Summary
Fönstret i murina rygg skinfold kammare presenteras visualiserar en zon av akut ihållande ischemi av en musculocutaneous flik. Intravital epi-fluorescens mikroskopi tillstånd för direkt och upprepad bedömning av mikrocirkulation och kvantifiering av hemodynamik. Morfologiska och hemodynamiska resultat kan vidare korreleras med histologiska och molekylära analyser.
Abstract
Trots djup expertis och avancerade kirurgiska tekniker, är ischemi-inducerade komplikationer allt från lindad nedbrytning omfattande vävnadsdöd fortfarande förekommer, särskilt i rekonstruktiv klaffkirurgi. Flera experimentella klaff modeller har utvecklats för att analysera bakomliggande orsaker och mekanismer och undersöka behandlingsstrategier för att förhindra ischemiska komplikationer. Den begränsande faktorn för de flesta modeller är den saknade möjlighet att direkt och repetitivt visualisera mikrovaskulära arkitektur och hemodynamik. Målet med protokollet var att presentera en väl etablerad musmodell affiliating dessa tidigare nämnts saknar element. Harder et al. Har utvecklat en modell av en musculocutaneous flik med ett slumpmässigt perfusion mönster som genomgår akut ihållande ischemi och resulterar i ~ 50% nekros efter 10 dagar om de förvaras obehandlade. Med hjälp av intravital epi-fluorescens mikroskopi, ger detta kammarmodell repetitiva visualisering avmorfologi och hemodynamik i olika regioner av intresse över tiden. Associerade processer såsom apoptos, inflammation, mikrovaskulära läckage och angiogenes kan undersökas och korreleras till immunhistokemiska och molekylära proteinanalyser. Hittills har modellen visat genomförbarhet och reproducerbarhet i flera publicerade experimentella studier som undersöker effekten av pre-, peri- och postconditioning av ischemiskt utmanade vävnad.
Introduction
Täckning av exponerade senor, ben och implantatmaterial i rekonstruktiv kirurgi bygger på användning av klaffar. En flik är ett block av vävnad som överförs på sin vaskulära pedicle som garanterar arteriell inflöde och venösa utflödet. Trots en bred kompetens och tillgång till en mängd olika flikar som ska överföras, är ischemi-inducerade komplikationer allt från lindad nedbrytning till total vävnadsförlust fortfarande påträffas. Av följande skäl kan förväntas konservativ behandling och läkning av sekundär intention efter mindre vävnadsnekros, signifikant klaff nekros kräver vanligen kirurgisk revision, inklusive debridering, lindad konditionering och sekundär rekonstruktion. Detta medför ökad sjuklighet, förlänger sjukhusvistelse och därmed leder till ökade vårdkostnader.
Flikar med en odefinierad mönster av kärl eller slumpmässigt perfusion områden i distala zonen längst bort från arteriell inflöde är speciellt benägna att ischemisk skada. Acco rdingly har många experimentella och kliniska studier bedömt utvecklingen av nekros i båda, axiell mönsterflikar (definierad blodförsörjnings) och slumpmässiga mönster flikar (odefinierat blod leverans) 1-3. De viktigaste resultaten är ofta baserade på makroskopisk bedömning av storleken på det nekrotiska området. För att kunna bedöma orsakerna till och mekanismerna för vävnadsnekros mer i detalj, flera studier fokuserat på analys av mikrocirkulationen. Olika tekniker har använts för att mäta vävnadsperfusion, inklusive analys av vävnadssyrespänningen med hjälp polarografiska elektroder 4-5, samt mätning av blodflödet med hjälp av laser Doppler flowmetry 6-7, färgdiffusion 8, och mikrosfärer 10/09. Dessa tekniker är dock endast tillåta för att mäta indirekta parametrar för vävnadsperfusion och gör det inte möjligt någon morfologisk analys av de microhemodynamic processer inom ett enskilt område av intresse i en flik.
t "> Sandison är känd för att vara den första som har använt en transparent kammare för förlängd in vivo studier, som han på kaniner 11 1943 -. ca 20 år senare - Algire var först med att anpassa en så transparent kammare att gälla i möss för att studera beteendet hos mikro implantat av tumörceller 12. På grund av det faktum att möss är så kallade lös hud djur och efter en del tekniska förbättringar under de följande åren, Lehr och medarbetare kunde anpassa sådana en dorsal skinfold kammare utveckla en mindre och lättare titan kammaren. Denna kammare aktiverat utvärdering med intravital fluorescensmikroskopi, en teknik som möjliggör direkt och repetitiva visualisering av ett antal morfologiska och mikrocirkulatoriska och dess förändring över tid under olika fysiologiska och patofysiologiska förhållanden, såsom såsom ischemi-reperfusionsskada 13.I utredningen av perfusion av hud, muskler och ben klaffar under normala och patologiska tillstånd två trender inträffat: Först de "akuta" klaffmodeller som inte använder rygg skinfold kammaren såsom pedicled öronfliken i musen 14, den i sidled baserad ön hudfliken i hamster 15 och pedicled sammansatta klaffen i råtta 16. För det andra, den "kroniska" klaff modell där kombinationen av en flik med en dorsal skinfold kammaren tillåter repetitiv blodcirkulationens analyser över flera dagar med intravital fluorescensmikroskopi. Den består av ett slumpmässigt perfunderad musculocutaneous flik som är integrerad i skinfold kammaren av musen 17. Dess bredd-längdförhållande valdes att en situation av akut ihållande ischemi leder konsekvent ~ 50% klaff vävnadsnekros 10 till 14 dagar efter klaff höjd. Denna reproducerbar omfattning vävnadsnekros möjliggör ytterligare utvärdering av båda, skyddande (dvs utveckling av less nekros) och skadliga faktorer (dvs utveckling av mer nekros) på klaff patofysiologi. Under de senaste åren har flera experimentella publikationer som visar effekten av olika pre-, peri- och postkonditioneförfaranden, inbegripet förvaltning av vävnadsskyddande ämnen 18-24 och den lokala tillämpningen av fysiologiska stressfaktorer såsom värme 25 och chockvågor 26, har uppstått.
