Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

En doi: 10.3791/51903 Published: October 21, 2014

Abstract

Den nøjagtige funktion af multi-kerneholdig mikroglia, kaldet Globoid celler, der er unikt rigelige i det centrale nervesystem af Globoid celle leukodystrofi (GLD) er uklar. Dette hul i viden er blevet hæmmet af manglen på en passende in vitro-model for at studere. Heri beskriver vi en primær murine glial kultur system, hvor behandling med psychosine resultater i multinukleation af mikroglia ligner de karakteristiske Globoid celler findes i GLD. Ved hjælp af dette nye system, vi definerede de betingelser og former for analyse for studiet af Globoid celler. Den potentielle anvendelse af denne model system blev valideret i vores tidligere undersøgelse, som identificerede en potentiel rolle for matrixmetalloproteinase (MMP) -3 i GLD. Denne hidtil ukendte in vitro-system kan være en nyttig model til at studere dannelsen og funktion, men også potentiale til terapeutisk manipulation af disse unikke celler.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Globoid celle leukodystrofi (GLD), også kendt som Krabbe sygdom er en dødelig demyeliniserende sygdom som følge af tab af funktion mutationer i galatocerebrosidase (GalC) gen 1. Den mest udbredte form for GLD er den infantile variant, som er præget af debut i den tidlige barndom og er kendetegnet ved en aggressiv kliniske forløb af motorisk og kognitiv forringelse, der fører til tidlig død ofte før femårsalderen 2,3. Gentest anvendes til at verificere en diagnose af GLD 4. Neuropatologien af GLD afslører udbredt demyelinisation neuronal atrofi, astrogliose og tilstedeværelse af engorged multi-nukleerede mikroglia kaldet Globoid celler 5-7. Identificeringen af ​​Globoid celler, der ofte indeholder tubulous optagelser i deres cytoplasma, har været et definerende træk ved GLD for de seneste 97 år, selv om den særlige funktion af disse iøjnefaldende celler har været undvigende.

Inddragelsen af ​​ikke-myeloprindelse Glia (mikroglia og astrocytter) i patogenesen af GLD har længe været betragtet som en sekundær reaktion til den dybe demyelinisering i denne sygdom 8. Interessant nok, den første beskrivelse af denne sygdom, lavet af Knud Krabbe i 1916 5, rapporterede dannelsen af flerkernede fagocytter indeholder lipid vragrester, der er blevet kaldt "Globoid celler« og er et iboende træk ved denne sygdom.

Globoid celler er kendetegnende træk ved GLD patologi, selv længe har været ignoreret deres rolle i GLD. Interessant er disse celler blandt de tidligste karakteristiske ændringer i CNS-væv af LD. Denne mangel på viden kan have været på grund af den antagelse, at dannelsen af flerkernede fagocytter, kaldet kæmpeceller i andre sygdomme, der typisk betragtes som en konsekvens af patologi snarere end en indledende patogene drivkraft 9. Derfor har der været få undersøgelser af den mekanisme, WHIch Globoid celler er dannet af fagocytter, især i CNS af LD. Det er beskrevet i denne rapport fremgangsmåde fokuserer på betydningen af Globoid celle dannelse i CNS og vores tidligere demonstration af, at psychosine-induceret multinukleation af mikroglia in vitro og disse celler havde højere niveauer af fagocyterende aktivitet. I overensstemmelse med disse observationer, Globoid celler i Twitcher hjerner ofte indeholde PAS-positive vragrester, hvilket tyder på en høj grad af fagocyterende aktivitet. Globoid celler er også fundet at være immunpositive for ferritin (en mikroglia markør) 10, KP-1 / CD68 (en monocyt markør), og nogle er også positive for vimentin (et mellemprodukt filamentprotein og markør for astrocytter og aktiveret mikroglia) 11, HLA-DRa (en MHCII overflade-receptor), og TNF-α 7 og Iba-1 (et calcium-bindende protein anvendes til at identificere mikroglia) 12. Baseret på denne samling af markører, Globoid celler stammer fra mikroglia, der udvikleren unik fænotype.

