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Medicine

마우스의 등쪽 피하 지방 상공 회의소에서 허혈성 조직 손상 : 피부 플랩 모델은 급성 영구 허혈을 조사하기

doi: 10.3791/51900 Published: November 17, 2014

Summary

제시 한 쥐의 등쪽 피하 지방 챔버의 창은 musculocutaneous 플랩의 급성 지속적인 허혈 영역을 시각화. 미세 혈관 및 혈류 역학의 정량의 직접적이고 반복적 인 평가를위한 생체 내에 에피 형광 현미경 수 있습니다. 형태 학적 및 혈역학 적 결과는 더 조직 학적 및 분자 분석과 관련 될 수있다.

Abstract

깊은 전문 지식과 첨단 수술 기법에도 불구하고, 광범위한 조직 괴사에 상처 고장에 이르기까지 허혈에 의한 합병증은 여전히​​ 특히 재건 플랩 수술에서 발생한다. 여러 실험 플랩 모델은 근본 원인과 메커니즘을 분석하고 허혈성 합병증을 예방하는 치료 전략을 조사하기 위해 개발되었다. 대부분의 모델의 제한 요소는 직접 반복적으로 미세 혈관 구조와 혈류 역학을 시각화하는 부족 가능성이다. 프로토콜의 목적은 앞서 언급이 부족한 요소 affiliating 잘 확립 된 마우스 모델을 제시하는 것이었다. 세게 등은. 치료 유지가 10 일 후에 50 %의 괴사 ~ 급성 지속적 허혈 및 결과를 거쳐 임의의 관류 패턴 musculocutaneous 플랩의 모델을 개발했다. 생체 내에 에피 형광 현미경의 도움으로,이 모델은 챔버의 반복적 시각화를 허용형태와 시간에 관심의 다른 지역에서 혈역학. 이러한 세포 사멸, 염증, 미세 혈관 누출 및 혈관 신생과 같은 관련 프로세스 조사 및 단백질 분자 및 면역 분석법에 상관 될 수있다. 지금까지 모델은 ischemically 도전 조직의 전, 수술 주변의 효과와 postconditioning을 조사 여러 출판 실험 연구에서 타당성과 재현성을 입증했다.

Introduction

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재건 수술에 노출 힘줄, 뼈와 임플란트 재료의 범위가 플랩의 사용에 의존한다. 플랩은 동맥 유입과 정맥 유출을 보장 혈관 척추 경에 전송되는 조직의 블록입니다. 폭 넓은 전문 지식과 전송 될 플랩의 다양한 가능성에도 불구하고, 전체 조직의 손실에 상처 고장에 이르기까지 허혈에 의한 합병증은 여전히​​ 발생하고 있습니다. 보조 의사에 의한 보존 적 치료와 치유가 작은 조직 괴사 후 예상 할 수있는 반면, 상당한 플랩 괴사는 일반적으로 변연 절제술, 상처 조절 및 보조 재건을 포함하여 수술 개정을 필요로합니다. 이것은, 이환율을 증가 입원 기간을 연장하고 결과적으로 증가 건강 관리 비용을 초래.

동맥 유입에서 가장 먼 먼 영역에서 혈관의 정의되지 않은 패턴 또는 무작위로 살포 지역과 플랩은 허혈성 손상에 특히 경향이있다. ACCO rdingly 수많은 실험 및 임상 연구 모두에서 괴사 현상을 평가 한 축 패턴 플랩 (정의 혈액 공급) 및 임의의 패턴 플랩 (정의되지 않은 혈액 공급) 1-3. 주요 연구 결과는 일반적으로 괴사 영역의 크기의 거시적 평가를 기준으로합니다. 원인과 조직 괴사 기전을 평가하기 위해 더 자세하게, 몇몇 연구는 미세 순환의 분석에 초점을 맞추었다. 다른 기술은 폴라 전극들 4-5을 사용하여 조직 산소 장력의 분석뿐만 아니라, 레이저 도플러 flowmetry 6-7, 염료 확산 8 및 미소 9-10를 이용하여 혈류량의 측정을 포함하여, 조직 관류를 측정하는 데 사용되어왔다. 이러한 기술은, 단, 조직 관류의 간접 파라미터를 측정하기위한 허용 플랩의 관심 영역 내에 개별 microhemodynamic 임의의 공정 형태소 해석을 가능하게하지 않는다.

t "> Sandison 그는 토끼 (11)에서 수행 생체 내 연구에 연장을위한 투명 챔버를 사용하는 한 사람을 첫 번째로 알려져있다 1943 년 -. 약 20 년 후 - Algire는 적용 할 수 이러한 투명 챔버를 적용하는 첫번째이었다 종양 세포 (12)의 마이크로 임플란트의 행동을 연구하기 위해 쥐. 때문에 마우스가 느슨한 피부 동물을 소위 다음과 같은 년 동안 몇 가지 기술적 인 개선 후, 레어와 동료 등을 적용 할 수 있었다는 사실에 작고 가벼운 티탄 챔버 개발 등쪽 피하 지방 챔버.이 챔버는 생체 내에 형광 현미경, 형태 학적 및 미세 순환 기능의 수와 다른 생리 학적 및 병태 생리 학적 조건에서 시간에 따른 이들의 변화를 직접 반복적 시각화를 허용하는 기술 등을 이용하여 평가를 활성화 허혈 - 재관류 손상 13.