De kvantitativa analyser av nekros, mikrovaskulära morfologi och mikrocirkulatoriska parametrar kan dessutom korreleras till immunhistokemiska analyser och proteinanalyser. Olika proteiner och molekyler inklusive vaskulär endotelial tillväxtfaktor (VEGF), kväveoxidsyntaser (NOS), nukleär faktor kappa B (NF-kB) och värmechockproteiner (HSP-32: heme-oxygenas 1 (HO-1) och HSP- 70) har visat sig spela en roll vid vävnadsskydd. Utifrån denna kammare flik modell har två ändringar utvecklats i order att analysera kärlnybildning och mikrocirkulationen under huden graft healing 27 och angiogena utvecklingen i ett pedicled flik med axiell mönster perfusion 28. Vi presenterar en reproducerbar och pålitlig modell som inkluderar en ischemiskt utmanade musculocutaneous flik i musen skinfold kammaren. Denna modell möjliggör visualisering och kvantifiering av mikrocirkulationen och hemodynamiken genom intravital epi-fluorescensmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Före genomförandet av den presenterade modellen, måste lagarna motsvarande skydd djur rådfrågas och tillstånd måste erhållas från de lokala myndigheterna. I detta arbete har alla experiment utföras i enlighet med de vägledande principerna för forskning som avser djur och den tyska lagstiftningen om skydd av djur. Experimenten godkändes av den lokala djurvård kommitté.
1. Animal Förberedelser och Kirurgisk Elevation av Flap
- Hålla djur i enkelburar vid rumstemperatur av 22-24 ° C och vid en relativ fuktighet på 60-65% med en 12-h-dag-och-natt-cykeln. Tillåt möss fri tillgång till dricksvatten och standardlaboratoriefoder. Håll alltid sterila förhållanden under överlevnadskirurgi.
- Bedöva musen genom intraperitoneal (ip) injektion av 0,1 ml koksaltlösning per 10 g kroppsvikt innehållande 90 mg / kg kroppsvikt ketamin-hydroklorid och 25 mg /kg kroppsvikt dihydroxylidinothiazine klorid. Anestesi är nödvändigt för beredning av animaliska, kirurgi och efterföljande mikroskopi. Bekräfta korrekt anesthetization genom att kontrollera svaret till en smärtsam stimulus. Under tiden för anestesi, tillämpa veterinär salva på ögonen för att förhindra torrhet.
- Efter induktion av tillräcklig anestesi, Vaxning varar ryggen med en elektrisk rakapparat. Härefter tillämpas depilation kräm på det rakade området för att ta bort kvarvarande hår.
- Under uppehållstiden för hårborttagning grädde på ~ 7-10 min, förbereder instrument, bland annat hud pincett och mikro pincett, sax och mikro sax, suturmaterial och en märkpenna. Desinficera och förbereda titankammaren genom att tillämpa de två skruvarna med muttern vid kammarens bas och genom att fixera självhäftande skum (fig. 1 AC) runt fönstret hos kammaren motsvarighet för att garantera tätheten hos kammarsystemet.
- Ta bort alla depilation grädde från baksidan genom tvättningbort det med ljummet vatten. Sedan torr och desinficera huden med en alkohol-haltig lösning.
- Placera musen i liggande ställning och definiera mittlinjen av ryggen. Ta tag i huden centralt och lyft upp för att skapa ett veck (Fig. 2A). Genom trans belysning med hjälp av någon form av ljuskälla, besluta om att provisorily placera titanramen (Fig. 2B). Kontrollera att de distala grenar av den laterala torakala artären (LTA) kranialt och den djupa cirkumflex iliaca (DCIA) kaudalt kurs genom centrum av kammarens fönster (fig. 2B-D). När väl positioneringen av kammaren sker, perforera båda lagren av huden vid själva botten av vecket för senare fixering av titanramen. Ta nu bort titanramen, placera musen i liggande läge och omdefiniera mittlinjen på ryggen om det behövs.
- Outline klaffen vinkelrätt mot ryggraden börjar vid mittlinjen med ett förhållande bredd-till-längd på 15 x 11 mm för att resultera i en i sidled baserad och slumpmässigt perfuserades fliken. Skissera sedan en ytterligare hudområde av 2 mm, som sträcker sig till den kontralaterala sidan (Fig. 2C, D). Detta område är plockas med pincett och senare sutureras till titanramen utan att interferera med den synliga klaff området.
- Efter slutlig märkning, incisionsfilm fliken. I att göra så, transekt både LTA och DCIA och elevate klaffen (fig. 2E). Det finns inget behov för koagulering eller ligering av de avskurna fartyg.
- Placera kammarens skruv genom de tidigare gjorda huden perforeringar (Fig. 2F) och fixera skinfold både framåt och bakåt i kammaren ram för den förhöjda fliken på baksidan delen av ramen med hjälp av hålen i kammarens ram och en 5-0 avbrutna suturer (Fig. 2G).
- Sutur de vertikala benen hos klaffen tillbaka till den omgivande huden med hjälp av 5-0 avbrutna suturer (
- Excidera en hemi-cirkulär yta av huden lateralt till den lilla hud remsa av 2 mm, det vill säga på den andra sidan av klaffen att observera klaffen vaskulatur. Detta möjliggör direkt vy genom observationsfönstret av kammaren som har en yta av 90 mm 2.
- Ta ut gelatinliknande lös areolar vävnad från tvärstrimmig muskulatur genom att använda mikro instrument och optisk förstoringsglas eller mikroskop för att förbättra bildkvaliteten vid mikroskopi. Försök att inte skada fartyg inom muskelvävnadsskikten.