På trods af deres egenart, har den pågældende funktion og bidrag GC'er til GLD patogenese er stort set blevet overset. Globoid celler er blevet anset for at være en sekundær konsekvens af kronisk demyelinisering. Imidlertid har tidligere undersøgelser undersøge den tidsmæssige sammenslutning af Globoid celler til den hvide substans patologi GLD identificeret tilstedeværelsen af ​​Globoid celler i sene embryonale til tidlige postnatale perioder; gange forud oligodendrocyt apoptose og åbenlys demyelinisering 13. Således tidsmæssige sekvens af udviklingen af neuropatologi i GLD tyder på, at Globoid celler dannes forud for demyelinisering i denne sygdom 14. Dette førte til vores hypotese, at den tidlige dannelse af Globoid celler i GLD kan udgøre et afgørende sygdomsfremkaldende begivenhed snarere end en sekundær, reaktiv reaktion på oligodendrocyt skade 15. Derudover har dysregulering af mikroglial aktivitet i LD været betragtet som et reeltr at begrænse den langsigtede effekt af hematopeotic stamcelleterapier til behandling af denne sygdom 16. Således undersøger de cellulære funktioner og regulering af mikroglia og Globoid celler som respons på psychosine forventes at give ny indsigt i patogenesen af ​​GLD.

Indtil for nylig havde manglen på en passende model til at studere Globoid celledannelse begrænset forståelse af den præcise funktion og bidrag af disse celler til patologi GLD. I de seneste undersøgelser blev det fastslået, at Globoid-lignende celler kan dannes i direkte reaktion på psychosine, en patogen lipid giftstof, der ophobes i GLD. Vi fandt, at mikroglia, men ikke makrofager, aktiveres og transformeret ind Globoid celler i primære glial kulturer som reaktion på psychosine 15. Denne omdannelse til Globoid celler blev fundet at være medieret af den ekstracellulære protease, matrixmetalloproteinase (MMP) -3 15. Mere for nylig, vihar udvidet disse konklusioner og fastslog, at psychosine-aktiverede microglia og Globoid celler udviklet i dette in vitro modelsystem er potent giftige for oligodendrocytter og oligodendrocyt stamceller. Derfor, når ses i sammenhæng med GLD, den tidlige ophobning af psychosine og dannelse af Globoid celler før demyelinisering ville støtte en spirende primær og eventuelt patogen rolle for mikroglia i denne sygdom.

Vi foreslår, at studiet af Globoid celledannelse vil afsløre nye oplysninger om patogenesen af ​​GLD som vil bidrage til vores forståelse af denne sygdom. Endvidere kan denne nye cellulære model af GLD give et nyt format, hvorfra nye terapeutiske tilgange til patologiske forandringer i denne sygdom kunne testes. Derfor i denne rapport giver vi en detaljeret protokol for in vitro udvikling af psychosine-induceret Globoid celler fra primære kulturer af ikke-myelinerende glia.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle procedurer, der involverer dyr blev udført i overensstemmelse med den politik på en human måde og brugen af ​​forsøgsdyr anført af Office of Laboratory Animal Welfare (NIH), og kun med godkendelse fra Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) fra University of Connecticut Health Center.

1. Fremstilling af blandet Glia kulturer

  1. Steriliser alle instrumenter før brug. Tilsæt 3 ml iskold steril Hanks balancerede saltopløsning (HBSS) indeholdende ingen kationer (Mg2 + eller Ca 2 +) og tre sterile 60 mm petriskåle opretholdt på is for at holde koldt.
  2. Isoler cortex fra postnatal P0-P2 museunger, som tidligere beskrevet 17,18.
    BEMÆRK: subkortikale strukturer, såsom hippocampi, er ikke medtaget i disse kulturer.
  3. Fjern forsigtigt hjernehinden og derefter overføre det isolerede cortex til frisk HBSS og dissociere væv enzymatisk ved hjælp af en neural væv dissektion kit ifølge producentens protokol.
  4. Plade cellerne i sterile T-175 kolber og inkuberes natten over i medier [Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM) med 10% føtalt bovint serum (FBS) indeholdende 1x penicillin / streptomycin].
  5. Udskift alle medier den følgende dag med frisk medier. Fortsæt med at inkubere kulturer, med regelmæssige medieændringer for cirka 3 uger, eller indtil et cellulært monolag er etableret.
    BEMÆRK: Denne monolag vil bestå af astrocytter og mikroglia med et ca. 10: 1 19.

