Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Medicine

Iskæmisk væv skade i Dorsal hudfolden Afdeling Mus: En hudlap modellen til Akut Persistent Iskæmi

doi: 10.3791/51900 Published: November 17, 2014

Abstract

Trods dyb ekspertise og avancerede kirurgiske teknikker er iskæmiinduceret komplikationer lige fra sår nedbrydning omfattende vævsnekrose stadig forekommer, især i rekonstruktiv flap kirurgi. Flere eksperimentelle flap modeller er blevet udviklet til at analysere de underliggende årsager og mekanismer og til at undersøge behandlingsstrategier for at forebygge iskæmiske komplikationer. Den begrænsende faktor i de fleste modeller er den manglende mulighed for direkte og repetitivt visualisere mikrovaskulær arkitektur og hæmodynamik. Målet med protokollen var at præsentere en veletableret musemodel affilierede disse før nævnte mangler elementer. Harder et al. Har udviklet en model af en musculocutaneous klap med en tilfældig perfusion mønster, som gennemgår akut vedvarende iskæmi og resulterer i ~ 50% nekrose efter 10 dage, hvis de holdes ubehandlet. Ved hjælp af intravital epi-fluorescens mikroskopi, dette kammer model muliggør gentagne visualisering afmorfologi og hæmodynamik i forskellige regioner af interesse over tid. Associerede processer, såsom apoptose, inflammation, mikrovaskulær lækage og angiogenese kan undersøges og korreleres til immunohistokemiske og molekylære protein assays. Til dato har den model bevist gennemførlighed og reproducerbarhed i flere publicerede eksperimentelle studier, der undersøger effekten af ​​præ-, peri- og postconditioning af iskæmisk udfordret væv.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Dækning af eksponeret sene, knogle og implantat materiale i rekonstruktionskirurgi bygger på anvendelsen af ​​flapper. En klap er en blok af væv, der overføres på vaskulære stilken, der garanterer arteriel indstrømning og venøs udstrømning. Trods bred ekspertise og tilgængeligheden af ​​en bred vifte af flapper, der skal overføres, er iskæmiinduceret komplikationer lige fra sår nedbrydning til total vævstab stadig stødt. Betragtninger kan forventes konservativ behandling og helbredelse ved sekundær intention efter mindre vævsnekrose, betydelig flap nekrose normalt kræver kirurgisk revision, herunder debridement, sår konditionering og sekundær rekonstruktion. Dette øger sygeligheden, forlænger hospitalsophold og dermed fører til øgede udgifter til sundhedspleje.

Flapper med en udefineret mønster af vaskulatur eller tilfældigt perfunderede områder i den distale zone længst væk fra arteriel indstrømning er særligt tilbøjelige til iskæmisk skade. Acco rdingly har adskillige eksperimentelle og kliniske undersøgelser evalueret udviklingen af nekrose i både aksial mønster klapper (defineret blodforsyning) og tilfældigt mønster klapper (udefineret blodforsyning) 1-3. De vigtigste resultater er almindeligt baseret på makroskopisk vurdering af størrelsen af ​​det nekrotiske område. For at vurdere årsagerne til og mekanismerne i vævsnekrose mere i detaljer, flere undersøgelser fokuseret på analysen af ​​mikrocirkulationen. Forskellige teknikker er blevet anvendt til at måle vævsperfusion, herunder en analyse af væv oxygenspænding hjælp polarografiske elektroder 4-5, samt måling af blodgennemstrømningen ved hjælp af laser Doppler-flowmetri 6-7, dye diffusion 8 og mikrosfærer 9-10. Disse teknikker imidlertid kun mulighed for at måle indirekte parametre vævsperfusion og ikke aktivere nogen morfologisk analyse af microhemodynamic processer i et enkelt område af interesse af en klap.

t "> Sandison er kendt for at være de første, der har anvendt en transparent kammer til langvarig in vivo-undersøgelser, som han udførte i kaniner 11 I 1943 -. ca. 20 år senere - Algire var den første til at tilpasse en sådan transparent kammer til anvendelse i mus for at undersøge opførslen af mikro-implantater af tumorceller 12. På grund af den kendsgerning, at mus er såkaldte løse hud dyr og efter nogle tekniske forbedringer i de følgende år Lehr og medarbejdere var i stand til at tilpasse sig en sådan en dorsal skinfold kammer udvikle en mindre og lettere titanium kammer. Dette kammer aktiveret evaluering under anvendelse af intravital fluorescensmikroskopi, en teknik, der giver mulighed for direkte og gentagne visualisering af et antal morfologiske og mikrocirkulatoriske funktioner og deres ændringer over tid under forskellige fysiologiske og patofysiologiske tilstande, såsom iskæmi-reperfusionsskade 13.