- Slutligen, försegla kammaren genom att montera motsvarigheten av ramen som tidigare förlänade med själv vidhäftande remsor av skum anteriort, cranially och bakåt, bedew klaffen med aktuella bisbenzimide och koksaltlösning (fig. 2J). Därefter tillämpa observationsfönstret med ett täckglas med hjälp av en låsring. Försök att inte fånga några blåsor luft under glaset (fig. 2K, L). Huden kommer att följa täckglaset genom adhesionskrafter.
2. Intravital epifluorescensmikroskopi
- Vänta 24 timmar efter kirurgisk förberedelse för första mikroskopisk analys för perfekt optisk kvalitet. Denna analys utgör baslinjen för mikroskopi och upprepas på dag 3, 5, 7 och 10 efter operationen. Varje gång, söva mus såsom beskrivs i steg 1,2. Placera djuret i sidoläge dekubitala på en skräddarsydd plexiglas bärare. På så sätt är de muskelvävnad lager av klaffen fastnat på täckglaset vänd upp-avdelningar.
- Injicera 0,05 ml av 5% grön fluorescens dextran (molekylvikt 150.000) och 0,05 ml 1% mycket fluorescerande rodamin familj färgämne i en svansven eller retro-bulbära venösa plexus. Det grönt fluorescerande dextran fläckar icke-cellulära komponenter i blodet om den tillämpas intravenöst (iv). Den fluorescerande Rodamin fläckar leukocyter och trombocyter som kan vara distinguished från andra cellulära och icke-cellulära komponenter. Slutligen bisbenzimide fläckar nukleära komponenter som avger mer eller mindre fluorescens i enlighet med den av kondens.
- Därefter placera musen under mikroskop. Se till att mikroskopet innefattar ett LED-system - LED balk kombinationer för 470 & 425 nm, 365 & 490 nm och 540 & 580 nm samt motsvarande filtersatser (62 HE BFP / GFP / HcRed, intervallet 1: 350 till 390 nm excitationsvåglängd, split 395 nm / 402-448 nm, intervall 2: 460-488 nm, split 495 nm / 500-557 nm, intervall 3: 567-602 nm, split 610 nm / 615 nm till oändligt 20 Rodamin, intervall. : 540-552 nm, split 560 nm, emission 575-640 nm).
- Notera de stillbilder och rörliga-bilder med en laddningskopplad enhet videokamera och spara dem på datorns hårddisk för ytterligare off-line-analys.
- Använd olika mål (2.5x, NA (numerisk bländare) = 0,06 för panoramautsikt över kammaren; 5X,NA = 0,16; 10X, NA = 0,32; 20X, NA = 0,50; 50X, NA = 0,55) för inspelningar av regioner av intresse.
- Praktiskt taget, dela flikytan som är synlig genom kammaren fönster i tre områden med lika höjd, det vill säga, en proximal, en central och en distal område längst bort från kärl inflöde (Fig. 3F). För bild förvärv, gör på följande sätt vid varje observationstidpunkt:
- Skanna vävnaden bild för bild i kammaren fönster från proximalt distalt använda 5X målet.
- Inom varje område av fliken, väljer andra eller tredje ordningens arterioler och deras medföljande venolerna med lätt identifierbara grenmönster. Använda 5X, 10X eller 20X objektiv, göra utskrifter av de arteriolovenular buntar i syfte att enkelt åter lokalisera buntarna under hela observationsperioden.
- Med 20X objektiv och 50X objektiv, ytterligare rekord 5-6 kapillär fält och "apoptotiska"fält per område av klaffen respektive. Alla bilder som tas med 10X och 20X mål använder blått ljus (fluorescerande dextran) och grönt ljus (Rhodamine) filter, medan bilder som spelats in med 5X och 50X objektiv användning blått ljus (fluorescerande dextran) och vitt ljus (Bisbenzimide) filter, respektive .
3. Analys av registrerade data
OBSERVERA: Med användning av en datorstödd bildanalyssystem kvantifiera alla registrerade parametrar off-line på följande 29.
- Mätning av området för icke-perfusion respektive nekrotisk vävnad (mm 2).
- Använd den kompletta skannade kammarfönster bild som spelats in med 5X målet (från 2.6.1) och fluorescerande dextran för att mäta icke-perfusion respektive nekrotisk vävnad. Använd "AreaBo" -funktion för att mäta icke-perfusion mörkt område: gränsen mellan icke-perfusion område och beräkna området mm 2 med hjälp av programvarans Area mätningsalgoritmer.
- Mätning av mikrovaskulär diameter i arterioler, kapillärer och venoler (pm).
- Last video eller bilder från de inspelade AV-knippen eller de kapillära fält i programvaran. För bästa resultat använder stillbilder eller filmer med högsta förstoring där bestämda gränser fartyget är klart synliga.
- Använd "DiamPe" funktionen av programvaran för att se till att mätningarna utförs vinkelrätt mot fartygets vägg. För att göra detta markera två punkter på fartygets väggen och med den tredje klickmärke den vinkelräta diametern på kärlet. Programmet kommer att utföra mätningen i pm.
- Upprepa mätningarna på samma fartyg för alla inspelningar på samma ställe. Mäta flera kapillärer att ackumulera medeldiameter.
- Analys av röda blodkroppar (RBC) hastighet i arterioler, kapillärer ennd venoler (mm / sek).
- För arteriolärt röda blodkroppar (RBC) hastighet (mm / s) mätningar använder "VeloLSD" funktionen av programvaran och välj samma fartyg i den fluorescerande dextran fönster för vilka diametrar har mätts.
- Analysera den med datorstödd bildanalyssystem använder linjen shift metoden, som är på grundval av mätning av skiftet (mm) för en enskild intravaskulär grånivån mönster över tid (sek).
- Mätning av volyme blodflöde i kärl (pl / sek).
- Beräkna volymetriska blodflödet (pl / sek) i arterioler, venoler och kapillärer från RBC hastighet och kärlet tvärsnittsarea (π * r 2) enligt ekvationen av Gross och Aroesty, dvs Q = V * π * r 2 antar ett cylindriskt kärl form 30.