PE의 조사에정상 및 병적 인 상태에서 피부, 근육과 뼈 플랩의 rfusion 두 가지 추세가 발생했습니다 : 첫째, 마우스 (14)의 유경 귀 플랩으로 등쪽 피하 지방 챔버를 사용하지 않는 "급성"플랩 모델, 측면을 기반으로 섬 피부 플랩 햄스터 (15)와(16)의 유경 복합 플랩. 둘째, 등쪽 피하 지방 챔버 허가 반복적 인 미세과 플랩의 조합이 생체 내에 형광 현미경으로 몇 일 동안 분석 "만성"플랩 모델. 그것은 마우스 (17)의 피하 지방 챔버에 통합되어 무작위로 관류 musculocutaneous 플랩으로 구성되어 있습니다. 그 폭과 길이의 비율은 영구 급성 허혈 상황 일관 10-14일 플랩 입면 후 50 % 플랩 조직 괴사 ~ 결과 것으로 선택되었다. 조직 괴사의이 재현 범위는, 보호 (즉, 개발 레 모두의 추가적인 평가를 할 수 있습니다의 괴사) 및 유해 요인 (즉, 플랩 병태 생리에 대한 자세한 괴사의 개발). 지난 년 동안, 다른 주 산기 사전, 및 조직 보호 물질 18-24의 관리 및 열 (25)과 충격파 (26)과 같은 생리 학적 스트레스의 로컬 응용 프로그램을 포함하여 사후 조절 절차의 효과를 입증하는 여러 가지 실험 출판물, 등장했다.

괴사, 미세 혈관 모폴로지 및 미세 파라미터의 정량적 분석은 또한 면역 분석 및 단백질 분석과 상관 될 수있다. 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 산화 질소 합성 효소 (NOS), 핵 인자 카파 B (NF-κB) 및 열 충격 단백질 (HSP-32을 포함하는 다양한 단백질 및 분자 : 헴 시게나 1 (HO-1) 및 HSP- 70) 조직의 보호에 중요한 역할을하는 것으로 나타났다. 이 챔버 플랩 모델에 기초하여, 두 개의 변형 순으로 하였다 개발되어왔다R은 축 패턴 관류 (28)와 유경 플랩 피부 이식 치료 (27)과 혈관 개발하는 동안 신생 혈관 및 미세 순환을 분석합니다. 우리는 마우스 피하 지방 챔버 ischemically 도전 musculocutaneous 플랩 포함 재현성 및 신뢰성있는 모델을 제시한다. 이 모델은 생체 내에 에피 형광 현미경에 의한 미세 순환 및 혈류 역학의 시각화 및 정량화 할 수 있습니다.

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Protocol

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참고 : 이전에 제시된 모델의 구현에, 해당 동물 보호법이 협의되어야하며, 권한 지방 자치 단체에서 얻을 수 있어야합니다. 본 연구에서는 모든 실험은 연구와 관련된 동물에 대한 원칙과 동물의 보호에 관한 독일 법률을 준수 하였다. 실험은 지역 동물 보호위원회에 의해 승인되었다.

1. 동물 준비 및 플랩의 외과 상승

  1. 22 ~ 24 ° C에서의 실내 온도에서 12 시간 밤낮주기 60~65%의 상대 습도에서 하나의 케이지에 동물이 오지 않게하십시오. 식수 및 표준 실험실 차우에 마우스 무료로 액세스 할 수 있습니다. 항상 생존 수술시 무균 조건을 유지한다.
  2. 90 ㎎ / kg BW 케타민 염산염을 25㎎ / 함유하는 10g의 BW 당 0.1 ml의 식염수를 복강하여 마우스를 마취 (IP) 주입kg bw의 dihydroxylidinothiazine 염산염. 마취는 동물 준비, 수술 이후 현미경 필요합니다. 고통스러운 자극에 대한 반응을 확인하여 적절한 마취를 확인합니다. 마취의 시간 동안 건조를 방지하기 위해 눈에 수의사 연고를 적용합니다.
  3. 충분한 마취 유도 후, 전기 면도기 뒷면에 털을 뽑다. 이하, 나머지 머리를 제거하는 면도 영역 제모 크림을 적용합니다.
  4. 7-10 분 ~의 제모 크림의 체류 시간 동안 피부의 집게와 마이크로 집게, 가위 및 마이크로 가위, 봉합사 및 마커 펜을 포함하여 악기를 준비합니다. 소독 챔버의 바닥에있는 너트와 나사 두 개를 적용하여 챔버 시스템의 기밀성을 보장하기 위해 챔버의 대응의 창 주위에 자체 접착 거품 (그림. 1 AC)를 고정하여 티타늄 챔버를 준비합니다.
  5. 세척하여 다시 모든 탈모 크림을 제거미지근한 물로 닦아주십시오. 이어서 건조 및 알코올 - 함유 용액과 피부를 소독.
  6. 발생하기 쉬운 위치에 마우스를 놓고 뒷면의 중간 선을 정의합니다. 중앙 피부를 잡고 배 (그림. 2A)을 작성하여 올립니다. 광원의 종류를 사용하여 트랜스 조명으로 provisorily 티타늄 프레임 (그림. 2B)를 배치 할 위치를 결정합니다. 있는지 확인 두개쪽으로 측면 흉부 동맥 (LTA)와 챔버의 윈도우의 중심을 미부 물론 깊은 곡절 장골 동맥 (DCIA)의 말단 지점 (그림. 2B-D). 챔버의 위치 결정이 완료되면, 티탄 프레임 이후 고정 용 배의 매우 하단 피부 양 층을 관통. 이제, 티탄 프레임을 제거하기 쉬운 위치에 마우스를 위치시키고 필요하다면 백의 정중선을 재정의.
  7. 척추 (15), X (1)의 폭과 길이의 비율이 정중선에서 시작에 수직 플랩 개요1mm는 측면을 기반으로 무작위로 관류 플랩이 발생할 수 있습니다. 그런 다음 반대쪽까지 연장 2mm의 추가 피부 영역 개요 (그림. 2C, D). 이 영역 포셉 고른 이상 가시 플랩 영역을 방해하지 않고 티타늄 프레임에 봉합된다.
  8. 마킹 최종 후, 플랩을 절개. 이 과정에서 LTA 및 DCIA 모두를 가로로 쪼개다 플랩 (그림. 2E)을 상승. 가로로 혈관의 응고 또는 결찰은 필요 없다.
  9. 이전에 만든 피부 구멍 (그림. 2 층)를 통해 챔버의 나사를 배치하고 챔버의 프레임의 구멍과 5-0를 사용하여 프레임의 뒷면 부분에 높은 플랩의 챔버의 프레임 안에 모두 전방과 후방으로 피하 지방을 흥분시키는 단속 봉합 (그림. 2G).
  10. (5-0 중단 봉합에 의해서 피부에 다시​​ 주변 플랩의 수직 사지 봉합
  11. 플랩의 혈관을 관찰하기 위해 플랩의 반대편에, 2mm의 작은 피부 스트립 피부 측방 헤미 원형 영역을 절제. 이 90mm (2)의 표면을 갖는 챔버의 관찰 창을 통해 직접 볼 수있다.
  12. 현미경 동안 이미지 품질을 향상시키기 위해 미세 수술기구 및 광 확대 렌즈 또는 현미경을 사용하는 횡문근에서 젤라틴 같은 느슨한 유륜 조직을 제거한다. 근육 조직 계층 내에서 혈관이 손상되지 않도록하십시오.
  13. 마지막으로, 국소 bisbenzimide 식염수 (도. 2J)와 플랩 이슬로 축축하게하다, 두개쪽으로 및 후방 이전에 전방으로 발포체의 자기 접착 스트립 옷 입기 된 프레임의 대응을 장착함으로써 챔버를 밀봉. 그 후, 스냅 링을 이용하여 커버 유리와 관찰 창을 적용한다. 유리 아래로 어떤 공기 물집을 모함하지 않으려 고한다 (도. 2K, L). 피부 접착력에 의해 커버 유리에 부착된다.

