Summary
Vinduet av det murine dorsal skinfold kammeret presentert visualiserer en sone av akutt iskemi vedvarende over en musculocutaneous klaff. Intra epi-fluorescens mikrostillatelse for direkte og repeterende vurdering av microvasculature og kvantifisering av hemodynamics. Morfologisk og hemodynamiske resultater kan videre være korrelert med molekyl og histologiske analyser.
Abstract
Til tross for dyp ekspertise og avanserte kirurgiske teknikker, er iskemiindusert komplikasjoner som spenner fra sår sammenbrudd til omfattende vevsnekrose fortsatt skjer, spesielt i rekonstruktiv klaff kirurgi. Flere eksperimentelle klaff modeller har blitt utviklet for å analysere underliggende årsaker og mekanismer, og for å undersøke behandlingsstrategier for å hindre iskemiske komplikasjoner. Den begrensende faktoren for de fleste modeller er den manglende muligheten til direkte og gjentatte ganger visualisere microvascular arkitektur og hemodynamics. Målet med protokollen var å presentere et veletablert musemodell affiliating disse før nevnte mangler elementer. Hardere et al. Har utviklet en modell av et musculocutaneous klaff med en tilfeldig perfusjon mønster som gjennomgår vedvarende akutt iskemi og resulterer i nekrose ~ 50% etter 10 dager hvis holdt ubehandlet. Ved hjelp av intravital epi-fluorescensmikroskopi, tillater dette kammer repeterende visualisering av modellenmorfologi og hemodynamics i ulike regioner av interesse over tid. Tilhørende prosesser slik som apoptose, inflammasjon, angiogenese, mikrovaskulær lekkasje og kan undersøkes og korrelert til immunohistokjemiske og molekylære assays protein. Til dags dato har modellen vist seg gjennomførbarhet og reproduserbarhet i flere publiserte eksperimentelle studier som undersøker effekten av pre-, peri- og postconditioning av ischemisk utfordret vev.
Introduction
Dekning av eksponert sene, ben og implantat materiale i rekonstruktiv kirurgi er avhengig av bruk av flaps. En klaff er en blokk med vev som er overført på sin vaskulær pedicle som garanterer arteriell tilsig og venøs utstrømning. Til tross for bred kompetanse og tilgjengeligheten av en rekke klaffer som skal overføres, er iskemiindusert komplikasjoner som spenner fra sår sammenbrudd til total vevstap fortsatt støtt. Mens konservativ behandling og helbredelse ved sekundær intensjon kan forventes etter mindre vevsnekrose, betydelig klaff nekrose krever vanligvis kirurgisk revisjon, inkludert debridement, sår condition og sekundær rekonstruksjon. Dette øker sykelighet, forlenger sykehusopphold og dermed fører til økte helsekostnader.
Flaps med ubestemt mønster av blodkar eller tilfeldig perfuserte områder i distal sone mest fjernt fra den arterielle tilsig er spesielt utsatt for iskemisk skade. Acco rdingly, har mange eksperimentelle og kliniske studier evalueres utvikling av nekrose i begge, aksial mønster flaps (definert blodforsyning) og tilfeldig mønster flaps (udefinert blodforsyning) 1-3. Hovedresultatene er vanligvis basert på makroskopisk evaluering av størrelsen av det nekrotiske området. For å vurdere de årsaker og mekanismer for vevsnekrose mer i detalj, flere studier fokusert på analyse av mikrosirkulasjonen. Forskjellige teknikker er blitt brukt til å måle vevsperfusjon, inkludert analyse av vev oksygenspenning ved hjelp av elektroder polarographic 4-5, så vel som måling av blodstrømmen ved hjelp av laser-Doppler-strømningsmåling 6-7, fargestoff diffusjon 8, og mikrokulene 9-10. Disse teknikkene er imidlertid bare tillate for indirekte måling av parametere av vevsperfusjon og ikke aktiverer noen morfologisk analyse av de microhemodynamic prosesser innen en individuell område av interesse av en klaff.
t "> Sandison er kjent for å være den første som har brukt en gjennomsiktig kammer for langvarig in vivo studier, som han utførte i kaniner 11 I 1943 -. ca 20 år senere - Algire var den første til å tilpasse seg en slik gjennomsiktig kammer å være aktuelt i mus for å studere oppførselen til mikroimplantater av 12 tumorceller. På grunn av det faktum at mus er såkalte løs hud dyr, og etter noen tekniske finesser i løpet av de neste årene, Lehr og medarbeidere var i stand til å tilpasse seg slike en dorsal skinfold kammer utvikle en mindre og lettere titan kammeret. Dette kammeret aktivert evaluering ved hjelp av intravital fluorescens mikroskopi, en teknikk som gjør det mulig direkte og repeterende visualisering av et antall morfologiske og microcirculatory egenskaper og deres endringer over tid under forskjellige fysiologiske og patofysiologiske betingelser, for eksempel som iskemi-reperfusjonsskade 13.I etterforskningen av perfusion av hud, muskel og bein flaps under normale og patologiske tilstander to trender skjedde: Først den "akutte" klaff modeller som ikke bruker rygg skinfold kammeret som pedicled øret klaff i muse 14, den lateralt basert øya hud klaff i hamster 15 og pedicled kompositt klaffen i rotte 16. Det andre, "kronisk" klaff modell der kombinasjonen av en klaff med en rygg skinfold kammer tillatelser repetitive microcirculatory analyser over flere dager med intra fluorescens mikroskopi. Den består av en tilfeldig perfusert musculocutaneous klaff som er integrert i skinfold kammeret av musen 17.. Dens bredde-til-lengde-forholdet ble valgt som en situasjon med vedvarende akutt iskemi gående resulterer i ~ 50% klaff vevsnekrose 10 til 14 dager etter klaff høyde. Denne reproduserbar omfanget av vevsnekrose tillater ytterligere evaluering av begge, beskyttende (dvs. utvikling av less nekrose) og skadelige faktorer (dvs. utvikling av mer nekrose) på klaff patofysiologi. I løpet av de siste årene, flere eksperimentelle publikasjoner som viser effekten av ulike pre-, peri- og post-condition prosedyrer, inkludert administrasjon av vev-beskyttende stoffer 18-24 og lokal påføring av fysiologiske stressfaktorer som varme 25 og sjokkbølger 26, har dukket opp.