I undersøgelsen af ​​perfusion af hud, muskler og knogler flaps under normale og patologiske tilstande to tendenser opstod: For det første de "akutte" klap-modeller, der ikke bruger den dorsale skinfold kammer såsom pedicled øre klap i musen 14, sideværts baseret ø hudlap den i hamster 15 og pedicled sammensatte klap i rotten 16. Sekund, "kronisk" flap model, hvor kombinationen af ​​en klap med en dorsal skinfold chamber tillader gentagne mikrocirkulatorisk analyser over flere dage med intravital fluorescensmikroskopi. Den består af en tilfældigt perfunderet musculocutaneous flap, der er integreret i skinfold kammer af musen 17. Dens bredde-til-længde forholdet blev valgt således, at en situation med akut vedvarende iskæmi konsekvent resulterer i ~ 50% flap vævsnekrose 10 til 14 dage efter flap elevation. Denne reproducerbar omfanget af vævsnekrose tillader yderligere vurdering af begge, beskyttende (dvs. udvikling af less nekrose) og skadelige faktorer (dvs. udvikling af mere nekrose) på klap patofysiologi. I de seneste år har flere eksperimentelle publikationer viser virkningen af forskellige præ-, peri- og post-conditioning procedurer, herunder administration af vævs-beskyttende stoffer 18-24 og den lokale anvendelse af fysiologiske stressfaktorer såsom varme 25 og chokbølger 26, er dukket op.

De kvantitative analyser af nekrose, mikrovaskulære morfologi og mikrocirkulatoriske parametre kan yderligere korreleret til immunohistokemiske analyser og protein assays. Forskellige proteiner og molekyler, herunder vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF), nitrogenoxidsyntaser (NOS), nuklear faktor kappa B (NF-KB) og varmechokproteiner (HSP-32: hemoxygenase 1 (HO-1) og HSP- 70) er blevet vist at spille en rolle i vævsbeskyttelse. Baseret på dette kammer flap model, har to ændringer er udviklet i order til at analysere neovaskularisering og mikrocirkulationen under hudtransplantation healing 27 og angiogene udviklingen i en pedicled klap med aksial mønster perfusion 28. Vi præsenterer en reproducerbar og pålidelig model, der inkluderer en iskæmisk udfordret musculocutaneous klap i musen skinfold kammer. Denne model giver mulighed for visualisering og kvantificering af mikrocirkulationen og hæmodynamik ved intravital epi-fluorescens mikroskopi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

BEMÆRK: Inden gennemførelse af den præsenterede model, må love de tilsvarende dyrebeskyttelse høres og tilladelse skal indhentes fra de lokale myndigheder. I dette arbejde blev alle forsøg udføres i overensstemmelse med de vejledende principper for forskning, der omfatter dyr og den tyske lovgivning om beskyttelse af dyr. Forsøgene blev godkendt af de lokale dyr pleje udvalg.