2. 생체 내에 표면 형광 현미경

  1. 이상적인 광학 품질에 대한 최초의 현미경 분석을위한 수술 준비 후 24 시간을 기다립니다. 이 분석은 현미경의 기준을 나타내고, 수술 후 3 일째, 5, 7 및 10에서 반복된다. 단계 1.2에 기재된 바와 같이마다 마우스를 마취. 주문 제작 플렉시 글라스 캐리어 측면 decubital 위치에 동물을 놓습니다. 그런 식으로, 커버 유리에 부착 된 플랩의 근육 조직 층이 최대 병동에 직면하고있다.
  2. 꼬리 정맥 또는 레트로 안구 정맥총에 5 %의 녹색 형광 덱스 트란 (분자량 15 만) 0.05 ml의 1 % 높은 형광 로다 민 가족 염료의 0.05 ㎖를 주입한다. 녹색 형광 덱스 트란 정맥 내 적용시 혈액 비 세포 성분 얼룩 (ⅳ). DIST 할 수있는 형광 로다 민 얼룩 백혈구 및 혈소판다른 셀룰러 및 비 셀룰러 성분으로부터 inguished. 마지막으로, 응축의 상태에 따라 더 많거나 적은 형광 발광 핵 성분 bisbenzimide 얼룩.
  3. 그 후, 현미경으로 마우스를 놓습니다. 현미경은 LED 시스템을 포함 확인 - 470 및 425 nm의, 365 및 490 nm의, 540 및 580 nm의에 대한 LED 빔 조합뿐만 아니라 해당 필터 세트 (62 HE BFP / GFP / HcRed, 범위 (1) : 350-390 nm의 , 460-488 nm의 495 nm의 / 500-557 nm의 분할; 범위 : 3 : 범위 2, 여기 파장은 395 nm의 / 402-448 nm의 분할 567-602 nm의, 무한에 610 nm의 / 615 nm의 분할 (20) 로다 민, 범위를. : 540-552 나노 미터는) 배출 575-640 nm의 560 nm의 분할.
  4. 스틸 및 전하 결합 장치 비디오 카메라를 사용하여 모션 픽처를 기록하고 상기 오프 - 라인 분석을 위해 컴퓨터의 하드 디스크에 저장한다.
  5. 다른 목표 (2.5 배, NA (개구 수) = 챔버의 파노라마 뷰 0.06을 사용하여, 5 배를,NA = 0.16; 10 배, NA는 0.32 =; 20 배, NA는 0.50 =; 관심있는 지역의 레코딩을위한 50X, NA = 0.55).
  6. 거의 동일 높이, 즉, 근위, 중앙, 대부분의 원격 혈관 유입 (그림. 3 층)에서 단역의 세 가지 영역으로 챔버의 창을 통해 볼 수있는 플랩 표면을 나눕니다. 화상 취득, 각 관찰 시점에서 다음과 같은 방법으로 진행 :
    1. 5 배 목표를 사용하여 원위하는 근위부에서 챔버의 창에서 이미지로 조직 이미지를 스캔합니다.
    2. 플랩의 각 영역에서 쉽게 식별 분기 패턴 2 ~ 또는 3 차 동맥과 동반 세정맥을 선택합니다. 5X, 10X, 20X 또는 목적을 사용하여, 용이하게 전체의 관찰 기간 내내 번들을 재 지역화 위해 arteriolovenular 번들의 출력물을 만든다.
    3. 20X의 목적, 50X 목표, 더 기록 5-6 모세관 필드와 "세포 사멸로각각 플랩의 지역 당 "필드. 10 배와 20 배 목표에 기록 된 모든 이미지는 녹색 빛 (로다 민) 필터, 반면, 5 배 및 50 배 목적 사용 푸른 빛 (형광 덱스 트란)과 흰색 빛 (Bisbenzimide) 필터로 촬영 한 이미지를 각각 푸른 빛 (형광 덱스 트란) 등을 사용 .