2. Globoid celleinducering i blandede Glia kulturer

  1. Forbered ECM-coatede dækglas.
    1. Soak cirkulære dækglas med steril 1 N saltsyre (HCI) i en steril petriskål i 30 minutter. Vask dækglas med sterilt vand 3x og derefter lægges i blød i 95% EtOH i mindst 20 minutter. og lad lufttørre.
    2. Place dråber fortyndet ekstracellulære matrix (ECM) protein coatingmaterialer på et stykke Parafilm (fx 150-250 pi / dråbe laminin 10 ug / ml opløst i steril phosphatbufferopløsning [PBS]). Fordel dråberne så dækglas ikke vil komme ind, når den anbringes på disse dråber. Anbring forsigtigt hver tørret dækglas på en dråbe med en pincet.
    3. Lad dækglas på dråberne i ca. 4-6 timer inde i kultur hætte med rammen lukket.
    4. Placer ECM-coatede dækglas (ECM-coatede opad) i hver af brøndene i en 24-brønds plade. Vask hver brønd med sterilt PBS 3x og holde ved 4 ° C indtil brug.
  2. Forberedelse gliaceller til udpladning på Dækglas.
    1. Sug medier fra glial kulturer og forsigtigt vaske gliøse enkeltlagskulturer 3x med 10 ml sterilt PBS. Dernæst tilsættes 8-10 ml trypsin-EDTA-opløsning til T-175, og der inkuberes i 5-10 minutter ved 37 ° C.
    2. Når de fleste af monolaget er blevet fjernet, tilsættes 20 ml komplette mediertil kolben for at stoppe trypsinisering. Indsamle de medier, der indeholder de løsnede celler i en 50 ml konisk rør og spin i 10 minutter ved 300 xg ved stuetemperatur.
    3. Aspirer supernatanten uden at forstyrre bundfaldet, og derefter re-suspendere cellerne i 2 ml frisk komplet medier ved forsigtigt at pipettere den løsning med en P1000 pipette.
    4. Bestem antallet af celler under anvendelse af et hæmocytometer, og derefter re-suspendere celler i komplet medium ved den ønskede densitet (f.eks 10 5 celler / ml). Plate celler på ECM-overtrukne dækglas (fx 500 pi til hver brønd af 24-brønds plade). Tilføj yderligere friske komplette medier til hver brønd for 3-5 dages inkubation ved 37 ° C, eller indtil cellerne vokse til den ønskede visuelle konfluens.
  3. Behandling med Psychosine.
    1. Opløs psychosine til en stamkoncentration (108,3 mM) i dimethylsulfoxid (DMSO). Fortynd denne bestand i 100% EtOH at lave en arbejdsgruppe bestand, kan denn tilsættes i hver brønd på 24-brønds plade for at opnå en slutkoncentration på 10 uM.
    2. På tidspunktet for at tilføje psychosine, bland forsigtigt dyrkningspladen at blande psychosine i kulturmedier. Suppler psychosine ved tilsætning svarende til 10 uM hver anden dag i en uge.
  4. Efter 7 dages psychosine behandling, indsamle medierne og pipette 500 pi kold 4% paraformaldehyd (PFA) i hver brønd. Inkuber ved stuetemperatur i 20 min for at fikseres cellerne. Derefter vask hver brønd 3x med PBS og derefter holde pladerne ved 4 ° C, indtil den forarbejdes til immuncytokemi (se nedenfor).
    BEMÆRK: cellekulturmedier kan indsamles til enzymatisk eller ELISA-analyse på dette tidspunkt, hvis det ønskes.

3. Immuncytokemi (ICC) til at visualisere Globoid Cells

  1. Udskift PBS med blokeringsbuffer [PBS + 0,3% Tween-20 + 5% normalt gedeserum (NGS)], og inkuber cellerne i 1 time ved stuetemperatur.
  2. Icubate de fikserede celler i primære antisera mod Iba-1 [(1: 1.000) fortyndet i PBS + 0,3% Tween-20 + 2% NGS] i mindst 1 time ved stuetemperatur, derefter vaske hver brønd med PBS 3x 5 min / vask.
  3. Tilsæt passende sekundære fluorescens-konjugeret antistof til at identificere det primære antistof mærkning og kontra-pletten med 4 ', 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI, 1: 1.000) for at identificere kerner. Inkuber i sekundært antistof opløsning i 1 time ved stuetemperatur og vaskes med PBS 3x 5 min.
  4. Monter hver dækglas til mikroskopobjektglas ved hjælp af en monterings medium. Vis glider på et fluorescerende mikroskop for visuelle og kvantitative analyser.