1. Animalske Forberedelse og Kirurgisk Elevation af klappen

  1. Holde dyr i enkelte bure ved stuetemperatur på 22-24 ° C og ved en relativ fugtighed på 60-65% med en 12-timers dag-og-nat cyklus. Tillad mus fri adgang til drikkevand og standard laboratorium chow. Opretholde altid sterile betingelser under overlevelse kirurgi.
  2. Bedøve mus ved intraperitoneal (ip) injektion af 0,1 ml saltvandsopløsning per 10 g legemsvægt indeholdende 90 mg / kg legemsvægt ketamin-hydrochlorid og 25 mg /kg legemsvægt dihydroxylidinothiazine hydrochlorid. Anæstesi er nødvendig for tilberedning af animalske, kirurgi og efterfølgende mikroskopi. Bekræfte korrekt bedøvelse ved at kontrollere reaktionen på en smertefuld stimulus. I den tid af anæstesi, gælder dyrlæge salve på øjnene for at forhindre tørhed.
  3. Efter induktion af tilstrækkelig anæstesi, fjerne hår på ryggen med en elektrisk barbermaskine. Herefter gælder hårfjerning creme til det barberede område for at fjerne de resterende hår.
  4. Under opholdstiden for hårfjerning fløde ~ 7-10 min, forberede instrumenter, herunder huden pincet og mikro pincet, saks og mikro saks, suturmateriale og en tuschpen. Desinficere og forberede titanium kammeret ved anvendelse af de to skruer med møtrik ved kammerets base og ved fastsættelse selvklæbende skum (fig. 1 AC) omkring vinduet af kammeret modstykke for at sikre tæthed af kammeret system.
  5. Fjerne alle hårfjerning fløde fra bagsiden ved vaskdet af med lunkent vand. Så tør og desinficere huden med en alkohol-opløsning.
  6. Anbring musen i maveleje-positionen og definere midterlinien af ​​ryggen. Tag fat i huden centralt og løft den op for at skabe en fold (Fig. 2A). Ved trans-belysning ved hjælp af enhver form for lyskilde, beslutte, hvor provisorily placere titanium rammen (fig. 2B). Sørg for, at de distale grene af den laterale thorax arterie (LTA) kranialt og den dybe circumflex bækkenpulsåre (DCIA) kaudalt kursus gennem midten af kammerets vinduet (Fig. 2B-D). Når positioneringen af ​​kammeret er færdig, perforere begge lag af huden på bunden af ​​folden til senere fiksering af titanium ramme. Nu fjerne titanium ramme, placer musen i udsat position og omdefinere midterlinjen af ​​tilbage, hvis det er nødvendigt.
  7. Outline klappen vinkelret på rygsøjlen starter ved midterlinjen med en bredde-til-længde forhold på 15 x 11 mm resulterer i en sideværts baseret og tilfældigt perfunderet flap. Derefter skitsere en yderligere hudområde på 2 mm, der strækker sig til den kontralaterale side (Fig. 2C, D). Dette område er plukket med pincet og senere sutureres til titanium ramme uden at interferere med den synlige flapområdet.
  8. Efter den endelige markering, incise flappen. Dermed transektere både LTA og DCIA og løfte klappen (fig. 2E). Der er ikke behov for koagulation eller ligering af de overskårne fartøjer.
  9. Placer kammerets skruen gennem de tidligere foretagne hud perforationer (fig. 2F) og fiksere hudfolden både fortil og bagtil i kammeret ramme af den forhøjede flap på bagsiden del af rammen ved hjælp af huller i kammerets ramme og en 5-0 afbrudte suturer (Fig. 2G).
  10. Suturere de lodrette led af klappen tilbage til den omgivende hud ved hjælp af 5-0 afbrudte suturer (
  11. Udskære en hemi-cirkulært hudområde laterale til den lille strimmel hud på 2 mm, dvs., på den anden side af klappen for at observere flappen vaskulatur. Dette giver mulighed for direkte visning gennem vinduet observation af kammeret, der har en overflade på 90 mm2.
  12. Fjern gelatine-lignende løs areolar væv fra tværstribede muskler ved hjælp af mikrokirurgiske instrumenter og optisk forstørrelsesglas eller mikroskop for at forbedre kvaliteten billedet under mikroskopi. Prøv ikke at beskadige fartøjer inden muskelvævet lag.
  13. Endelig forsegle kammeret ved at montere modstykke til den ramme, der tidligere er blevet udrustet med selvklæbende strimler af skum fortil, kranialt og bagtil, bedew flappen med aktuel bisbenzimid og saltvand (Fig. 2J). Derefter anvende observation vindue med et dæksel glasset med en snap ring. Prøv ikke at fange nogen luft blærer under glasset (Fig. 2K, L). Huden vil klæbe til dækglasset ved adhæsionskræfter.