- Mätning av funktionell kapillär densitet på RBC-perfusion kapillärer (närande perfusion: cm / cm
- Sätt i en inspelad fluorescerande kapillär fält med 20X objektiv förstoring i mjukvaran. Använd "DensLA" funktionen för att mäta funktionell kapillär densitet på RBC-perfusion mikrokärl.
- Spåra perfuserade kapillärer med markören och markera perfuserade fartygen. Markera inte icke-perfusion kapillärer, arterioler och venoler. Mjukvaran kommer att mäta funktionell kapillär densitet av perfunderade kapillärer i cm / cm 2. Upprepa stegen för andra registrerade kapillär områden.
- Load inspelade videor eller ramar av fluorescerande kapillära fält i mjukvaran. Identifiera gyrose fartyg och använda "TorqIx" funktionen av programvaran. Spåra definitiva kärlflöde med kursen och avslutas med ett högerklick. Programvaran kommerdra en rak linje för direkt sätt och ställer den i relation med den spårade banan.
OBS: Se upp för tecken på angiogenes såsom knoppar, skott och nybildade kapillärer, som vanligtvis härrör vinkelrätt från de redan existerande kapillärer. Mät densiteten av dessa nybildade kärl som beskrivs i steg 3.5.
- Ladda Bisbenzimide-inspelade videor (50X objektiv) i programvaran. Använd "DenseNA" -funktionen. Markera apoptotiska celler enligt nämnda egenskaper såsom nukleär kondensation, fragmentering och marginalisering med en vänsterklicka.
- Efter märkning alla karakteristiska celler i hela videon, klicka på "N / A" i mjukvaran, som automatiskt kommer att räkna alla markerade celler och dela upp den i hela området. Resultatet kommer att bli apoptotiskaceller / mm 2.
- Analysera den inflammatoriska responsen genom att räkna antalet av rodamin-märkta leukocyter som vidhäftade till den endoteliala beklädnaden av post-kapillära venoler under en tidsperiod av ≥30 sek ("dekaler") och de intermittent vidhäftande leukocyter (<30 sek, "valsar") . Venular leukocytvidhäftning uttrycks som celler per mm 2 endotelial yta.
- Bedöma makromolekylärt leakage som en parameter av mikrovaskulär permeabilitet efter en intravenös injektion av ett fluorescerande dextran. Densitometriskt bestämma flera grånivåer i vävnaden i direkt anslutning till det kapillära kärlväggen (E1), såväl som i den marginella cellfri plasma av kärlet (E2). Sedan beräkna makromolekylär extravasation (E) som förhållandet E1 / E2 31.
4. Postoperativ vård
- Tillbaka djuret i en separat bur för att undvika sällskap av andra djur förrän återhämtat sig helt. Lämna inte ett djur utan tillsyn tills den har återfått tillräckligt medvetande för att upprätthålla sternala VILA. Övervaka djur dagligen för blödningar, lokala och systemiska tecken på infektion och positionen av kammaren.
- Utvärdera det allmänna tillståndet hos djuret genom att observera motorisk aktivitet, kroppsvikt, tecken på smärta, tolerans mot förbandet och autostympning.
- Hålla mössen en per bur för att undvika Mutual manipulering av kammaren. Vid något tecken på smärta, tillämpa Buprenorfin i en dos på 0,05 till 0,1 mg / kg kroppsvikt, subkutant i 8 h intervaller.
5. Eutanasi och explantation av skinfold avdelningen
- På dag 10, offra djur med hjälp av en överdos av narkosmedel läkemedel (150 mg / kg pentobarbital).
- Ta bort kammaren och prov flik vävnad för immunhistokemiska och molekylär proteinanalyser. Prov vävnader för konventionell histologi (formalin) och kvantifierbara proteinanalyser (flytande kväve eller torris).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nekros
Huvudeffektmåttet i denna modell - vävnadsnekros efter klaff höjd (dvs induktion av akut ihållande ischemi) - upprepade gånger mäts och illustreras makroskopiskt som visas i figur 3 under en period av 10 dagar. Slutlig avgränsning av klaff nekros uppträder vanligen mellan dag 5 och 7 efter operation och kännetecknas av en röd frans, dvs zon av kärlutvidgning och mikrovaskulära ombyggnad, utveckling mellan den proximala vital och distala nekrotisk zon klaffen (Fig. 3D-F ). Obehandlade kontrollmöss utvecklar oftast en nekrotisk yta på ca 50% efter 10 dagar som kan delas in i tre olika områden: den väl perfusion proximala, den inlagrade och kritiskt perfusion centrala området och nekrotiska distala området (Fig 3F.). Tidigare studier i vår grupp, som nämndes i inledningen, har visat skyddande effekter efter olika prekonditionerande förfaranden, som kännetecknas av en förskjutning av kritiskt perfusion området från den centrala zonen mot den distala zonen av klaffen.
Kärl parametrar
Mikrovaskulära diametrar och röda blodkroppar (RBC) -velocity av arterioler och venoler med olika diametrar samt för angränsande kapillärer mäts och det resulterande volymetriska blodflödet beräknas off-line. Detta gör det möjligt att korrelera både morfologiska och funktionella förändringar av distinkta mikrokärl från dag 1 till dag 10 (Fig. 4A-B). Dessutom, den funktionella densiteten hos de RBC-perfunderade kapillärer, parametern för närande perfusion av vävnaden, analyseras. Kapillärerna vanligen orienterade i parallella och närvarande med diametrar mellan 3-5 um under fysiologiska förhållanden (Fig. 4C). Blodflödet, funktionell kapillär densitet och slutligen syre spänning tissUE gradvis minska från den proximala till den distala att nå en tröskel "av viabilitet" (fig. 4C-E), där kapillärerna inte perfunderades längre (fig. 4E).
