Summary
Das Fenster des murinen Rückenhautkammer dargestellt visualisiert eine Zone von akuter Ischämie persistent eines muskulokutanen Klappe. Intravital Epifluoreszenzmikroskopie Genehmigungen für direkte und wiederholte Bewertung der Mikrogefäß und Quantifizierung der Hämodynamik. Morphologische und hämodynamische Ergebnisse kann weiter mit histologischen und molekularen Analysen korreliert werden.
Abstract
Trotz tiefen Erfahrung und die moderne Operationstechniken werden Ischämie-induzierten Komplikationen reichen von Wund Aufschlüsselung umfangreiche Gewebsnekrose noch auftritt, vor allem in der rekonstruktiven Klappenchirurgie. Mehrere experimentelle Klappenmodelle wurden entwickelt, um die Ursachen und Mechanismen zu analysieren und Behandlungsstrategien zu untersuchen, um ischämische Komplikationen zu verhindern. Der limitierende Faktor der meisten Modelle ist die fehlende Möglichkeit, mikrovaskuläre Architektur und Hämodynamik direkt und wiederholt zu visualisieren. Das Ziel des Protokolls war es, ein gut etabliertes Mausmodell Gunter diese bereits erwähnt fehlt Elemente präsentieren. Härtere et al. Haben ein Modell eines musculocutaneus Klappe mit einem zufälligen Perfusion Muster, das akute persistent Ischämie und Ergebnisse in ~ 50% Nekrose nach 10 Tagen, wenn unbehandelt gehalten erfährt entwickelt. Mit Hilfe der intravital Epifluoreszenzmikroskopie ermöglicht dieses Modell Kammer wiederholende VisualisierungMorphologie und Hämodynamik in verschiedenen Regionen von Interesse über die Zeit. Verbundenen Prozesse wie Apoptose, Entzündung und Angiogenese mikrovaskulären Leckage untersucht und immunhistochemische und molekular Protein-Assays korreliert werden. Bis heute hat das Modell Durchführbarkeit und Reproduzierbarkeit in mehreren veröffentlichten experimentellen Studien zur Untersuchung der Wirkung von prä-, peri- und Postkonditionierung ischämisch fochten Gewebe bewährt.
Introduction
Abdeckung der freiliegenden Sehnen, Knochen und Implantatmaterial in der rekonstruktiven Chirurgie beruht auf der Verwendung von Klappen. Eine Klappe ist ein Block von Gewebe, das an seiner Gefäßstiel, der arteriellen Zustroms und eines venösen Abflusses garantiert übertragen wird. Trotz breiten Know-how und die Verfügbarkeit von einer Vielzahl von Klappen zu übertragen ist, werden Ischämie-induzierten Komplikationen reichen von Wund Aufschlüsselung der Gesamtgewebeverlust noch angetroffen. Während konservative Behandlung und Heilung durch sekundäre Absicht kann nach kleineren Gewebsnekrose erwarten, signifikante Lappennekrose erfordert in der Regel chirurgische Revision, einschließlich Debridement, Wundanlage und sekundäre Rekonstruktion. Dies erhöht die Morbidität, verlängert Krankenhausaufenthalt und damit zu erhöhten Kosten im Gesundheitswesen.
Klappen mit einem undefinierten Muster Vaskulatur oder zufällig perfundiert Bereiche in dem distalen Bereich der am weitesten von der arteriellen Zustrom sind besonders anfällig für ischämische Schädigung. Acco rdingly wurden zahlreiche experimentelle und klinische Studien, die Entwicklung der Nekrose sowohl ausgewertet, axialen Musterklappen (definiert Blutversorgung) und Zufallsmuster Klappen (undefined Blutversorgung) 1-3. Die wichtigsten Ergebnisse sind häufig auf makroskopische Auswertung der Größe des nekrotischen Bereich basiert. Um die Ursachen und Mechanismen der Gewebenekrose beurteilen näher konzentrierte mehrere Studien auf der Analyse der Mikrozirkulation. Verschiedene Techniken wurden eingesetzt, um die Gewebedurchblutung zu messen, einschließlich der Analyse von Gewebesauerstoffspannung mit polarographischen Elektroden 4-5, sowie die Messung der Blutströmung unter Verwendung der Laser-Doppler-Flussmessung 6-7, Farbstoffdiffusions 8 und 9-10 Mikrokügelchen. Diese Techniken sind jedoch nur für Mess indirekte Parameter der Gewebedurchblutung zu ermöglichen und keine morphologischen Analyse der microhemodynamic Prozesse innerhalb eines einzelnen interessierenden Bereich einer Klappe zu ermöglichen.
t "> Sandison ist bekannt, dass der erste, der eine transparente Kammer eingesetzt hat für die in vivo Studien, die er bei Kaninchen 11 geführt verlängert sein 1943 -. etwa 20 Jahre später - Algire war der erste, wie eine transparente Kammer anzupassen anwendbar zu sein bei Mäusen, um das Verhalten von Mikroimplantate von Tumorzellen 12 zu studieren. Aufgrund der Tatsache, dass Mäuse sind so genannte lose Haut Tieren und nach einigen technischen Raffinessen in den folgenden Jahren waren Lehr und Mitarbeiter in der Lage, sich anzupassen wie eine Rückenhautkammer der Entwicklung eines kleineren und leichteren Titankammer. Diese Kammer aktiviert Auswertung mittels Intravitalfluoreszenzmikroskopie, eine Technik, die direkten und wiederholenden Darstellung von einer Reihe von morphologischen und Mikrozirkulationsmerkmale und deren Veränderungen im Laufe der Zeit unter verschiedenen physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen ermöglicht, wie Ischämie-Reperfusionsschaden 13.Bei der Untersuchung von PErfusion von Haut, Muskeln und Knochen Klappen unter normalen und pathologischen Bedingungen zwei Trends aufgetreten: Erstens, die "akut" Klappe Modelle, die nicht die Rückenhautkammer verwenden wie die gestielten Ohrenklappe in der Maus 14, die seitlich auf der Basis Insel Hautlappen im Hamster 15 und der Verbund gestielten Lappen bei der Ratte 16. Zweitens, die "chronische" Klappe Modell, bei dem die Kombination von einer Klappe mit einer Rückenhautkammer erlaubt wiederholende Mikrozirkulation über mehrere Tage mit Intravitalfluoreszenzmikroskopie analysiert. Es besteht aus einem zufällig perfundiert muskulokutanen Klappe, die in der Hautkammer der Maus 17 integriert ist. Seine Breite-zu-Länge-Verhältnis wurde gewählt, dass eine Situation der akuten persistent Ischämie führt durchweg in ~ 50% Klappen Gewebsnekrose 10 bis 14 Tage nach Lappenhebung. Diese reproduzierbare Ausmaß der Gewebsnekrose ermöglicht die weitere Auswertung der beiden, Schutz (dh Entwicklung less Nekrose) und schädlichen Faktoren (dh Entwicklung von mehr Nekrose) auf der Klappe Pathophysiologie. In den letzten Jahren wurden mehrere experimentelle Publikationen, die die Wirkung von verschiedenen prä-, peri- und postKonditionierungsVerfahren, einschließlich der Verabreichung von Tissue-Schutzsubstanzen 18-24 und der lokalen Anwendung der physiologischen Stressfaktoren wie Wärmeschockwellen 25 und 26, entstanden.