2. Intravital epifluorescensmikroskopi

  1. Vent 24 timer efter kirurgisk forberedelse til den første mikroskopisk analyse for ideel optisk kvalitet. Denne analyse repræsenterer baseline af mikroskopi og gentages på dag 3, 5, 7 og 10 efter operationen. Hver gang, bedøve mus som beskrevet i trin 1.2. Placer dyret i en lateral dekubital position på et skræddersyet Plexiglas luftfartsselskab. På den måde bliver muskelvævet lag af klappen klæber til dækglasset vender up-afdelinger.
  2. Injicere 0,05 ml af 5% grøn fluorescens dextran (molekylvægt 150.000) og 0,05 ml 1% stærkt fluorescerende rhodamin familie farvestof i en halevene eller retro-bulbar venøse plexus. Det grønt fluorescerende dextran pletter ikke-cellulære blodkomponenter, hvis den anvendes intravenøst ​​(iv). Den fluorescerende Rhodamin pletter leukocytter og blodplader, som kan være distinguished fra andre cellulære og ikke-cellulære komponenter. Endelig bisbenzimid pletter nukleare komponenter, der udsender mere eller mindre fluorescens efter staten af ​​kondensvand.
  3. Efterfølgende placere musen under mikroskopet. Sørg mikroskopet omfatter et LED-system - LED stråle kombinationer for 470 & 425 nm, 365 & 490 nm, og 540 & 580 nm samt de tilsvarende filtrer sæt (62 HE BFP / GFP / HcRed, størrelsesordenen 1: 350 til 390 nm excitationsbølgelængde, opdele 395 nm / 402 til 448 nm; række 2: 460-488 nm, fordelt 495 nm / 500 til 557 nm; række 3: 567-602 nm, fordelt 610 nm / 615 nm til uendelig 20 rhodamin, range. : 540-552 nm, fordelt 560 nm, emission 575-640 nm).
  4. Optag stillbilleder og Motion-billeder ved hjælp af en ladningskoblet anordning videokamera og gemme dem på computerens harddisk for yderligere off-line analyse.
  5. Brug forskellige målsætninger (2,5X, NA (blændetal) = 0,06 for panorama udsigt over kammerets 5X,NA = 0,16; 10X, NA = 0,32; 20X, NA = 0,50; 50X, NA = 0,55) for optagelser af områder af interesse.
  6. Næsten opdele klappen overflade, der er synlig gennem kammeret vindue i tre områder af ens højde, dvs. en proksimal, en central, og en distal område længst væk fra det vaskulære indstrømning (Fig. 3F). For billedet erhvervelse, fortsæt på følgende måde på hver observation tidspunkt:
    1. Scan vævet billede efter billede i kammeret vindue fra proximal til distal vha 5X mål.
    2. I hvert område af klappen, skal du vælge anden- eller tredje-ordens arterioler og deres ledsagende venuler med let identificerbare forgrening mønstre. Brug af 5X, 10X eller 20X objektiv, lave udskrifter af arteriolovenular bundter, så du nemt re-lokalisere bundterne i hele observationsperioden.
    3. Med 20X objektiv og 50X objektiv yderligere record 5-6 kapillære felter og "apoptotisk"felter per areal af klappen hhv. Alle billeder optaget med 10X og 20X mål bruge det blå lys (fluorescerende dextran) og grønt lys (Rhodamin) filter, hvorimod billeder optaget med 5X og 50X objektiv brug blåt lys (fluorescerende dextran) og hvidt lys (bisbenzimid) filter, henholdsvis .

3. Analyse af registrerede data

BEMÆRK: Ved brug af en computer-assisteret billedanalysesystem kvantificere alle registrerede parametre off-line som følger 29.