Mikrovaskulära ombyggnad och angiogenes
Ombyggnad med dilatation och ökad slingrighet av mikrokärlen kan observeras i alla experimentella grupper som genomgår förberedelser flik (dvs induktion av akut ihållande ischemi: Fig. 4F). Men i denna modell, är den ischemiska stimulus ensam inte tillräcklig för att inducera angiogenes såsom exempelvis ses i en mängd prekonditionerande experiment med hormonet erytropoietin (fig. 4G-H). De nya funktionell mikrovaskulära nätverk som brukar utvecklas från mikrovaskulära knoppar och skott som kommer vinkelrätt från tidigare in-parallellt arrangerade kapillärer är första synliga mellan dag 3 och 5.
Inflammatoriskt svar (leukocyt-endotel interaktion och apoptos)
Akut ihållande ischemi inducerar vanligtvis en betydande inflammatorisk reaktion i obehandlade djur som representeras av vidhäftande leukocyter till mikrokärlendotel. Denna inflammatoriska responsen karaktäriseras av valsning (dvs intermittent vidhäftning av leukocyter till det vaskulära endotelet), och att klibba (dvs fast adhesion av leukocyter till det vaskulära endotelet) leukocyter (Fig. 5A-B). Dessutom kan en ischemi inducerad ökning av apoptotiska celler ses i alla kontrolldjur med de karakteristiska tecknen på nukleär kondensation, fragmentering och marginalisering (fig. 5C-D). Båda, leukocyt-endotel interaktion och apoptos är tecken för ischemi-inducerade inflammatoriska svaret och gradvis öka med progressiv mikrovaskulära dysfunktion och minskad syrespänning av vävnaden (dvs. (Fig. 5A-D)).
Figur 1. Illustration av titankammarramen och alla dess arbetsstycken. (A) kan tas isär ram bestående av två ramdelar, tre skruvar, fem nötter, en bit av skum, ett täckglas och en snäppring. (B) Krävs verktyg för att montera stommen inklusive en mutter förare, en monteringstång och en avbitartång. En skruvmejsel är inte nödvändig men rekommenderas om kammare kommer att användas flera gånger. (C) Monterade enstaka kammardelar. Vänster: Tillbaka sida av ramen med två skruvar och fäst muttrarna på de nedre två hålen. Baksidan används för att sy ihop ramen på huden och är försedd med lock. Höger: Monterade framsidaramen med bifogade skum för att garantera täthet. Notera att alla tre skruvhålen hålls fria från skum. Se till att ingen av skummet kommer att pressas in i observationsfönstret, som bär täckglaset. (D) Schematisk monterade kammarramen utan rygg skinfold.
Figur 2. Illustration av den operativa flikförfarandet och dess genomförande i titan rygg skinfold kammare av musen. (A) Förhöjda trans upplyst fördubblats rygg skinfold på musen för att visualisera kärl arkitektur för beskriver läget på rygg skinfold kammaren. (B) Baksidan av kammarens titan ramen har placerats och anpassats till kärlen. Snittet av två hål för skruvar för att fästa framsidan av ramen hektarar gjorts. (C och D) Disposition av luckan på rygghuden sidled: Den bredd-längdförhållande är 15 mm till 11 mm medan centralisera de två vinkelrätt uppstår fartyg. En 2 mm avstånd till kontralaterala sidan (omärkt området mellan tunn flik kontur och tjock ram) kommer att användas för att ta tag i huden med pincett för att lyfta klaffen. För observation av baksidan huden genom kammaren fönstret, har extra vävnad tas bort (streckade området). (E) Förhöjd sidled baserad hudfliken, vilket demonstrerar den slumpmässigt ordnade vaskulär arkitektur härrör från basen på klaffen. Den streckade ytan har skurits ut, men fortfarande är fäst vid fliken och avlägsnas i nästa steg (hängande hud under tången). (F) Montering av baksidan av kammarramen. Hudytan av klaffen är på baksidan och den "rå" yta under glaset fönstersidan. De chamber`s skruvar är fast thrgrundlig den snittas hål på båda sidor av den dorsala skinfold. (G) Den omgivande hud, anteriort och posteriort, av klaffen är fast i hålen i den övre kammaren fälgen. (H) Den hudfliken sträcks ut och också sys fast på baksidan av ramen. För att undvika uttorkning av klaffen, är 0,9% natriumkloridlösning droppas på klaffen upprepade gånger. (I) Den klaff och den omgivande huden är helt fixerad i hålen i den övre kammaren fälgen. Klaffen sutureras tillbaka i sidled in i den intilliggande rygghuden för att garantera tätheten av kammaren. (J) Montering av skumbärande motsvarighet av ramen, omgivande observationsfönstret. (K) Helt monterad kammare: En täckglas är fäst vid de observationsfönster och förseglades med en snäppring. En tredje skruv är fäst på toppen av ramen för ytterligare täthet. Fönstret i kammaren tillåter upprepade analyser av microvasculature av klaffen genom intravital mikroskopi. För enklare åtkomst under mikroskopi de tre skruvarna förkortas. (L) Vakna och flytta musen med monterade rygg skinfold kammare.
Figur 3. Presentation av morfologiska utveckling och avgränsning av fliken nekros vid dag 0 (omedelbart efter klaff beredning, A), 1 (B), 3 (C), 5 (D), 7 (E) och 10 (F) . Slutlig nekrotisk avgränsning sker mellan dagarna 5 och 7 (D och E). Kontroller visar en distinkt zon av avgränsning i det centrala flikområdet, bland annat en röd frans och en vit falx (dubbel pilspets och asterisk i E), vilket återspeglar en hyperemisk respons och mikrovaskulära ombyggnad samt en icke-perfusion men potentiellt livskraftiga område avgränsning vävnad nekros utvecklas distalt (E). I panel F, klaffenvävnad är indelat i tre olika områden med 2 horisontella linjer: den väl perfusion proximala zonen (vid basen av bilden), den kritiker perfusion centrala zonen (inklusive röda fransar en vit "falx Lunatica" motsvarar den halvskuggan i ischemisk hjärnan vävnad efter stroke skada) och nekrotiska distala zonen (perifer markerad med röd kant). Förstoring 16X.
