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Neuroscience

एक doi: 10.3791/51903 Published: October 21, 2014

Abstract

GLOBOID सेल leukodystrophy (GLD) के केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में विशिष्ट प्रचुर मात्रा में हैं कि GLOBOID कोशिकाओं बुलाया बहु एकल microglia की सटीक समारोह, स्पष्ट नहीं है. ज्ञान के इस अंतर को अध्ययन के लिए इन विट्रो मॉडल में एक उपयुक्त की कमी से बाधा गया है. इस के साथ साथ, हम एक प्राथमिक murine glial संस्कृति प्रणाली का वर्णन GLD में पाया विशेषता GLOBOID कोशिकाओं जैसी microglia की multinucleation में psychosine परिणामों के साथ जो उपचार में. इस उपन्यास प्रणाली का उपयोग करना, हम GLOBOID कोशिकाओं के अध्ययन के लिए स्थितियां और विश्लेषण के तरीके को परिभाषित किया. इस मॉडल प्रणाली की क्षमता का उपयोग मैट्रिक्स metalloproteinase (एमएमपी) के लिए एक संभावित भूमिका की पहचान की है जो हमारे पिछले अध्ययन में मान्य किया गया था -3 GLD में. इन विट्रो प्रणाली में इस उपन्यास इन अनोखी कोशिकाओं के निर्माण और समारोह, लेकिन यह भी संभावित चिकित्सीय हेरफेर, अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी मॉडल हो सकता है.

Introduction

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भी Krabbe रोग के रूप में जाना Globoid सेल leukodystrophy (GLD), galatocerebrosidase (galc) जीन 1 समारोह में म्यूटेशन के नुकसान से उत्पन्न एक घातक demyelinating रोग है. GLD का सबसे प्रचलित रूप बचपन में शुरुआत से typified और अक्सर उम्र 2,3 की पांच साल पहले मोटर और समय से पहले मौत के लिए अग्रणी संज्ञानात्मक गिरावट की एक आक्रामक नैदानिक ​​पाठ्यक्रम की विशेषता है जो शिशु संस्करण है. जेनेटिक परीक्षण GLD 4 के निदान की पुष्टि करने के लिए प्रयोग किया जाता है. GLD की Neuropathology GLOBOID कोशिकाओं 5-7 बुलाया व्यापक demyelination, न्यूरोनल शोष, astrogliosis और engorged बहु एकल microglia की मौजूदगी का पता चलता है. इन विशिष्ट कोशिकाओं की विशेष समारोह मायावी बनी हुई है, हालांकि अक्सर उनके कोशिका द्रव्य में tubulous समावेशन युक्त GLOBOID कोशिकाओं की पहचान,,, पिछले 97 वर्षों के लिए GLD का एक परिभाषित विशेषता रही है.

गैर myel की भागीदारीGLD के रोगजनन में inating glia (microglia और astrocytes) लंबे समय से इस रोग 8 में गहरा demyelination के लिए एक माध्यमिक प्रतिक्रिया माना गया है. दिलचस्प है, 1916 5 में Knud Krabbe द्वारा किए गए इस बीमारी का पहला विवरण, नाम दिया गया है कि लिपिड मलबे युक्त multinucleated फ़ैगोसाइट की सूचना गठन 'कोशिकाओं Globoid' और इस रोग का एक परिभाषित विशेषता हैं.