  1. Måling af området for ikke-perfunderede henholdsvis nekrotisk væv (mm 2).
    1. Brug den komplette scannede kammer vindue billede optaget med 5X mål (fra 2.6.1) og fluorescerende dextran at måle ikke- perfunderet henholdsvis nekrotisk væv. Brug "AreaBo" funktion til at måle ikke-perfunderede mørke område: grænse ikke- perfunderet område og beregne arealet imm 2 ved hjælp af software-området måling algoritmer.
  2. Måling af microvascular diameter i arterioler, kapillærer og vener (pm).
    1. Load video eller billeder fra de optagede AV-bundter eller de kapillære felterne ind i softwaren. For de bedste resultater bruge stillbilleder eller videoer med den højeste forstørrelse, hvor bestemte grænser af fartøjet er klart synlige.
    2. Brug "DiamPe" -funktionen af ​​softwaren for at sikre målingerne udføres vinkelret på skibets væg. For at gøre dette markerer to punkter på fartøjet væg og med tredje klik mærke den vinkelrette diameter af karret. Softwaren vil udføre målingen i um.
    3. Gentage målingerne på samme fartøjer til alle optagelser på samme sted. Måle flere kapillærer at akkumulere gennemsnitlig diameter.
  3. Analyse af røde blodlegemer (RBC) hastighed i arterioler, kapillærer ennd venuler (mm / sek).
    1. For arteriolær røde blodlegemer (RBC) hastighed (mm / s) målinger bruge "VeloLSD" -funktionen af ​​softwaren og vælge de samme fartøjer i fluorescerende dextran vindue for hvilke der er målt diametre.
    2. Analysere det med computer-assisteret billedanalyse system ved hjælp af linjeskift metoden, som er på basis af måling af forskydningen (mm) af en individuel intravaskulær grå niveau mønster over tid (sek).
  4. Måling af volumetrisk blodgennemstrømningen i skibe (pl / sek).
    1. Beregn volumetrisk blodgennemstrømning (pl / sek) i arterioler, vener og kapillærer fra RBC hastighed og fartøj tværsnitsareal (π * r 2) ifølge ligningen for Gross og Aroesty, dvs. Q = V * π * r 2 under forudsætning af en cylindrisk beholder facon 30.
  5. Måling af funktionel kapillartæthed af RBC-perfunderede kapillærer (næringsværdi perfusion: cm / cm
  6. Læg en indspillet fluorescerende kapillær felt med 20X objektiv forstørrelse ind i softwaren. Brug "DensLA" funktion til at måle den funktionelle kapillær tæthed af RBC-perfusionerede mikrokar.
  7. Spore perfusionerede kapillærer med markøren og markere perfusionerede fartøjer. Må ikke markere ikke-perfunderet kapillærer, arterioler og vener. Softwaren vil måle funktionel kapillartæthed af de perfunderede kapillærer i cm / cm2. Gentag trinene for de andre indspillede kapillære felter.
  • Måling af snoning af mikrokarrene (mikrovaskulære remodeling), tidlige tegn på angiogenese, såsom opløbet og spire-dannelse og nydannede mikrokar.
    1. Load optagede videoer eller rammer af fluorescerende kapillære felter ind i softwaren. Identificer gyrose fartøjer og bruge "TorqIx" -funktionen af ​​softwaren. Spore bestemt fartøj flow med kurset og slutter med et højreklik. Vil softwarentegne en lige linje for den direkte vej, og vil sætte det i relation til den spores sti.
      BEMÆRK: Hold øje med tegn på angiogenese, såsom knopper, rosenkål og nydannede kapillærer, som normalt udspringer vinkelret ud fra de allerede eksisterende kapillærer. Mål tætheden af ​​disse nydannede fartøjer som beskrevet i trin 3.5.
  • Identifikation af karakteristika for apoptotisk celledød, såsom kernekondensering, fragmentering og / eller marginering (celler / mm 2).
    1. Load bisbenzimid-optagede videoer (50X objektive) i softwaren. Brug "DenseNA" -funktion. Markere apoptotiske celler ifølge de nævnte karakteristika såsom cellekernekondensation, fragmentering og margination med en venstre klik.
    2. Efter mærkning af alle karakteristiske celler hele videoen, klik på "N / A" i softwaren, som automatisk vil tælle alle markerede celler og opdele det i hele området. Resultatet vil være apoptotiskceller / mm2.
  • Analyse af leukocyt tilslutning til det vaskulære endotel repræsenterer inflammation. Periodisk vedhæftning af leukocytter (rullende leukocytter, overholdelse <30 sek: antal ruller / mm 2 endotheloverflade) og fast vedhæftning af leukocytter (stikning leukocytter, overholdelse> 30 sek: antal af klistermærker / mm2 endotheloverflade).
    1. Analysere det inflammatoriske respons ved at tælle antallet af rhodaminmærket leukocytter, der overholdt den endotele foring af post-kapillære venuler i et tidsrum på ≥30 sec ("selvklæbende") og de intermitterende vedhængende leukocytter (<30 sek, "ruller") . Venular leukocyt vedhæftning er udtrykt som celler pr mm2 endotheloverflade.
  • Måling af intravaskulære og interstitielle gråtoner som en parameter for mikrovaskulær lækage (makromolekylær ekstravasation E = E1 / E2).
    1. Vurdere makromolekylær leakage som en parameter af mikrovaskulær permeabilitet efter en iv injektion af et fluorescerende dextran. Densitometrisk bestemme flere grå niveauer i væv støder direkte op til det kapillære karvæggen (E1), såvel som i den marginale cellefri plasma af fartøjet (E2). Derefter beregner makromolekylær ekstravasation (E) som forholdet mellem E1 / E2 31.
  • 4. Postoperativ Care

