後、50％フラップ組織壊死〜になるように選択した。組織壊死のこの再現性の程度は、保護（ すなわち 、開発のレ両方のさらなる評価を可能にするS壊死）と有害な因子（ すなわち、フラップ病態生理の詳細壊死の開発）。最後の年の間に、別の閉経前、および組織保護物質18-24を投与すると、熱25および衝撃波26などの生理的ストレッサーのローカルアプリケーションを含む、ポストコンディショニング手順、の効果を実証するいくつかの実験の出版物、浮上している。
壊死、微小血管形態および微小循環のパラメータの定量分析は、さらに、免疫組織化学的分析およびタンパク質アッセイに相関させることができる。ヘムオキシゲナーゼ1（HO-1）及びHSP-：血管内皮増殖因子（VEGF）、一酸化窒素合成酵素（NOS）、核因子カッパB（NF-κB）および熱ショックタンパク質（HSP-32を含む種々のタンパク質および分子70）組織保護において役割を果たすことが示されている。このチャンバーフラップモデルに基づいて、2つの修正は、オードが開発されているR皮膚移植治癒27と軸パターン灌流28と有茎フラップにおける血管新生の開発中に新生血管形成および微小循環を分析すること。我々は、マウスの皮下脂肪チャンバー内の虚血挑戦筋皮フラップを含み、再現性と信頼性モデルを提示。このモデルは、生体エピ蛍光顕微鏡により微小循環と血行動態の可視化および定量化を可能にする。
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Protocol
注：前に提示されたモデルの実装に対応する動物保護法が参照されなければならないと許可が地元当局から取得する必要があります。本研究では、すべての実験は、動物に関わる研究や動物の保護に関するドイツの法律のための指針に準拠して実施した。実験は、地元の動物管理委員会によって承認された。
1.動物の準備とフラップの外科標高
- 22-24℃の室温で12時間昼夜サイクルで60から65までパーセントの相対湿度での単一ケージ内の動物にしてください。飲料水と標準的な実験用飼料へのマウスの自由なアクセスを許可します。常に生存手術中に無菌状態を維持する。
- 90 mg / kg体重塩酸ケタミンおよび25mgを/含む10グラムの体重あたり0.1ミリリットル生理食塩水の腹腔内、マウスを麻酔（ip）注射kg体重dihydroxylidinothiazine塩酸塩。麻酔動物の準備、手術とその後の顕微鏡検査のために必要である。痛みを伴う刺激に対する応答を確認することで、適切な麻酔を確認してください。麻酔の時間の間に、乾燥を防ぐために、目に獣医軟膏を適用します。
- 十分な麻酔の誘導後、電気シェーバーで背中をdepilate。以下、残りの毛を除去するために剃った領域に脱毛クリームを適用します。
- 7-10分〜の脱毛クリームの滞留時間の間、皮膚鉗子、マイクロ鉗子、はさみ、マイクロはさみ、縫合材料やマーカーペンなどの器具を準備。チャンバーの基部でナットで2本のネジを適用することにより、チャンバシステムの気密性 を保証するために、チャンバの相手の窓の周りに自己粘着性発泡体（ 図1 AC）を固定することにより、チタン室を消毒し、準備します。
- 洗浄による背面からすべての脱毛クリームを削除ぬるま湯でそれオフ。その後、乾燥したアルコール含有溶液で皮膚を消毒する。
- 腹臥位でマウスを置き、背中の正中線を定義します。一元的に皮膚をつかみ、倍（ 図2A）を作成するためにそれを持ち上げます。光源の任意の種類を使用してトランス照明により、provisorilyチタンフレーム（ 図2B）を配置する場所を決定します。ていることを確認してください頭蓋外側胸動脈（LTA）とチャンバーの窓の中心を通る尾もちろん深い曲折腸骨動脈（DCIA）の遠位枝（ 図2B-D）。チャンバーの位置決めが完了すると、チタンフレームの後の固定のために倍の一番下の皮膚の両方の層を穿孔。さて、チタンフレームを削除しやすい位置にマウスを置き、必要に応じて、背中の正中線を再定義。
- xは1〜15の幅と長さの比が正中線から始まる脊椎に垂直なフラップを概説1mmで横方向に基づいて、ランダムに灌流フラップになります。そして、反対側（ 図2C、D）に至る2mmの追加の皮膚領域を概説する。このエリアには、ピンセットで採取し、後で目に見えるフラップエリアに干渉することなく、チタンフレームに縫合される。
- マーキングファイナルに続いて、フラップを切開。そうすることで、LTAとDCIAの両方を横断するとフラップ（ 図2E）を高める。離断血管の凝固または連結する必要はない。