De kvantitative analyser av nekrose, mikrovaskulær morfologi og microcirculatory parametere kan videre være korrelert til immunhistokjemiske analyser og proteinanalyser. Forskjellige proteiner og molekyler inkludert vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF), nitrogenoksid synthases (NOS), nukleær faktor kappa B (NF-kB) og varmesjokkproteiner (HSP-32: hem oksygenase-1 (HO-1) og HSP- 70) er blitt vist å spille en rolle i vev beskyttelse. Basert på denne modellen kammerklaffen, er det utviklet to modifikasjoner i order å analysere neovascularization og mikrosirkulasjonen under huden pode healing 27 og angiogeniske utviklingen i et pedicled klaff med aksial mønster perfusjon 28. Vi presenterer en reproduserbar og pålitelig modell som inkluderer en ischemisk utfordret musculocutaneous klaff i muse skinfold kammeret. Denne modellen gjør det mulig for visualisering og kvantifisering av mikrosirkulasjonen og hemodynamics av intra epi-fluorescens mikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Før gjennomføring av presenterte modellen, må de tilsvarende dyrevernlovene bli konsultert og tillatelse må innhentes fra de lokale myndighetene. I dette arbeidet ble alle eksperimenter utført i samsvar med de føringer for forskning som involverer dyr og den tyske lovgivningen om beskyttelse av dyr. Forsøkene ble godkjent av den lokale dyr omsorg komiteen.
1. Animal Forberedelse og Kirurgisk Heving av Flap
- Holde dyrene i burene enkelt ved værelsestemperatur på 22-24 ° C og ved en relativ fuktighet på 60-65% med en 12-timers dag og natt-syklus. Tillat mus fri tilgang til drikkevann og standard laboratoriefor. Alltid opprettholde sterile forhold under overleve operasjonen.
- Bedøve mus ved intraperitoneal (ip) injeksjon av 0,1 ml saltvannsoppløsning per 10 g kroppsvekt inneholdende 90 mg / kg ketamin-hydroklorid og 25 mg /kg kroppsvekt dihydroxylidinothiazine hydroklorid. Anestesi er nødvendig for dyr forberedelse, kirurgi og påfølgende mikroskopi. Bekreft riktig anesthetization ved å sjekke responsen på en smertefull stimulus. Under tiden med anestesi, gjelder veterinær salve på øynene for å hindre tørrhet.
- Etter induksjon av tilstrekkelig bedøvelse, fjerne håret på ryggen med en barbermaskin. Heretter gjelder hårfjerning krem til det barberte området for å fjerne gjenværende hår.
- Under oppholdstid for hårfjerning kremen av ~ 7-10 min, forberede instrumenter, herunder hud tang og mikro tang, saks og mikro saks, suturmateriale og tusj. Desinfisere og fremstille titan kammeret ved å anvende de to skruer med mutteren ved kammerets base og ved å feste selvklebende skum (fig. 1 AC) rundt vinduet av kammeret motstykke for å garantere tettheten av kammersystemet.
- Fjern alle hårfjerning krem fra baksiden ved å vaskeden av med lunkent vann. Så tørr og desinfisere huden med en spritholdig løsning.
- Plassere musen i liggende stilling, og definerer midtlinjen av ryggen. Ta tak i huden sentralt og løft det opp for å skape en fold (Fig. 2A). Ved trans-belysning bruke noen form for lyskilde, bestemme hvor du provisorily plassere titan ramme (Fig. 2B). Sørg for at de fjerne grener av den laterale brystpulsåren (LTA) kranialt og den dype circumflexa bekkenarterie (DCIA) caudally kurs gjennom sentrum av kammeret vindu (Fig. 2B-D). Når posisjoneringen av kammeret er gjort, perforere begge lag av huden på bunnen av folden for senere fiksering av titanrammen. Nå fjerne titan ramme, plasserer muse i liggende stilling og redefinere midtlinjen av ryggen hvis det er nødvendig.
- Outline klaffen vinkelrett på ryggraden starter på midtlinjen med en bredde-til-lengde-forhold på 15 x 11 mm for å resultere i en sideveis basert og tilfeldig perfusert klaff. Deretter skisserer en ytterligere hudområde på 2 mm som strekker seg til den kontralaterale side (fig. 2C, D). Dette området er plukket med pinsett og senere sydd til titanrammen uten å forstyrre det synlige klaffområdet.
- Etter endelig merking, langsgående snitt i klaffen. Ved å gjøre det, transekt både LTA og DCIA og heve klaffen (Fig. 2E). Det er ikke behov for koagulering eller ligering av de transektert fartøy.
- Plasser kammeret skrue gjennom tidligere gjort hud perforeringer (Fig. 2F) og fiksere skinfold både anteriort og posteriort i kammeret ramme av forhøyet klaff til baksiden av rammen ved hjelp av hullene i kammeret ramme og en 5-0 avbrutte suturer (Fig. 2G).
- Suturer de vertikale lemmer av klaffen tilbake til den omgivende hud ved hjelp av 5-0 avbrutte suturer (
- Eksisere en hemi-sirkulært område av huden sideveis til den lille huden stripe på 2 mm, dvs. på den andre siden av klaffen for å observere klaffen vaskulatur. Dette tillater direkte syn gjennom observasjonsvinduet av kammeret som har en overflate på 2 90 mm.
- Ta av gelatin-lignende løs areolar vev fra tverrstripet muskel bruker mikrokirurgiske instrumenter og optisk forstørrelsesglass eller mikroskop for å forbedre bildekvaliteten ved mikroskopi. Prøv ikke å skade fartøy innenfor muskel vev lag.
