Abstract
وظيفة محددة من الخلايا الدبقية الصغيرة متعددة الأنوية، تسمى خلايا الكروي، التي هي وفيرة فريد في النظام العصبي المركزي من حثل المادة البيضاء الكروي الخلايا (GLD) غير واضحة. وقد أعاقت هذه الفجوة في المعرفة من خلال عدم وجود الاقتضاء في النموذج المختبر للدراسة. هنا، نحن تصف الفئران نظام الثقافة الدبقية الأساسي في العلاج مع النتائج التي سيكوزين في الانوية من الخلايا الدبقية الصغيرة تشبه الخلايا كروي الشكل المميزة وجدت في شعبة الشؤون القانونية العامة. باستخدام هذا النظام المبتكر، حددنا شروط وطرق التحليل للدراسة الخلايا الكروي. تم التحقق من صحة الاستخدام المحتمل لهذا النظام نموذجا في دراستنا السابقة، والتي حددت دور محتمل للمصفوفة الفلزي (MMP) -3 في شعبة الشؤون القانونية العامة. هذه الرواية في نظام المختبر قد تكون نموذجا مفيدا للدراسة تشكيل وظيفة، ولكن أيضا التلاعب العلاجية المحتملة، من هذه الخلايا الفريدة من نوعها.
Introduction
حثل المادة البيضاء الكروي الخلية (GLD)، المعروف أيضا باسم مرض كرابه، هو مرض قاتل المزيل الناتجة عن فقدان وظيفة الطفرات في galatocerebrosidase (galc) الجين 1. الشكل الأكثر شيوعا من GLD هو البديل الطفولي الذي تمثله في بداية مرحلة الطفولة المبكرة وتتميز نمطا سريريا من السيارات والتدهور المعرفي يؤدي إلى الوفاة المبكرة غالبا قبل سن الخامسة 2،3. وتستخدم الاختبارات الجينية للتحقق من تشخيص GLD 4. أمراض الأعصاب من GLD يكشف إزالة الميالين على نطاق واسع، وضمور الخلايا العصبية، دباق النجمي وجود محتقن الخلايا الدبقية الصغيرة متعددة الأنوية تسمى خلايا كروي الشكل 5-7. تحديد خلايا كروي الشكل، وغالبا ما تحتوي على شوائب نبيبي في السيتوبلازم بها، لقد كان السمة المميزة لشعبة الشؤون القانونية العامة على مدى السنوات 97 الماضية، على الرغم من أن ظلت وظيفة معينة من هذه الخلايا واضحة بعيد المنال.
مشاركة غير myel-منذ فترة طويلة تعتبر inating الدبقية (الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا النجمية) في التسبب في GLD استجابة الثانوية إلى إزالة الميالين عميق في هذا المرض 8. ومن المثير للاهتمام، وأول وصف لهذا المرض، الذي أدلى به كنود كرابه 5 في عام 1916، وتشكيل ذكرت من البالعات متعددة النوى التي تحتوي على الدهون الحطام التي تم اسمه 'الكروي الخلايا وهي السمة المميزة لهذا المرض.
خلايا الكروي هي سمة مميزة لGLD علم الأمراض، على الرغم منذ فترة طويلة تجاهل دورها في GLD. ومن المثير للاهتمام، وهذه الخلايا هي من بين أولى التغييرات المميزة في أنسجة الجهاز العصبي المركزي GLD. هذا النقص في المعرفة قد يكون بسبب افتراض أن تشكيل البالعات متعددة النوى، تسمى الخلايا العملاقة في أمراض أخرى، تعتبر عادة نتيجة للأمراض المسببة للأمراض بدلا من القوة الدافعة الأولية 9. ولذلك، كانت هناك دراسات قليلة للتحقق من الآلية التي كتبها مبادرة الخوذ البيضاءتتشكل خلايا الكروي CH من البالعات، وخاصة في الجهاز العصبي المركزي من GLD. الإجراء الموضح في هذا التقرير يركز على أهمية تشكيل الكروي الخلايا في الجهاز العصبي المركزي ومظاهرة لدينا السابقة التي يسببها سيكوزين الانوية من الخلايا الدبقية الصغيرة في المختبر، وعرضت هذه الخلايا مستويات أعلى من النشاط البلعمة. واتساقا مع هذه الملاحظات، والخلايا في أدمغة الكروي twitcher كثيرا ما تحتوي-PAS إيجابي الحطام، مما يشير إلى ارتفاع مستويات نشاط البلعمة. تم العثور على خلايا كروي الشكل أيضا أن يكون immunopositive لالفيريتين (علامة الخلايا الدبقية الصغيرة) 10، KP-1 / CD68 (علامة الوحيدات)، وبعضها أيضا إيجابية لvimentin (بروتين خيوط وسيطة وعلامة من الخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة تفعيلها) 11، HLA-DRA (وهي مستقبلات سطح MHCII)، و TNF-α 7، وإيبا-1 (بروتين ملزمة الكالسيوم المستخدمة لتحديد الخلايا الدبقية الصغيرة) 12. وبناء على هذه المجموعة من علامات، وخلايا الكروي تنشأ من الخلايا الدبقية الصغيرة التي تنميالنمط الظاهري فريدة من نوعها.