4. Analyse og karakterisering af Globoid celler i primær kultur

  1. Brug følgende tre morfologiske kriterier til at identificere en Globoid celle i kultur:
    1. Identificer Globoid celler ved hjælp af fluorescerende mikroskopi af immunpositive mærkning for mikroglial markør, Iba-1 +.
    2. IdentificerGloboid celler som polynukleære (dvs. indeholdende to eller flere DAPI positive kerner).
    3. Identificer Globoid celler ved en afrundet morfologi adskiller sig fra den stærkt forgrenet udseende hvilende mikrogliaceller.
      BEMÆRK: Celler kan også indsamles for celleoverflademarkør analyse og kvantificering ved flowcytometri fra disse kulturer.
  2. Måling af fagocytiske aktivering af mikroglia og Globoid celler
    1. For at vurdere den fagocytiske aktivitet af psychosine behandlet microglia tilføje FITC-mærkede latexkugler til brøndene i overensstemmelse med producentens anvisninger. Tilføj fluorescerende-konjugerede latexperler 48 timer før fiksering med PFA. Fix celler behandlet med perler (som nævnt i afsnit 2.4), og proces til immuncytokemi (som beskrevet i afsnit 3).
    2. Vælg fluoroforen-konjugerede sekundære antistoffer, således at de ikke overlapper fluorescensemissionen spektre af fluoroforen mærkede perler.
    3. Analyze de phagocytotic profiler IBA-1 + mikroglia ved at identificere de celler, der co-lokalisere med fluorescens-mærkede perler.
      BEMÆRK: Psychosine vil aktivere mikroglia. Fagocyteret perler vil blive identificeret inden mononukleære og flerkernede Iba-1 + celler i denne kultur indstilling.

5. Induktion af Globoid Celler fra renset microgliale kulturer

BEMÆRK: En alternativ tilgang til at dechifrere signalering mellem astrocyt og mikroglia er en anden fordel ved denne in vitro Globoid celle model. Oprensning af primære mikrogliaceller for genudpladning eller co-dyrkning kan opnås ved deres lavere tilslutning ejendom i kultur, som beskrevet i de følgende trin (se afsnit 5.2).

  1. Saml medier fra sammenflydende blandede gliaceller kulturer i 50 ml konisk rør og vedligeholde det ved 37 ° C i inkubatoren.
  2. Microglial Isolering fra Primary Mixed Glia kulturer.
    1. Efter fjernelse af medier fra en sammenflydende blandet glial kultur T175 kolbe, der tilsættes varm rystende medier [bestående af komplette medier + 25 mM 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsyre (HEPES) + 25 mM natriumbicarbonat (Sigma)]. Rystes kolberne for 3-4 timer i en orbitalryster ved 100 rpm (37 ° C). Saml medierne fra disse rystekolber i 50 ml koniske rør.
      BEMÆRK: Dette medie vil omfatte mindre klæbende mikroglia fra kolberne.
    2. Spin medierne ved 300 xg i 10 min ved stuetemperatur. Aspirere supernatanten og derefter re-suspendere cellerne i 2 ml af astrocyt-condition medier (indsamlet i trin 5.1).
    3. Fastsætte antallet af celler er erhvervet ved anvendelse af et hæmocytometer og derefter plade mikrogliaceller onto substrat-coatede dækglas (se afsnit 2.1) for immuncytokemi eller plade på ultralav vedhæftning brøndplader for fremtidig indsamling af Globoid celler til co-kultur med andre celletyper, såsom oligodendrocytter (som described i det følgende afsnit).
      BEMÆRK: Når belagt det mikroglia kan behandles med psychosine (10 uM) som beskrevet ovenfor (se afsnit 2.3).
  3. Co-kultur med primær Oligodendrocytter til analyse af cytotoksicitet.
    BEMÆRK: Indsamling af psychosine behandlet mikroglia fra lav adhærens plader til efterfølgende samdyrkning på primære kulturer af oligodendrocytter eller oligodendrocyt progenitorceller, kan anvendes til at undersøge potentialet cytotoksiske funktion af disse Globoid-lignende celler in vitro.
    1. Udvikle kulturer af primære oligodendrocyter med velkendte metoder 18,20. At indsamle psychosine-behandlede mikroglia, forsigtigt pipetteres at afmontere løstsiddende celler fra bunden af ​​brøndene. Indsamle cellerne, centrifugeres ved 300 xg i 10 minutter og derefter forsigtigt resuspenderes i oligodendrocyt differentiering medier [sammensat af neurobasalt medier, L-glutamin (1x), B-27 supplement (1x), og Triiodothyronine (T3, 10 ng / ml )].
    2. Tæl antallet af celler under anvendelse af et hæmocytometer og frø af mikroglia onto oligodendrocyt kultur på 1 x 10 5 celler / ml, hvilket resulterer i et omtrentligt 1: 2 mikroglia / oligodendrocyt forholdet. Inkuberes som en co-kultur i op til 3 dage.
    3. Fix cellerne i immuncytokemi (se afsnit 2.4). Saml cellekulturmedier til ELISA eller kemiske analyser efter behov.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Denne protokol, som skrevet, forventes at tage cirka 36 dage til at fuldføre fra start til slut (Se figur 1: Eksperimentel Workflow Scheme). Det har været vores erfaring, at udviklingen af ​​"Globoid-lignende" celler i denne primære kultur system er både pålidelig og reproducerbar: dannelsen af ​​flerkernede celler som reaktion på psychosine konsekvent observeret med 7 dages behandling.