Figur 4. Intravital epi-fluorescensmikroskop visar bilder av arteriovenular (AV) buntar (A, B), kapillär fält (C, D, E) och morfologiska förändringar såsom ombyggnad (F) och angiogenes (G, H). Intravital mikroskopi visar samma AV-bunt i ett kontrolldjur (A, B) vid dag 1 (A) och 10 (B). Notera frånvaron av obstruerande svar i kontroller under hela observationsperioden på både arteriolar (a) och venular (v) diameter. Bilder C, D och E visas hur parallellt anordnade kapillärer i brunnen perfuserades proximala zon (C), kritiskt perfuserades central övergångszonen (D) och det icke-perfunderade nekrotisk distala zonen (E) av den ischemiska klaff vävnad. I kritiskt perfusion central zon kontrollmöss bara visar kärlremodellering (F), som kännetecknas av parallellt ordnade kapillärer med dilatation och ökad slingrighet. Däremot möss som fick erytropoietin innan klaff höjd som en konditioneringsregim visar nybildade och vinkelrätt uppstår kapillärer, som tydligt skiljer sig från normala redan existerande kapillärer (G, H). Detta angiogena svar har inte observerats i kontrollerna. Kontrastförstärkning med fluorescerande dextran 150.000. Förstoring 80X.
Figur 5. </ Strong> Intravital epi-fluorescensmikroskop visar AV-buntar i väl perfusion proximala flikzon (A) och den kritiker perfusion ischemisk central övergångszon av vävnaden (B). Observera den ökade närvaron av vidhäftande leukocyter (pilar) i postkapillära venoler (v) och arterioler (a) i den ischemiska flikzon (B) jämfört den friska proximala zonen (A). Kontrastförstärkning med Rodamin. Förstoring 80X. Intravital epi-fluorescensmikroskop visar nukleär kondensation indikerar apoptotisk celldöd inom den proximala (C) och kritiskt perfusion centrala flikområdet (D) för kontroll. Ett ökat antal apoptotiska celler (vita pilar) observeras i mer ischemisk centrala övergångszon (D) jämfört med den proximala zonen (C). Kontrastförstärkning med Bisbenzimide. Förstoring 250X.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
För att minska ischemiska komplikationer och därmed förbättra det kliniska resultatet, krävs bättre kunskaper om patofysiologiska processer i kritiskt perfusion klaffvävnad. Utvecklingen av nya djurmodeller som efterliknar akut ihållande ischemi är därför obligatorisk. Följaktligen kunde vi utveckla en lätt reproducerbar och pålitlig modell som gör det möjligt för upprepad morfologiska, dynamisk och funktionell realtid utvärdering av olika parametrar i muskler och hud kärl som kan korreleras med immunhistokemisk och molekylär analys av fliken vävnaden provtas.
Det kirurgiska ingreppet kräver inga specifika kirurgiska färdigheter, även om praktiken och lite fingerfärdighet krävs. En inlärningskurva av cirka 25-30 drivs djur är vanligtvis nödvändigt att behärska monteringen av den dorsala skinfold kammaren och klaff preparatet korrekt. I erfarna händer, tid för kirurgi genomsnitt 35 minuter. Avgörandestegen klaff beredningen inkluderar rätt placering och disposition av fliken i mitten av kammaren fönster med exakt positionering av de viktigaste fartyg som ska transected (med trans belysning) och noggrann borttagning av gelatinliknande skikt ovanför panniculus carnosus med hjälp av bild-förstoring för att förbättra bildkvaliteten.
Sedan flik mått anges i millimeter, rekommenderar vi att du använder ett skjutmått för rätt flik märkning. Om det finns några problem när positionering de horisontellt ordnade dominerande fartyg inom kammarens fönster bör man hellre välja en mer distal än en mer proximal position fartygen. Den korrekta placeringen av dessa fartyg som tvärgående kammarens fönster, garanterar transektion av dessa samtidigt upplyft klaffen från distalt proximal och resulterar i en slumpmässigt perfusion flik. Med andra ord, för att inte transekt dessa stora fartyg kommer att resultera i en axiell perfusionmönster utan nekros av vävnaden under fönstret. Det slutliga avgörande steg under kirurgisk preparering avser avlägsnande av gelatin-liknande areolar vävnadsskiktet. Erfarenheten har visat att alltför stora skador flytt den underliggande panniculus carnosus och så delikat arrangerade horisontellt muskulösa kapillärer. Omvänt, konservativa borttagning resulterar i ödembildning och slutligen begränsade synlighet för de områden av intresse under mikroskopi. Om alla dessa steg behärskas med omsorg, utvecklar klaffen mycket konstant ca 50% nekros 10 dagar efter klaff höjd. Detta gör det möjligt att studera olika terapeutiska strategier som kan förbättra eller försämra överlevnaden av fliken vävnaden. Slutligen är metoden för intravital fluorescensmikroskopi ett väletablerat förfarande för att utvärdera mikrovaskulär vävnad perfusion och kan läras mycket snabbt.
Den största nackdelen med denna modell är den begränsad observationstid av vävnaden inuti kammaren217; s fönster på cirka 10 till 14 dagar efter klaff förberedelser. Detta beror på den progressiva uppluckring av huden proximalt till den dorsala skinfold kammaren som slutligen resulterar i sidled tippning av kammaren. Sällan, drar sandwich-liknande, fast hud ut ur kammaren ram och omöjliggör mikroskopi. Sedan nekros är oftast helt avgränsade mellan dag 5 och 7 efter operation, det egentligen inte äventyrar datainsamling innan tippning av kammaren eller dra ur huden i kammaren.