    1. Sende dyret tilbage i et separat bur for at undgå selskab med andre dyr, indtil fuldt tilbagebetalt. Lad ikke et dyr uden opsyn, indtil det har genvundet tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde brystleje. Overvåg dyr dagligt for blødning, lokale og systemiske tegn på infektion, og positionen af ​​kammeret.
    2. Vurdere den generelle tilstand af dyret ved at observere motorisk aktivitet, kropsvægt, tegn på smerte, tolerance over for dressing og auto-lemlæstelse.
    3. Holde musene én pr bur for at undgå Mutual manipulation af kammeret. Ved tegn på smerte, anvendelse Buprenorphin i en dosis på 0,05-0,1 mg / kg legemsvægt, subkutant i 8 timers intervaller.

    5. Eutanasi og explantation af skinfold Afdeling

    1. På dag 10, ofre dyr ved hjælp af en overdosis af et bedøvelsesmiddel stof (150 mg / kg pentobarbital).
    2. Fjern kammeret og prøve flap væv til immunhistokemiske og molekylære protein assays. Sample væv til konventionel histologi (formalin) og kvantificerbare proteinassays (flydende nitrogen eller tøris).

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    C57Bl/6 mice, 6-8 w, 20-22 g Charles River
    Depilation cream Balea Any depilation cream
    Titanium chamber Irola 160001 Halteblech M
    Custom-made Plexiglass mounting frame Frame to secure chamber to avoid chamber movement due to the animal's respiration.
    Slotted cheese head screw Screws and More 842210 DIN84 M2x10
    Hexagon full nut Screws and More 93422 DIN934 M2
    Snap ring Schaefer-Peters 472212 DIN472 J12x1,0
    Cover glass Volab Custom-made cover glass, 11.8 mm in diameter.
    Fixing foam tesamoll 05559-100 tesamoll Standard I-Profile
    Ketamine hydrochloride Parke Davis Ketavet®
    Dihydroxylidinothiazine hydrochloride Bayer Rompun®
    Buprenorphin Essex Pharma Temgesic®
    Saline 0.9%
    Desinfection alcohol
    Vicryl 5-0 Ethicon V 490 H
    Ethilon 5-0 Ethicon EH 7823 H
    1 ml syringes
    Surgical skin marker with flexible ruler Purple surgical PS3151 Any surgical skin marker and flexible ruler
    Pointed scissors
    Micro-Scissors
    Normal scissors
    2 clamps
    Fine anatomic forceps
    Micro-forceps
    Hex nuter driver wiha 1018
    Screwdriver wiha 685
    Snap ring plier Knipex 4411J1 12-25 mm
    Wire cutter Knipex 70 02 160 Wire cutter is used to cut screws short; 160 mm
    Trans-illumination light IKEA 501.632.02 LED light Jansjö; any light 
    Magnification glasses
    Intravital microscope Zeiss 490035-0001-000 Scope.A1.Axiotech
    LED system Zeiss 423052-9501-000 Colibri.2
    LED module 365nm Zeiss 423052-9011-000
    LED module 470nm Zeiss 423052-9052-000
    LED module 540-580nm Zeiss 423052-9121-000
    Filter set 62 62 HE BFP + GFP + HcRed Zeiss 489062-9901-000 Range 1: 350-390 nm excitation wavelength, split 395 nm / 402-448 nm; range 2: 460-488 nm, split 495 nm / 500-557 nm; range 3: 567-602 nm, split 610 nm / 615 nm to infinite.
    Filter set 20 Rhodamine Zeiss 485020-0000-000 540-552 nm, split 560 nm, emission 575-640 nm
    2.5X objective NA=0.06 Zeiss 421020-9900-000 A-Plan 2.5X/0.06
    5X objective NA=0.16 Zeiss 420330-9901-000 EC Plan-Neofluar 5X/0.16 M27
    10X objetive NA=0.30 Zeiss 420340-9901-000 EC Plan-Neofluar 10X/0.30 M27
    20X objective NA=0.50 Zeiss 420350-9900-000 EC Plan-Neofluar 20X/0.50 M27
    50X objective NA=0.55 Zeiss 422472-9960-000 LD Epiplan-Neofluar 50X/0.55 DIC 27
    ZEN imaging software Zeiss ZenPro 2012
    CapImage Dr. Zeintl
    Fluorescein isothiocyanate-dextran Sigma-Aldrich 45946
    bisBenzimide H 33342 trihydrochloride Sigma-Aldrich B2261 Harmful if swallowed; causes severe skin burns and eye damage, may cause respiratory irritation.
    Rhodamine 6G chloride Invitrogen R634 Harmful if swallowed; may cause genetic defects; may cause cancer; may damage fertility or the unborn child.
    Pentobarbital Merial Narcoren®