- 以前に行った皮膚穿孔（ 図2F）を介して、チャンバのネジを置き、チャンバーのフレームの穴を使用して、フレームの背面部に昇格フラップのチャンバーの枠内で両方の前方と後方に皮下脂肪を固定し、5-0結節縫合（ 図2G）。
- （5-0中断縫合により周囲の皮膚に戻ってフラップの垂直手足を縫合
- フラップの血管を観察するために、フラップの反対側に、 すなわち 2mmの小さな皮膚片に皮膚の横の半円形領域を切り出す。これは、90 mm 2の表面を有し、チャンバの観察窓を通して直視を可能にする。
- 顕微鏡検査時の画像品質を向上させるために顕微手術器具および光学拡大鏡または顕微鏡を用いて横紋筋からのゼラチン様緩い疎性結合組織を取り除く。筋肉組織層内の血管を傷つけないようにしてみてください。
- 最後に、局所ビスベンズイミドおよび生理食塩水（ 図2J）とフラップbedew、頭側と後方、以前に前方の泡自己接着ストリップでenduedされたフレームのカウンターパートを搭載することにより、チャンバをシール。その後、スナップリングを使用してカバーガラスで観察窓を適用する。ガラスの下に空気の水疱を捕捉しないようにしてください（ 図2K、L）。皮膚は、接着力によってカバーガラスに付着する。
2.生体内落射蛍光顕微鏡
- 理想的な光学的品質のための最初の顕微鏡分析のための外科調製後24時間を待ちます。この分析は、顕微鏡のベースラインを表しており、手術後3日目、5,7及び10で繰り返される。ステップ1.2に記載されるようにするたびに、マウスを麻酔。カスタムメイドのプレキシグラスキャリア上の横方向の褥瘡位置に動物を配置します。そうすれば、カバーガラスに付着したフラップの筋肉組織層は、アップ病棟に直面している。
- 尾静脈または眼球後静脈叢に5％の緑色蛍光デキストラン（分子量15万）および0.05ミリリットルの1％高蛍光ローダミンファミリーの色素の0.05ミリリットルを注入。緑色蛍光デキストランを静脈内適用した場合、血液の非細胞成分を染色する（ニ）。 distのできる蛍光ローダミン汚れ白血球と血小板他の細胞および非細胞成分からinguished。最後に、結露の状態に応じて、多かれ少なかれ、蛍光発光する核成分をビスベンズイミド染色する。
- その後、顕微鏡下でマウスを置きます。顕微鏡は、LEDシステムを含んでいるか確認します - 470＆425 nmの、365＆490 nmの、540＆580 nmのためのLEDの光の組み合わせだけでなく、対応するフィルターセット（62 HE BFP /、GFP / HcRed、レンジ1：350から390 nmのを励起波長、395nmで/ 402から448 nmの分割、範囲2：460から488ナノメートル、495ナノメートル/ 500から557 nmの分割、範囲3：567から602 nmのは、無限の20ローダミン、範囲に610ナノメートル/ 615ナノメートルを分割：540から552 nmの、560 nmの分割、エミッション575から640 nm）を。
- 静止画や電荷結合素子ビデオカメラを使用してモーション映像を記録し、さらにオフライン分析のためのコンピュータのハードディスク上に保存します。
- 異なる目的（2.5X、NA（開口数）=チャンバーのパノラマビューの0.06を使用します。5Xを、NA = 0.16、 10X、NA = 0.32、 20X、NAは0.50 =;関心領域の録音のための50X、NA = 0.55）。
- 事実上、同じ高さの3つの領域、 すなわち 、近位、中央に、チャンバの窓を通して見えるフラップ表面を分割し、最も離れた血管の流入（ 図3F）から遠位領域。画像取得のために、各観察時点で、次のように進む。
- 5倍対物レンズを用いて遠位近位からチャンバのウィンドウ内の画像による組織画像をスキャンします。
- フラップの各エリアでは、容易に識別可能な分岐パターンを持つ2次または三次細動脈とそれに付随する小静脈を選択します。 5X、10X、20Xまたは対物レンズを用いて、簡単に全体の観察期間を通してバンドルを再局在化させるために、arteriolovenularバンドルのプリントアウトを行う。
- 20Xの対物レンズおよび50倍の対物レンズ、さらに記録5-6キャピラリーフィールドと "アポトーシス付きそれぞれフラップの面積当たり」フィールドに入力します。 5Xおよび50X対物レンズで撮影した画像は、青色光（蛍光デキストラン）および白色光（ビスベンズイミド）フィルタを使用するのに対し、すべての10倍で撮影した画像と20Xの目的は、それぞれ、青色光（蛍光デキストラン）および緑色光（ローダミン）フィルタを使用する。