기록 된 데이터의 분석 (3)

NOTE : 29는 다음과 같이 컴퓨터 보조 화상 분석 시스템의 사용은 오프라인으로 기록 된 모든 파라미터를 수치화하여.

  1. 의 면적의 측정 비 관류 각각 괴사 조직 (mm 2).
    1. (2.6.1)에서 5 배 목적으로 기록 된 완전한 스캔 챔버 창 이미지와 비 관류 각각 괴사 조직을 측정 할 수있는 형광 덱스 트란을 사용합니다. 비 관류 영역의 경계와 m의 면적을 계산 : 비 관류 어두운 영역을 측정하기 위해 "AreaBo"기능을 사용하여소프트웨어의 면적 측정 알고리즘을 이용하여 m이.
  2. 동맥, 모세 혈관과 소정맥 (μm의)에서 미세 혈관 직경의 측정.
    1. 기록 된 AV-번들 또는 소프트웨어에 모세관 필드에서로드 비디오 또는 사진. 최상의 결과 가장 높은 배율 스틸 또는 비디오를 사용하기 위해 선박의 명확한 경계를 명확하게 볼 수있는 곳.
    2. 측정은 혈관의 벽에 수직 수행하고 있는지 확인하기 위해 소프트웨어의 "DiamPe"기능을 사용합니다. 이를 위해 그렇게 용기의 수직 직경 혈관의 벽에 세 번째 클릭 표시가있는 두 점을 표시합니다. 소프트웨어에 μm의 측정을 수행한다.
    3. 같은 장소에서 모든 레코딩을위한 동일한 선박에 대한 측정을 반복합니다. 평균 직경을 축적하는 복수의 모세관을 측정한다.
  3. 소동맥에서 적혈구 (RBC) 속도의 분석, 모세 혈관ND 세정맥 (mm / 초).
    1. 세동맥 적혈구 (RBC)를 들어 속도 (mm / s) 측정 소프트웨어 "VeloLSD"기능을 사용하여 직경이 측정되고있는 형광 덱스 트란 창 같은 혈관을 선택한다.
    2. 시간 (초)에 걸쳐 개별적인 혈관 계조 패턴의 시프트 (mm)의 측정을 기초로 선 시프트 법을 이용하여 컴퓨터 보조 화상 분석 장치로 분석한다.
  4. 용기의 체적 혈류 (PL / 초)의 측정.
    1. RBC 속도 및 용기 단면적의 세동맥, 세정맥과 모세 혈관의 용적 혈류 (PL / 초)를 계산한다 (π * R 2) 총과 Aroesty, 즉, Q는 = V * π * R (2)의 방정식에 따라 , 원통 형상 용기 (30)를 가정.
  5. RBC 관류 모세 혈관의 기능 모세 혈관 밀도의 측정 (영양 관류 : cm / cm
  6. 소프트웨어에 20 배 목표 배율 기록 형광 모세관 필드를 넣습니다. RBC 관류 미세 혈관의 기능 모세 혈관 밀도를 측정하기 위해 "DensLA"기능을 사용합니다.
  7. 커서를 관류 모세 혈관을 추적하고 관류 혈관을 표시합니다. 표시하지 마십시오 모세 혈관, 소동맥 또는 세정맥 비 관류. 소프트웨어는 cm / cm 2의 관류 모세관 작용 모세관 밀도를 측정 할 것이다. 다른 기록 모세관 필드의 단계를 반복합니다.
  • 미세 혈관 (미세 혈관 리모델링), 같은 꽃 봉 오리와 새싹-형성과 새로 형성된 미세 혈관 등의 혈관 신생의 초기 징후의 비틀림 측정.
    1. 로드 소프트웨어에 동영상이나 형광 모세관 필드의 프레임을 기록했다. gyrose 혈관을 확인하고 소프트웨어의 "TorqIx"기능을 사용합니다. 코스 명확한 혈관의 흐름을 추적하고 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭로 끝납니다. 소프트웨어 것직접적인 방법에 대한 직선을 그리고 추적 경로와 관계를 설정합니다.
      참고 : 일반적으로 기존의 모세 혈관에서 수직으로 쏘아 같은 새싹, 콩나물, 새로 형성된 모세 혈관 등의 혈관 신생의 징후, 조심해. 단계 3.5에 기재된 바와 같이 이들 새로 형성된 혈관의 밀도를 측정한다.
  • 핵 응축, 조각 및 / 또는 주변부의 (세포 / mm 2)와 같은 세포 사멸 세포 사멸에 대한 특성, 식별.
    1. 소프트웨어에 Bisbenzimide - 녹화 된 비디오 (50X 목표)을로드합니다. "DenseNA"기능을 사용합니다. 같은 왼쪽 버튼을 클릭 핵 응축, 분열과 주변부의 같은 언급 특성에 따라 세포 사멸을 표시합니다.
    2. 비디오 전반에 걸쳐 모든 특성 세포를 표시 한 후, 자동으로 모든 표시 셀을 계산하고, 지역 전체에 그것을 분할되는 소프트웨어에 "N / A"를 클릭합니다. 결과는 세포 사멸됩니다세포 / mm 2.
  • 염증을 나타내는 혈관 내피 세포에 백혈구 부착 분석. 백혈구의 간헐적 준수 (백혈구 롤링, 준수 <30 초 : 롤러의 수 / mm 2 내피 세포의 표면)과 백혈구의 확고한 준수 (백혈구를 고집, 준수> 30 초 : 스티커 / mm 2의 혈관 내피 세포 표면의 수).
    1. 로다의 수를 카운트함으로써 염증 반응을 분석은 (<30 초, "롤러") ≥30 초 시간주기 ( "스티커")에 대해 포스트 모세관 세정맥의 내피 라이닝에 부착하는 백혈구와 간헐적으로 부착 백혈구 라벨링 . 세정맥 백혈구 준수는 mm 2 내피 세포 표면 당 세포로 표현된다.
  • 미세 혈관 누출 (고분자 혈관 외 유출의 E = E1 / E2)의 매개 변수로 혈관 및 간질 그레이 레벨의 측정.
    1. 고분자 L 평가형광 덱스 트란의 정맥 주사 후 미세 혈관 투과성의 매개 변수로 eakage. Densitometrically 직접 모세 혈관 벽 (E1)에 인접뿐만 아니라 용기 (E2)의 한계 무 세포 혈장 조직에서 여러 계조를 결정한다. 이어서 E1 / E2 (31)의 비율과 같은 거대 분자 혈관 외 유출 (E)를 계산한다.
  • 4. 수술 후 케어