Die quantitativen Analysen der Nekrose, mikrovaskulären Morphologie und Mikrozirkulationsparameter kann weiter auf immunhistochemischen Analysen und Protein-Assays korreliert werden. Verschiedene Proteine und Moleküle, einschließlich vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor (VEGF), Stickstoffmonoxid-Synthasen (NOS), Nuklearfaktor kappa B (NF-kB), und Hitzeschockproteinen (HSP-32: Häm-Oxygenase-1 (HO-1) und HSP- 70) haben gezeigt, dass eine Rolle bei der Gewebeschutz spielen. Auf der Grundlage dieser Kammer Klappe Modell wurden zwei Modifikationen in orde entwickeltr zu Neovaskularisation und Mikrozirkulation während Hauttransplantation Heilung 27 und angiogene Entwicklungen in einem gestielten Klappe mit axialen Muster Perfusion 28 zu analysieren. Wir präsentieren eine reproduzierbare und zuverlässige Modell, das eine ischämisch fochten musculocutaneus Klappe in der Maus Hautkammer enthält. Dieses Modell ermöglicht die Visualisierung und Quantifizierung der Mikrozirkulation und die Hämodynamik durch Intravital Auflicht-Fluoreszenz-Mikroskopie.
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Protocol
HINWEIS: Vor Durchführung des vorgestellten Modells, müssen die entsprechenden Tierschutzgesetze eingesehen werden und muss eine Genehmigung der örtlichen Behörden erhalten werden. In dieser Arbeit wurden alle Experimente in Übereinstimmung mit den Leitlinien für die Forschung mit Tieren und der deutschen Rechtsvorschriften über den Schutz von Tieren durchgeführt. Die Versuche wurden von der örtlichen Tierpflegekommission genehmigt.
1. Vorbereitung der Tiere und chirurgische Elevation der Klappe
- Halten Sie Tiere in Einzelkäfigen bei Raumtemperatur von 22-24 ° C und bei einer relativen Luftfeuchtigkeit von 60-65% mit einem 12-Stunden-Tag-und-Nacht-Zyklus. Lassen Mäuse freien Zugang zu Trinkwasser und Standardlaborfutter. Halten Sie immer sterile Bedingungen während Überleben Chirurgie.
- Betäuben die Maus durch intraperitoneale (ip) Injektion von 0,1 ml Salzlösung pro 10 g Körpergewicht, die 90 mg / kg Körpergewicht Ketamin-Hydrochlorid und 25 mg /kg KG dihydroxylidinothiazine Hydrochlorid. Anästhesie ist für die Tier Vorbereitung, Operation und anschließende Mikroskopie notwendig. Überprüfen Sie die Betäubung durch Überprüfung der Reaktion auf einen schmerzhaften Reiz. Während der Zeit der Anästhesie, gelten Tierarzt Salbe auf die Augen, um Trockenheit zu verhindern.
- Nach Einleitung der Narkose ausreichend, enthaaren die Rückseite mit einem elektrischen Rasierer. Hiernach gelten Enthaarungscreme auf die rasierte Fläche, um die restlichen Haare zu entfernen.
- Während Verweilzeit der Enthaarungscreme von ~ 7-10 min, bereiten Instrumente, einschließlich Hautzange und Mikro Zangen, Scheren und Mikro Schere, Nahtmaterial und einem Filzstift. Desinfizieren und bereiten die Titankammer, indem die beiden Schrauben mit der Mutter an der Kammerbasis und durch Befestigen selbstklebenden Schaumstoff (Fig. 1 AC) um das Fenster von der Kammer Gegen Dichtigkeit des Kammersystems zu gewährleisten.
- Entfernen Sie alle Enthaarungscreme von der Rückseite durch Waschenes mit lauwarmem Wasser. Dann trocknen und desinfizieren Sie die Haut mit einer alkoholhaltigen Lösung.
- Platzieren Sie die Maus in Bauchlage und definieren die Mittellinie des Rückens. Fassen Sie die Haut zentral und heben Sie ihn in eine Falte (Abb. 2A) zu erstellen. Durch Transillumination mit jeder Art von Lichtquelle, entscheiden, wo sie provisorisch platzieren Sie den Titanrahmen (Abb. 2B). Stellen Sie sicher, dass die distalen Äste der seitlichen Brustwandarterie (LTA) kranial und der Arteria circumflexa ilium profunda (DCIA) kaudal natürlich durch die Mitte der Fenster der Kammer (Fig. 2B-D). Sobald die Positionierung der Kammer durchgeführt wird, zu perforieren beide Hautschichten ganz am Boden der Falte zur späteren Fixierung der Titanrahmen. Entfernen Sie nun die Titanrahmen, platzieren Sie die Maus in Bauchlage und definieren die Mittellinie des Rückens, wenn nötig.