على الرغم من طابعها الفريد، تم التغاضي عن وظيفة محددة ومساهمة GCS إلى GLD المرضية إلى حد كبير. كان يظن خلايا الكروي لتكون نتيجة ثانوية للإزالة الميالين المزمن. ومع ذلك، فقد حددت دراسات سابقة دراسة جمعية الزمنية للخلايا الكروي لعلم الأمراض المسألة الأبيض من GLD وجود خلايا الكروي في أواخر الجنينية لفترة ما بعد الولادة في وقت مبكر؛ الأوقات التي سبقت موت الخلايا المبرمج دبقية قليلة التغصن وإزالة الميالين العلني 13. وهكذا، فإن التسلسل الزمني لتطور أمراض الأعصاب في GLD تشير إلى أن الخلايا الكروي تتشكل في وقت مبكر من إزالة الميالين في هذا المرض 14. وأدى ذلك إلى فرضيتنا أن تشكيل المبكر للخلايا الكروي في GLD قد تمثل حدثا الممرضة تحديد بدلا من الثانوية، والاستجابة التفاعلية للتلف دبقية قليلة التغصن 15. بالإضافة إلى ذلك، فقد اعتبر ديسريغولاتيون النشاط دبقية في GLD والواقعص تحد من فعالية على المدى الطويل hematopeotic العلاج بالخلايا الجذعية لعلاج هذا المرض 16. وهكذا، والتحقيق في الوظائف الخلوية وتنظيم الخلايا الدبقية الصغيرة، وخلايا الكروي، ردا على سيكوزين من المتوقع أن توفر رؤى جديدة في التسبب في GLD.
حتى وقت قريب، كان عدم وجود نموذج مناسب للدراسة تشكيل خلية الكروي محدودة فهم وظيفة محددة ومساهمة هذه الخلايا للأمراض من GLD. في الدراسات الحديثة، تقرر أن الخلايا الكروي مثل يمكن تشكيلها في استجابة مباشرة لسيكوزين، وهو توكسين الدهون التي تتراكم العدوى في GLD. وجدنا أن الخلايا الدبقية الصغيرة، ولكن ليس الضامة، يتم تنشيط وتحويلها إلى خلايا الكروي في الثقافات الدبقية الأولية ردا على سيكوزين 15. تم العثور على هذا التحول إلى خلايا الكروي أن بوساطة البروتيني خارج الخلية، الفلزي مصفوفة (MMP) -3 15. وفي الآونة الأخيرة، فإنناقمنا بمد هذه النتائج وقرر أن الخلايا الدبقية الصغيرة وتنشيط خلايا الكروي سيكوزين المتقدمة في هذا المختبر في نظام نموذجي هي أكثر قدرة سامة للخلايا والخلايا قليلة التغصن دبقية قليلة التغصن السلف. وبالتالي، عندما اعتبر في سياق GLD، وتراكم في وقت مبكر من سيكوزين وتشكيل خلايا الكروي قبل إزالة الميالين ستدعم دورا الابتدائي وربما العدوى الناشئة عن الخلايا الدبقية الصغيرة في هذا المرض.
نقترح دراسة تشكيل خلية الكروي سوف تكشف معلومات جديدة عن التسبب في GLD من شأنها أن تسهم في فهمنا لهذا المرض. وعلاوة على ذلك، هذا النموذج الخلوي الجديد من GLD قد توفر شكلا جديدا من النهج الذي علاجية جديدة لمعالجة يمكن اختبارها تغيرات مرضية في هذا المرض. وبالتالي، في هذا التقرير نقدم بروتوكول مفصلة لتطوير في المختبر من خلايا كروي الشكل الناجم عن سيكوزين من الثقافات الأولية من غير myelinating الدبقية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على الحيوانات وفقا للسياسة على الرعاية الإنسانية واستخدام الحيوانات المختبرية التي وضعها مكتب مختبر رعاية الحيوان (NIH) وفقط بموافقة من اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام (IACUC) من جامعة مركز الصحة كونيتيكت.