    1. 완전히 회복 될 때까지 다른 동물의 회사를 방지하기 위해 별도의 케이지에 동물을 돌려줍니다. 이 흉골 드러 누움을 유지하기에 충분한 의식을 회복 할 때까지 무인 동물을 두지 마십시오. 출혈, 지역 및 감염의 전신 증상과 챔버의 위치를​​ 매일 동물을 모니터링합니다.
    2. 드레싱 및 자동 절단에 운동 활동, 체중, 고통의 징후, 공차를 관찰함으로써 동물의 일반적인 상태를 평가한다.
    3. 무투을 피하기 위해 케이지 당 마우스를 유지챔버의 알 조작. 고통의 흔적에서, 8 시간 간격으로 피하, 0.05-0.1 ㎎ / ㎏ BW의 용량 프레 놀핀을 적용합니다.

    5. 안락사와 피하 지방 상공 회의소의 외식

    1. 10 일에, 마취약 (150 ㎎ / ㎏ 펜 토바 비탈)의 과다 복용을 이용하여 동물을 희생.
    2. 챔버를 제거하고 면역 및 분자 단백질 분석에 대한 플랩 조직 샘플. 기존의 조직학 (포르말린) 및 정량화 단백질 분석 (액체 질소 나 드라이 아이스)의 샘플 조직.

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    Representative Results

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    괴사

    이 모델의 주요 포인트 - 조직 괴사 다음 플랩 고도 (즉, 영구 급성 허혈 유도) - 반복적으로 측정하고, 10 일의 기간에 걸쳐도 3에 도시 된 바와 같이, 거시적으로 도시. 플랩 괴사의 최종 경계는 보통 수술 후 5 일째와 7 사이에 발생도. 3D-F (근위 중요하고 플랩의 말단 ​​괴사 영역 사이에 개발, 혈관 확장 및 미세 혈관 리모델링의 빨간색 무늬, 즉, 영역 특징 ). 웰 관류 근위, 인터 비판적 관류 중앙 영역과 괴사 단역 (도 3F.) : 무 처리 대조군 마우스는 일반적으로 세 가지 영역으로 분할 될 수 십일 후 약 50 %의 괴사 면적을 개발한다. 서론에서 언급 한 바와 같이 우리 그룹의 이전 연구는, 보호 E를 보여 주었다플랩의 말단 영역으로 중앙 영역에서 비판적으로 관류 영역의 변화 특징으로 다른 전처리 과정 후 ffects.

    선박 매개 변수

    미세 혈관 직경 및 세동맥의 적혈구 (RBC) 및 -velocity 다양한 직경뿐만 아니라 이웃 모세관 세정맥 측정되고 결과 체적 혈류량 오프라인 계산된다. 이는 10 일 (그림. 4A-B)에 1 일에서 별개의 미세 혈관의 형태 학적 및 기능적 변화의 상관 관계를 할 수 있습니다. 또한, RBC-관류 모세관 작용 밀도, 조직의 영양 관류 매개 변수가 분석된다. 모세 혈관은 일반적으로 병렬 및 생리 학적 조건 (그림. 4C)에서 3 ~ 5 μm의 사이에 직경이 현재 지향하고 있습니다. 혈액 흐름의 마는 결국 기능적 모세관 밀도와 산소 장력점차적으로 "생존"임계 값에 도달 원위부하는 근위부에서 감소 UE (그림. 4C-E) 모세 혈관이 더 이상 (그림. 4E)를 관류되지 않습니다.

    미세 혈관 리모델링 및 혈관 신생

    팽창과 리모델링 및 미세 혈관의 증가 굴곡이 플랩 준비를 받고 모든 실험군에서 관찰 할 수있다 (즉, 급성 지속적 허혈 유도 :. 그림 4 층). 그러나,이 모델에서, 단독으로 허혈성 자극 호르몬, 에리트로 포이 에틴 (도. 4G-H)와 전처리 다양한 실험에서 본 바와 같이, 예를 들어 혈관 신생을 유도하기에 충분하지 않다. 보통에서 수직으로 나오는 미세 혈관 싹와 콩나물에서 개발하는 새로운 기능 미세 혈관 네트워크를 기존의 배열 모세 혈관 하루 3과 5 사이에 볼 최초로 병렬로 -.

    염증 반응 (백혈구 - 내피 세포 상호 작용 및 세포 사멸)

    급성 허혈은 보통 영구적 미세 혈관 내피 세포에 백혈구 부착에 의해 표현된다 미처리 동물에서 상당한 염증 반응을 유도한다. 이 염증 반응 (즉, 간헐적 인 혈관 내피 세포에 백혈구의 부착) 및 부착 (즉, 혈관 내피 세포에 백혈구의 회사 접착) 백혈구 (그림. 5A-B)를 압연 특징입니다. 또한, 사멸 세포의 허혈 유도 증가 응축 핵 분열 및 주변부의 (도. 5C-D)의 특징적인 징후와 모든 대조 동물에서 볼 수있다. 모두, 백혈구 - 내피 세포 상호 작용 및 세포 사멸은 허혈에 의한 염증 반응에 대한 징후이며, 점차적으로 진보적 인 미세 혈관 기능 장애 증가와 조직의 산소 장력을 감소 (즉, (그림. 5A-D)).