- Til slutt forsegle kammeret ved å montere motstykket av rammen som tidligere har blitt ikledd selvklebende strimler av skum anteriorly, kranialt og baktil, bedugg klaffen med aktuelle bisbenzimide og saltvann (Fig. 2J). Deretter gjelder observasjonsvindu med et dekkglass ved hjelp av en låsering. Prøv ikke å lure noen luft blemmer under glasset (Fig. 2K, L). Huden vil følge dekkglasset ved adhesjonskreftene.
2. intra epifluorescens Mikros
- Vent 24 timer etter kirurgisk forberedelse for første mikroskopisk analyse for ideelle optisk kvalitet. Denne analysen representerer grunnlinjen for mikroskopi og ble gjentatt på dag 3, 5, 7 og 10 etter operasjonen. Hver gang, bedøve mus som beskrevet i trinn 1.2. Plasser dyret i en lateral dekubitale posisjon på en skreddersydd Pleksiglass transportør. På den måten blir de muskuløse vev lag av klaffen festet til dekselet glass mot up-avdelinger.
- Injisere 0,05 ml av 5% grønn fluorescens dekstran (molekylvekt 150.000) og 0,05 ml 1% Rhodamine sterkt fluorescerende fargestoff i en halevene eller retro-bulbar venøse pleksus. Den grønne fluorescerende flekker dekstran de ikke-cellulære komponenter av blod hvis den anvendes intravenøst (iv). Den fluorescerende Rhodamin flekker leukocytter og blodplater som kan være distinguished fra andre cellulære og ikke-cellulære komponenter. Endelig bisbenzimide flekker kjernefysiske komponenter som avgir mer eller mindre fluorescens i henhold til staten av kondens.
- Deretter plasserer du muse under mikroskopet. Sørg mikroskop inkluderer et LED-system - LED beam kombinasjoner for 470 & 425 nm, 365 og 490 nm, og 540 og 580 nm samt de tilsvarende filter sett (62 HE BFP / GFP / HcRed, område 1: 350-390 nm eksitasjonsbølgelengde, delt 395 nm / 402-448 nm; range 2: 460-488 nm, delt 495 nm / 500-557 nm; range 3: 567-602 nm, delt 610 nm / 615 nm til uendelig 20 Rhodamin, rekkevidde. : 540-552 nm, delt 560 nm, emisjon 575-640 nm).
- Ta opp stillbilder og levende-bilder ved hjelp av en CCD videokamera og lagre dem på en datamaskin harddisk for ytterligere off-line analyse.
- Bruk forskjellige mål (2.5x, NA (numerisk apertur) = 0,06 for panorama utsikt over kammeret, 5X,NA = 0,16; 10X, NA = 0,32; 20X, NA = 0,50; 50X, NA = 0,55) for opptak av regionene av interesse.
- Praktisk talt, dele klaffen overflate som er synlig gjennom kammeret vindu inn i tre områder av lik høyde, det vil si, en proksimal, en sentral, og et distalt område mest fjerntliggende fra det vaskulære innstrømning (fig. 3F). For image oppkjøpet, fortsetter på følgende måte ved hver observasjon tidspunkt:
- Skann vevet bilde etter bilde i kammeret vindu fra proksimale til distalt med 5X målet.
- I hvert område av klaff, velg andre- eller tredje-ordens arterioler og deres tilhørende venyler med lett identifiserbare forgreningsmønster. Bruke 5X, 10X eller 20X objektiv, lage utskrifter av arteriolovenular bunter for å enkelt re-lokalisere buntene gjennom hele observasjonsperioden.
- Med 20X objektiv og 50X objektiv, ytterligere rekord 5-6 kapillær felt og "apoptotisk"felt per område av klaffen henholdsvis. Alle bildene er tatt med 10X og 20X målsettinger bruke blått lys (fluorescerende dekstran) og grønt lys (Rhodamine) filter, mens bilder tatt med 5X og 50X objektiv bruk blått lys (fluorescerende dekstran) og hvitt lys (Bisbenzimide) filter, henholdsvis .
3. Analyse av registrerte data
MERK: Med bruk av en datamaskin-assistert bildeanalyse-system kvantifisere alle registrerte parametre off-line 29 som følger.
- Måling av arealet av ikke-perfusert, henholdsvis nekrotisk vev (mm2).
- Bruk komplett skannet kammer vindu bilde tatt med 5X objektiv (fra 2.6.1) og den fluorescerende dekstran å måle ikke-perfundert henholdsvis nekrotisk vev. Bruk "AreaBo" funksjon for å måle eventuelle ikke-perfusert mørke området: border den ikke-perfusert området og beregne arealet i mm 2 ved å bruke programvarens området målealgoritmer.
- Måling av mikrovaskulær diameter i arterioler, kapillærer og venules (mikrometer).
- Load video eller bilder fra de registrerte AV-bunter eller kapillær feltene inn i programvaren. For best resultat bruker stillbilder eller videoer med høyest forstørrelse hvor klare grenser fartøyet er klart synlig.
- Bruk "DiamPe" funksjon av programvaren for å sørge for at målingene utføres vinkelrett på fartøyets veggen. For å gjøre dette markerer to poeng på fartøyets veggen og med den tredje klikket mark normalen diameter av fartøyet. Programvaren vil utføre målingen i mikrometer.
- Gjenta målingene på de samme fartøyene for alle opptak på samme sted. Mål flere kapillærer til å akkumulere gjennomsnittlig diameter.
- Analyse av røde blodceller (RBC) hastighet i arterioler, kapillærer ennd venuler (mm / sek).
- For arteriolar røde blodceller (RBC) hastighet (mm / s) målinger bruke "VeloLSD" funksjon av programvare og velger de samme fartøyene i fluorescerende dekstran vinduet for hvilke diametre er målt.
- Analyser den med datamaskin-assistert bildeanalyse-system ved bruk av linjeskift metoden, som er basert på måling av forskyvning (mm) av en individuell intravaskulær gråtonenivå mønsteret over tid (sek).
- Måling av volumetrisk blodstrøm i skip (pl / sek).