1. إعداد الثقافات المختلطة الدبقية
- تعقيم جميع الأدوات قبل استخدامها. إضافة 3 مل من محلول معقم الجليد الباردة هانك متوازن الملح (HBSS) التي لا تحتوي على الكاتيونات (المغنيسيوم أو الكالسيوم 2+ 2+) إلى ثلاثة العقيمة 60 ملم أطباق بتري الحفاظ على الجليد للحفاظ على برودة.
- عزل القشور من الجراء بعد الولادة الماوس P0-P2، 17،18 كما هو موضح سابقا.
ملاحظة: هياكل تحت القشرية، مثل الحصين، ليست مدرجة في هذه الثقافات. - إزالة بعناية السحايا ومن ثم نقل إلى عزل القشور HBSS الطازجة وفصل الأنسجة إنزيمي، وذلك باستخدام نيالاورال عدة تشريح الأنسجة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
- لوحة الخلايا في العقيمة T-175 قوارير واحتضان بين عشية وضحاها في وسائل الإعلام [Dulbecco لتعديل النسر المتوسط (DMEM) مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) التي تحتوي على 1X البنسلين / الستربتومايسين].
- استبدال جميع وسائل الإعلام في اليوم التالي مع وسائل الإعلام الطازجة. الاستمرار في احتضان الثقافات، مع التغييرات الوسائط العادية، لحوالي 3 أسابيع أو حتى يتم تأسيس أحادي الطبقة الخلوية.
ملاحظة: سيتم يتألف هذا أحادي الطبقة من الخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة مع ما يقرب من 10: 1 نسبة 19.
2. الكروي التعريفي الخلايا الدبقية في الثقافات المختلطة
- إعداد لل coverslips المغلفة ECM.
- نقع coverslips دائرية مع معقم 1 N حمض الهيدروكلوريك (حمض الهيدروكلوريك) في طبق بتري معقمة لمدة 30 دقيقة. غسل coverslips مع 3X المياه المعقمة ومن ثم نقع في ETOH 95٪ لمدة 20 دقيقة على الأقل. ومن ثم السماح الهواء الجاف.
- مكان قطرات من MATR خارج الخلية المخففالمواد التاسع (ECM) البروتين طلاء على ورقة من parafilm (على سبيل المثال 150-250 ميكرولتر / قطرة من laminin 10 ميكروغرام / مل في حل عقيم حل العازلة الفوسفات [PBS]). توزيع قطرات بحيث coverslips لن تلمس عند وضعها على هذه القطرات. ضع بلطف كل ساترة المجففة على قطرات باستخدام ملقط.
- ترك لل coverslips على قطرات تقريبا. 4-6 ساعة داخل الثقافة هود مع وشاح مغلقة.
- وضع لل coverslips المغلفة ECM (ECM المغلفة الجانب متابعة) في كل من الآبار من 24 لوحة جيدا. غسل كل بئر مع برنامج تلفزيوني العقيمة 3X والحفاظ على 4 درجات مئوية لحين الحاجة إليها.
- إعداد الخلايا الدبقية لطلاء على coverslips.
- نضح وسائل الإعلام من الثقافات الدبقية وغسل بلطف 3X أحادي الطبقة الدبقية مع 10 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة. المقبل، إضافة 8-10 مل التربسين-EDTA حل لT-175، واحتضان لمدة 5-10 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- عندما تم فصل أكثر من أحادي الطبقة، إضافة 20 مل من وسائل الإعلام كاملةإلى القارورة لوقف trypsinization. جمع وسائل الإعلام التي تحتوي على خلايا منفصلة في 50 مل أنبوب مخروطي الشكل وتدور لمدة 10 دقيقة في 300 XG في درجة حرارة الغرفة.
- نضح طاف دون الإخلال بيليه، ومن ثم اعادة تعليق الخلايا في 2 مل من وسائل الإعلام كاملة جديدة من قبل pipetting بلطف الحل باستخدام الماصة P1000.