GLD में उनकी भूमिका लंबे समय पर ध्यान नहीं दिया गया है, हालांकि Globoid कोशिकाओं, GLD पैथोलॉजी की बानगी विशेषता है. दिलचस्प बात यह है कि इन कोशिकाओं GLD की सीएनएस ऊतक में जल्द से जल्द विशेषता परिवर्तन शामिल हैं. ज्ञान के अभाव के कारण multinucleated फ़ैगोसाइट, अन्य बीमारियों में बुलाया विशाल कोशिकाओं के निर्माण, आम तौर पर नहीं बल्कि एक प्रारंभिक रोगजनक असली ताकत 9 से विकृति का एक परिणाम के रूप में माना जाता है कि इस धारणा के लिए किया गया हो सकता है. इसलिए, whi द्वारा तंत्र की जांच के कुछ अध्ययन किए गएचर्चा GLOBOID कोशिकाओं को विशेष रूप से GLD की सीएनएस में, फ़ैगोसाइट से बनते हैं. इस रिपोर्ट में वर्णित प्रक्रिया सीएनएस में GLOBOID सेल के गठन के महत्व और phagocytic गतिविधि का उच्च स्तर का प्रदर्शन विट्रो में microglia और इन कोशिकाओं की कि psychosine प्रेरित multinucleation हमारे पिछले प्रदर्शन पर केंद्रित है. इन टिप्पणियों के अनुरूप, ट्विचर दिमाग में GLOBOID कोशिकाओं अक्सर phagocytic गतिविधि का उच्च स्तर, सुझाव पीए पॉजिटिव मलबे होते हैं. Globoid कोशिकाओं को भी ferritin के लिए immunopositive होना पाया जाता है (एक microglia मार्कर) 10, केपी -1 / CD68 (एक monocyte मार्कर), और कुछ भी vimentin के लिए सकारात्मक रहे हैं (एक मध्यवर्ती रेशा प्रोटीन और astrocytes के मार्कर और सक्रिय microglia) 11, एचएलए नाटकीय (एक MHCII सतह रिसेप्टर), और TNF-α 7, और मोबाइल -1 12 (microglia की पहचान करने के लिए इस्तेमाल एक कैल्शियम बाध्यकारी प्रोटीन). मार्कर के इस संग्रह के आधार पर, GLOBOID कोशिकाओं को विकसित कि microglia से उत्पन्नएक अद्वितीय फेनोटाइप.

अपनी विशिष्टता के बावजूद, विशेष समारोह और GLD रोगजनन को जेन्टलमैन कैडटों का योगदान काफी हद तक अनदेखी की गई है. Globoid कोशिकाओं पुरानी demyelination के एक माध्यमिक परिणाम माना गया है. हालांकि, GLD के सफेद पदार्थ विकृति को GLOBOID कोशिकाओं के अस्थायी एसोसिएशन की जांच पिछले अध्ययनों जल्दी प्रसव के बाद की अवधि के लिए देर से भ्रूण में GLOBOID कोशिकाओं की उपस्थिति की पहचान की है; oligodendrocyte apoptosis और प्रकट demyelination 13 पूर्ववर्ती बार. इस प्रकार, GLD में neuropathology के विकास के अस्थायी अनुक्रम GLOBOID कोशिकाओं को इस रोग से 14 में demyelination के अग्रिम में गठन कर रहे हैं कि पता चलता है. इस GLD में GLOBOID कोशिकाओं के प्रारंभिक गठन oligodendrocyte क्षति 15 में माध्यमिक, प्रतिक्रियाशील प्रतिक्रिया के बजाय एक निर्णायक रोगजनक घटना प्रतिनिधित्व कर सकते हैं कि हमारी परिकल्पना के लिए नेतृत्व किया. साथ ही, GLD में microglial गतिविधि का अनियंत्रण एक वास्तविक माना गया हैआर इस रोग से 16 के इलाज के लिए hematopeotic स्टेम सेल उपचार के दीर्घकालिक प्रभाव को सीमित. इस प्रकार, psychosine के जवाब में सेलुलर कार्यों और microglia के विनियमन, और GLOBOID कोशिकाओं की जांच GLD के रोगजनन में नए अंतर्दृष्टि प्रदान करने की उम्मीद है.

अभी हाल तक, GLOBOID सेल गठन का अध्ययन है जिसमें एक उपयुक्त मॉडल की कमी सटीक समारोह और GLD की विकृति को इन कोशिकाओं के योगदान की समझ सीमित थी. हाल के अध्ययन में यह GLOBOID कोशिकाओं की तरह, GLD में जम जाता है कि एक रोगजनक लिपिड विष psychosine के लिए सीधी प्रतिक्रिया में गठित किया जा सकता है कि निर्धारित किया गया था. हम चाहते हैं कि microglia पाया, लेकिन नहीं मैक्रोफेज, सक्रिय और 15 psychosine के जवाब में प्राथमिक glial संस्कृतियों में GLOBOID कोशिकाओं में तब्दील कर रहे हैं. GLOBOID कोशिकाओं में इस परिवर्तन कोशिकी प्रोटीज, मैट्रिक्स metalloproteinase (एमएमपी) -3 15 द्वारा मध्यस्थता हो पाया था. हाल ही में, हमइस में इन विट्रो मॉडल प्रणाली में विकसित किया है कि psychosine सक्रिय microglia और GLOBOID कोशिकाओं इन निष्कर्षों को बढ़ाया और निर्धारित किया है oligodendrocytes और oligodendrocyte पूर्वज कोशिकाओं को potently विषाक्त कर रहे हैं. इसलिए, GLD, psychosine और इस रोग में microglia के लिए एक उभरते प्राथमिक और संभवतः रोगजनक भूमिका का समर्थन करेगी demyelination से पहले GLOBOID कोशिकाओं के गठन के प्रारंभिक संचय के संदर्भ में माना जाता है.