Immunocytokemisk farvning af mikroglia hjælp Iba-1 i forbindelse med et nukleart kontra-plet vil muliggøre identifikation af store, afrundede flerkernede celler (figur 1b). I nogle tilfælde nukleare indhold i disse Globoid-lignende celler vises med forskellige kerner. Men i mange tilfælde, brutto udvidelse af størrelsen af kernen afspejler flercellede status for disse celler (figur 1b). Antallet af Globoid-lignende celler kan variere fra synsfeltet til synsfeltet,men det er værd at bemærke, at andelen af Globoid celler dannet in vitro repræsenterer <5-10% af den samlede mikroglial celle population. Det er også vigtigt at påpege, at psychosine behandling fremkalder også en generel aktivering af mikroglia (dvs. målbar stigning i fagocytære aktivitet), der forekommer som respons på psychosine behandling blandt mononukleære mikroglia og flerkernede Globoid celler (GCS) i disse kulturer. Som vist i figur 1c, kan phagocytically aktive profiler IBA-1 + mikroglia let identificeres, når de sættes i co-kultur med oligodendrocyt stamceller (OPCs).

Denne cellekultursystem er modtagelig for eksperimentel manipulation som et middel til at vurdere biologi Globoid celler. For eksempel har vi for nylig påvist en hidtil ukendt rolle for den ekstracellulære protease matrixmetalloproteinase-3 (MMP-3 / stromelysin-1) som en vigtig mediator af psychosine-induceret GC dannelse ved hjælp af denne culratur assay 15.