- تحديد عدد الخلايا باستخدام عدادة الكريات ثم اعادة تعليق الخلايا في المتوسط كاملة في الكثافة المطلوبة (على سبيل المثال 10 5 خلية / مل). لوحة الخلايا على لل coverslips المغلفة ECM (على سبيل المثال 500 ميكرولتر في كل بئر من 24 لوحة جيدا). إضافة وسائط جديدة كاملة إضافية إلى كل بئر لمدة 3-5 أيام من الحضانة عند 37 درجة مئوية، أو حتى تنمو الخلايا لالتقاء البصري المطلوب.
- العلاج مع سيكوزين.
- إعادة تشكيل سيكوزين إلى تركيز الأسهم (108.3 ملم) في سلفوكسيد ثنائي ميثيل (DMSO). تمييع هذه الأسهم في ETOH 100٪ لجعل مخزون العمل التي يمكن للن أن يضاف إلى كل بئر من 24 لوحة جيدا لتحقيق تركيز النهائي من 10 ميكرومتر.
- عند إضافة سيكوزين، دوامة بلطف لوحة الثقافة لخلط سيكوزين إلى وسائل الإعلام الثقافة. تكملة سيكوزين بإضافة ما يعادل 10 ميكرومتر كل يوم لمدة أسبوع واحد.
- بعد 7 أيام من العلاج سيكوزين، وجمع وسائل الإعلام والماصة 500 ميكرولتر من البرد بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) في كل بئر. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة لإصلاح الخلايا. ثم، وغسل كل 3X بشكل جيد مع برنامج تلفزيوني ومن ثم الحفاظ وحات في 4 درجات مئوية حتى المجهزة للمناعية (انظر أدناه).
ملاحظة: خلية الإعلام الثقافة يمكن جمع لالأنزيمية أو فحص ELISA في هذه المرحلة اذا شئت.
3. كيمياء سيتولوجية مناعية (ICC) لتصور خلايا الكروي
- استبدال برنامج تلفزيوني مع عرقلة العازلة [PBS + 0.3٪ توين 20 + 5٪ مصل الماعز العادي (خ ع)]، واحتضان الخلايا لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- فيcubate الخلايا الثابتة في أمصال مضادة ضد الأساسي إيبا-1 [(1: 1،000) المخفف في برنامج تلفزيوني + 0.3٪ توين 20 + 2٪ NGS] لا يقل عن 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة، ثم يغسل جيدا مع كل برنامج تلفزيوني 3X 5 دقيقة / يغسل.
- إضافة مضان مترافق الضد الثانوية المناسب للتعرف على العلامات الأولية للأجسام المضادة ومكافحة وصمة عار مع 4 '، 6 diamidino-2-phenylindole (دابي، 1: 1،000) لتحديد نوى. احتضان في حل الضد الثانوية لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة، ويغسل مع PBS 3X 5 دقائق.
- كل جبل ساترة لشرائح المجهر باستخدام المتوسطة المتزايدة. عرض الشرائح على المجهر الفلورسنت للتحليلات البصرية والكمية.
4. تحليل وتوصيف الخلايا الكروي في الثقافة الأولية
- استخدام ثلاثة معايير المورفولوجية التالية لتحديد خلية الكروي في الثقافة:
- تحديد الخلايا الكروي باستخدام المجهر الفلورسنت من وضع العلامات immunopositive للعلامة دبقية صغيرة، إيبا-1 +.
- تحديدخلايا الكروي ومتعدد النوى (أي التي تحتوي على اثنين أو أكثر من نوى دابي إيجابية).
- تحديد الخلايا الكروي من قبل مورفولوجيا مستدير متميزة من مظهر تشعبت للغاية من خلايا يستريح دبيقي.
ملاحظة: يمكن أيضا أن تجمع الخلايا لتحليل علامة سطح الخلية وتقدير التدفق الخلوي من هذه الثقافات.
- قياس تفعيل البلعمة من الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا الكروي
- لتقييم نشاط البلعمة من المعالجة سيكوزين الخلايا الدبقية الصغيرة، إضافة حبات اللاتكس FITC المسمى إلى الآبار وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. إضافة حبات اللاتكس الفلورسنت مترافق 48 ساعة قبل تثبيت مع PFA. إصلاح الخلايا تعامل مع الخرز (كما هو مذكور في القسم 2.4)، وعملية مناعية (كما هو موضح في القسم 3).
- تحديد الأجسام المضادة الثانوية مترافق fluorophore بحيث لا تتداخل أطياف الانبعاث فلوري من fluorophore المسمى الخرز.