हम इस बीमारी के बारे में हमारी समझ के लिए योगदान देगा कि GLD के रोगजनन के बारे में नई जानकारी खोलेगा GLOBOID सेल के गठन की है कि अध्ययन का प्रस्ताव. इसके अलावा, GLD के इस नए सेलुलर मॉडल उपन्यास चिकित्सकीय दृष्टिकोण इस रोग में रोग परिवर्तन का परीक्षण किया जा सकता है पता करने के लिए जिसमें से एक नया स्वरूप प्रदान कर सकता है. इसलिए, इस रिपोर्ट में हम गैर myelinating glia के प्राथमिक संस्कृतियों से psychosine प्रेरित GLOBOID कोशिकाओं की इन विट्रो विकास के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं.

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Protocol

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जानवरों को शामिल सभी प्रक्रियाओं इंसानियत की देखभाल और प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग पर नीति के अनुसार प्रदर्शन किया गया प्रयोगशाला पशु कल्याण कार्यालय (एनआईएच) द्वारा और केवल विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) से अनुमोदन के साथ उल्लिखित कनेक्टिकट स्वास्थ्य केंद्र.

मिश्रित Glial संस्कृतियों का 1. तैयारी

  1. उपयोग करने से पहले सभी उपकरणों जीवाणुरहित. ठंड रखने के लिए बर्फ पर बनाए रखा तीन बाँझ 60 मिमी पेट्री डिश के लिए (2 मिलीग्राम + या सीए 2 +) कोई फैटायनों युक्त ठंडा बाँझ हांक संतुलित नमक समाधान (HbSS) के 3 मिलीलीटर जोड़ें.
  2. पहले 17,18 वर्णित है, प्रसव के बाद P0-P2 माउस पिल्ले से cortices अलग.
    नोट: इस तरह के हिप्पोकाम्पी रूप subcortical संरचनाओं,, इन संस्कृतियों में शामिल नहीं हैं.
  3. एक पूर्वोत्तर का प्रयोग, ध्यान तानिका हटाने और फिर ताजा HBSS के लिए अलग cortices हस्तांतरण और enzymatically ऊतकों को अलग कर देनानिर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार यूराल ऊतक विच्छेदन किट.
  4. प्लेट बाँझ टी 175 बोतल में कोशिकाओं और मीडिया में रातोंरात सेते [Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम 1x पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन युक्त 10% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ (DMEM) (एफ बी एस)].
  5. ताजा मीडिया के साथ अगले दिन सब मीडिया की जगह. लगभग 3 सप्ताह के लिए या एक सेलुलर monolayer की स्थापना की है, जब तक नियमित रूप से मीडिया में परिवर्तन के साथ, संस्कृतियों सेते जारी रखें.
    नोट: 1 अनुपात 19: इस monolayer एक लगभग 10 से astrocytes और microglia के शामिल किया जाएगा.