- Umriss der Klappe senkrecht auf die Wirbelsäule ausgehend von der Mittellinie mit einem Breite-zu-Länge-Verhältnis von 15 x 11 mm in einer seitlich auf und zufällig perfundiert Klappe führen. Dann beschreiben eine zusätzliche Hautfläche von 2 mm erstreckt, um der Gegenseite (Fig. 2C, D). Dieser Bereich ist mit der Pinzette aufgenommen und später an den Titanrahmen vernäht, ohne mit dem Klappenbereich sichtbar.
- Nach der endgültigen Kennzeichnung, einzuschneiden die Klappe. Dabei durchtrennen sowohl das LTA und DCIA und heben die Klappe (Fig. 2E). Es besteht keine Notwendigkeit für die Koagulation oder die Ligation der durchtrennten Gefäße.
- Platzieren der Kammer Schraube durch den zuvor hergestellten Haut Perforationen (Fig. 2F) und fixieren den skinfold sowohl vorne und nach hinten innerhalb des Kammerrahmens des erhöhten Klappe an der Rückseite Teil des Rahmens unter Verwendung der Löcher der Kammerrahmen und einem 5-0 Knopfnähten (Abb. 2G).
- Naht der vertikalen Schenkeln der Klappe zurück in die umgebende Haut mit Hilfe von 5-0 Nähten (
- Zuschneiden eine halbkreisförmige Bereich der Haut seitlich der kleinen Hautstreifen von 2 mm, das heißt, auf der anderen Seite der Klappe, um die Klappe des Gefäßsystems zu beobachten. Dies ermöglicht den direkten Blick durch das Sichtfenster der Kammer, die eine Fläche von 90 mm 2 hat.
- Entfernen Sie die gelatineartigen losen Zellgewebe von der quergestreiften Muskulatur mit mikrochirurgischen Instrumenten und optische Lupe oder Mikroskop, um die Bildqualität während der Mikroskopie verbessern. Versuchen Sie nicht für Schiffe innerhalb der muskulären Gewebeschichten beschädigen.
- Schließlich Abdichtung der Kammer durch die Montage des Gegen des Rahmens, der zuvor mit selbsthaftenden Schaumstoffstreifen vorne begabt wurde, kranial und posterior, bedew der Klappe mit topischen Bisbenzimid und Kochsalzlösung (Fig. 2J). Danach gelten die Beobachtungsfenster mit einem Deckglas mit einem Sprengring. Versuchen Sie nicht, alle Luftblasen unter dem Glas einzuschließen (Abb. 2K, L). Die Haut wird auf dem Deckglas durch Adhäsionskräfte haften.
2. Intravital Epifluoreszenzmikroskopie
- Wartezeit von 24 Stunden nach der chirurgischen Vorbereitung der ersten mikroskopischen Analyse für optimale optische Qualität. Diese Analyse stellt die Grundlinie der Mikroskopie und wird an Tag 3, 5, 7 und 10 nach der Operation wiederholt. Jedes Mal, betäuben die Maus wie in Schritt 1.2 beschrieben. Legen Sie das Tier in einer lateralen Dekubitusposition auf einer maßgeschneiderten Plexiglas Träger. So das Muskelgewebe Schichten der Klappe an der Abdeckung Glas anhaftende Blick up-Stationen.
- Injizieren von 0,05 ml 5% grüne Fluoreszenz Dextran (Molekulargewicht 150.000) und 0,05 ml 1% stark fluoreszierenden Rhodamin-Farbstoff-Familie in eine Schwanzvene oder retrobulbären Venenplexus. Die grün fluoreszierenden Dextran färbt die nicht-zelluläre Bestandteile des Blutes, wenn intravenös angewendet (iv). Das fluoreszierende Rhodamin Flecken Leukozyten und Blutplättchen, die dist sein könnenvon anderen zellulären und nicht-zellulären Komponenten inguished. Schließlich Bisbenzimid färbt Kernkomponenten, die mehr oder weniger Fluoreszenz zu emittieren nach dem Stand der Kondensation.
- Anschließend platzieren Sie die Maus unter dem Mikroskop. Stellen Sie sicher, das Mikroskop enthält eine LED-System - LED-Lichtstrahl-Kombinationen für 470 & 425 nm, 365 & 490 nm und 540 & 580 nm sowie die entsprechenden Filtersätzen (62 HE BFP / GFP / HcRed, Bereich 1: 350 bis 390 nm Anregungswellenlänge, aufgeteilt 395 nm / 402-448 nm; Bereich 2: 460-488 nm, geteilt 495 nm / 500-557 nm; Bereich 3: 567-602 nm, geteilt 610 nm / 615 nm bis unendlich 20 Rhodamin, Bereich. : 540-552 nm, geteilt 560 nm, Emission 575 bis 640 nm).
- Notieren Sie die Standbilder und Motion-Bilder mit einem Charge-Coupled Device Videokamera und speichern Sie sie auf einer Computer-Festplatte für weitere Offline-Analyse.
- Verwenden Sie unterschiedliche Ziele (2.5X, NA (numerische Apertur) = 0,06 für Panoramablick auf die Kammer; 5X,NA = 0,16; 10X, NA = 0,32; 20X, NA = 0,50; 50X, NA = 0,55) für Aufnahmen der Regionen von Interesse.
- Praktisch, teilen die Klappenfläche, die durch das Fenster der Kammer in drei Bereiche von gleicher Höhe, also einen proximalen, einen mittleren und einen distalen Bereich der am weitesten von der Gefäß Zulauf (Fig. 3F) sichtbar ist. Für die Bildaufnahme, gehen auf folgende Weise zu jeder Beobachtungszeit Punkt:
- Scannen Sie den Gewebe Bild für Bild in das Fenster der Kammer von proximal nach distal mit der 5X Ziel.
- In jedem Bereich der Klappe, wählen zweiter oder dritter Ordnung Arteriolen und die sie begleitenden Venolen mit leicht identifizierbaren Verzweigungsmuster. Mit dem 5X, 10X oder 20X Ziel, stellen Sie Ausdrucke der arteriolovenular Bündel, um einfach wieder zu lokalisieren die Bündel im gesamten Beobachtungszeitraum.