- يحلله لمحات من بلعمية إيبا-1 + الخلايا الدبقية الصغيرة من خلال تحديد تلك الخلايا التي تشارك في توطين مع حبات fluorescently المسمى.
ملاحظة: سوف سيكوزين تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة. وسيتم تحديد الخرز المبتلعة داخل mononucleated ومتعددة النوى إيبا-1 + الخلايا في هذا الإعداد الثقافة.
5. تحريض الخلايا الكروي من الثقافات تنقية دبقية
ملاحظة: نهج بديل فك الإشارات بين الخلايا بين نجمية والخلايا الدبقية الصغيرة هي ميزة أخرى لهذا في المختبر نموذج كروي الشكل الخلية. ويمكن تحقيق تنقية خلايا دبقية الأولية للreplating أو زملاء زراعة بانخفاض الملكية تمسكهم في الثقافة، كما هو موضح في الخطوات التالية (انظر القسم 5.2).
- جمع وسائل الإعلام من ثقافات مختلطة الدبقية متكدسة في أنبوب مخروطي 50 مل والحفاظ عليه عند 37 درجة مئوية في الحاضنة.
- عزل دبقية صغيرة من الثقافات المختلطة الدبقية الأولية.
- بعد إزالة وسائل الإعلام من متكدسة مختلطة الثقافة الدبقية T175 قارورة، إضافة وسائط اهتزاز الدافئة [تتألف من وسائل الإعلام كاملة + 25 ملي 4- (2 هيدروكسي إيثيل) حامض -1-piperazineethanesulfonic (HEPES) + 25 ملي بيكربونات الصوديوم (سيغما)]. يهز قوارير لمدة 3-4 ساعة في شاكر المداري في 100 دورة في الدقيقة (37 ° C). جمع وسائل الإعلام من هذه قوارير اهتزت في 50 مل أنابيب مخروطية.
ملاحظة: وسوف تشمل هذه الوسائط على الخلايا الدبقية الصغيرة ملتصقة أقل من قوارير. - تدور في وسائل الإعلام في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. نضح طاف ثم اعادة تعليق الخلايا في 2 مل من وسائل الإعلام مكيفة نجمية (تم جمعها في الخطوة 5.1).
- تحديد عدد الخلايا المكتسبة باستخدام عدادة الكريات ثم لوحة الخلايا دبقية صغيرة على coverslips المغلفة الركيزة (انظر القسم 2.1) للمناعية، أو لوحة على لوحات فائقة الانخفاض تمسك جيدا لجمع الخلايا في المستقبل الكروي للثقافة مشتركة مع أنواع الخلايا الأخرى، مثل الخلايا قليلة التغصن (كما تنازلياribed في القسم التالي).
ملاحظة: مطلي مرة واحدة يمكن التعامل مع الخلايا الدبقية الصغيرة مع سيكوزين (10 ميكرومتر) كما هو موضح أعلاه (انظر القسم 2.3).
- بعد إزالة وسائل الإعلام من متكدسة مختلطة الثقافة الدبقية T175 قارورة، إضافة وسائط اهتزاز الدافئة [تتألف من وسائل الإعلام كاملة + 25 ملي 4- (2 هيدروكسي إيثيل) حامض -1-piperazineethanesulfonic (HEPES) + 25 ملي بيكربونات الصوديوم (سيغما)]. يهز قوارير لمدة 3-4 ساعة في شاكر المداري في 100 دورة في الدقيقة (37 ° C). جمع وسائل الإعلام من هذه قوارير اهتزت في 50 مل أنابيب مخروطية.
- شارك في الثقافة مع الخلايا قليلة التغصن الابتدائية للتحليل السمسة.
ملاحظة: مجموعة من الخلايا الدبقية الصغيرة المعالجة سيكوزين من لوحات التقيد منخفضة لاحقة شارك في ثقافة على الثقافات الأولية من الخلايا قليلة التغصن، أو خلايا دبقية قليلة التغصن السلف، ويمكن استخدامها لدراسة وظيفة السامة المحتملة لمثل هذه الخلايا في المختبر كروي الشكل.- تطوير ثقافات قليلة التغصن الأولية باستخدام أساليب أنشئت 18،20. لجمع الخلايا الدبقية الصغيرة المعالجة سيكوزين، الماصة بلطف لفصل الخلايا الملتصقة فضفاضة من أسفل الآبار. جمع الخلايا، وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة، وresuspend ثم بعناية في وسائل الإعلام دبقية قليلة التغصن التمايز [مكونة من Neurobasal وسائل الإعلام، L-الجلوتامين (1X)، B-27 ملحق (1X)، و triiodothyronine (T3، 10 نانوغرام / مل )].