- Beregn volumetrisk blodstrøm (pl / sek) i arterioler, kapillærer og venyler fra RBC fartøyets hastighet og tverrsnittsareal (π * r 2) i henhold til ligningen av Gross og Aroesty, som er, Q = V * π * r 2 , forutsatt en sylindrisk beholder 30 formen.
- Måling av funksjonell kapillær tetthet av RBC-perfuserte kapillærer (nærings perfusjon: cm / cm
- Last inn en innspilt fluorescerende kapillær feltet med 20X objektiv forstørrelse inn i programvaren. Bruk "DensLA" -funksjonen for å måle funksjonell kapillær tetthet av RBC-perfuserte microvessels.
- Spore perfuserte kapillærer med markøren og markere perfuserte fartøy. Ikke markere ikke-perfusert kapillærer, arterioler eller venuler. Programvaren vil måle funksjonell kapillær tetthet av de perfuserte kapillærer i cm / cm2. Gjenta fremgangsmåten for de andre registrerte kapillær felt.
- Load spilt inn videoer eller rammer av fluorescerende kapillære felt inn i programvaren. Identifisere gyrose fartøyer og bruke "TorqIx" funksjon av programvaren. Spore klart fartøy flyte med kurset og avslutte med et høyreklikk. Programvaren viltegne en rett linje for direkte måte, og vil sette den i sammenheng med den spores banen.
MERK: Se opp for tegn på angiogenese som knopper, spirer og nydannede kapillærer, som vanligvis utgår vinkelrett fra pre-eksisterende kapillærer. Måle tettheten av disse nylig dannede fartøy som beskrevet i trinn 3.5.
- Laste Bisbenzimide-innspilte videoer (50X objektiv) i programvaren. Bruk "DenseNA" -funksjonen. Marker apoptotiske celler i henhold til de nevnte egenskapene som kjernekraft kondens, fragmentering og margination med en venstreklikk.
- Etter merking av alle karakteristiske celler i hele videoen, klikk på "N / A" i programvaren, som automatisk vil telle alle merkede celler og dele det i hele området. Resultatet vil bli apoptotiskceller / mm2.
- Analyser inflammatorisk respons ved å telle antallet av Rhodamine merkede leukocytter som klebet til det endoteliale foring av post-kapillære venyler i en tidsperiode på ≥30 sek ("selvklebende"), og man følger de intermittent leukocytter (<30 sek, "ruller") . Venular leukocytt tilslutning er uttrykt som celler per mm 2 endotelial overflate.
- Vurdere makromolekylært leakage som en parameter av mikrovaskulær permeabilitet etter en intravenøs injeksjon av en fluorescerende dekstran. Densitometrically bestemme flere grå nivåer i vev direkte ved siden av kapillært beholderveggen (E1), så vel som i den marginale cellefritt plasma av fartøyet (E2). Deretter beregner makromolekylært ekstravasasjon (E) som forholdet mellom E1 / E2 31.
4. Postoperativ Care
- Returnere dyret i et eget bur for å unngå selskap med andre dyr før fullt restituert. Ikke la et dyr uten tilsyn før det har gjenvunnet tilstrekkelig bevissthet til å opprettholde sternal recumbency. Overvåk dyrene daglig for blødning, lokale og systemiske tegn på infeksjon og posisjonen av kammeret.
- Evaluere den generelle tilstanden til dyret ved å observere motorisk aktivitet, kroppsvekt, tegn på smerte, toleranse til dressing og auto-lemlestelse.
- Hold mus ett per bur for å unngå Mutual manipulering av kammeret. På ethvert tegn på smerte, anvende Buprenorfin i en dose på 0,05 til 0,1 mg / kg kroppsvekt, subkutant i 8 timers intervaller.
5. Eutanasi og explantation av skinfold Chamber
- På dag 10, ofre dyr ved hjelp av en overdose av et bedøvelsesmiddel medikament (150 mg / kg Pentobarbital).
- Fjern kammeret og smake på klaff vev for immunhistokjemiske og molekylær protein analyser. Eksempel på vev for konvensjonell histologi (formalin) og kvantifiserbare proteinanalyser (flytende nitrogen eller tørris).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nekrose
Hovedendepunktet av denne modellen - vevsnekrose følgende klaff høyde (dvs., induksjon av akutt iskemi vedvarende) - er gjentatte ganger målt makroskopisk og illustreres som vist i figur 3 over en periode på 10 dager. Slutt avgrensning av klaffen nekrose skjer vanligvis mellom dag 5 og 7 etter kirurgi, og er karakterisert ved en rød frynser, dvs. sone av vasodilatasjon og mikrovaskulær remodellering, utvikling mellom den proksimale og den distale vital nekrotisk sone av klaffen (fig. 3D-F ). Ubehandlede kontrollmus vanligvis utvikle en nekrotisk område på ca 50% etter 10 dager som kan deles i tre atskilte områder: brønnen perfusert proksimale, den interkalerte og kritisk perfusert sentrale området og den distale nekrotisk område (fig 3F.). Tidligere studier av vår gruppe, som nevnt i innledningen, har vist beskyttelses effekter etter ulike prekondisjonering prosedyrer, som er preget av en forskyvning av den kritiker perfusert området fra den sentrale sonen mot den ytre sonen av klaff.
Fartøysparametre
Mikrovaskulære diametre og røde blodceller (RBC) -velocity av arterioler og venuler av ulike diametre, samt av nabokapillærene, måles, og den resulterende volumetriske blodstrøm blir beregnet off-line. Dette gjør det mulig å korrelere både morfologiske og funksjonelle forandringer av distinkte mikrokar fra dag 1 til dag 10 (fig. 4A-B). I tillegg er den funksjonelle tettheten av RBC-perfuserte kapillærer, parameteren for nærings perfusjon av vev, blir analysert. Kapillærene er vanligvis orientert i-parallell og nåtid med diameter mellom 3-5 mikrometer i henhold fysiologiske forhold (fig. 4C). Blodstrømmen, funksjonelle kapillære tetthet, og til slutt oksygenspenningen i tissue gradvis avta fra proksimalt til distalt til å nå en terskel "av levedyktighet" (fig. 4C-E), hvor kapillarene er ikke lenger perfusert (fig. 4E).