記録されたデータの分析3。
NOTE：29を以下のようにコンピュータ支援画像解析システムを用いることにより、オフラインで記録されたすべてのパラメータを定量化する。
- 非灌流、それぞれ壊死組織さ（mm 2）の面積を測定する。
- （2.6.1から）5倍の対物レンズで記録された完全なスキャンしたチャンバー窓画像と非灌流し、それぞれ壊死組織を測定するための蛍光デキストランを使用してください。非灌流さの領域を境界線とmは面積を計算：非灌流さ暗い領域を測定するために、「AreaBo」機能を使用してくださいソフトウェアの面積測定アルゴリズムを使用することによりm 2である 。
- 動脈、毛細血管および細静脈（μm）とにおける微小血管径の測定。
- 記録されたAV-バンドルまたはソフトウェアにキャピラリーフィールドからの負荷のビデオや写真。最良の結果を得るには、容器の明確な境界線がはっきり見える最高倍率で静止画や動画を使用しています。
- 測定は、血管の壁に垂直に行われていることを確認するソフトウェアの「DiamPe」機能を使用してください。そうするために容器の垂直な直径、血管の壁に第三のクリックマークの付いた二つの点をマーク。ソフトウェアは、μmで測定を行います。
- 同じ場所ですべての録音のために同じ船での測定を繰り返します。平均直径を蓄積するために、複数のキャピラリを測定します。
- 動脈内の赤血球（RBC）の速度の分析は、毛細管ND細静脈（MM /秒）。
- 細動脈の赤血球（RBC）速度（MM / s）のための測定は、ソフトウェアの「VeloLSD」機能を使用し、直径が測定されたために、蛍光デキストランウィンドウ内の同じ血管を選択します。
- 時間（秒）を超える個々の血管の階調パターンのシフト量（mm）での測定に基づいているラインシフト法を用いて、コンピュータ支援画像分析システムを用いてそれを分析する。
- 血管内容積の血流（PL /秒）の測定。
- RBC速度および血管断面積の細動脈、細静脈及び毛細血管内容積の血流（PL / sec）を算出する（π* R 2）総とAroesty、すなわち、Qは= V *π* rは2の式に従って、円筒容器形状30を仮定。
- RBC灌流毛細血管の機能毛細血管密度の測定（栄養灌流：CM / cmの
- ソフトウェアに20X対物倍率で記録した蛍光キャピラリーフィールドをロードします。 RBC灌流微小血管の機能的な毛細血管密度を測定するために、「DensLA」機能を使用してください。
- カーソルで灌流し毛細血管をトレースし、灌流し、血管をマーク。マークしない毛細血管、細動脈や細静脈を非灌流した。ソフトウェアは、センチメートル/ cm 2単位灌流毛細血管の機能的毛細血管密度を測定する。他の記録された毛細血管のフィールドの手順を繰り返します。
- 負荷はソフトウェアにビデオや蛍光キャピラリーフィールドのフレームを記録した。 gyrose血管を特定し、ソフトウェアの「TorqIx」関数を使用します。コース明確な血管の流れをトレースし、右クリックで終了。ソフトウェアの意志直接的な方法のために直線を引くと、トレースされたパスに関連して、それを設定します。
注：通常、既存の毛細血管から垂直に発するような芽、もやしと新たに形成された毛細血管のような血管新生の兆候、気を付けろ。ステップ3.5で説明したように、これらの新しく形成された血管の密度を測定します。
- ソフトウェアにビスベンズイミド-録画したビデオ（50Xの対物レンズ）をロード。 「DenseNA」機能を使用してください。そのような左クリックで核凝縮、断片化および辺縁などのような特性に応じてアポトーシスを起こした細胞をマーク。
- 映像全体のすべての特徴的な細胞をマークした後、自動的にすべてのマークされたセルをカウントし、エリア全体にそれを分割するソフトウェアに「N / A」をクリックします。結果は、アポトーシスになります細胞/ mm 2。
- ローダミンの数をカウントすることによって炎症反応を分析≥30秒（「シール」）を断続的に付着した白血球（<30秒、「ローラー」）の期間の後毛細血管細静脈の内皮層に付着した白血球を標識し。細静脈白血球付着はmm 2内皮表面あたりの細胞として表される。