Fördelar med modellen inkluderar enkla reproducerbarhet och den potentiella användningen av genetiskt modifierade djur. Den relativt lilla storleken på fönstret som kan bedömas kan dock äventyra betydelse omräkning av resultat i mänskliga förhållanden. Dessutom finns det anatomiska skillnader mellan lösa flådda djur och människor. Medan djuren och kirurgiska instrument har en rimlig kostnadseffektivitet, den Hard- och programvara som krävs för att utföra mikroskopi (epi-belysning mikroskop, kamera med hög upplösning, fluorescerande färger och speciell programvara för offlinedataanalys) är en större investering.
Slutsats:
Vi presenterar en tids- och kostnadseffektiv djurmodell hos möss som möjliggör visualisering och kvantifiering av mikrocirkulatoriska parametrar med hög upplösning. Detta tillvägagångssätt utgör en idealisk metod för att analysera kritiskt perfusion musculocutaneous klaffvävnad och de underliggande cellulära mekanismer. Morfologiska förändringar av regioner av intresse kan upprepat undersökas och korreleras med funktionella förändringar på en mikrovaskulära och cellnivå. Efter intravital epi-fluorescensmikroskopi kan vävnaden behandlas vidare med hjälp av histologiska och molekylära metoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi tackar Katharina Haber för bildredigering. Finansiering: senior författaren fick en KKF Grant från Technische Universität München för att inrätta ett nytt forskningslaboratorium.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57Bl/6 mice, 6-8 w, 20-22 g | Charles River | ||
| Depilation cream | Balea | Any depilation cream | |
| Titanium chamber | Irola | 160001 | Halteblech M |
| Custom-made Plexiglass mounting frame | Frame to secure chamber to avoid chamber movement due to the animal's respiration. | ||
| Slotted cheese head screw | Screws and More | 842210 | DIN84 M2x10 |
| Hexagon full nut | Screws and More | 93422 | DIN934 M2 |
| Snap ring | Schaefer-Peters | 472212 | DIN472 J12x1,0 |
| Cover glass | Volab | Custom-made cover glass, 11.8 mm in diameter. | |
| Fixing foam | tesamoll | 05559-100 | tesamoll Standard I-Profile |
| Ketamine hydrochloride | Parke Davis | Ketavet® | |
| Dihydroxylidinothiazine hydrochloride | Bayer | Rompun® | |
| Buprenorphin | Essex Pharma | Temgesic® | |
| Saline 0.9% | |||
| Desinfection alcohol | |||
| Vicryl 5-0 | Ethicon | V 490 H | |
| Ethilon 5-0 | Ethicon | EH 7823 H | |
| 1 ml syringes | |||
| Surgical skin marker with flexible ruler | Purple surgical | PS3151 | Any surgical skin marker and flexible ruler |
| Pointed scissors | |||
| Micro-Scissors | |||
| Normal scissors | |||
| 2 clamps | |||
| Fine anatomic forceps | |||
| Micro-forceps | |||
| Hex nuter driver | wiha | 1018 | |
| Screwdriver | wiha | 685 | |
| Snap ring plier | Knipex | 4411J1 | 12-25 mm |
| Wire cutter | Knipex | 70 02 160 | Wire cutter is used to cut screws short; 160 mm |
| Trans-illumination light | IKEA | 501.632.02 | LED light Jansjö; any light |
| Magnification glasses | |||
| Intravital microscope | Zeiss | 490035-0001-000 | Scope.A1.Axiotech |
| LED system | Zeiss | 423052-9501-000 | Colibri.2 |
| LED module 365nm | Zeiss | 423052-9011-000 | |
| LED module 470nm | Zeiss | 423052-9052-000 | |
| LED module 540-580nm | Zeiss | 423052-9121-000 | |
| Filter set 62 62 HE BFP + GFP + HcRed | Zeiss | 489062-9901-000 | Range 1: 350-390 nm excitation wavelength, split 395 nm / 402-448 nm; range 2: 460-488 nm, split 495 nm / 500-557 nm; range 3: 567-602 nm, split 610 nm / 615 nm to infinite. |
| Filter set 20 Rhodamine | Zeiss | 485020-0000-000 | 540-552 nm, split 560 nm, emission 575-640 nm |
| 2.5X objective NA=0.06 | Zeiss | 421020-9900-000 | A-Plan 2.5X/0.06 |
| 5X objective NA=0.16 | Zeiss | 420330-9901-000 | EC Plan-Neofluar 5X/0.16 M27 |
| 10X objetive NA=0.30 | Zeiss | 420340-9901-000 | EC Plan-Neofluar 10X/0.30 M27 |
| 20X objective NA=0.50 | Zeiss | 420350-9900-000 | EC Plan-Neofluar 20X/0.50 M27 |
| 50X objective NA=0.55 | Zeiss | 422472-9960-000 | LD Epiplan-Neofluar 50X/0.55 DIC 27 |
| ZEN imaging software | Zeiss | ZenPro 2012 | |
| CapImage | Dr. Zeintl | ||
| Fluorescein isothiocyanate-dextran | Sigma-Aldrich | 45946 | |
| bisBenzimide H 33342 trihydrochloride | Sigma-Aldrich | B2261 | Harmful if swallowed; causes severe skin burns and eye damage, may cause respiratory irritation. |
| Rhodamine 6G chloride | Invitrogen | R634 | Harmful if swallowed; may cause genetic defects; may cause cancer; may damage fertility or the unborn child. |
| Pentobarbital | Merial | Narcoren® |
References
- McFarlane, R., De Young, G., Henry, R. The design of a pedicle flap in the rat to study necrosis and its prevention. Plast Reconstr Surg. 35, 177-182 (1965).
- Finseth, F., Cutting, C. An experimental neurovascular island skin flap for the study of the delay phenomenon. Plast Reconstr Surg. 61, 412-420 (1978).
- Petry, J. J., Wortham, K. A. The anatomy of the epigastric flap in the experimental rat. Plast Reconstr Surg. 74, 410-413 (1984).