Microvascular ombygging og angiogenese
Remodeling med dilatasjon og øket tortuosity av mikrokar kan bli observert i alle forsøksgrupper som gjennomgår klaff preparat (dvs., induksjon av akutt iskemi vedvarende: Fig. 4F). Imidlertid, i denne modellen, er den iskemiske stimulus alene ikke nok til å indusere angiogenese, som for eksempel vist i en rekke forsøk med prekondisjonering hormonet erytropoietin (fig. 4G-H). De nye funksjonelle mikrovaskulære nettverk som vanligvis utvikler fra mikrovaskulære knopper og spirer som kommer vinkelrett ut fra den pre-eksisterende er første synlige mellom dag 3 og 5 i parallelle arrangert kapillærer.
Inflammatorisk respons (leukocytt-endotelial interaksjon og apoptose)
Akutt iskemi induserer vedvarende vanligvis en betydelig inflammatorisk respons hos ubehandlede dyr som er representert ved å klebe leukocytter til endotelet mikrovaskulær. Dette inflammatoriske respons er karakterisert ved valsing (dvs. intermitterende adhesjon av leukocytter til det vaskulære endotel) og stikker (dvs. fast adhesjon av leukocytter til det vaskulære endotel) leukocytter (fig. 5A-B). I tillegg kan en iskemi indusert økning av apoptotiske celler ses i alle kontrolldyrene med de karakteristiske tegn på atom kondensasjon, fragmentering og margination (fig. 5C-D). Begge, leukocytt-endotelial interaksjon og apoptose er tegn til iskemiindusert inflammatorisk respons og gradvis øke med progressiv mikrovaskulær dysfunksjon og redusert oksygen spenning i vevet (dvs. (fig. 5A-D)).
Figur 1. Illustrasjon av titan kammer ramme og alle sine arbeidsstykker. (A) Disassembled ramme som består av to rammedeler, tre skruer, fem nøtter, en del av skum, et dekkglass og en låsering. (B) Nødvendig verktøy for å montere rammen inkludert en hex mutter driver, en låsering tang og en wire cutter. En skrutrekker er ikke nødvendig, men anbefales dersom kamrene vil bli brukt flere ganger. (C) Assembled enkeltkammer deler. Venstre: Bakside side av rammen med to skruer og mutre festes i de nedre to hull. Baksiden blir brukt til å suturere rammen på huden og bærer klaffen. Høyre: Montert forsiden avrammen med vedlagte skum for å garantere tetthet. Legg merke til at alle de tre skruehullene holdes fri for skum. Pass på at ingen av skummet vil bli presset inn i observasjonsvindu, som bærer dekselet glass. (D) Skjematisk montert kammer ramme uten rygg skinfold.
Figur 2. Illustrasjon av den operative prosedyren klaff og dens implementering i titan dorsal skinfold kammeret i mus. (A) Forhøyet trans-belyste doblet dorsal skinfold av musen for å visualisere vaskulær arkitektur for skisserte posisjonen til den dorsale skinfold kammeret. (B) Baksiden av kammeret er titan ramme har blitt plassert og justert med skipene. Snittet av to hull for skruer for å feste frontsiden av rammen has blitt gjort. (C og D) Disposisjon av klaffen på rygghuden lateralt: Bredden-til-lengde-forholdet er 15 mm til 11 mm mens sentraliserings de to vinkelrett som oppstår fartøy. En 2 mm avstand til motsatt side (umerket område mellom tynn klaff disposisjon og tykk kant) vil bli brukt til å ta tak i huden med pinsett for å heve klaffen. For observasjon av baksiden huden gjennom kammeret vinduet, har ekstra vev som skal fjernes (skravert område). (E) Forhøyet lateralt basert hud klaff, som viser at tilfeldig anordnet vaskulær arkitektur som stammer fra undersiden av klaffen. Klekket området har blitt kuttet ut, men er fortsatt festet til klaffen og fjernes i neste trinn (hengende hud under tang). (F) Montering av baksiden av kammerrammen. Hudens overflate av klaffen er på baksiden, og den "rå" overflate under glassvindussiden. De chamber`s skruene står fast thrOugh den radert hullene på begge sider av den dorsale skinfold. (G) Den omkringliggende hud, anteriort og posteriort, av klaffen er festet i hullene i det øvre kammeret felgen. (H) Huden klaff er strukket ut, og også sutureres til baksiden av rammen. For å unngå dehydrering av klaffen, blir 0,9% natriumklorid-løsning dryppet ned på klaffen gjentatte ganger. (I) Den klaff og den omkringliggende huden er helt fast i hullene i det øvre kammer felgen. Klaffen er sutureres tilbake sideveis inn i den tilstøtende rygghuden for å garantere tettheten av kammeret. (J) Montering av skumbærende motstykke av rammen, som omgir observasjonsvinduet. (K) Fullstendig montert kammer: Et deksel glass er festet til observasjon vinduer og forseglet med en låsering. En tredje skrue er festet til toppen av rammen for ytterligere stramming. Vinduet i kammeret gjør gjentatte analyser av microvasculature av klaffen ved intramikroskopi. For enklere tilgang under mikros de tre skruene er forkortet. (L) Awake og flytte musen med montert rygg skinfold kammeret.
Figur 3. Presentasjon av den morfologiske utvikling og avgrensning av klaffen nekrose på dag 0 (umiddelbart etter fremstillingen klaff, A), 1 (b), 3 (C), 5 (D), 7 (E) og 10 (F) . Endelig nekrotiske avgrensning foregår mellom 5 og 7 (D og E). Kontroller viser en tydelig sone skillelinje innenfor sentrale klaff området, inkludert en rød frynser og en hvit falx (dobbel pilspiss og stjerne i E), noe som reflekterer en hyperemiske respons og microvascular ombygging samt en ikke-perfusert men potensielt levedyktig område opptegning vev nekrose utvikler distalt (E). I panel F, klaffenvev er delt i tre distinkte områder av to horisontale linjer: brønnen perfusert proksimale sone (ved bunnen av bildet), kritisk perfusert den sentrale sone (inkludert den røde frynser en hvit "falx Lunatica" svarende til penumbra i iskemiske hjerne vev etter hjerneslag skade) og nekrotiske distal sone (perifert markert med rød ramme). Forstørrelse 16X.