- Mit dem 20x-Objektiv und dem 50X Ziel, weitere Rekord 5-6 Kapillare Felder und "apoptotischen"Felder pro Fläche der Klappe sind. Alle Bilder mit dem 10X und 20X Ziele aufgenommen wurden das blaue Licht (Fluoreszenz Dextran) und grünes Licht (Rhodamin) Filter, während Bilder mit der 5X und 50X objektiven Verwendung blauem Licht (Fluoreszenz Dextran) und Weißlicht (Bisbenzimid) Filter aufgezeichnet, jeweils .
3. Analyse der aufgezeichneten Daten
HINWEIS: Bei der Verwendung eines computerunterstützten Bildanalysesystems Quantifizierung aller aufgezeichneten Parameter off-line wie folgt 29.
- Messung der Fläche der nicht-perfundierte bzw. nekrotischen Gewebes (mm 2).
- Verwenden Sie den vollständigen gescannt Raumfenster Bild mit dem 5X Ziel (von 2.6.1) aufgezeichnet und das fluoreszierende Dextran zu nicht-durchbluteten jeweils nekrotischen Gewebes zu messen. Verwenden Sie "AreaBo" Funktion, um die nicht-durchbluteten dunklen Bereich zu messen: border die nicht-durchbluteten Bereich und berechnen Sie die Fläche in mm 2 unter Verwendung der Software Gebiet Messalgorithmen.
- Messung der mikrovaskulären Durchmesser in Arteriolen, Kapillaren und Venolen (um).
- Last Video oder Bilder aus den aufgezeichneten AV-Bündel oder die kapillaren Felder in die Software. Für beste Ergebnisse verwenden Sie die Standbilder oder Videos mit der höchsten Vergrößerung, wo bestimmte Grenzen des Schiffes sind deutlich sichtbar.
- Mit der Funktion "DiamPe" der Software, um sicherzustellen, werden die Messungen senkrecht zur Wand des Schiffes durchgeführt. Um dies zu tun markieren zwei Punkten auf der Gefässwand und mit dem dritten Klick Marke der senkrechten Durchmesser des Gefäßes. Die Software wird die Messung in & mgr; m auszuführen.
- Wiederholen Sie die Messungen an den gleichen Gefäßen für alle Aufnahmen an der gleichen Stelle. Messung mehrerer Kapillaren mittleren Durchmesser ansammeln.
- Analyse von roten Blutzellen (RBC) Geschwindigkeit in Arteriolen, Kapillaren and Venolen (mm / sec).
- Für arteriolären roten Blutkörperchen (RBC) Geschwindigkeit (mm / s) Messungen mit der "VeloLSD" Funktion der Software, und wählen Sie die gleichen Schiffe in der fluoreszierenden Dextran Fenster, für das die Durchmesser gemessen worden.
- Analysieren mit dem computerunterstützten Bildanalysesystems unter Verwendung der Zeilenverschiebungsverfahren, die auf der Grundlage der Messung der Verschiebung (mm) einer einzelnen intravaskulären Graustufenmuster über der Zeit (sec) ist.
- Messung der volumetrischen Blutströmung in Gefßen (pl / sec).
- Volumetrischen Blutströmung (pl / sec) in den Arteriolen, Kapillaren und Venolen von RBC Geschwindigkeit und Gefäßquerschnittsfläche zu berechnen (π * r 2) entsprechend der Gleichung von Gross und Aroesty, dh Q = V * π * r 2 unter Annahme einer zylindrischen Behälterform 30.
- Messung der funktionellen Kapillardichte der RBC-perfundierten Kapillaren (nutritive Perfusion: cm / cm
- Legen Sie eine bespielte Fluoreszenz Kapillare Feld mit 20X Objektivvergrößerung in die Software. Mit der Funktion "DensLA" funktionelle Kapillardichte der RBC-perfundierten Mikrogefäße zu messen.
- Verfolgen Sie die perfundierten Kapillaren mit dem Cursor und markieren die durchblutete Gefäße. Markieren Sie nicht nicht-durchbluteten Kapillaren, Arteriolen oder Venolen. Die Software wird funktionelle Kapillardichte der perfundierten Kapillaren in cm / cm 2 zu messen. Wiederholen Sie die Schritte für die anderen aufgenommenen Kapillare Felder.
- Last aufgenommenen Videos oder Rahmen aus fluoreszierenden Kapillare Felder in die Software. Identifizieren gyrose Gefäße und die Funktion "TorqIx" der Software. Verfolgen Sie die definitive Gefäßfluss mit dem Verlauf und enden mit einem Rechtsklick. Die Software wirdeine gerade Linie für den direkten Weg und wird es im Zusammenhang mit der zurückverfolgt Weg zu bringen.
HINWEIS: Achten Sie auf Anzeichen von Angiogenese wie Knospen, Sprossen und neu gebildete Kapillaren, die in der Regel senkrecht von den bereits bestehenden Kapillaren ausgehen. Messung der Dichte der neu gebildeten Gefäße, wie in Schritt 3.5 beschrieben.
- Legen Bisbenzimid aufgenommene Videos (50X Objektiv) in die Software. Mit der Funktion "DenseNA". Markieren apoptotischen Zellen nach den genannten Eigenschaften wie Kernkondensation, Fragmentierung und Margination mit einem Linksklick.
- Nach Markieren aller charakteristischen Zellen im ganzen Video, klicken Sie auf "N / A" in der Software, die automatisch zu zählen alle markierten Zellen und teilen sie in der gesamten Region. Das Ergebnis wird sein, apoptotischeZellen / mm 2.
- Analysieren die entzündliche Reaktion durch Zählen der Anzahl von Rhodamin markierten Leukozyten, die die endotheliale Auskleidung der post-kapillaren Venolen für eine Zeitspanne von ≥30 sec ("Sticker") entsprechen und die intermittierenden anhaftenden Leukozyten (<30 sec, "Walzen") . Venulären Leukozytenadhärenz als Zellen pro mm 2 endotheliale Oberfläche angegeben.