- حساب عدد الخلايا باستخدام عدادة الكريات ثم بذر الخلايا الدبقية الصغيرة على ثقافة دبقية قليلة التغصن في 1 × 10 5 خلية / مل، مما أدى إلى تقارب 1: 2 الخلايا الدبقية الصغيرة / نسبة دبقية قليلة التغصن. احتضان باعتباره الثقافة المشتركة لمدة تصل إلى 3 أيام.
- إصلاح خلايا مناعية ل(انظر القسم 2.4). جمع وسائل الإعلام ثقافة الخلية لELISA أو التحاليل الكيميائية حسب الحاجة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
هذا البروتوكول، كما هو مكتوب، ومن المتوقع أن تستغرق نحو 36 يوما لاستكمال من البداية الى النهاية (انظر الشكل 1: مخطط سير العمل التجريبية). فقد كان من تجربتنا أن تطوير الخلايا مثل كروي الشكل 'في هذا النظام الأساسي الثقافة على حد سواء موثوقة وقابلة للتكرار: لوحظ تشكيل خلايا متعددة النوى ردا على سيكوزين باستمرار مع 7 أيام من العلاج.
تلطيخ Immunocytochemical من الخلايا الدبقية الصغيرة باستخدام إيبا-1 بالتزامن مع مكافحة وصمة عار النووية سيمكن تحديد كبيرة، تقريب خلايا متعددة النوى (الشكل 1B). في بعض الحالات محتوى النووي في هذه الخلايا الكروي مثل ستظهر مع نواة متميزة. ومع ذلك، في كثير من الحالات، وتوسيع الإجمالي من حجم نواة يعكس الوضع متعددة النوى من هذه الخلايا (الشكل 1B). عدد الخلايا الشبيهة كروي الشكل يمكن أن تختلف من المجال البصري إلى المجال البصري،ولكن من الجدير بالذكر أن نسبة الخلايا الكروي شكلت في المختبر تمثل <5-10٪ من مجموع السكان خلية دبقية صغيرة. ومن المهم أيضا أن نشير إلى أن العلاج سيكوزين أيضا تثير لتفعيل المعمم من الخلايا الدبقية الصغيرة (أي زيادة ملموسة في نشاط البلعمة) الذي يحدث في استجابة لسيكوزين المعاملة بين الخلايا الدبقية الصغيرة mononucleated والخلايا الكروي متعددة النوى (GCS) في هذه الثقافات. كما هو مبين في الشكل 1C، وملامح النشطة phagocytically من إيبا-1 + الخلايا الدبقية الصغيرة يمكن تحديدها بسهولة عند وضعها في ثقافة مشتركة مع خلايا دبقية قليلة التغصن السلف (يجد OPCs).
هذا النظام ثقافة الخلية هو قابل للتلاعب التجريبي كوسيلة لتقييم بيولوجيا الخلايا الكروي. على سبيل المثال، لقد أثبتنا في الآونة الأخيرة دورا جديدا لالبروتيني خارج الخلية، مصفوفة الفلزي 3 (MMP-3 / stromelysin-1) كوسيط مهم من تشكيل GC-سيكوزين يسببها استخدام هذا طريق مسدودالبنية فحص 15.