Figur 4. intra epi-fluorescens mikroskopi viser bilder av arteriovenular (AV) bunter (A, B), kapillær felt (C, D, E) og morfologiske endringer som for eksempel ombygging (F) og angiogenese (G, H). Intravital mikroskopi viser den samme AV-bunt i et kontrolldyr (A, B) på dag 1 (A) og 10 (B). Legg merke til fraværet av dilatory respons i kontroller i løpet av hele observasjonsperioden på begge arteriolar (a) og venular (v) diameter. Images C, D og E demonstrere parallelt anordnet kapillarer i brønnen perfusert proksimale sone (C), kritisk perfusert sentral overgangssone (D) og den ikke-perfunderte nekrotisk distale sone (E) av den ischemiske klaff vev. I de kritisk perfuserte sentrale sone kontrollmus bare viser vaskulær remodellering (F), karakterisert ved kapillarer anordnet i parallelle med dilatasjon og øket tortuosity. I kontrast, mus som fikk erytropoietin før klaff høyde som en prekondisjonering regime viser nydannede og vinkelrett som oppstår kapillærer, som er lett å skille fra vanlige pre-eksisterende kapillærer (G, H). Dette angiogent responsen har ikke blitt observert i kontrollene. Kontrastforbedring med fluorescerende dekstran 150.000. Forstørrelse 80X.
Figur 5. </ Strong> intravital epi-fluorescens mikroskopi viser AV-bunter i brønnen perfusert proksimale klaff sone (A) og kritisk perfusert sentral iskemisk overgangssone av vevet (B). Legg merke til den økte nærværet av leukocytter man følger (piler) i postkapillære venyler (v) og arterioler (a) innen den ischemiske sonen klaff (B) sammenlignet den sunne proksimale sone (A). Kontrastforbedring med Rhodamin. Forstørrelse 80X. Intravital epi-fluorescens-mikroskopi viser atom kondensasjon indikerer apoptotisk celledød i det proksimale (C) og kritisk perfusert sentrale klaff område (D) av kontrollene. Et økt antall av apoptotiske celler (hvite piler) er observert i løpet av de mer sentrale ischemiske overgangssone (D) i forhold til den proksimale sone (C). Kontrastforbedring med Bisbenzimide. Forstørrelse 250x.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For å redusere ischemiske komplikasjoner, og derved forbedre klinisk resultat, er mer detaljert kjennskap til patofysiologiske prosesser i kritisk perfusert klaff vev nødvendig. Utviklingen av nye dyremodeller som etterligner akutt vedvarende iskemi er derfor obligatorisk. Følgelig var vi i stand til å utvikle en lett reproduserbar og pålitelig modell som åpner for repeterende morfologiske, dynamisk og funksjonell sanntid evaluering av ulike parametere av muskel og hud blodkar som kan korrelerte med immunhistokjemisk og molekylær analyse av samplet klaff vev.
Den kirurgiske prosedyren krever ingen spesifikke kirurgiske ferdigheter, selv om praksis og noen fingerferdighet er nødvendig. En lærekurve av ca 25-30 opererte dyr, er vanligvis nødvendig for å mestre monteringen av den dorsale skinfold kammeret og klaffen forberedelse på riktig måte. I erfarne hender, tid for kirurgi gjennomsnitt 35 minutter. Crucialtrinnene med klaff preparatet inkluderer riktig plassering og omrisset av klaffen i midten av kammerets vindu med nøyaktig posisjonering av hoved fartøy som skal transektert (ved bruk av trans-belysning), og den grundige fjernelse av gelatin-lignende lag over panniculus carnosus ved hjelp av image-forstørrelse for å forbedre bildekvaliteten.
Siden klaff dimensjoner er gitt i millimeter, anbefaler vi å bruke en glidende caliper for korrekt klaff merking. Hvis det er noen problemer mens posisjonere horisontalt ordnet dominerende skip innen kammeret vindu, bør man heller velge en mer distal enn en mer proksimale posisjon av skipene. Den korrekte posisjonering av fartøyene som den tverrgående kammer største vinduet, garanterer transeksjon av disse mens heve klaffen fra å proksimale og distale resulterer i en tilfeldig perfusert klaff. Med andre ord, for å svikt tversgående disse store fartøyer vil resultere i en aksial perfusjonmønster uten nekrose av vevet under vinduet. Den endelige avgjørende skritt i løpet av kirurgiske forberedelse vedrører fjerning av gelatin-aktig areolar vevet sjikt. Erfaring har vist at overdreven fjerning skader den nedenforliggende panniculus carnosus, og slik at den skjøre horisontalt anordnet muskulære kapillærer. Tvert imot, konservative fjerning resulterer i ødemdannelse og til slutt begrenset synlighet av regionene av interesse under mikroskopi. Hvis alle disse trinnene er mastret med forsiktighet, klaffen svært stadig utvikler ca 50% nekrose 10 dager etter klaff høyde. Dette gjør det mulig å studere ulike terapeutiske strategier som kan forbedre eller forverre overlevelse av klaffen vev. Til slutt, er metoden for intravital fluorescensmikroskopi en veletablert prosedyre for å evaluere mikrovaskulær vevsperfusjon og kan læres svært raskt.
Den store ulempen med denne modellen er begrenset observasjonsperiode på vevet i kammeret217; s vindu på ca 10 til 14 dager etter fremstillingen klaff. Dette er på grunn av den gradvise løsgjøring av huden proksimalt til den dorsale skinfold kammeret som til slutt resulterer i sideveis vipping av kammeret. Sjelden, trekker sandwich-aktig, fast hud ut av kammeret ramme og gjengir mikros umulig. Siden nekrose er oftest fullt avgrenset mellom dag 5 og 7 etter operasjonen, betyr ikke egentlig kompromiss datainnsamling før tilting av kammeret eller trekke ut av huden i kammeret.