- Beurteilen makromolekularen leakage als Parameter der mikrovaskulären Durchlässigkeit nach einer iv Injektion eines fluoreszierenden Dextran. Densitometrisch ermitteln mehreren Graustufen in das Gewebe unmittelbar benachbart zur Kapillare Gefäßwand (E1) sowie in der Randzellfreien Plasmas der Behälter (E2). Dann berechnen makromolekulare Extravasation (E) als das Verhältnis E1 / E2 31.
4. Postoperative Pflege
- Bringen Sie das Tier in einem separaten Käfig, um das Unternehmen von anderen Tieren zu vermeiden, bis vollständig erholt. Sie ein Tier nicht unbeaufsichtigt lassen, bis es ausreichend das Bewusstsein wiedererlangt, um Brustlage zu halten. Überwachung Tiere täglich für Blutungen, lokale und systemische Infektionszeichen und die Lage der Kammer.
- Werten Sie den allgemeinen Zustand des Tieres durch die Beobachtung der motorischen Aktivität, Körpergewicht, Anzeichen von Schmerzen, Toleranz gegenüber dem Verband und auto-Verstümmelung.
- Halten Sie den Mäusen eine pro Käfig Mutu vermeidenal Manipulation der Kammer. Bei Anzeichen von Schmerzen, gelten Buprenorphin in einer Dosis von 0,05 bis 0,1 mg / kg KG, subkutan in 8 Stunden Intervallen.
5. Euthanasie und Explantation des Hautkammer
- Am Tag 10, opfern Tiere mit einer Überdosis eines Narkose Droge (150 mg / kg Pentobarbital).
- Entfernen Sie die Kammer und probieren Sie die Klappe Gewebe zur immunhistochemischen und molekular Protein-Assays. Gewebeproben für die konventionelle Histologie (Formalin) und quantifizierbare Proteinassays (flüssiger Stickstoff oder Trockeneis).
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Representative Results
Nekrose
Der Hauptendpunkt dieses Modells - Gewebsnekrose folgenden Lappen (dh Induktion der akuten persistent Ischämie) - wiederholt gemessen und makroskopisch wie in Abbildung 3 über einen Zeitraum von 10 Tagen gezeigt dargestellt. Endgültige Festlegung Lappennekrose tritt in der Regel zwischen 5 und 7 Tage nach der Operation und wird durch einen roten Fransen, dh Zone Vasodilatation und mikrovaskuläre Remodeling gekennzeichnet, die sich zwischen dem proximalen und dem distalen Vital nekrotischen Zone der Klappe (Fig. 3D-F ). Unbehandelte Kontroll Mäuse entwickeln in der Regel eine nekrotischen Bereich von etwa 50% nach 10 Tagen, die in drei verschiedene Bereiche unterteilt werden können: die gut durchbluteten proximalen, die eingelagerten und kritisch durchbluteten zentralen Bereich und der nekrotischen distalen Bereich (Abb 3F.). Frühere Studien unserer Gruppe, wie in der Einleitung erwähnt, haben Schutz e gezeigtUSWIRKUNGEN nach unterschiedlicher Vorbehandlung Verfahren, die durch eine Verschiebung des kritischen perfundierten Bereich von der zentralen Zone zu dem distalen Bereich der Klappen gekennzeichnet sind.
Vessel Parameter
Mikrovaskulären Durchmesser und der roten Blutkörperchen (RBC) -velocity von Arteriolen und Venolen mit verschiedenen Durchmessern als auch von benachbarten Kapillaren gemessen und der resultierende Volumendurchblutung off-line berechnet. Dies ermöglicht die Korrelation sowohl morphologische und funktionelle Veränderungen der unterschiedlichen Mikrogefäßen von Tag 1 bis Tag 10 (Fig. 4A-B). Darüber hinaus ist die funktionelle Dichte der RBC-perfundierten Kapillaren, die Parameter für die nutritive Perfusion des Gewebes, untersucht. Die Kapillaren werden in der Regel in-parallel und mit einem Durchmesser von 3-5 um unter physiologischen Bedingungen (Fig. 4C) vorhanden orientiert. Durchblutung, funktionelle Kapillardichte und schließlich Sauerstoffspannung des TISSUE allmählich von proximal nach distal abnimmt, um einen Schwellenwert "Lebensfähigkeit" zu erreichen (Fig. 4C-G), wobei die Kapillaren nicht mehr (Fig. 4E) perfundiert.
Mikrovaskuläre Remodeling und Angiogenese
Umbau mit Dilatation und erhöhte Verwindung der Mikrogefäße in allen Versuchsgruppen unterzogen Flappräparation beobachtet werden (dh die Induktion von akuter Ischämie persistent: Fig. 4F). In diesem Modell ist jedoch ischämischen Reiz alleine nicht ausreicht, um die Angiogenese wie beispielsweise in einer Vielzahl von Vorbehandlungsversuche mit dem Hormon Erythropoietin (Fig. 4G-H) gesehen, zu induzieren. Die neuen funktionellen mikrovaskulären Netzwerken, die in der Regel von mikrovaskulären Knospen und Sprossen senkrecht von ausgeh entwickeln die bereits bestehenden in-parallel angeordneten Kapillaren sind erste sichtbare zwischen Tag 3 und 5.
Entzündungsreaktion (Leukozyten-Endothel-Interaktionen und Apoptose)
Akute Ischämie induziert persistent gewöhnlich eine beträchtliche Entzündungsreaktion in unbehandelten Tieren, die durch Anhaften von Leukozyten an die mikrovaskulären Endothel dargestellt ist. Diese Entzündungsreaktion wird durch Walzen (dh intermittierende Adhäsion von Leukozyten an das vaskuläre Endothel) und das Festhalten (dh feste Adhäsion von Leukozyten an das vaskuläre Endothel) Leukozyten (Fig. 5A-B) ist. Darüber hinaus kann eine Ischämie induzierte Zunahme der apoptotischen Zellen in allen Kontrolltieren mit den charakteristischen Zeichen der Kernkondensation, Fragmentierung und margination (Fig. 5C-D) gesehen werden. Beide, Leukozyten-Endothel-Interaktion und Apoptose sind Zeichen für die Ischämie-induzierten Entzündungsreaktion und nach und nach mit progressiven mikrovaskulären Dysfunktion zu erhöhen und verringerte Sauerstoffspannung des Gewebes (dh (Fig. 5A-D)).