- 高分子リットルを評価蛍光デキストランの静脈注射後の微小血管透過性のパラメータとしてeakage。デンシトメトリー直接毛細血管壁（E1）に隣接して、ならびに容器（E2）の縁無細胞血漿中の組織に複数のグレーレベルを決定する。次に、E1 / E2 31の比として高分子溢出（E）を計算する。
4.術後ケア
- 完全に回復するまで、他の動物の会社を避けるために、別々のケージに動物を返します。それは胸骨横臥位を維持するのに十分な意識を取り戻したまでは無人の動物を放置しないでください。出血、地元や感染の全身徴候とチャンバーの位置のために毎日動物を監視します。
- 運動活動、体重、苦痛の徴候、ドレッシングおよび自動切断に対する耐性を観察することによって、動物の一般的な状態を評価する。
- ムトゥを避けるために、マウスをケージ当たり1を保つチャンバーのアル操作。痛みの兆候では、8時間の間隔で皮下に、0.05〜0.1 mg / kg体重の用量でブプレノルフィンを適用します。
5.安楽死や皮脂所の植
- 10日目に、麻酔薬（150 mg / kgをペントバルビタール）の過剰摂取を使って動物を生け贄に捧げる。
- チャンバーを取り外し、免疫組織化学、分子、タンパク質アッセイのためのフラップ組織をサンプリングする。従来の組織学（ホルマリン）、および定量化可能なタンパク質アッセイ（液体窒素やドライアイス）のサンプル組織。
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Representative Results
壊死
このモデルの主なエンドポイント-組織壊死次フラップ上昇（ すなわち、急性永続的虚血の誘導） -繰り返し測定され、10日間にわたって、図3に示すように、巨視的に示さ。フラップ壊死の最終的な境界は、通常、手術後5日目と7との間に発生し、 図3D-F（近位バイタルとフラップの遠位壊死ゾーンの間に発生する、血管および微小血管リモデリングの赤い縞、 すなわち 、ゾーンによって特徴付けられる）。よく灌流近位、インターカレートされた批判的灌流中央領域と壊死遠位領域（ 図3F）：未処理対照マウスには、通常3つの別個の領域に分けることができ、10日後に約50％壊死領域を生じる。冒頭で述べたように、当社グループのこれまでの研究では、保護電子を示しているフラップの遠位ゾーンに向かって中央のゾーンから批判的に灌流した領域のシフトによって特徴付けられる異なるプレコンディショニング手順、後ffects。
血管パラメータ
微小血管の直径および赤血球（RBC）は、種々の直径の細動脈及び細静脈の-velocityならびに隣接するキャピラリーのを測定し、得られた体積血流がオフラインで計算される。これは10日目（ 図4A-B）に対する1日目からの明確な微小血管の形態学的および機能的両方の変更を相関することができます。また、RBC潅流毛細血管の機能密度、組織の栄養灌流パラメータが、分析される。毛細血管は、通常では、並列および生理学的条件下（ 図4C）の下で3~5ミクロンの間の直径を有する本配向されている。血流、TISSの最終的に機能的な毛細血管密度及び酸素分圧徐々に「生存率」閾値に到達するために遠位、近位から減少UE（ 図4C-E）毛細管がもはや（ 図4E）を灌流していない。
微細血管のリモデリングと血管新生
膨張して改造し、微小血管の増加ねじれフラップ準備を受けているすべての実験群で観察することができる（ すなわち 、急性永続的虚血の誘導：図4F）。しかし、このモデルでは、単独で虚血性刺激ホルモン、エリスロポエチン（ 図4G-H）とのプレコンディショニング種々の実験に見られるように、例えば血管形成を誘導するのに十分ではない。通常から垂直に発せられる微小血管芽と芽から発達新たな機能微小血管ネットワークは、既存の中で並列配置された毛細血管は3日目と5の間に目に見える最初のものである。
炎症反応（白血球-内皮相互作用およびアポトーシス）
急性永続的虚血は、通常、微小血管内皮細胞への白血球の付着によって表される未処理の動物においてかなりの炎症反応を誘導する。この炎症反応（ すなわち 、断続的な血管内皮への白血球の接着）および付着（ すなわち 、血管内皮への白血球の堅固な接着）白血球（ 図5A-B）を圧延することを特徴とする。加えて、アポトーシス細胞の増加を誘導し、虚血、核の凝縮、断片化および辺縁の特徴的な徴候（ 図5C-D）を使用して、すべての対照動物で見られる。両方、白血球-内皮相互作用とアポトーシスが虚血誘発性の炎症反応の標識であり、徐々に進行性の微小血管の機能障害に伴って増加し、組織の酸素分圧を減少させた（ つまり、 図5A-D））。