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. McFarlane, R., De Young, G., Henry, R. The design of a pedicle flap in the rat to study necrosis and its prevention. Plast Reconstr Surg. 35, 177-182 (1965).
    2. Finseth, F., Cutting, C. An experimental neurovascular island skin flap for the study of the delay phenomenon. Plast Reconstr Surg. 61, 412-420 (1978).
    3. Petry, J. J., Wortham, K. A. The anatomy of the epigastric flap in the experimental rat. Plast Reconstr Surg. 74, 410-413 (1984).
    4. Achauer, B. M., Black, K. S., Litke, D. K. Transcutaneous PO2 in flaps: a new method of survival prediction. Plast Reconstr Surg. 65, 45-45 (1980).
    5. Vollmar, B., Menger, M. D. Assessment of microvascular oxygen supply and tissue oxygenation in hepatic ischemia/reperfusion. Adv. Exp. Med. Biol. 428, 403-408 (1997).
    6. Menger, M. D., Barker, J. H., Messmer, K. Capillary blood perfusion during postischemic reperfusion in striated muscle. Plast Reconstr Surg. 89, 1104-1114 (1992).
    7. Uhl, E., Rösken, F., Curri, S. B., Menger, M. D., Messmer, K. Reduction of skin flap necrosis by transdermal application of buflomedil bound to liposomes. Plast Reconstr Surg. 102, 1598-1604 (1998).
    8. Pang, C. Y., Neligan, P., Nakatsuka, T., Sasaki, G. H. Assessment of the fluorescein dye test for prediction of skin flap viability in pigs. J Surg Res. 41, 173-181 (1986).
    9. Hjortdal, V. E., Hansen, E. S., Henriksen, T. B., Kjolseth, D., Soballe, K., Djurhuus, J. C. The microcirculation of myocutaneous island flaps in pigs studied with radioactive blood volume tracers and microspheres of different sizes. Plast Reconstr Surg. 89, 116-122 (1992).
    10. Pang, C. Y., Neligan, P., Nakatsuka, T. Assessment of microsphere technique for measurement of capillary blood flow in random skin flaps in pigs. Plast Reconstr Surg. 74, 513-521 (1984).
    11. Sandison, J. C. A new method for the microscopic study of living growing tissues by the introduction of a transparent chamber in the rabbit's ear. The Anatomical Record. 28, 281-287 (1924).
    12. Algire, G. H. An Adaptation of the Transparent-Chamber Technique to the Mouse. Journal of the National Cancer Institute. 4, 1-11 (1943).
    13. Lehr, H. A., Leunig, M., Menger, M. D., Nolte, D., Messmer, K. Dorsal skinfold chamber technique for intravital microscopy in nude mice. Am J Pathol. 4, 1055-1062 (1993).
    14. Barker, J. H., et al. An animal model to study microcirculatory changes associated with vascular delay. Br J Plast Surg. 52, 133-142 (1999).
    15. Erni, D., Sakai, H., Banic, A., Tschopp, H. M., Intaglietta, M. Quantitative assessment of microhemodynamics in ischemic skin flap tissue by intravital microscopy. Ann Plast Surg. 43, 405-414 (1999).
    16. Roesken, F., Schäfer, T., Spitzer, W. J., Vollmar, B., Menger, M. D. In vivo analysis of the microcirculation of osteomyocutaneous flaps using fluorescence microscopy. Br J Plast Surg. 52, 644-652 (1999).
    17. Harder, Y., Amon, M., Erni, D., Menger, M. D. Evolution of ischemic tissue injury in a random pattern flap: a new mouse model using intravital microscopy. J Surg Res. 121, 197-205 (2004).
    18. Harder, Y., Contaldo, C., Klenk, J., Banic, A., Jakob, S. M., Erni, D. Preconditioning with monophosphoryl lipid A improves survival of critically ischemic tissue. Anesth Analg. 100, 1786-1792 (2005).