Abbildung 1. Illustration des Titankammerrahmen und alle ihre Werkstücke. (A) Zerlegt Rahmen aus zwei Rahmenteilen, drei Schrauben, fünf Nüsse, ein Stück Schaumstoff, einem Deckglas und einem Sprengring. (B) Benötigte Werkzeuge, um den Rahmen mit einer Sechskantmutter-Treiber, einen Sprengring Zange und einem Drahtschneider zubauen. Ein Schraubenzieher ist nicht erforderlich, aber empfehlenswert, wenn Kammern mehrmals verwendet werden. (C) montiert Einkammer Teile. Links: Rückseite des Rahmens mit zwei Schrauben befestigt und Muttern an den unteren zwei Löcher. Die Rückseite wird verwendet, um den Rahmen auf die Haut zu nähen, und trägt die Klappe. Rechts: Assembled Vorderseiteder Rahmen mit aufgesetzter Schaum um die Dichtheit zu garantieren. Beachten Sie, dass alle drei Schraubenlöcher sind schaumfrei gehalten. Stellen Sie sicher, dass keiner der Schaum in das Beobachtungsfenster, das das Deckglas trägt gedrückt werden. (D) Schematische montiert Kammerrahmen ohne Rückenhaut.
Abbildung 2. Abbildung des operativen Klappenverfahren und deren Umsetzung in der Titanrückenhautkammer der Maus. (A) Erhöhte trans beleuchtet verdoppelt Rückenhaut der Maus, um Gefäßarchitektur für umreißt die Position der Rückenhautkammer zu visualisieren. (B) Die Rückseite der Kammer Titanrahmen positioniert und mit den Gefäßen ausgerichtet. Der Schnitt von zwei Löchern für die Schrauben zur Befestigung der Frontseite des Rahmens zu befestigen has gemacht. (C und D) umreißt der Klappe auf der Rückenhaut seitlich: Die Breite-zu-Länge-Verhältnis beträgt 15 mm bis 11 mm, während die Zentralisierung der zwei rechtwinklig sich Gefäße. Ein 2 mm Abstand zur Gegenseite (nicht markierten Bereich zwischen dünne Klappe Umriss und dicken Rand) wird verwendet, um die Haut mit einer Pinzette fassen, um die Klappe zu heben. Für die Beobachtung der Rückseite der Haut durch das Kammerfenster, zusätzliche Gewebe entfernt werden (schraffierte Fläche). (E) Erhöhte seitlich basierte Hautlappen, was die zufällig angeordneten Gefäßarchitektur von der Basis der Klappe Ursprung. Der schraffierte Bereich ausgeschnitten worden ist, aber immer noch an der Klappe befestigt ist und in dem nächsten Schritt entfernt (hängende Haut unterhalb der Zange). (F) Montage der Rückseite des Kammerrahmen. Die Hautoberfläche der Klappe auf der Rückseite und der "rohen" Fläche unter der Glasfensterseite. Die chamber`s Schrauben thr steckenough die eingeschnittenen Öffnungen auf beiden Seiten des Rückenhaut. (G) Die umgebende Haut, vorn und hinten, von der Klappe in die Löcher der oberen Kammerrand fixiert. (H) Der Hautlappen wird gestreckt und an der Rückseite des Rahmens genäht. Zur Dehydratisierung der Klappe zu vermeiden, wird 0,9% Natriumchlorid-Lösung auf die Klappe wiederholt getropft. (I) der Klappe und der umgebenden Haut vollständig in den Löchern der oberen Kammerrand fixiert. Die Klappe ist wieder seitlich in den benachbarten Rückenhaut vernäht, um Dichtheit der Kammer zu gewährleisten. (J) Montage des Schaumtragenden Gegenstück des Rahmens, das Beobachtungsfenster umgibt. (K) komplett montiert Kammer: Ein Deckglas wird auf den Beobachtungsfenstern angebracht und mit einem Sprengring abgedichtet. Eine dritte Schraube ist an der Oberseite des Rahmens für zusätzliche Dichtigkeit angebracht. Das Fenster in der Kammer ermöglicht wiederholten Analysen der microvasculature der Klappe durch Intravitalmikroskopie. Für einen leichteren Zugang während Mikroskopie die drei Schrauben werden verkürzt. (L) Awake und Bewegen der Maus mit montierten Rückenhautkammer.
Abbildung 3. Darstellung der morphologischen Entwicklung und Abgrenzung des Lappennekrose an den Tagen 0 (unmittelbar nach Lappenpräparation, A), 1 (B), 3 (C), 5 (D), 7 (E) und 10 (F) . Schluss nekrotischen Abgrenzung erfolgt zwischen den Tagen 5 und 7 (D und E). Kontrollen zeigen eine deutliche Zone der Abgrenzung innerhalb des zentralen Klappenbereich, einschließlich einer roten Fransen und einem weißen Falx (Doppelpfeilspitze und Sternchen in E), was auf einen hyperämisch Antwort und mikrovaskuläre Remodeling sowie eine nicht-durchbluteten, aber potenziell lebensfähigen Bereich Abgrenzung Gewebe Nekrose entwickeln distal (E). In Panel F, die KlappeGewebe wird in drei verschiedene Bereiche von 2 horizontalen Zeilen unterteilt: die gut durchbluteten proximale Zone (auf der Basis des Bildes), die kritisch perfundierten Mittelzone (einschließlich der roten Fransen eine die weiße "falx lunatica" entsprechend den Halbschatten in ischämische Hirn Gewebe nach Schlaganfall Verletzung) und nekrotischen distalen Zone (in Umfangsrichtung durch rote Umrandung markiert). Vergrößerung 16X.