チタン室枠とそのワークピースの全ての図1のイラスト。2つのフレーム部品、3つのネジは、5つのナット、発泡体の一枚、カバーガラスとスナップリングからなる（A）逆アセンブルフレーム。 （B）六角ナット·ドライバー、スナップリングプライヤー、ワイヤーカッターを含むフレームを組み立てるためのツールが必要です。室が数回使用される場合は、ドライバーは必要ですが、推奨されていません。 （C）は、単一のチャンバパーツを組み立て。 2本のネジでフレームの裏面を、下部つの穴にナットを添付：左。裏面は、皮膚へのフレームを縫合するために使用され、フラップを担持されている。右：の組み立てられた前面側気密性を保証する添付泡を有するフレーム。すべての3つのネジ穴は、発泡体の自由保たれることに注意してください。フォームのいずれも、カバーガラスを負い観測窓、内に押し込まれないことを確認してください。 （D）は回路図では、背側皮下脂肪なし室枠を組み立てた。
手術フラップ手順およびマウスのチタン背側皮下脂肪チャンバーでの実装図2.イラスト。（A）の高架トランス照射は、背側皮下脂肪チャンバーの位置を概説するために、血管のアーキテクチャを視覚化するために、マウスの背側皮下脂肪を倍増した。 （B）チャンバのチタンフレームの裏側に配置され、血管に整列されている。フレームヘクタールの前側を取り付けるためのネジ用の2つの穴の切開sが行われて。幅対長さの比が11ミリメートルに15ミリメートル2垂直に生じる血管を一元化しながら、次のとおりです。横方向に背部皮膚上のフラップのアウトライン（CおよびD）。対側（薄いフラップアウトラインと太いボーダーの間でマークされていない部分）に2mmの距離は、フラップを昇格させる鉗子で皮膚を把握するために使用されます。チャンバ窓を介して裏面の皮膚の観察のために、付加的な組織は、（斜線部分）を除去しなければならない。フラップの底から発信ランダムに配置され、血管のアーキテクチャを実証し、（E）高架横方向に基づいて、皮膚弁、。斜線部は、切り出されたが、それでもフラップに取り付けられており、（鉗子下の皮膚をぶら下げ）、次の工程で除去される。枠体の裏面を取り付け（F）。フラップの皮膚表面は、裏面及びガラス窓の下側の「生」表面上にある。 chamber`sネジがTHR立ち往生しているウワーッ背側皮下脂肪の両側に穴を切開。フラップの前方と後方（G）の周囲の皮膚は、上部チャンバーリムの穴に固定されています。 （H）皮膚弁を伸ばして、フレームの背面側に縫合される。フラップの脱水を避けるために、0.9％塩化ナトリウム溶液を繰り返しフラップ上に滴下される。 （I）のフラップと周囲の皮膚が完全に上室リムの穴に固定されています。フラップは、チャンバの気密性を保証するために、隣接する背部皮膚に横方向に戻って縫合する。 （J）は、観察窓を囲む枠の泡担持対応マウント。 （K）完全に取り付けられたチャンバ：カバーガラスは、観察窓に取り付けられたスナップリングで封止されている。第三のねじは、追加の気密性のために、フレームの上部に取り付けられている。チャンバー内のウィンドウはmicrovasculaturの繰り返し分析を可能にする生体顕微鏡によるフラップの電子メール。顕微鏡の間に簡単にアクセスするための3本のネジが短縮されます。 （L）アウェイクし、マウント背側皮下脂肪チャンバーにマウスを移動。
0日目（直ちにフラップ調製後、A）、図1（B）、図3（C）、図5（D）、図7（E）及び図10（F）における弁壊死の形態学的発達との境界の図3プレゼンテーションファイナル壊死性境界は、5日目および7（DおよびE）との間で行われます。コントロールが充血レスポンスおよび微小血管リモデリングなどに灌流非しかし、潜在的に実行可能なエリア線引き組織を反映して、赤フリンジおよび（Eの二重矢印とアスタリスク）白鎌を含む中央フラップ区域内の境界の明確なゾーンを示し壊死遠位に（E）を開発する。パネルで、F、フラップ組織は、2本の水平線によって3つの分野に分かれています（画像の基部）がよく灌流さ近位ゾーン、赤フリンジ虚血性脳におけるペナンブラに対応する「lunatica鎌 "白を含めて批判的に灌流中央ゾーン（脳卒中損傷後の組織）と円周方向に赤い枠でマーク壊死性遠位ゾーン（）。倍率16X。