    19. Rezaeian, F., et al. Erythropoieton protects critically perfused flap tissue. Ann Surg. 248, 919-929 (2008).
    20. Harder, Y., et al. Erythropoietin reduces necrosis in critically ischemic myocutaneous tissue by protecting nutritive perfusion in a dose-dependent manner. Surgery. 145, 10-1016 (2009).
    21. Rezaeian, F., et al. Erythropoietin-induced upregulation of endothelial nitric oxide synthase but not vascular endothelial growth factor prevents musculocutaneous tissue from ischemic damage. Lab Invest. 90, 40-51 (2010).
    22. Rezaeian, F., Ong, M. F., Harder, Y., Menger, M. D. N-acetylcysteine attenuates leukocytic inflammation and microvascular perfusion failure in critically ischemic random pattern flaps. Microvasc Res. 82, 28-34 (2011).
    23. Rezaeian, F., et al. Ghrelin protects musculocutaneous tissue from ischemic necrosis by improving microvascular perfusion. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 302, 603-610 (2012).
    24. Rezaeian, F., et al. Long-term preconditioning with Erythropoietin reduces ischemia-induced skin necrosis. Microcirculation. (2013).
    25. Harder, Y., et al. Heat shock preconditioning reduces ischemic tissue necrosis by heat shock protein (HSP)-32-mediated improvement of the microcirculation rather than induction of ischemic tolerance. Ann Surg. 242, 869-878 (2005).
    26. Tobalem, M., et al. Local shockwave-induced capillary recruitment improves survival of musculocutaneous flaps. J Surg Res. 184, 1196-1204 (2013).
    27. Lindenblatt, N., Calcagni, M., Contaldo, C., Menger, M. D., Giovanoli, P., Vollmar, B. A new model for studying the revascularization of skin grafts in vivo: the role of angiogenesis. Plast Reconstr Surg. 122, 169-1680 (2008).
    28. Schweizer, R., et al. Morphology and hemodynamics during vascular regeneration in critically ischemic murine skin studied by intravital microscopy techniques. Eur Surg Res. 47, 222-230 (2011).
    29. Klyscz, T., Jünger, M., Jung, F., Zeintl, H. Cap image—a new kind of computer-assisted video image analysis system for dynamic capillary microscopy. Biomed. Tech. 42, 168-1675 (1997).
    30. Gross, J. F., Aroesty, J. Mathematical models of capillary flow: a critical review. Biorheology. 9, 225-264 (1972).
    31. Menger, M. D., Pelikan, S., Steiner, D. Microvascular ischemiareperfusion injury in striated muscle: significance of ‘reflow paradox. Am J Physiol. 263, (6 part 2), 1901-1906 (1992).
    Iskæmisk væv skade i Dorsal hudfolden Afdeling Mus: En hudlap modellen til Akut Persistent Iskæmi
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Harder, Y., Schmauss, D., Wettstein, R., Egaña, J. T., Weiss, F., Weinzierl, A., Schuldt, A., Machens, H. G., Menger, M. D., Rezaeian, F. Ischemic Tissue Injury in the Dorsal Skinfold Chamber of the Mouse: A Skin Flap Model to Investigate Acute Persistent Ischemia. J. Vis. Exp. (93), e51900, doi:10.3791/51900 (2014).More

    Harder, Y., Schmauss, D., Wettstein, R., Egaña, J. T., Weiss, F., Weinzierl, A., Schuldt, A., Machens, H. G., Menger, M. D., Rezaeian, F. Ischemic Tissue Injury in the Dorsal Skinfold Chamber of the Mouse: A Skin Flap Model to Investigate Acute Persistent Ischemia. J. Vis. Exp. (93), e51900, doi:10.3791/51900 (2014).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    simple hit counter