Abbildung 4. Intra Epifluoreszenzmikroskopie Anzeigen von Bildern arteriovenöse (AV) Bündel (A, B), Verbindungsfelder (C, D, E) und morphologische Veränderungen wie Umbau (F) und Angiogenese (G, H). Intravitalmikroskopie, die die gleichen AV-Bündel in einem Kontrolltier (A, B) am Tag 1 (A) und 10 (B). Man beachte die Abwesenheit von dilatory Reaktion in Kontrollen über den gesamten Beobachtungszeitraum in beiden arteriolAr (a) und Venolen (v) Durchmesser. Bilder C, D und E demonstrieren parallel in der gut durchblutete proximale Zone (C), kritisch perfundierten zentralen Übergangszone (D) und dem nicht-durchbluteten nekrotischen distale Zone (E) des ischämischen Gewebeklappe angeordnet Kapillaren. In den kritisch perfundierten zentralen Zone Kontrollmäusen nur zeigen vaskuläre Remodeling (F), die parallel angeordnet sind Kapillaren mit Dilatation und erhöhte Tortuosität gekennzeichnet durch. Im Gegensatz dazu Mäuse, die Erythropoietin vor Klappe Höhe wie ein Präkonditionierung Regime zeigen neu gebildeten und senkrecht entstehenden Kapillaren, die eindeutig von üblichen vorbestehenden Kapillaren (G, H) sind. Diese angiogene Antwort wurde nicht bei den Kontrollen festgestellt wurden. Kontrastverstärkung mit fluoreszierenden Dextran 150.000. Vergrößerung 80X.
Abbildung 5. </ Strong> Intravital Auflicht-Fluoreszenz-Mikroskopie Anzeige AV-Bündel in der gut durchbluteten proximalen Klappe Zone (A) und dem von der Kritik durchbluteten ischämischen zentralen Übergangszone des Gewebes (B). Beachten Sie die verstärkte Präsenz von anhaftenden Leukozyten (Pfeile) in postkapillaren Venolen (v) und Arteriolen (a) innerhalb des ischämischen Klappe Zone (B), wenn die gesunde proximale Zone (A) verglichen. Kontrastverstärkung mit Rhodamin. Vergrößerung 80X. Intravital Epifluoreszenzmikroskopie Anzeigen Kernkondensation anzeigt apoptotischen Zelltod innerhalb des proximalen (C) und kritisch perfundierten zentralen Klappenbereich (D) der Kontrollen. Eine erhöhte Anzahl von apoptotischen Zellen (weiße Pfeile) in dem mehr ischämischen zentralen Übergangszone (D) beobachtet, wenn im Vergleich zu den proximalen Zone (C). Kontrastverstärkung mit Bisbenzimid. Vergrößerung 250X.
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Discussion
Um ischämischen Komplikationen zu verringern und dadurch die Verbesserung der klinischen Ergebnisse wird genauere Kenntnis der pathophysiologischen Prozesse bei kritisch durchbluteten Gewebeklappe erforderlich. Die Entwicklung neuer Tiermodelle, die akute persistent Ischämie imitieren ist daher zwingend. Dementsprechend konnten wir eine leicht reproduzierbare und zuverlässige Modell erlaubt für sich wiederholende morphologischen, dynamische und funktionale Echtzeit-Auswertung der verschiedenen Parameter des Muskel- und Hautgefäßsystem, die mit immunhistochemischen und molekularen Analyse des abgetasteten Klappengewebe korreliert werden kann zu entwickeln.
Das chirurgische Verfahren keine spezifischen chirurgischen Fähigkeiten erfordern, obwohl die Praxis und einige manuelle Geschicklichkeit erforderlich ist. Eine Lernkurve von etwa 25-30 operierten Tieren ist in der Regel notwendig, die Montage der Rückenhautkammer und Flappräparation richtig zu meistern. In erfahrenen Händen, die Zeit für die Operation durchschnittlich 35 Minuten. EntscheidendSchritte Flappräparation umfassen die korrekte Anordnung und Kontur der Klappe in der Mitte der Fenster der Kammer mit genauer Positionierung der Hauptgefäße (mittels Transillumination) durchtrennt werden und die sorgfältige Entfernung des gelatineartigen Schicht über dem Panniculus carnosus Verwendung von Bild Vergrößerung die Bildqualität zu verbessern.
Seit Klappe Abmessungen sind in Millimetern angegeben, empfehlen wir, ein Schwimmsattel für eine korrekte Klappe Kennzeichnung. Wenn es irgendwelche Schwierigkeiten beim Positionieren der horizontal angeordneten dominanten Gefäße innerhalb des Fensters der Kammer sollte man lieber ein distaler als eine proximale Position der Gefäße. Die korrekte Positionierung dieser Schiffe, die das Fenster der Kammer quer garantiert Durchtrennung dieser während Anheben der Klappe von distal nach proximal und die Ergebnisse in einer zufällig durchbluteten Klappe. Mit anderen Worten, das Versagen der schneiden diese großen Schiffe werden in einer axialen Durchblutung führenMuster ohne Nekrose des Gewebes unter dem Fenster. Die endgültige entscheidender Schritt bei der Herstellung chirurgischer betrifft die Entfernung des gelatineartigen Zellgewebeschicht. Die Erfahrung hat gezeigt, dass die übermäßige Entnahme schädigt die darunter liegenden Panniculus carnosus und so das empfindliche horizontal angeordneten Muskel Kapillaren. Umgekehrt, konservativ Entfernungsergebnisse in Ödem-Bildung und schließlich begrenzt Sichtbarkeit der Regionen von Interesse während der Mikroskopie. Wenn alle diese Schritte werden mit Sorgfalt beherrscht, entwickelt die Klappe sehr konstant etwa 50% Nekrose 10 Tage nach Lappenhebung. Dies ermöglicht das Studium verschiedene therapeutische Strategien, verbessern oder verschlechtern Überleben des Klappengewebes kann. Schließlich ist die Methode der Intravitalfluoreszenzmikroskopie ein etabliertes Verfahren, um mikrovaskuläre Gewebedurchblutung zu beurteilen und kann sehr schnell erlernt werden.
Der Hauptnachteil dieses Modells ist die begrenzte Beobachtungszeit des Gewebes innerhalb der Kammer217; s Fenster von etwa 10 bis 14 Tagen nach Lappenpräparation. Dies ist aufgrund der fortschreitenden Ablösen der Haut proximal zum Rückenhautkammer, die sich letztendlich in einer seitlichen Verkippung der Kammer. Selten, zieht der sandwichartigen, festen Haut von der Kammerrahmen und macht Mikroskopie möglich. Seit Nekrose wird meist vollständig zwischen Tag 5 und 7 nach der Operation abgesetzt, dies nicht wirklich Datenerfassung beeinträchtigen vor dem Kippen der Kammer oder Herausziehen der Haut innerhalb der Kammer.