मिश्रित Glial संस्कृति में 2 Globoid सेल प्रेरण

  1. ईसीएम में लिपटे coverslips तैयार करें.
    1. 30 मिनट के लिए एक बाँझ पेट्री डिश में बाँझ 1 एन हाइड्रोक्लोरिक एसिड (एचसीएल) के साथ परिपत्र coverslips भिगोएँ. बाँझ पानी 3x साथ coverslips धो लें और फिर कम से कम 20 मिनट के लिए 95% EtOH में लेना. और फिर हवा शुष्क करते हैं.
    2. पतला कोशिकी matr की जगह बूंदोंParafilm की एक शीट पर नौवीं (ईसीएम) प्रोटीन कोटिंग सामग्री (मिलीलीटर बाँझ फॉस्फेट बफर समाधान में भंग laminin 10 माइक्रोग्राम / जैसे 150-250 μl / छोटी बूंद [पीबीएस]). इन बूंदों पर रखा गया जब coverslips नहीं छू जाएगा ताकि बूंदों बांटो. धीरे संदंश का उपयोग कर एक छोटी बिंदु पर प्रत्येक सूखे coverslip जगह.
    3. लगभग बूंदों पर coverslips छोड़ दें. सैश के साथ संस्कृति हुड के अंदर 4-6 घंटा बंद हुआ.
    4. 24 अच्छी तरह से थाली के कुओं में से प्रत्येक में ईसीएम में लिपटे coverslips (ईसीएम में लिपटे ऊपर की ओर) रखें. बाँझ पीबीएस 3X के साथ अच्छी तरह से प्रत्येक धोने और जब तक जरूरत 4 डिग्री सेल्सियस पर रखना.
  2. Coverslips पर चढ़ाना के लिए glial कोशिकाओं की तैयारी.
    1. Glial संस्कृतियों से मीडिया Aspirate और धीरे बाँझ पीबीएस के 10 एमएल के साथ glial monolayer 3x धो लो. अगला, टी 175 के लिए 8-10 मिलीलीटर trypsin-EDTA समाधान जोड़ने, और 37 डिग्री सेल्सियस पर 5-10 मिनट के लिए सेते हैं.
    2. Monolayer के सबसे अलग किया गया है, पूरा मीडिया के 20 मिलीलीटर जोड़नेफ्लास्क trypsinization रोकने के लिए. एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में अलग कोशिकाओं से युक्त मीडिया लीजिए और कमरे के तापमान पर 300 XG पर 10 मिनट के लिए स्पिन.
    3. धीरे एक P1000 pipet का उपयोग समाधान pipetting द्वारा ताजा पूरा मीडिया के 2 मिलीलीटर में कोशिकाओं फिर से निलंबित तो गोली परेशान बिना सतह पर तैरनेवाला Aspirate, और.
    4. वांछित घनत्व (जैसे 10 5 कोशिकाओं / एमएल) पर पूरा मध्यम में कोशिकाओं से निलंबित कर रहे हैं तो एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की संख्या का निर्धारण और. ईसीएम में लिपटे coverslips (24 अच्छी तरह से थाली में से प्रत्येक कुएं में जैसे 500 μl) पर कोशिकाओं प्लेट. 37 डिग्री सेल्सियस ऊष्मायन के प्रत्येक अच्छी तरह से 3-5 दिनों के लिए अतिरिक्त ताजा पूरा मीडिया जोड़ें, या कोशिकाओं वांछित दृश्य संगम को बढ़ने जब तक.
  3. Psychosine साथ उपचार.
    1. एक शेयर एकाग्रता डाइमिथाइल sulfoxide में (108.3 मिमी) (DMSO) को psychosine पुनर्गठित. एक काम कर स्टॉक बनाने के लिए 100% EtOH में इस शेयर पतला कर सकते हैं किn 10 माइक्रोन का एक अंतिम एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए 24 अच्छी तरह से थाली में से प्रत्येक कुएं में जोड़ दिया.
    2. Psychosine जोड़ने के समय, धीरे संस्कृति मीडिया में psychosine मिश्रण करने के लिए संस्कृति की थाली ज़ुल्फ़. एक सप्ताह के लिए 10 माइक्रोन हर दूसरे दिन के बराबर जोड़कर psychosine अनुपूरक.
  4. Psychosine इलाज के 7 दिनों के बाद, मीडिया और प्रत्येक कुएं में ठंड 4% paraformaldehyde (पीएफए) के pipet 500 μl इकट्ठा. 20 मिनट कोशिकाओं को ठीक करने के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं. फिर, पीबीएस के साथ प्रत्येक अच्छी तरह 3x धोने और (नीचे देखें) immunocytochemistry के लिए प्रसंस्कृत तक तो 4 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें रखना.
    नोट: अगर वांछित सेल संस्कृति मीडिया में इस बिंदु पर enzymatic या एलिसा परख के लिए एकत्र किया जा सकता है.

3 Immunocytochemistry (आईसीसी) Globoid कोशिकाओं कल्पना करने के लिए

  1. बफर [पीबीएस + 0.3% बीच 20 + 5% सामान्य बकरी सीरम (NGS)] अवरुद्ध साथ पीबीएस बदलें, और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए कोशिकाओं को सेते हैं.
  2. मेंमोबाइल -1 के खिलाफ प्राथमिक antisera में तय कोशिकाओं cubate [(1: 1000) पीबीएस में पतला + 0.3% + 2% NGS-20 के बीच] कमरे के तापमान पर कम से कम 1 घंटे के लिए, तो पीबीएस 3x 5 मिनट के साथ एक अच्छी तरह से धो / धो लो.
  3. नाभिक की पहचान करने के लिए: 4 ', 6 diamidino-2-phenylindole (1,000 DAPI, 1) के साथ एंटीबॉडी लेबलिंग और जवाबी दाग ​​प्राथमिक पहचान करने के लिए उपयुक्त माध्यमिक प्रतिदीप्ति संयुग्मित एंटीबॉडी जोड़ें. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान में सेते हैं और पीबीएस 3x 5 मिनट से धो लें.
  4. एक बढ़ते माध्यम का उपयोग कर स्लाइड खुर्दबीन के लिए प्रत्येक coverglass माउंट. दृश्य और मात्रात्मक विश्लेषण के लिए एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप पर देखें स्लाइड.