    그림 1
    그림 1. 티타늄 챔버 프레임의 그림과 워크의 모든. (A) 두 프레임 부분, 세 개의 나사, 다섯 견과류, 하나 거품의 조각, 커버 유리와 스냅 링으로 구성된 분해 프레임. (B)는 육각 너트 드라이버, 스냅 링 플라이어와 와이어 커터를 포함하는 프레임을 조립하는 도구가 필요합니다. 챔버가 여러 번 사용할 경우 드라이버가 필요하지만 사용하지 않는 것이 좋습니다. (C)는 단일의 챔버 부품을 조립. 두 개의 나사를 사용하여 프레임의 뒷면과 아래쪽 두 개의 구멍에 너트를 부착 : 왼쪽. 뒷면은 피부에 프레임을 봉합하는데 사용 플랩을지지한다. 오른쪽 :의 전​​면을 조립첨부 된 거품 프레임 압박감을 보장한다. 세 개의 나사 구멍이 거품의 무료 보관합니다. 거품 중에 커버 유리 곰 관찰 창으로 누르면되지 않습니다 있는지 확인하십시오. (D) 도식은 등쪽 피하 지방없이 실 프레임을 조립.

    그림 2
    수술 플랩 절차 및 마우스의 티타늄 등쪽 피하 지방 챔버에서 구현 그림 2. 그림. (A) 상승 횡단 조명은 등쪽 피하 지방 챔버의 위치를 개설하기위한 혈관 구조를 시각화하기 위해 마우스의 등쪽 피하 지방을 두 배로. (B) 상기 챔버의 티탄 프레임의 뒤편에 위치 및 혈관과 정렬되었다. 나사 두 개의 구멍의 절개는 프레임 헥타르의 앞면을 부착하려면S가되었습니다. 폭과 길이의 비는 11mm에 15mm 두 개의 수직으로 발생하는 혈관을 중앙 집중화 동안이다 : 옆 지느러미 피부에 플랩의 개요 (C와 D). 반대쪽 (얇은 플랩 개요 및 두꺼운 테두리 사이의 표시가없는 지역)에 2mm 거리가 플랩을 상승 집게로 피부를 파악하는 데 사용됩니다. 챔버 창을 통해이면 피부의 관찰을 위해, 부가적인 조직 (해칭 영역)이 제거되어야한다. (E) 상승은 측면 플랩의 기지에서 발생하는 무작위로 배열 된 혈관 구조를 보여, 피부 플랩을 기준으로합니다. 빗금 영역은 절단되었지만 여전히 플랩에 부착되고 (포셉 피부 아래에 매달려) 다음 단계에서 제거된다. 챔버 프레임의 배면 측을 실장 (F). 플랩의 피부 표면과 배면 유리 창 측 아래 "원시"표면 상에있다. chamber`s 나사 THR 붙어깨닫지 못하고 있거나 남의 등쪽 피하 지방의 양쪽에 구멍을 절개. 플랩의 전방 및 후방 (G) 주변의 피부는 상부 챔버 림의 구멍에 고정되어 있습니다. (H) 피변 뻗어 있으며 상기 프레임의 후방 측에 봉합된다. 플랩의 탈수를 방지하기 위해, 0.9 % 염화나트륨 용액은 반복적 플랩 적하된다. (I) 플랩과 주변의 피부는 완전히 상부 챔버 림의 구멍에 고정되어 있습니다. 플랩은 챔버의 기밀성을 보장하기 위해 인접 지느러미 피부에 옆으로 다시 봉합한다. (J)는 관찰 창을 둘러싸는 프레임의 발포 베어링 대응 실장. (K)는 완전히 챔버 장착 : 커버 유리는 관찰 창에 부착 된 스냅 링에 의해 밀봉된다. 셋째 나사 조임 추가적인 프레임의 위쪽에 부착된다. 챔버의 창은 microvasculatur 반복 분석을 할 수 있습니다생체 내에 현미경으로 플랩의 전자. 현미경 동안 쉽게 접근 할 수 있도록 세 개의 나사 단축된다. (L) 장착 등쪽 피하 지방 챔버와 깨어 및 이동 마우스.

    그림 3
    일째 플랩 괴사 형태학 개발과의 경계도 3 프레젠테이션 0, 1 (B),도 3 (C),도 5 (D), 7 (E) 및 10 (즉시 플랩 준비 후) (F) . 최종 괴사 경계는 일 5, 7 (D와 E) 사이에 일어난 일입니다. 컨트롤은 충혈 반응과 미세 혈관 리모델링뿐만 아니라 관류 비 그러나 잠재적으로 가능한 영역의 윤곽 조직을 반영, 빨간색 프린지​​ (E 이중​​ 화살촉 및 별표) 흰색 FALX을 포함하여 중앙 플랩 지역 내의 경계의 고유 한 영역을 보여 괴사 원심 (E)를 개발. 패널에서 F, 플랩조직은 2 수평 라인이 세 가지 영역에서 구분됩니다 (이미지의 기지에서) 잘 관류 인접 영역, 붉은 프린지 허혈성 뇌에 반그림자에 해당하는 "루나 티카 FALX"흰색을 포함하여 비판적으로 관류 중앙 영역 ( 스트로크 부상)와 원주 빨간색 테두리로 표시 괴사 말단 영역 () 후 조직. 배율 16 배.