- Achauer, B. M., Black, K. S., Litke, D. K. Transcutaneous PO2 in flaps: a new method of survival prediction. Plast Reconstr Surg. 65, 45-45 (1980).
- Vollmar, B., Menger, M. D. Assessment of microvascular oxygen supply and tissue oxygenation in hepatic ischemia/reperfusion. Adv. Exp. Med. Biol. 428, 403-408 (1997).
- Menger, M. D., Barker, J. H., Messmer, K. Capillary blood perfusion during postischemic reperfusion in striated muscle. Plast Reconstr Surg. 89, 1104-1114 (1992).
- Uhl, E., Rösken, F., Curri, S. B., Menger, M. D., Messmer, K. Reduction of skin flap necrosis by transdermal application of buflomedil bound to liposomes. Plast Reconstr Surg. 102, 1598-1604 (1998).
- Pang, C. Y., Neligan, P., Nakatsuka, T., Sasaki, G. H. Assessment of the fluorescein dye test for prediction of skin flap viability in pigs. J Surg Res. 41, 173-181 (1986).
- Hjortdal, V. E., Hansen, E. S., Henriksen, T. B., Kjolseth, D., Soballe, K., Djurhuus, J. C. The microcirculation of myocutaneous island flaps in pigs studied with radioactive blood volume tracers and microspheres of different sizes. Plast Reconstr Surg. 89, 116-122 (1992).
- Pang, C. Y., Neligan, P., Nakatsuka, T. Assessment of microsphere technique for measurement of capillary blood flow in random skin flaps in pigs. Plast Reconstr Surg. 74, 513-521 (1984).
- Sandison, J. C. A new method for the microscopic study of living growing tissues by the introduction of a transparent chamber in the rabbit's ear. The Anatomical Record. 28, 281-287 (1924).
- Algire, G. H. An Adaptation of the Transparent-Chamber Technique to the Mouse. Journal of the National Cancer Institute. 4, 1-11 (1943).
- Lehr, H. A., Leunig, M., Menger, M. D., Nolte, D., Messmer, K. Dorsal skinfold chamber technique for intravital microscopy in nude mice. Am J Pathol. 4, 1055-1062 (1993).
- Barker, J. H., et al. An animal model to study microcirculatory changes associated with vascular delay. Br J Plast Surg. 52, 133-142 (1999).
- Erni, D., Sakai, H., Banic, A., Tschopp, H. M., Intaglietta, M. Quantitative assessment of microhemodynamics in ischemic skin flap tissue by intravital microscopy. Ann Plast Surg. 43, 405-414 (1999).
- Roesken, F., Schäfer, T., Spitzer, W. J., Vollmar, B., Menger, M. D. In vivo analysis of the microcirculation of osteomyocutaneous flaps using fluorescence microscopy. Br J Plast Surg. 52, 644-652 (1999).
- Harder, Y., Amon, M., Erni, D., Menger, M. D. Evolution of ischemic tissue injury in a random pattern flap: a new mouse model using intravital microscopy. J Surg Res. 121, 197-205 (2004).
- Harder, Y., Contaldo, C., Klenk, J., Banic, A., Jakob, S. M., Erni, D. Preconditioning with monophosphoryl lipid A improves survival of critically ischemic tissue. Anesth Analg. 100, 1786-1792 (2005).
- Rezaeian, F., et al. Erythropoieton protects critically perfused flap tissue. Ann Surg. 248, 919-929 (2008).
- Harder, Y., et al. Erythropoietin reduces necrosis in critically ischemic myocutaneous tissue by protecting nutritive perfusion in a dose-dependent manner. Surgery. 145, 10-1016 (2009).
- Rezaeian, F., et al. Erythropoietin-induced upregulation of endothelial nitric oxide synthase but not vascular endothelial growth factor prevents musculocutaneous tissue from ischemic damage. Lab Invest. 90, 40-51 (2010).
- Rezaeian, F., Ong, M. F., Harder, Y., Menger, M. D. N-acetylcysteine attenuates leukocytic inflammation and microvascular perfusion failure in critically ischemic random pattern flaps. Microvasc Res. 82, 28-34 (2011).
- Rezaeian, F., et al. Ghrelin protects musculocutaneous tissue from ischemic necrosis by improving microvascular perfusion. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 302, 603-610 (2012).
- Rezaeian, F., et al. Long-term preconditioning with Erythropoietin reduces ischemia-induced skin necrosis. Microcirculation. , (2013).
- Harder, Y., et al. Heat shock preconditioning reduces ischemic tissue necrosis by heat shock protein (HSP)-32-mediated improvement of the microcirculation rather than induction of ischemic tolerance. Ann Surg. 242, 869-878 (2005).
- Tobalem, M., et al. Local shockwave-induced capillary recruitment improves survival of musculocutaneous flaps. J Surg Res. 184, 1196-1204 (2013).
- Lindenblatt, N., Calcagni, M., Contaldo, C., Menger, M. D., Giovanoli, P., Vollmar, B. A new model for studying the revascularization of skin grafts in vivo: the role of angiogenesis. Plast Reconstr Surg. 122, 169-1680 (2008).
- Schweizer, R., et al. Morphology and hemodynamics during vascular regeneration in critically ischemic murine skin studied by intravital microscopy techniques. Eur Surg Res. 47, 222-230 (2011).
- Klyscz, T., Jünger, M., Jung, F., Zeintl, H. Cap image—a new kind of computer-assisted video image analysis system for dynamic capillary microscopy. Biomed. Tech. 42, 168-1675 (1997).
- Gross, J. F., Aroesty, J. Mathematical models of capillary flow: a critical review. Biorheology. 9, 225-264 (1972).
- Menger, M. D., Pelikan, S., Steiner, D. Microvascular ischemiareperfusion injury in striated muscle: significance of ‘reflow paradox. Am J Physiol. 263 (6 part 2), 1901-1906 (1992).