arteriovenularの画像を表示する図4：生体内落射蛍光顕微鏡（AV）束（A、B）、キャピラリーフィールド（C、D、E）およびリモデリング（F）および血管新生（G、H）のような形態学的変化。対照動物（A、B）1日目（A）及び図10（B）での同じAV束を示す生体顕微鏡両方 arteriolにおける全観察期間にわたって対照における引き延ばし応答が存在しないことに注意アル（a）と、細静脈（v）の直径。画像C、DおよびEは、十分に灌流近位領域（C）で並列配置されたキャピラリーを、批判的に灌流中心遷移ゾーン（D）および虚血フラップ組織の非灌流壊死遠位領域（E）を実証する。唯一の血管リモデリングを示す決定的灌流中央ゾーンコントロールマウス（F）では、拡張および増加したねじれと平行に配置され、毛細血管内ことを特徴とする方法。対照的に、マウスは、前処理レジメンは、新たに形成されたショーのようにフラップ上昇する前にエリスロポエチンを受けて垂直に通常の既存の毛細血管（G、H）とは明確に区別される毛細血管を生じる。この血管新生反応は、対照では観察されていない。蛍光デキストラン15万とコントラスト強調。倍率80X。
図5. </ ウェル灌流し、近位フラップゾーン（A）にAV-バンドルを表示 strong>を生体内落射蛍光顕微鏡および組織（B）との批判的に灌流し、虚血性中枢移行帯。毛細血管細静脈における付着白血球（矢印）の存在の増加に注意してください（v）は、健康な近位領域（A）と比較して虚血性のフラップ領域（B）内の細動脈（a）である。ローダミンとコントラスト強調。倍率80X。コントロールの近位（C）内のアポトーシス細胞死と決定的に灌流中央フラップ領域（D）を示す核凝縮を表示する生体落射蛍光顕微鏡。近位領域（C）と比較した場合、アポトーシス細胞（白矢印）の数の増加は、より虚血性中枢移行ゾーン（D）内で観察される。ビスベンズイミドでコントラスト強調。倍率250X。
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Discussion
虚血性合併症を減少させ、それによって臨床結果を改善するために、決定的に灌流フラップ組織における病態生理学的プロセスのより詳細な知識が必要である。急性持続性の虚血を模倣する新規の動物モデルの開発が必須である。したがって、我々は、サンプリングされたフラップ組織の免疫組織化学的および分子解析と相関させることができる筋肉と皮膚血管系の種々のパラメータを繰り返し、形態学的および機能的動的なリアルタイムの評価を可能容易に再現可能で信頼性の高いモデルを開発することができた。
練習といくつかの手先の器用さが必要ですが、外科的処置は、特定の外科的なスキルを必要としません。約25〜30を操作した動物の学習曲線が正しく背皮下脂肪チャンバーフラップ製剤の取り付けを習得することが通常必要である。経験豊富な手の中に、手術を平均35分の時間。決定的なフラップの準備の手順は、（トランス照明を使用して）離断すべき主な血管の正確な位置決めと、チャンバのウインドウの中央にフラップと皮筋層上記のゼラチン状の層の細心の除去の正しい配置とアウトラインを含める画像品質を改善するために画像の倍率を使用して。
フラップ寸法はミリメートル単位で与えられているので、我々は正しいフラップがマーキングにスライディングキャリパーを使用することをお勧めします。室内のウィンドウ内で水平に配置された支配的な血管を位置決めしながらどんな困難がある場合、人はむしろ血管のより近位の位置よりも遠位選択する必要があります。遠位からフラップを昇降する近位および無作為に灌流し、フラップの結果としながら、室内の窓を横断これらの血管の正確な位置決めは、これらの離断を保証します。言い換えれば、これらの主要な血管を横断するための障害は、軸方向の灌流をもたらす窓の下に組織の壊死のないパターン。外科的調製中の最終の重要なステップは、ゼラチン様疎性結合組織層の除去に関する。経験は、過除去損傷が直下皮筋層など繊細水平に筋肉の毛細血管を配置することを示している。逆に、浮腫形成と顕微鏡の間の関心領域の限られた、最終的には視認性に保守的な除去をもたらす。すべてのこれらのステップは、注意して習得している場合は、フラップは非常に絶えずフラップ標高後に50％壊死10日およそ開発しています。これは改善またはフラップ組織の生存を悪化させることができる様々な治療戦略を研究することができます。最後に、生体内蛍光顕微鏡の方法は微小組織灌流を評価するための十分に確立された手順であり、非常に迅速に学習することができる。