Fordeler med modellen inkluderer enkel reproduserbarhet og potensiell bruk av genmodifiserte dyr. Den relativt lille størrelsen på vinduet som kan vurderes kan imidlertid kompromittere betydning i å oversette resultatene i menneskelige forhold. I tillegg er det anatomiske forskjeller mellom løse isolerte dyr og mennesker. Mens dyrene og kirurgiske verktøy har en rimelig kostnadseffektivitet, HARD- og programvare som er nødvendig for å utføre mikroskopi (epi-belysning mikroskop med høy oppløsning, fluorescerende fargestoffer og spesiell programvare for off-line analyse av data) representerer en større investering.
Konklusjon:
Vi presenterer en tids- og kostnadseffektive dyremodell i mus som tillater visualisering og kvantifisering av mikrosirkulasjons parametere ved høy oppløsning. Denne tilnærmingen representerer en ideell metode for å analysere kritisk perfusert musculocutaneous klaff vev og de underliggende cellulære mekanismene. Morfologiske endringer av regioner av interesse kan være gjentatte ganger undersøkt og korrelert med funksjonelle endringer på en mikrovaskulær og cellenivå. Etter intra epi-fluorescens mikroskopi, kan vevet bli videre behandlet ved hjelp av histologiske og molekylære metoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi takker Katharina Haberland for bilderedigering. Finansiering: senior forfatter mottatt en KKF Grant fra Technische Universität München for å sette opp et nytt forskningslaboratorium.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57Bl/6 mice, 6-8 w, 20-22 g | Charles River | ||
| Depilation cream | Balea | Any depilation cream | |
| Titanium chamber | Irola | 160001 | Halteblech M |
| Custom-made Plexiglass mounting frame | Frame to secure chamber to avoid chamber movement due to the animal's respiration. | ||
| Slotted cheese head screw | Screws and More | 842210 | DIN84 M2x10 |
| Hexagon full nut | Screws and More | 93422 | DIN934 M2 |
| Snap ring | Schaefer-Peters | 472212 | DIN472 J12x1,0 |
| Cover glass | Volab | Custom-made cover glass, 11.8 mm in diameter. | |
| Fixing foam | tesamoll | 05559-100 | tesamoll Standard I-Profile |
| Ketamine hydrochloride | Parke Davis | Ketavet® | |
| Dihydroxylidinothiazine hydrochloride | Bayer | Rompun® | |
| Buprenorphin | Essex Pharma | Temgesic® | |
| Saline 0.9% | |||
| Desinfection alcohol | |||
| Vicryl 5-0 | Ethicon | V 490 H | |
| Ethilon 5-0 | Ethicon | EH 7823 H | |
| 1 ml syringes | |||
| Surgical skin marker with flexible ruler | Purple surgical | PS3151 | Any surgical skin marker and flexible ruler |
| Pointed scissors | |||
| Micro-Scissors | |||
| Normal scissors | |||
| 2 clamps | |||
| Fine anatomic forceps | |||
| Micro-forceps | |||
| Hex nuter driver | wiha | 1018 | |
| Screwdriver | wiha | 685 | |
| Snap ring plier | Knipex | 4411J1 | 12-25 mm |
| Wire cutter | Knipex | 70 02 160 | Wire cutter is used to cut screws short; 160 mm |
| Trans-illumination light | IKEA | 501.632.02 | LED light Jansjö; any light |
| Magnification glasses | |||
| Intravital microscope | Zeiss | 490035-0001-000 | Scope.A1.Axiotech |
| LED system | Zeiss | 423052-9501-000 | Colibri.2 |
| LED module 365nm | Zeiss | 423052-9011-000 | |
| LED module 470nm | Zeiss | 423052-9052-000 | |
| LED module 540-580nm | Zeiss | 423052-9121-000 | |
| Filter set 62 62 HE BFP + GFP + HcRed | Zeiss | 489062-9901-000 | Range 1: 350-390 nm excitation wavelength, split 395 nm / 402-448 nm; range 2: 460-488 nm, split 495 nm / 500-557 nm; range 3: 567-602 nm, split 610 nm / 615 nm to infinite. |
| Filter set 20 Rhodamine | Zeiss | 485020-0000-000 | 540-552 nm, split 560 nm, emission 575-640 nm |
| 2.5X objective NA=0.06 | Zeiss | 421020-9900-000 | A-Plan 2.5X/0.06 |
| 5X objective NA=0.16 | Zeiss | 420330-9901-000 | EC Plan-Neofluar 5X/0.16 M27 |
| 10X objetive NA=0.30 | Zeiss | 420340-9901-000 | EC Plan-Neofluar 10X/0.30 M27 |
| 20X objective NA=0.50 | Zeiss | 420350-9900-000 | EC Plan-Neofluar 20X/0.50 M27 |
| 50X objective NA=0.55 | Zeiss | 422472-9960-000 | LD Epiplan-Neofluar 50X/0.55 DIC 27 |
| ZEN imaging software | Zeiss | ZenPro 2012 | |
| CapImage | Dr. Zeintl | ||
| Fluorescein isothiocyanate-dextran | Sigma-Aldrich | 45946 | |
| bisBenzimide H 33342 trihydrochloride | Sigma-Aldrich | B2261 | Harmful if swallowed; causes severe skin burns and eye damage, may cause respiratory irritation. |
| Rhodamine 6G chloride | Invitrogen | R634 | Harmful if swallowed; may cause genetic defects; may cause cancer; may damage fertility or the unborn child. |
| Pentobarbital | Merial | Narcoren® |
References
- McFarlane, R., De Young, G., Henry, R. The design of a pedicle flap in the rat to study necrosis and its prevention. Plast Reconstr Surg. 35, 177-182 (1965).
- Finseth, F., Cutting, C. An experimental neurovascular island skin flap for the study of the delay phenomenon. Plast Reconstr Surg. 61, 412-420 (1978).