Vorteile des Modells sind die einfache Reproduzierbarkeit und die mögliche Verwendung von gentechnisch veränderten Tieren. Die relativ geringe Größe des Fensters, das zu beurteilen kann möglicherweise jedoch die Bedeutung Kompromisse bei der Umsetzung der Ergebnisse in die menschlichen Bedingungen werden. Darüber hinaus gibt es anatomischen Unterschiede zwischen loser Haut Tieren und Menschen. Während die Tiere und chirurgische Instrumente haben einen angemessenen Kostenwirksamkeit, die harD- und Software notwendig Mikroskopie (epi-Beleuchtungsmikroskop, hochauflösende Kamera, fluoreszierende Farbstoffe und spezieller Software für off-line Datenanalyse) eine größere Anlagezuführen.
Fazit:
Wir präsentieren eine zeit- und kosteneffektive Tiermodell bei Mäusen, die Visualisierung und Quantifizierung von Mikrozirkulationsparameter ermöglicht bei hoher Auflösung. Dieser Ansatz stellt eine ideale Methode, um kritisch perfundierten musculocutaneus Klappe Gewebe und die zugrunde liegenden zellulären Mechanismen zu analysieren. Morphologische Veränderungen der Bereiche von Interesse wiederholt untersucht und mit funktionellen Veränderungen auf zellulärer Ebene und mikrovaskulären korreliert werden. Nach intravital Epifluoreszenzmikroskopie kann das Gewebe ferner mit histologischen und molekularen Ansätzen verarbeitet.
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Acknowledgments
Wir danken Katharina Haberland für die Bildbearbeitung. Finanzierung: Der leitende Autor erhielt eine KKF Zuschuss der Technischen Universität München die Einrichtung eines neuen Forschungslabor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57Bl/6 mice, 6-8 w, 20-22 g | Charles River | ||
| Depilation cream | Balea | Any depilation cream | |
| Titanium chamber | Irola | 160001 | Halteblech M |
| Custom-made Plexiglass mounting frame | Frame to secure chamber to avoid chamber movement due to the animal's respiration. | ||
| Slotted cheese head screw | Screws and More | 842210 | DIN84 M2x10 |
| Hexagon full nut | Screws and More | 93422 | DIN934 M2 |
| Snap ring | Schaefer-Peters | 472212 | DIN472 J12x1,0 |
| Cover glass | Volab | Custom-made cover glass, 11.8 mm in diameter. | |
| Fixing foam | tesamoll | 05559-100 | tesamoll Standard I-Profile |
| Ketamine hydrochloride | Parke Davis | Ketavet® | |
| Dihydroxylidinothiazine hydrochloride | Bayer | Rompun® | |
| Buprenorphin | Essex Pharma | Temgesic® | |
| Saline 0.9% | |||
| Desinfection alcohol | |||
| Vicryl 5-0 | Ethicon | V 490 H | |
| Ethilon 5-0 | Ethicon | EH 7823 H | |
| 1 ml syringes | |||
| Surgical skin marker with flexible ruler | Purple surgical | PS3151 | Any surgical skin marker and flexible ruler |
| Pointed scissors | |||
| Micro-Scissors | |||
| Normal scissors | |||
| 2 clamps | |||
| Fine anatomic forceps | |||
| Micro-forceps | |||
| Hex nuter driver | wiha | 1018 | |
| Screwdriver | wiha | 685 | |
| Snap ring plier | Knipex | 4411J1 | 12-25 mm |
| Wire cutter | Knipex | 70 02 160 | Wire cutter is used to cut screws short; 160 mm |
| Trans-illumination light | IKEA | 501.632.02 | LED light Jansjö; any light |
| Magnification glasses | |||
| Intravital microscope | Zeiss | 490035-0001-000 | Scope.A1.Axiotech |
| LED system | Zeiss | 423052-9501-000 | Colibri.2 |
| LED module 365nm | Zeiss | 423052-9011-000 | |
| LED module 470nm | Zeiss | 423052-9052-000 | |
| LED module 540-580nm | Zeiss | 423052-9121-000 | |
| Filter set 62 62 HE BFP + GFP + HcRed | Zeiss | 489062-9901-000 | Range 1: 350-390 nm excitation wavelength, split 395 nm / 402-448 nm; range 2: 460-488 nm, split 495 nm / 500-557 nm; range 3: 567-602 nm, split 610 nm / 615 nm to infinite. |
| Filter set 20 Rhodamine | Zeiss | 485020-0000-000 | 540-552 nm, split 560 nm, emission 575-640 nm |
| 2.5X objective NA=0.06 | Zeiss | 421020-9900-000 | A-Plan 2.5X/0.06 |
| 5X objective NA=0.16 | Zeiss | 420330-9901-000 | EC Plan-Neofluar 5X/0.16 M27 |
| 10X objetive NA=0.30 | Zeiss | 420340-9901-000 | EC Plan-Neofluar 10X/0.30 M27 |
| 20X objective NA=0.50 | Zeiss | 420350-9900-000 | EC Plan-Neofluar 20X/0.50 M27 |
| 50X objective NA=0.55 | Zeiss | 422472-9960-000 | LD Epiplan-Neofluar 50X/0.55 DIC 27 |
| ZEN imaging software | Zeiss | ZenPro 2012 | |
| CapImage | Dr. Zeintl | ||
| Fluorescein isothiocyanate-dextran | Sigma-Aldrich | 45946 | |
| bisBenzimide H 33342 trihydrochloride | Sigma-Aldrich | B2261 | Harmful if swallowed; causes severe skin burns and eye damage, may cause respiratory irritation. |
| Rhodamine 6G chloride | Invitrogen | R634 | Harmful if swallowed; may cause genetic defects; may cause cancer; may damage fertility or the unborn child. |
| Pentobarbital | Merial | Narcoren® |
References
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