4 विश्लेषण और प्राथमिक संस्कृति में Globoid कोशिकाओं की विशेषता

  1. संस्कृति में एक GLOBOID सेल की पहचान करने के लिए निम्नलिखित तीन रूपात्मक मापदंड का उपयोग करें:
    1. , Microglial मार्कर के लिए immunopositive लेबलिंग द्वारा मोबाइल -1 + फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग GLOBOID कोशिकाओं की पहचान.
    2. पहचानेंpolynucleated (यानी वाले दो या अधिक DAPI सकारात्मक नाभिक) के रूप में GLOBOID कोशिकाओं.
    3. Microglial कोशिकाओं आराम की अत्यधिक branched उपस्थिति से अलग एक गोल आकृति विज्ञान द्वारा GLOBOID कोशिकाओं की पहचान.
      नोट: प्रकोष्ठों भी इन संस्कृतियों से प्रवाह cytometry द्वारा सेल सतह मार्कर विश्लेषण और मात्रा का ठहराव के लिए एकत्र किया जा सकता है.
  2. Microglia और GLOBOID कोशिकाओं की phagocytic सक्रियण मापने
    1. Psychosine इलाज microglia की phagocytic गतिविधि का आकलन करने के लिए निर्माता के निर्देशों के अनुसार वेल्स को FITC लेबल लेटेक्स मोती जोड़ें. पूर्व पीएफए ​​के साथ निर्धारण करने के लिए फ्लोरोसेंट संयुग्मित लेटेक्स मोती 48 घंटा जोड़ें. (धारा 3 में वर्णित) immunocytochemistry के लिए (धारा 2.4 में वर्णित के रूप में) मोतियों के साथ इलाज किया कोशिकाओं, और इस प्रक्रिया को ठीक करें.
    2. वे फ्लोरोफोरे लेबल मोतियों की फ्लोरोसेंट उत्सर्जन स्पेक्ट्रा ओवरलैप नहीं है कि इतनी फ्लोरोफोरे संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी का चयन करें.
    3. Analyzई है कि उन कोशिकाओं की पहचान करके मोबाइल -1 + microglia की phagocytotic प्रोफाइल के fluorescently लेबल मोतियों के साथ सह स्थानीय बनाना.
      नोट: Psychosine microglia सक्रिय करेंगे. Phagocytosed मोतियों इस संस्कृति की स्थापना में mononucleated और multinucleated मोबाइल -1 + कोशिकाओं के भीतर की पहचान की जाएगी.

शुद्ध microglial संस्कृतियों से Globoid प्रकोष्ठों के 5 प्रेरण

नोट: astrocyte और microglia के बीच कहनेवाला संकेत समझने के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण इस में इन विट्रो GLOBOID सेल मॉडल का एक और फायदा है. निम्नलिखित कदम (धारा 5.2 देखें) के रूप में वर्णित replating या सह संवर्धन के लिए प्राथमिक microglial कोशिकाओं की शुद्धि, संस्कृति में उनके निचले पालन संपत्ति से प्राप्त किया जा सकता है.

  1. 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में मिला हुआ मिश्रित glial संस्कृतियों से मीडिया लीजिए और इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखने.
  2. प्राथमिक मिश्रित Glial संस्कृतियों से microglial अलगाव.
    1. एक मिला हुआ मिश्रित glial संस्कृति T175 कुप्पी से मीडिया को हटाने के बाद, [+ 25 मिमी 4 (2 hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic एसिड (HEPES) + 25 मिमी सोडियम बाइकार्बोनेट (सिग्मा) पूरा मीडिया से मिलकर] गर्म मिलाते हुए मीडिया जोड़ें. 100 आरपीएम (37 डिग्री सेल्सियस) पर एक कक्षीय प्रकार के बरतन में 3-4 घंटे के लिए बोतल हिला. 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों में इन हिल बोतल से मीडिया लीजिए.
      नोट: यह मीडिया बोतल से कम पक्षपाती microglia शामिल होंगे.
    2. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 300 XG पर मीडिया स्पिन. Astrocyte वातानुकूलित मीडिया के 2 मिलीलीटर में कोशिकाओं फिर से निलंबित फिर सतह पर तैरनेवाला Aspirate और (5.1 कदम में एकत्र).
    3. एक hemocytometer का उपयोग और फिर सब्सट्रेट में लिपटे coverslips पर microglial कोशिकाओं थाली का अधिग्रहण कोशिकाओं की संख्या की स्थापना immunocytochemistry के लिए (अनुभाग 2.1 देखें), या अन्य प्रकार की कोशिकाओं के साथ सह संस्कृति के लिए GLOBOID कोशिकाओं के भविष्य के संग्रह के लिए ultralow पालन अच्छी तरह प्लेटों पर थाली, ऐसे oligodendrocytes रूप में (जानकारी के रूप में) निम्न खंड में ribed.
      नोट: एक बार microglia (अनुभाग 2.3 देखें) जैसा कि ऊपर वर्णित psychosine (10 माइक्रोन) के साथ इलाज किया जा सकता चढ़ाया.
  3. Cytotoxicity के विश्लेषण के लिए प्राथमिक oligodendrocytes साथ सह संस्कृति.
    नोट: प्राथमिक oligodendrocytes की संस्कृतियों, या oligodendrocyte पूर्वज कोशिकाओं पर बाद में सह संस्कृति के लिए कम पालन प्लेटों से psychosine इलाज microglia का संग्रह, इन विट्रो में इन GLOBOID की तरह कोशिकाओं की क्षमता साइटोटोक्सिक समारोह जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
    1. स्थापित तरीकों 18,20 का उपयोग प्राथमिक oligodendrocytes की संस्कृतियों का विकास करना. Psychosine इलाज microglia इकट्ठा करने के लिए, धीरे कुओं की गहराई से शिथिल पक्षपाती कोशिकाओं को अलग pipet. 10 मिनट के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओं लीजिए, और फिर ध्यान Neurobasal मीडिया से बना oligodendrocyte भेदभाव मीडिया [में resuspend, एल glutamine (1x), बी -27 पूरक (1x), और ट्राईआयोडोथायरोनिन (T3, 10 एनजी / एमएल )].
    2. एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की संख्या की गणना और फिर एक अनुमानित 1 में जिसके परिणामस्वरूप, 1 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल पर oligodendrocyte संस्कृति पर microglia बीज: 2 microglia / oligodendrocyte अनुपात. ऊपर से 3 दिन के लिए एक सह संस्कृति के रूप में सेते हैं.
    3. Immunocytochemistry के लिए कोशिकाओं को ठीक (अनुभाग 2.4 देखें). एलिसा के लिए सेल संस्कृति मीडिया लीजिए या जरूरत के रूप में रासायनिक विश्लेषण करती है.

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Representative Results

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यह प्रोटोकॉल, लिखित रूप में, खत्म (: प्रायोगिक कार्यप्रवाह योजना चित्रा 1 देखें) को शुरू से ही पूरा करने के लिए लगभग 36 दिन लग जाने की उम्मीद है. यह इस प्राथमिक संस्कृति प्रणाली में 'GLOBOID की तरह' कोशिकाओं के विकास को विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है कि दोनों हमारे अनुभव रहा है: psychosine के जवाब में multinucleated कोशिकाओं के गठन के लगातार इलाज के 7 दिनों के साथ मनाया जाता है.

बड़े की पहचान सक्षम हो जाएगा एक परमाणु काउंटर दाग के साथ संयोजन के रूप में मोबाइल-1 का उपयोग microglia के Immunocytochemical धुंधला हो जाना, multinucleated कोशिकाओं गोल (चित्रा 1 बी). कुछ उदाहरणों में इन GLOBOID की तरह कोशिकाओं में परमाणु सामग्री अलग नाभिक के साथ दिखाई देंगे. हालांकि, कई मामलों में, नाभिक के आकार की सकल वृद्धि इन कोशिकाओं (चित्रा 1 बी) के multinucleated स्थिति को दर्शाता है. GLOBOID की तरह कोशिकाओं की संख्या, दृश्य क्षेत्र के लिए दृश्य क्षेत्र से भिन्न हो सकते हैंलेकिन यह इन विट्रो में गठन GLOBOID कोशिकाओं का अनुपात <कुल microglial सेल आबादी के 5-10% का प्रतिनिधित्व करता है कि ध्यान देने योग्य है. यह psychosine उपचार भी mononucleated microglia और इन संस्कृतियों में multinucleated GLOBOID कोशिकाओं (जेन्टलमैन कैडटों) के बीच इलाज psychosine के जवाब में होता है कि microglia की एक सामान्यीकृत सक्रियण (phagocytic गतिविधि में यानी औसत दर्जे का वृद्धि) उदाहरण भी देते हैं कि बाहर बात करने के लिए भी महत्वपूर्ण है. चित्रा -1 सी में दिखाया गया है oligodendrocyte पूर्वज कोशिकाओं (OPCs) के साथ सह संस्कृति में डाल दिया जब, आईबीए -1 + microglia की phagocytically सक्रिय प्रोफाइल को आसानी से पहचाना जा सकता है.

यह सेल संस्कृति प्रणाली GLOBOID कोशिकाओं के जीव विज्ञान का आकलन करने के लिए एक साधन के रूप में प्रयोगात्मक हेरफेर करने के लिए उत्तरदायी है. उदाहरण के लिए, हम हाल ही में बाह्य प्रोटीज के लिए एक उपन्यास भूमिका का प्रदर्शन किया है, मैट्रिक्स metalloproteinase -3 (एमएमपी 3 / stromelysin -1) psychosine प्रेरित जीसी गठन की एक महत्वपूर्ण मध्यस्थ के रूप में इस संस्कृति का उपयोगसंरचना परख 15.

चित्रा 1
चित्रा 1:. Globoid कोशिका निर्माण के प्राथमिक संस्कृति में इन विट्रो मॉडल के लिए प्रायोगिक कार्यप्रवाह (ए) फ्लोचार्ट प्राथमिक चरणों चित्रण और संस्कृति में GLOBOID कोशिकाओं के विकास के लिए (दिन में) बार हस्तक्षेप. हर कदम प्रोटोकॉल से उसके संबंधित पाठ खंड के साथ लेबल है. (; धारा 1 astrocyte और microglial संस्कृतियों) और शुद्ध microglia (धारा 5) (बी) psychosine की लगातार 7 दिनों के बाद एक multinucleated microglial सेल के प्रतिनिधि immuncytochemical धुंधला की एक वैकल्पिक प्रारंभिक संस्कृति (10. इस कार्यप्रवाह मिश्रित से एक तार्किक प्रगति दोनों प्रदान करता है Iba1 (हरा) और DAPI (नीला) द्वारा की पहचान के रूप में माइक्रोन) उपचार. (सी) प्रकल्पित phagocytic microglial सेल का उदाहरण (Olig2 + (लाल) OPC के साथ सह संस्कृति में psychosine इलाज के बाद) हरे. (पैनल बी में) स्केल बार 'सी' के लिए 'बी' और = 150 माइक्रोन के लिए 90 माइक्रोन =. चित्रा 1 बी का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें और यहां चित्रा 1C का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए.

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Discussion

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इस के साथ साथ वर्णित प्रोटोकॉल विकास और सक्रिय microglia और GLOBOID कोशिकाओं के कार्यात्मक लक्षण वर्णन का अध्ययन करने के लिए एक नया मॉडल प्रणाली प्रदान करता है. इम एट अल द्वारा पहले काम. एक HEK293 सेल लाइन का उपयोग GLOBOID सेल गठन 21 के अध्ययन के लिए वर्तमान प्रोटोकॉल के विकास के लिए खाका प्रदान की है. यह मॉडल में निकाली गई GLOBOID कोशिकाओं GLD में पहचाने जाने देशी GLOBOID कोशिकाओं से अलग है कि बाहर बात करने के लिए भी महत्वपूर्ण है. GLD में GLOBOID कोशिकाओं अक्सर 10 नाभिक से अधिक युक्त मनाया गया है, जबकि उदाहरण के लिए, हम नियमित रूप से हमारे murine संस्कृतियों में microglia की quadranucleation मनाया है. Vivo में मनाया उन लोगों की तुलना के रूप में दूसरे, इन विट्रो प्रणाली में गठित GLOBOID कोशिकाओं को भी व्यास में छोटे हैं. इस्तेमाल किया संस्कृति प्रणाली के रिश्तेदार सादगी शामिल हो सकते हैं जो इन प्ररूपी मतभेद के लिए कई कारणों से होने की संभावना नहीं हैं. उदाहरण के लिए, कोई कुछ कर रहे हैंन्यूरॉन्स या इस प्राथमिक glial संस्कृति प्रक्रिया का उपयोग कर GLOBOID सेल गठन के शामिल चरण के दौरान उपस्थित oligodendrocytes. इसके अलावा, सात दिन प्रोटोकॉल का समय GLOBOID कोशिकाओं का एक महत्वपूर्ण घनत्व पैदावार; हालांकि, अब इलाज बार आगे GLD में मनाया GLOBOID कोशिकाओं के देशी सुविधाओं के साथ इस प्रोटोकॉल द्वारा गठित murine GLOBOID कोशिकाओं की समानता बढ़ाने सकता है.

इस मॉडल की एक महत्वपूर्ण विशेषता यह दोनों astrocytes और microglia 15,19 शामिल है जो प्राथमिक मिश्रित glial संस्कृतियों, का उपयोग करता है. इस astrocytes और microglia के बीच योगदान और परस्पर क्रिया का आकलन करने में इसकी उपयोगिता के लिए इस GLOBOID सेल मॉडल की एक महत्वपूर्ण लाभ है. इस रोग में अपनी भूमिका कर रहे हैं, हालांकि अभी तक खराब विशेषता के रूप में इन गैर myelinating प्रकार की कोशिकाओं के दोनों, GLD में सक्रिय कर रहे हैं. महत्वपूर्ण बात है, हम पहले से GLD में astrocytes एमएमपी 3 अभिव्यक्ति के उच्च स्तर को व्यक्त करने और निर्धारित किया था कि यह संभवतः astrocyte-डेरिवेटिव्स किएड कारक psychosine के जवाब में microglia के परिवर्तन के लिए महत्वपूर्ण था. GLOBOID सेल के गठन का यह इन विट्रो मॉडल का भविष्य अनुप्रयोगों काइमेरिक astrocytes की संस्कृतियों और microglia पर psychosine की रोगजनक प्रभाव को सेल विशिष्ट योगदान के बारे में हमारी समझ अग्रिम करने के लिए नियोजित किया जा सकता है जो भिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि, के microglia रोजगार मिल रहा.

संक्षेप में, इस प्रोटोकॉल GLD के रोगजनन अध्ययन करने के लिए एक नया दृष्टिकोण प्रदान करता है. GLOBOID कोशिकाओं की भूमिका रहस्यपूर्ण रहा है और GLD में उनकी सुरक्षा या हानिकारक कार्यों पर परिकल्पना प्रस्तावित किया गया है. GLD के प्राकृतिक इतिहास में GLOBOID कोशिकाओं की जल्दी पहचान और आगे GLD में microglia की सक्रियता एक प्राथमिक रोगजनक प्रतिक्रिया और इस रोग में माइलिन पैथोलॉजी की एक संभावना मध्यस्थ हैं कि इस समय हमारे विचार का समर्थन करेगी. इस में इन विट्रो मॉडल प्रणाली के अनुकूलन सेलुलर ई पर हमारी समझ और आगे के लिए उम्मीद हैGLD की tiology.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hank’s balanced salt solution (HBSS) containing no cations (Mg2+ and Ca2+). Life technologies 14175-095
Neural Tissue Dissociation Kit Miltenyi 130-092-628
40 μm cell-strainer Fisherbrand 22363547
Hank’s balanced salt solution (HBSS) containing cations (Mg2+ and Ca2+). Gibco 14025-092
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) Gibco 11995-065
fetal bovine serum (FBS) Atlanta Biologicals S11150
Penicilin/Streptomycin Life technologies 15070-063
Laminin Sigma L2020
Trypsin-EDTA solution Life technologies 25299-056
Psychosine Sigma P9256
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D2650
Paraformaldehyde (PFA) Electron Microscopy Science 19208
Normal Goat Serum (NGS) Invitrogen PCN5000
Iba-1 WAKO 019-19741
Alexa Fluor conjugated antisera Life Technologies Various
Mounting Media Southern Biotech OB100-01
Phagocytic Assay Kit Cayman Chemicals 500290
HEPES Sigma BP310-500

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References

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एक<em&gt; इन विट्रो</em&gt; Globoid सेल Leukodystrophy में सेलुलर pathophysiology के अध्ययन के लिए मॉडल
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Claycomb, K. I., Johnson, K. M., Bongarzone, E. R., Crocker, S. J. An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy. J. Vis. Exp. (92), e51903, doi:10.3791/51903 (2014).More

Claycomb, K. I., Johnson, K. M., Bongarzone, E. R., Crocker, S. J. An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy. J. Vis. Exp. (92), e51903, doi:10.3791/51903 (2014).

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