このモデルの主な欠点は、チャンバ内の組織の限られた観測時間である217;フラップ調製後約10〜14日のsの窓。これは最終的には、チャンバの横傾斜、その結果、背側皮下脂肪チャンバーに対する皮膚近位の進行緩みに起因している。まれに、サンドイッチ状、固定皮膚は、チャンバの枠から撤退しないと不可能な顕微鏡をレンダリングします。壊死が最も頻繁に完全に手術後5日目と7の間に画定されているので、これは本当に、チャンバの傾斜や室内の皮膚から撤退する前にデータ収集を損なわない。
モデルの利点は、簡単に再現性と遺伝子改変動物の使用の可能性があります。しかし、人間の条件に結果を変換するときに重要性を損なう可能性のある評価することが可能で、ウィンドウのサイズが比較的小さい。さらに、ルーズスキン動物とヒトとの間の解剖学的な違いがある。動物や外科ツールは、合理的な費用対効果を持っている一方で、HARd-および顕微鏡検査を行うために必要なソフトウェア（落射照明顕微鏡、高解像度カメラ、蛍光色素およびオフラインデータ分析のための特別なソフトウェア）が大きな投資を表す。
結論：
我々は、高解像度で微小循環パラメータの可視化および定量化を可能にするマウスにおける、時間と費用対効果の動物モデルを提示する。このアプローチは、批判的に灌流した筋皮弁組織および基礎となる細胞のメカニズムを分析するための理想的な方法を表しています。関心領域の形態学的変化を繰り返し調査し、微小血管および細胞レベルでの機能的変化と相関させることができる。生体落射蛍光顕微鏡の後、組織は、さらに組織学的及び分子的アプローチを使用して処理することができる。
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Acknowledgments
私たちは、画像編集用のカタリーナHaberlandに感謝します。資金は：筆頭著者は、新しい研究室をセットアップするためにミュンヘン工科大学からKKFグラントを受け取った。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57Bl/6 mice, 6-8 w, 20-22 g | Charles River | ||
| Depilation cream | Balea | Any depilation cream | |
| Titanium chamber | Irola | 160001 | Halteblech M |
| Custom-made Plexiglass mounting frame | Frame to secure chamber to avoid chamber movement due to the animal's respiration. | ||
| Slotted cheese head screw | Screws and More | 842210 | DIN84 M2x10 |
| Hexagon full nut | Screws and More | 93422 | DIN934 M2 |
| Snap ring | Schaefer-Peters | 472212 | DIN472 J12x1,0 |
| Cover glass | Volab | Custom-made cover glass, 11.8 mm in diameter. | |
| Fixing foam | tesamoll | 05559-100 | tesamoll Standard I-Profile |
| Ketamine hydrochloride | Parke Davis | Ketavet® | |
| Dihydroxylidinothiazine hydrochloride | Bayer | Rompun® | |
| Buprenorphin | Essex Pharma | Temgesic® | |
| Saline 0.9% | |||
| Desinfection alcohol | |||
| Vicryl 5-0 | Ethicon | V 490 H | |
| Ethilon 5-0 | Ethicon | EH 7823 H | |
| 1 ml syringes | |||
| Surgical skin marker with flexible ruler | Purple surgical | PS3151 | Any surgical skin marker and flexible ruler |
| Pointed scissors | |||
| Micro-Scissors | |||
| Normal scissors | |||
| 2 clamps | |||
| Fine anatomic forceps | |||
| Micro-forceps | |||
| Hex nuter driver | wiha | 1018 | |
| Screwdriver | wiha | 685 | |
| Snap ring plier | Knipex | 4411J1 | 12-25 mm |
| Wire cutter | Knipex | 70 02 160 | Wire cutter is used to cut screws short; 160 mm |
| Trans-illumination light | IKEA | 501.632.02 | LED light Jansjö; any light |
| Magnification glasses | |||
| Intravital microscope | Zeiss | 490035-0001-000 | Scope.A1.Axiotech |
| LED system | Zeiss | 423052-9501-000 | Colibri.2 |
| LED module 365nm | Zeiss | 423052-9011-000 | |
| LED module 470nm | Zeiss | 423052-9052-000 | |
| LED module 540-580nm | Zeiss | 423052-9121-000 | |
| Filter set 62 62 HE BFP + GFP + HcRed | Zeiss | 489062-9901-000 | Range 1: 350-390 nm excitation wavelength, split 395 nm / 402-448 nm; range 2: 460-488 nm, split 495 nm / 500-557 nm; range 3: 567-602 nm, split 610 nm / 615 nm to infinite. |
| Filter set 20 Rhodamine | Zeiss | 485020-0000-000 | 540-552 nm, split 560 nm, emission 575-640 nm |
| 2.5X objective NA=0.06 | Zeiss | 421020-9900-000 | A-Plan 2.5X/0.06 |
| 5X objective NA=0.16 | Zeiss | 420330-9901-000 | EC Plan-Neofluar 5X/0.16 M27 |
| 10X objetive NA=0.30 | Zeiss | 420340-9901-000 | EC Plan-Neofluar 10X/0.30 M27 |
| 20X objective NA=0.50 | Zeiss | 420350-9900-000 | EC Plan-Neofluar 20X/0.50 M27 |
| 50X objective NA=0.55 | Zeiss | 422472-9960-000 | LD Epiplan-Neofluar 50X/0.55 DIC 27 |
| ZEN imaging software | Zeiss | ZenPro 2012 | |
| CapImage | Dr. Zeintl | ||
| Fluorescein isothiocyanate-dextran | Sigma-Aldrich | 45946 | |
| bisBenzimide H 33342 trihydrochloride | Sigma-Aldrich | B2261 | Harmful if swallowed; causes severe skin burns and eye damage, may cause respiratory irritation. |
| Rhodamine 6G chloride | Invitrogen | R634 | Harmful if swallowed; may cause genetic defects; may cause cancer; may damage fertility or the unborn child. |
| Pentobarbital | Merial | Narcoren® |
References
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