الشكل 1: سير العمل التجريبي للالابتدائية الثقافة في المختبر نموذج الكروي تشكيل خلية (A) مخطط تصور الخطوات الأولية وتتدخل مرات (بالأيام) لتطوير خلايا الكروي في الثقافة. يسمى كل خطوة مع قسم النص المرتبط به من البروتوكول. يقدم هذا العمل كلا من تطور منطقي المختلطة (نجمية والثقافات دبقية صغيرة؛ القسم 1) وثقافة انطلاق بديلة لتنقية الخلايا الدبقية الصغيرة (القسم 5) (B) تلطيخ immuncytochemical الممثل خلية دبقية صغيرة متعددة النوى بعد 7 أيام متتالية من سيكوزين (10. ميكرومتر) العلاج كما حددها Iba1 (الخضراء) ودابي (الأزرق). (C) مثال من خلية دبقية صغيرة أكلة الظني (الأخضر) بعد العلاج سيكوزين في ثقافة مشتركة مع Olig2 + (الحمراء) OPC. شريط النطاق (في لوحة B) = 90 ميكرون ل 'B' و= 150 ميكرون ل 'C'. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من الشكل 1B، و هنا لمشاهدة نسخة أكبر من الشكل 1C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
بروتوكول الموصوفة هنا يوفر النظام نموذج جديد للدراسة تطوير وتوصيف وظيفي لتنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا الكروي. العمل مسبق من ايم وآخرون. باستخدام خط الخلية HEK293 قدمت نموذجا لتطوير هذا البروتوكول لدراسة تشكيل خلية الكروي 21. ومن المهم أيضا أن نشير إلى أن الخلايا المشتقة الكروي في النموذج تختلف عن الخلايا الأم الكروي تحديدها في GLD. على سبيل المثال، لاحظنا بشكل روتيني quadranucleation من الخلايا الدبقية الصغيرة في الثقافات الفئران لدينا، في حين أن الخلايا الكروي في GLD وقد لوحظ في كثير من الأحيان تحتوي على ما يزيد على 10 نواة. ثانيا، شكلت خلايا الكروي في النظام في المختبر هي أيضا صغيرة في قطر بالمقارنة مع تلك التي لوحظت في الجسم الحي. هناك من المحتمل أن تكون عدة أسباب لهذه الاختلافات المظهرية والتي قد تشمل البساطة النسبية للنظام الثقافة المستخدمة. على سبيل المثال، لا يوجد لالخلايا العصبية أو الخلايا قليلة التغصن الحالية خلال المرحلة تحريض تشكيل خلية الكروي باستخدام هذا الإجراء ثقافة الدبقية الابتدائي. أيضا، توقيت بروتوكول سبعة أيام غلة كثافة كبيرة من خلايا الكروي. ومع ذلك، قد العلاج مرات أطول من تعزيز تشابه خلايا كروي الشكل الفئران التي شكلتها هذا البروتوكول مع ميزات الأم من خلايا الكروي لوحظ في GLD.
سمة هامة من سمات هذا النموذج هو أنه يستخدم الثقافات المختلطة الدبقية الأولية، التي تشمل كلا من الخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة 15،19. هذه هي ميزة مهمة لهذا النموذج الكروي للخلية فائدتها في تقييم المساهمات والتفاعل بين الخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة. يتم تنشيط كل من هذه أنواع الخلايا غير myelinating في GLD، على الرغم من دورهم في هذا المرض هي، حتى الآن، تتميز بشكل سيئ. الأهم من ذلك أننا قد حددت في وقت سابق ان الخلايا النجمية في GLD تعبر عن مستويات أعلى من MMP-3 التعبير وأن هذا يفترض نجمية-الاوعيةوثمة عامل حاسم إد لتحول الخلايا الدبقية الصغيرة ردا على سيكوزين. التطبيقات المستقبلية من هذا الطراز في المختبر تشكيل خلية الكروي يمكن أن توظف الثقافات خيالية من الخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة من مختلف الخلفيات الوراثية التي يمكن استخدامها لتعزيز فهمنا للمساهمات خلية محددة إلى الآثار المسببة للأمراض من سيكوزين على الخلايا الدبقية الصغيرة.
باختصار، يتيح هذا البروتوكول نهجا جديدا لدراسة التسبب في GLD. وكان دور الخلايا كروي الشكل الغامض ولقد تم اقتراح فرضيات على وظائفهم وقائية أو الضارة في GLD. ان التعرف المبكر على الخلايا الكروي في التاريخ الطبيعي للGLD مزيد من الدعم رأينا في هذا الوقت أن تفعيل الخلايا الدبقية الصغيرة في GLD هي استجابة الممرضة الابتدائية وسيط المرجح المايلين علم الأمراض في هذا المرض. ومن المتوقع أن تعزيز فهمنا على البريد الخلوي تطويع هذا النظام نموذجا في المختبرtiology من GLD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) containing no cations (Mg2+ and Ca2+). | Life technologies | 14175-095 | |
| Neural Tissue Dissociation Kit | Miltenyi | 130-092-628 | |
| 40 μm cell-strainer | Fisherbrand | 22363547 | |
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) containing cations (Mg2+ and Ca2+). | Gibco | 14025-092 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Gibco | 11995-065 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Penicilin/Streptomycin | Life technologies | 15070-063 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| Trypsin-EDTA solution | Life technologies | 25299-056 | |
| Psychosine | Sigma | P9256 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Science | 19208 | |
| Normal Goat Serum (NGS) | Invitrogen | PCN5000 | |
| Iba-1 | WAKO | 019-19741 | |
| Alexa Fluor conjugated antisera | Life Technologies | Various | |
| Mounting Media | Southern Biotech | OB100-01 | |
| Phagocytic Assay Kit | Cayman Chemicals | 500290 | |
| HEPES | Sigma | BP310-500 |
References
- Rafi, M. A., Luzi, P., Chen, Y. Q., Wenger, D. A. A large deletion together with a point mutation in the GALC gene is a common mutant allele in patients with infantile Krabbe disease. Hum Mol Genet. 4, 1285-1289 (1995).
- Duffner, P. K., et al. The long-term outcomes of presymptomatic infants transplanted for Krabbe disease: report of the workshop held on July 11 and 12. Genet Med. 11, Holiday Valley, New York. 450-454 (2008).
- Duffner, P. K., Jalal, K., Carter, R. L. The Hunter's Hope Krabbe family database. Pediatr Neurol. 40, 13-18 (2009).
- Duffner, P. K., et al. Newborn screening for Krabbe disease: the New York State model. Pediatr Neurol. 40, 245-252 (2009).
- Krabbe, K. A new familial, infantile form of brain sclerosis. Brain. 39, 74-114 (1916).
- Percy, A. K., Odrezin, G. T., Knowles, P. D., Rouah, E., Armstrong, D. D. Globoid cell leukodystrophy: comparison of neuropathology with magnetic resonance imaging. Acta Neuropathol. 88, 26-32 (1994).
- Itoh, M., et al. Immunohistological study of globoid cell leukodystrophy. Brain Dev. 24, 284-290 (2002).
- Reddy, A. S., Patel, J. R., Vogler, C., Klein, R. S., Sands, M. S. Central nervous system pathology progresses independently of KC and CXCR2 in globoid-cell leukodystrophy. PLoS One. 8, (2013).
- McNally, A. K., Anderson, J. M. Macrophage fusion and multinucleated giant cells of inflammation. Adv Exp Med Biol. 713, 97-111 (2011).
- Kaneko, Y., Kitamoto, T., Tateishi, J., Yamaguchi, K. Ferritin immunohistochemistry as a marker for microglia. Acta Neuropathol. 79, 129-136 (1989).
- Graeber, M. B., Streit, W. J., Kreutzberg, G. W. The microglial cytoskeleton: vimentin is localized within activated cells in situ. J Neurocytol. 17, 573-580 (1988).
- Kondo, Y., Adams, J. M., Vanier, M. T., Duncan, I. D. Macrophages counteract demyelination in a mouse model of globoid cell leukodystrophy. J Neurosci. 31, 3610-3624 (2011).
- Pollanen, M. S., Brody, B. A. Fetal globoid cell leukodystrophy. Arch Pathol Lab Med. 114, 213-216 (1990).
- Martin, J. J., et al. Fetal Krabbe leukodystrophy. A morphologic study of two cases. Acta Neuropathol. 53, 87-91 (1981).
- Ijichi, K., et al. MMP-3 mediates psychosine-induced globoid cell formation: Implications for leukodystrophy pathology. Glia. , (2013).
- Pellegatta, S., et al. The therapeutic potential of neural stem/progenitor cells in murine globoid cell leukodystrophy is conditioned by macrophage/microglia activation. Neurobiol Dis. 21, 314-323 (2006).
- Crocker, S. J., Milner, R., Pham-Mitchell, N., Campbell, I. L. Cell and agonist-specific regulation of genes for matrix metalloproteinases and their tissue inhibitors by primary glial cells. Journal of Neurochemistry. 98, 812-823 (2006).
- Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. J Vis Exp. , (2013).
- Crocker, S. J., Frausto, R. F., Whitton, J. L., Milner, R. A novel method to establish microglia-free astrocyte cultures: comparison of matrix metalloproteinase expression profiles in pure cultures of astrocytes and microglia. Glia. 56, 1187-1198 (2008).
- Moore, C. S., et al. Astrocytic Tissue Inhibitor of Metalloproteinase-1 (TIMP-1) Promotes Oligodendrocyte Differentiation and Enhances CNS Myelination. J Neurosci. 31, 6247-6254 (2011).
- Im, D. S., Heise, C. E., Nguyen, T., O'Dowd, B. F., Lynch, K. R. Identification of a molecular target of psychosine and its role in globoid cell formation. J Cell Biol. 153, 429-434 (2001).