Figur 1
Figur 1:. Eksperimentel Workflow til primær kultur in vitro-model af Globoid celledannelse (A) flowdiagram de primære trin og mellemliggende tidspunkter (i dage) for udvikling af Globoid celler i kultur. Hvert trin er mærket med dets tilhørende tekstafsnit fra protokollen. Denne arbejdsproces giver både en logisk progression fra blandet (astrocyt og microgliale kulturer afsnit 1) og en suppleant start kultur af renset mikroglia (Afsnit 5) (B) Repræsentant immuncytochemical farvning af en flercellede mikroglial celle efter 7 dage i træk med psychosine (10. uM) behandling, som identificeret af Iba1 (grøn) og DAPI (blå). (C) Eksempel på formodede fagocytisk mikroglial celle (grøn) efter psychosine behandling i co-kultur med Olig2 + (rød) OPC. Målestokken (i panel B) = 90 um for 'B' og = 150 um til »C«. Klik her for at se en større version af figur 1B, og her for at se en større version af figur 1C.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Den her beskrevne protokol giver en ny model system, hvor at studere udviklingen og funktionel karakterisering af aktiverede mikroglia og Globoid celler. Tidligere arbejde af Im et al. ved hjælp af en HEK293 cellelinje forudsat en skabelon for udvikling af den nuværende protokol for studiet af Globoid celledannelse 21. Det er også vigtigt at påpege, at de Globoid celler afledt i modellen adskiller sig fra de indfødte Globoid celler identificerbare i GLD. For eksempel har vi rutinemæssigt observeret quadranucleation af mikroglia i vores murine kulturer, mens Globoid celler i GLD er ofte blevet observeret som indeholder mere end 10 kerner. For det andet, de Globoid celler efter in vitro-system er også små i diameter i forhold til dem, der observeres in vivo. Der vil sandsynligvis være flere grunde til disse fænotypiske forskelle, som kan omfatte den relative enkelhed af kulturen, der anvendes. For eksempel er der ingenneuroner eller oligodendrocytter stede under induktion fase af Globoid celle dannelse ved hjælp af denne primære glia kultur procedure. Også timingen af ​​syv dages protokol giver en betydelig densitet Globoid celler; dog kan længere behandlingstider yderligere øge ligheden af ​​murine Globoid celler dannet af denne protokol med de indfødte funktioner Globoid celler observeret i GLD.

Et vigtigt element i denne model er, at den bruger primære blandede gliaceller kulturer, som omfatter både astrocytter og mikroglia 15,19. Dette er en vigtig fordel ved denne Globoid celle model for dens anvendelighed i vurderingen af ​​de bidrag og samspil mellem astrocytter og mikroglia. Begge disse ikke-myelinerende celletyper aktiveres i GLD, selvom deres roller i denne sygdom er, som endnu, dårligt karakteriseret. Vigtigere er det, vi tidligere havde besluttet, at astrocytter i GLD udtrykker højere niveauer af MMP-3-ekspression, og at dette formentlig astrocyt-derived faktor var afgørende for omdannelsen af ​​mikroglia som respons på psychosine. Fremtidige anvendelser af denne in vitro-model af Globoid celledannelse kunne ansætte kimære kulturer af astrocytter og mikroglia af forskellig genetiske baggrunde, som kunne anvendes til at fremme vores forståelse af celle-specifikke bidrag til de patogene effekter af psychosine på mikroglia.