- Petry, J. J., Wortham, K. A. The anatomy of the epigastric flap in the experimental rat. Plast Reconstr Surg. 74, 410-413 (1984).
- Achauer, B. M., Black, K. S., Litke, D. K. Transcutaneous PO2 in flaps: a new method of survival prediction. Plast Reconstr Surg. 65, 45-45 (1980).
- Vollmar, B., Menger, M. D. Assessment of microvascular oxygen supply and tissue oxygenation in hepatic ischemia/reperfusion. Adv. Exp. Med. Biol. 428, 403-408 (1997).
- Menger, M. D., Barker, J. H., Messmer, K. Capillary blood perfusion during postischemic reperfusion in striated muscle. Plast Reconstr Surg. 89, 1104-1114 (1992).
- Uhl, E., Rösken, F., Curri, S. B., Menger, M. D., Messmer, K. Reduction of skin flap necrosis by transdermal application of buflomedil bound to liposomes. Plast Reconstr Surg. 102, 1598-1604 (1998).
- Pang, C. Y., Neligan, P., Nakatsuka, T., Sasaki, G. H. Assessment of the fluorescein dye test for prediction of skin flap viability in pigs. J Surg Res. 41, 173-181 (1986).
- Hjortdal, V. E., Hansen, E. S., Henriksen, T. B., Kjolseth, D., Soballe, K., Djurhuus, J. C. The microcirculation of myocutaneous island flaps in pigs studied with radioactive blood volume tracers and microspheres of different sizes. Plast Reconstr Surg. 89, 116-122 (1992).
- Pang, C. Y., Neligan, P., Nakatsuka, T. Assessment of microsphere technique for measurement of capillary blood flow in random skin flaps in pigs. Plast Reconstr Surg. 74, 513-521 (1984).
- Sandison, J. C. A new method for the microscopic study of living growing tissues by the introduction of a transparent chamber in the rabbit's ear. The Anatomical Record. 28, 281-287 (1924).
- Algire, G. H. An Adaptation of the Transparent-Chamber Technique to the Mouse. Journal of the National Cancer Institute. 4, 1-11 (1943).
- Lehr, H. A., Leunig, M., Menger, M. D., Nolte, D., Messmer, K. Dorsal skinfold chamber technique for intravital microscopy in nude mice. Am J Pathol. 4, 1055-1062 (1993).
- Barker, J. H., et al. An animal model to study microcirculatory changes associated with vascular delay. Br J Plast Surg. 52, 133-142 (1999).
- Erni, D., Sakai, H., Banic, A., Tschopp, H. M., Intaglietta, M. Quantitative assessment of microhemodynamics in ischemic skin flap tissue by intravital microscopy. Ann Plast Surg. 43, 405-414 (1999).
- Roesken, F., Schäfer, T., Spitzer, W. J., Vollmar, B., Menger, M. D. In vivo analysis of the microcirculation of osteomyocutaneous flaps using fluorescence microscopy. Br J Plast Surg. 52, 644-652 (1999).
- Harder, Y., Amon, M., Erni, D., Menger, M. D. Evolution of ischemic tissue injury in a random pattern flap: a new mouse model using intravital microscopy. J Surg Res. 121, 197-205 (2004).
- Harder, Y., Contaldo, C., Klenk, J., Banic, A., Jakob, S. M., Erni, D. Preconditioning with monophosphoryl lipid A improves survival of critically ischemic tissue. Anesth Analg. 100, 1786-1792 (2005).
- Rezaeian, F., et al. Erythropoieton protects critically perfused flap tissue. Ann Surg. 248, 919-929 (2008).
- Harder, Y., et al. Erythropoietin reduces necrosis in critically ischemic myocutaneous tissue by protecting nutritive perfusion in a dose-dependent manner. Surgery. 145, 10-1016 (2009).
- Rezaeian, F., et al. Erythropoietin-induced upregulation of endothelial nitric oxide synthase but not vascular endothelial growth factor prevents musculocutaneous tissue from ischemic damage. Lab Invest. 90, 40-51 (2010).
- Rezaeian, F., Ong, M. F., Harder, Y., Menger, M. D. N-acetylcysteine attenuates leukocytic inflammation and microvascular perfusion failure in critically ischemic random pattern flaps. Microvasc Res. 82, 28-34 (2011).
- Rezaeian, F., et al. Ghrelin protects musculocutaneous tissue from ischemic necrosis by improving microvascular perfusion. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 302, 603-610 (2012).
- Rezaeian, F., et al. Long-term preconditioning with Erythropoietin reduces ischemia-induced skin necrosis. Microcirculation. , (2013).
- Harder, Y., et al. Heat shock preconditioning reduces ischemic tissue necrosis by heat shock protein (HSP)-32-mediated improvement of the microcirculation rather than induction of ischemic tolerance. Ann Surg. 242, 869-878 (2005).
- Tobalem, M., et al. Local shockwave-induced capillary recruitment improves survival of musculocutaneous flaps. J Surg Res. 184, 1196-1204 (2013).
- Lindenblatt, N., Calcagni, M., Contaldo, C., Menger, M. D., Giovanoli, P., Vollmar, B. A new model for studying the revascularization of skin grafts in vivo: the role of angiogenesis. Plast Reconstr Surg. 122, 169-1680 (2008).
- Schweizer, R., et al. Morphology and hemodynamics during vascular regeneration in critically ischemic murine skin studied by intravital microscopy techniques. Eur Surg Res. 47, 222-230 (2011).
- Klyscz, T., Jünger, M., Jung, F., Zeintl, H. Cap image—a new kind of computer-assisted video image analysis system for dynamic capillary microscopy. Biomed. Tech. 42, 168-1675 (1997).
- Gross, J. F., Aroesty, J. Mathematical models of capillary flow: a critical review. Biorheology. 9, 225-264 (1972).
- Menger, M. D., Pelikan, S., Steiner, D. Microvascular ischemiareperfusion injury in striated muscle: significance of ‘reflow paradox. Am J Physiol. 263 (6 part 2), 1901-1906 (1992).