    그림 4
    arteriovenular의 화상을 표시 그림 4. 생체 내에 에피 형광 현미경 (AV) 번들 (A, B), 모세관 필드 (C, D, E) 및 리모델링 (F) 및 혈관 신생 (G, H) 등의 형태 학적 변화. 제어 동물 (A, B) 일 1 (A) 및도 10 (B)에서 동일한 AV-번들을 도시 생체 내에 현미경. arteriol 모두에서 관찰 기간 전체에 걸쳐 대조군 dilatory 응답의 부재를 참고AR (a) 및 세정맥 (v) 직경. 이미지 C, D 및 E는 병행 웰 관류 근위 구역 (C), 결정적으로 관류 중앙 전이 영역 (D)과 플랩 허혈성 조직의 관류 비 괴사 원위 구역 (E)으로 모세관을 정렬 보여준다. 만 혈관 리모델링을 보여 비판적으로 관류 중앙 구역 제어 마우스 (F)에서, 팽창 증가 굴곡과 병렬로 배열 된 모세 혈관에 의해 특징. 반면, 마우스는 전처리 요법이 새로 형성된 쇼로 플랩 상승하기 전에 에리트로 포이 에틴을 받아 수직으로 정상적인 기존의 모세 혈관 (G, H)에서 명확하게 구별 모세 혈관을 발생. 이 혈관 반응은 컨트롤에서 관찰되지 않았습니다. 형광 덱스 트란 15과 향상을 대조. 배율 80X.

    그림 5
    그림 5. </ 강해> 생체 내에 에피 형광 현미경 웰 관류 근위 플랩 존 (A)과 조직 (B)의 비판적 관류 허혈성 중앙 전이 영역에 AV-번들을 디스플레이하는 단계를 포함한다. 모세관 세정맥에 백혈구를 (화살표) 부착의 증가 존재를 참고 (v) 및 건강한 근위 구역 (A)에 비해 허혈성 플랩 존 (B) 내에서 세동맥 (a). 로다 민과 향상을 대조. 배율 80X. 컨트롤의 근위부 (C) 내에서 사멸 세포의 죽음과 비판적 관류 중앙 플랩 영역 (D)를 나타내는 핵 응축을 표시 생체 내에 에피 형광 현미경. 기단부 영역 (C)에 비해 세포 사멸 (흰색 화살표)의 증가 된 수는 더 허혈성 중앙 전이 영역 (D) 내에서 관찰된다. Bisbenzimide과 향상을 대조. 배율 250X.

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    Discussion

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    임상 결과 허혈성 합병증을 감소시켜 개선하기 위해, 비판적으로 관류 플랩 조직의 병태 생리 학적 과정의 자세한 지식이 필요합니다. 급성 허혈 영구 모방 새로운 동물 모델의 개발 따라서 필수적이다. 따라서, 우리는 샘플링 플랩 조직의 면역 조직 화학 및 분자 분석과 상관 될 수 근육 및 피부 맥관계의 다양한 파라미터의 반복적 형태학 다이나믹 및 기능적 실시간 평가를 허용 쉽고 신뢰성 있고, 재현성있는 모델을 개발할 수 있었다.

    연습과 약간의 손재주가 필요하지만 수술은, 특정 수술 기술을 필요로하지 않습니다. 약 25 ~ 30 운영 동물의 학습 곡선이 제대로 등쪽 피하 지방 챔버와 플랩 준비의 장착을 마스터하는 것이 필요하다. 경험이 풍부한 손에, 수술 평균 35분 시간. 결정적인플랩 준비 단계는 정확한 위치 및 개요 주요 혈관의 정확한 위치와 챔버의 윈도우의 중앙에 플랩 (트랜스 조명을 사용)으로 횡단 할 및 panniculus의 카르노 서스 상기 젤라틴 형 층의 세심한 제거를 포함 화상 배율을 사용하여 화질을 향상시킬 수있다.

    플랩 치수는 밀리미터 단위로 제공되기 때문에, 우리는 올바른 플랩 마킹 슬라이딩 캘리퍼를 사용하는 것이 좋습니다. 챔버의 윈도우 내의 수평으로 배열 지배적 용기를 배치하는 동안 어려움이있는 경우, 하나 오히려 혈관의 위치보다 더 근위 말단 더 선택한다. 원위부에서 플랩을 올리는 것은 근위부와 무작위로 관류 플랩의 결과로 동안 챔버의 창을 횡단이 선박의 정확한 위치는, 이들의 절개를 보장한다. 즉, 실패는 이러한 주요 혈관이 축 관류가 발생합니다 가로로 쪼개다합니다창 아래에있는 조직의 괴사가없는 패턴. 수술 준비하는 동안 마지막 중요 단계는 젤라틴 형 유륜 티슈 층의 제거에 관한 것이다. 경험은 과도한 제거 손해 바로 아래 panniculus의 카르노 서스 등 섬세한 수평 근육의 모세 혈관을 배열 것으로 나타났습니다. 이에 반하여, 부종 형성에 보수적 인 제거 결과와 현미경 동안 관심의 영역을 결국 제한 가시성. 이러한 모든 단계를주의 지배하는 경우, 플랩은 매우 지속적으로 플랩 상승 후 50 %의 괴사 십일 약 개발하고 있습니다. 이 개선 또는 플랩 조직의 생존을 악화시킬 수있는 다양한 치료 전략을 연구 할 수 있습니다. 마지막으로, 생체 내에 형광 현미경의 방법은 미세 혈관 조직 관류를 평가 잘 설립 절차 매우 빠르게 습득 할 수있다.

    이 모델의 주된 단점은 챔버 내의 조직의 제한된 관찰 시간(217), 플랩 준비 다음 약 10-14일의의 창. 이는 최종적으로 챔버의 옆으로 기울어 결과 등쪽 피하 지방 챔버에 인접한 피부의 점진적인 풀림에 기인한다. 드물게, 샌드위치와 같은 고정 피부는 챔버의 프레임 밖으로 끌어없고 현미경 불가능 렌더링합니다. 괴사 가장 자주 완전히 수술 후 5 일 및 7 일 사이에 경계가되기 때문에, 이것이 실제로 챔버의 틸팅 또는 챔버 내의 피부 꺼내 전에 데이터 수집을 손상하지 않는다.

    이 모델의 장점은 쉽고 재현성 및 유전자 변형 동물의 잠재적 인 사용을 포함한다. 그러나 인간의 조건으로 번역 결과에 의의를 손상시킬 수있는 평가 될 수있는 윈도우의 상대적으로 작은 크기. 또한, 느슨한 피부 동물과 인간 사이의 해부학 적 차이가있다. 동물과 수술 도구가 합리적인 비용 효율성을 가지고 있지만, HARD- 필요한 소프트웨어는 (오프 - 라인 데이터 분석을위한 에피 조명 현미경, 고해상도 카메라, 형광 염료 및 특수 소프트웨어) 현미경 큰 연구물을 수행.

    결론 :

    우리는 높은 해상도에서 시각화 및 미세 파라미터의 정량화를 허용 시간 및 마우스에서 경제적 동물 모델을 제시한다. 이 방법은 매우 관류 musculocutaneous 플랩 조직 및 기본 세포 메커니즘을 분석 할 수있는 이상적인 방법을 나타냅니다. 관심 지역의 형태 학적 변화는 반복적으로 조사하여 미세 혈관과 세포 수준에서의 기능 변화와 관련 될 수있다. 생체 내에 에피 형광 현미경 후, 조직은 또한 조직 학적 및 분자 접근법을 이용하여 처리 될 수있다.

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    Acknowledgments

    우리는 이미지 편집을위한 카타리나 Haberland 감사합니다. 자금 조달 : 수석 저자는 새로운 연구 실험실을 설정 뮌헨 공과 대학교에서 KKF 그랜트를 받았다.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    C57Bl/6 mice, 6-8 w, 20-22 g Charles River
    Depilation cream Balea Any depilation cream
    Titanium chamber Irola 160001 Halteblech M
    Custom-made Plexiglass mounting frame Frame to secure chamber to avoid chamber movement due to the animal's respiration.
    Slotted cheese head screw Screws and More 842210 DIN84 M2x10
    Hexagon full nut Screws and More 93422 DIN934 M2
    Snap ring Schaefer-Peters 472212 DIN472 J12x1,0
    Cover glass Volab Custom-made cover glass, 11.8 mm in diameter.
    Fixing foam tesamoll 05559-100 tesamoll Standard I-Profile
    Ketamine hydrochloride Parke Davis Ketavet®
    Dihydroxylidinothiazine hydrochloride Bayer Rompun®
    Buprenorphin Essex Pharma Temgesic®
    Saline 0.9%
    Desinfection alcohol
    Vicryl 5-0 Ethicon V 490 H
    Ethilon 5-0 Ethicon EH 7823 H
    1 ml syringes
    Surgical skin marker with flexible ruler Purple surgical PS3151 Any surgical skin marker and flexible ruler
    Pointed scissors
    Micro-Scissors
    Normal scissors
    2 clamps
    Fine anatomic forceps
    Micro-forceps
    Hex nuter driver wiha 1018
    Screwdriver wiha 685
    Snap ring plier Knipex 4411J1 12-25 mm
    Wire cutter Knipex 70 02 160 Wire cutter is used to cut screws short; 160 mm
    Trans-illumination light IKEA 501.632.02 LED light Jansjö; any light 
    Magnification glasses
    Intravital microscope Zeiss 490035-0001-000 Scope.A1.Axiotech
    LED system Zeiss 423052-9501-000 Colibri.2
    LED module 365nm Zeiss 423052-9011-000
    LED module 470nm Zeiss 423052-9052-000
    LED module 540-580nm Zeiss 423052-9121-000
    Filter set 62 62 HE BFP + GFP + HcRed Zeiss 489062-9901-000 Range 1: 350-390 nm excitation wavelength, split 395 nm / 402-448 nm; range 2: 460-488 nm, split 495 nm / 500-557 nm; range 3: 567-602 nm, split 610 nm / 615 nm to infinite.
    Filter set 20 Rhodamine Zeiss 485020-0000-000 540-552 nm, split 560 nm, emission 575-640 nm
    2.5X objective NA=0.06 Zeiss 421020-9900-000 A-Plan 2.5X/0.06
    5X objective NA=0.16 Zeiss 420330-9901-000 EC Plan-Neofluar 5X/0.16 M27
    10X objetive NA=0.30 Zeiss 420340-9901-000 EC Plan-Neofluar 10X/0.30 M27
    20X objective NA=0.50 Zeiss 420350-9900-000 EC Plan-Neofluar 20X/0.50 M27
    50X objective NA=0.55 Zeiss 422472-9960-000 LD Epiplan-Neofluar 50X/0.55 DIC 27
    ZEN imaging software Zeiss ZenPro 2012
    CapImage Dr. Zeintl
    Fluorescein isothiocyanate-dextran Sigma-Aldrich 45946
    bisBenzimide H 33342 trihydrochloride Sigma-Aldrich B2261 Harmful if swallowed; causes severe skin burns and eye damage, may cause respiratory irritation.
    Rhodamine 6G chloride Invitrogen R634 Harmful if swallowed; may cause genetic defects; may cause cancer; may damage fertility or the unborn child.
    Pentobarbital Merial Narcoren®

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    References

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    마우스의 등쪽 피하 지방 상공 회의소에서 허혈성 조직 손상 : 피부 플랩 모델은 급성 영구 허혈을 조사하기
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    Harder, Y., Schmauss, D., Wettstein, R., Egaña, J. T., Weiss, F., Weinzierl, A., Schuldt, A., Machens, H. G., Menger, M. D., Rezaeian, F. Ischemic Tissue Injury in the Dorsal Skinfold Chamber of the Mouse: A Skin Flap Model to Investigate Acute Persistent Ischemia. J. Vis. Exp. (93), e51900, doi:10.3791/51900 (2014).More

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