Sammenfattende er dette protokol giver en ny tilgang til at studere patogenesen af ​​GLD. Rolle Globoid celler har været gådefulde og hypoteser om deres beskyttende eller skadelige funktioner i GLD er blevet foreslået. Tidlig identifikation af Globoid celler i den naturlige historie af GLD vil yderligere understøtte vores opfattelse på dette tidspunkt, at aktivering af mikroglia i GLD er en primær patogen respons og en sandsynlig mediator af myelin patologi i denne sygdom. Tilpasning af denne in vitro modelsystem forventes at fremme vores forståelse af det cellulære etiology af GLD.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hank’s balanced salt solution (HBSS) containing no cations (Mg2+ and Ca2+). Life technologies 14175-095
Neural Tissue Dissociation Kit Miltenyi 130-092-628
40 μm cell-strainer Fisherbrand 22363547
Hank’s balanced salt solution (HBSS) containing cations (Mg2+ and Ca2+). Gibco 14025-092
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) Gibco 11995-065
fetal bovine serum (FBS) Atlanta Biologicals S11150
Penicilin/Streptomycin Life technologies 15070-063
Laminin Sigma L2020
Trypsin-EDTA solution Life technologies 25299-056
Psychosine Sigma P9256
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D2650
Paraformaldehyde (PFA) Electron Microscopy Science 19208
Normal Goat Serum (NGS) Invitrogen PCN5000
Iba-1 WAKO 019-19741
Alexa Fluor conjugated antisera Life Technologies Various
Mounting Media Southern Biotech OB100-01
Phagocytic Assay Kit Cayman Chemicals 500290
HEPES Sigma BP310-500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rafi, M. A., Luzi, P., Chen, Y. Q., Wenger, D. A. A large deletion together with a point mutation in the GALC gene is a common mutant allele in patients with infantile Krabbe disease. Hum Mol Genet. 4, 1285-1289 (1995).
  2. Duffner, P. K., et al. The long-term outcomes of presymptomatic infants transplanted for Krabbe disease: report of the workshop held on July 11 and 12. Genet Med. 11, Holiday Valley, New York. 450-454 (2008).
  3. Duffner, P. K., Jalal, K., Carter, R. L. The Hunter's Hope Krabbe family database. Pediatr Neurol. 40, 13-18 (2009).
  4. Duffner, P. K., et al. Newborn screening for Krabbe disease: the New York State model. Pediatr Neurol. 40, 245-252 (2009).
  5. Krabbe, K. A new familial, infantile form of brain sclerosis. Brain. 39, 74-114 (1916).
  6. Percy, A. K., Odrezin, G. T., Knowles, P. D., Rouah, E., Armstrong, D. D. Globoid cell leukodystrophy: comparison of neuropathology with magnetic resonance imaging. Acta Neuropathol. 88, 26-32 (1994).
  7. Itoh, M., et al. Immunohistological study of globoid cell leukodystrophy. Brain Dev. 24, 284-290 (2002).
  8. Reddy, A. S., Patel, J. R., Vogler, C., Klein, R. S., Sands, M. S. Central nervous system pathology progresses independently of KC and CXCR2 in globoid-cell leukodystrophy. PLoS One. 8, (2013).
  9. McNally, A. K., Anderson, J. M. Macrophage fusion and multinucleated giant cells of inflammation. Adv Exp Med Biol. 713, 97-111 (2011).
  10. Kaneko, Y., Kitamoto, T., Tateishi, J., Yamaguchi, K. Ferritin immunohistochemistry as a marker for microglia. Acta Neuropathol. 79, 129-136 (1989).
  11. Graeber, M. B., Streit, W. J., Kreutzberg, G. W. The microglial cytoskeleton: vimentin is localized within activated cells in situ. J Neurocytol. 17, 573-580 (1988).
  12. Kondo, Y., Adams, J. M., Vanier, M. T., Duncan, I. D. Macrophages counteract demyelination in a mouse model of globoid cell leukodystrophy. J Neurosci. 31, 3610-3624 (2011).
  13. Pollanen, M. S., Brody, B. A. Fetal globoid cell leukodystrophy. Arch Pathol Lab Med. 114, 213-216 (1990).
  14. Martin, J. J., et al. Fetal Krabbe leukodystrophy. A morphologic study of two cases. Acta Neuropathol. 53, 87-91 (1981).
  15. Ijichi, K., et al. MMP-3 mediates psychosine-induced globoid cell formation: Implications for leukodystrophy pathology. Glia. (2013).
  16. Pellegatta, S., et al. The therapeutic potential of neural stem/progenitor cells in murine globoid cell leukodystrophy is conditioned by macrophage/microglia activation. Neurobiol Dis. 21, 314-323 (2006).
  17. Crocker, S. J., Milner, R., Pham-Mitchell, N., Campbell, I. L. Cell and agonist-specific regulation of genes for matrix metalloproteinases and their tissue inhibitors by primary glial cells. Journal of Neurochemistry. 98, 812-823 (2006).
  18. Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. J Vis Exp. (2013).
  19. Crocker, S. J., Frausto, R. F., Whitton, J. L., Milner, R. A novel method to establish microglia-free astrocyte cultures: comparison of matrix metalloproteinase expression profiles in pure cultures of astrocytes and microglia. Glia. 56, 1187-1198 (2008).
  20. Moore, C. S., et al. Astrocytic Tissue Inhibitor of Metalloproteinase-1 (TIMP-1) Promotes Oligodendrocyte Differentiation and Enhances CNS Myelination. J Neurosci. 31, 6247-6254 (2011).
  21. Im, D. S., Heise, C. E., Nguyen, T., O'Dowd, B. F., Lynch, K. R. Identification of a molecular target of psychosine and its role in globoid cell formation. J Cell Biol. 153, 429-434 (2001).
En<em&gt; In Vitro</em&gt; Model for Studiet af Cellular patofysiologi i Globoid Cell Leukodystrofi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Claycomb, K. I., Johnson, K. M., Bongarzone, E. R., Crocker, S. J. An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy. J. Vis. Exp. (92), e51903, doi:10.3791/51903 (2014).More

Claycomb, K. I., Johnson, K. M., Bongarzone, E. R., Crocker, S. J. An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy. J. Vis. Exp. (92), e51903, doi:10.3791/51903 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter