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Neuroscience

Um doi: 10.3791/51903 Published: October 21, 2014

Abstract

A função precisa da microglia multi-nucleadas, chamados de células Globóides, que são excepcionalmente abundantes no sistema nervoso central de leucodistrofia celular globoso (GLD) é incerto. Esta lacuna no conhecimento tem sido dificultada pela falta de um adequado modelo in vitro para o estudo. Relata-se um sistema de cultura glial murino primário em que o tratamento com resultados psicosina em multinucleações de microglia semelhantes às células Globóides características encontradas em GLD. Usando este novo sistema, que definiu as condições e modos de análise para o estudo de células Globóides. O potencial de uso deste sistema modelo foi validado em nosso estudo anterior, que identificou um papel potencial para metaloproteinases da matriz (MMP) -3 em GLD. Este novo sistema in vitro pode ser um modelo útil para estudar a formação e função, mas também a manipulação terapêutica potencial, destas células únicas.

Introduction

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Leucodistrofia celular Globóides (GLD), também conhecida como doença de Krabbe, é uma doença desmielinizante fatal, resultante da perda de mutações de função no galatocerebrosidase (GalC) do gene 1. A forma mais prevalente de GLD é a variante infantil que se caracteriza por início na infância e caracteriza-se por um curso clínico agressivo do motor e do declínio cognitivo, levando à morte prematura, muitas vezes antes dos cinco anos de idade 2,3. O teste genético é utilizado para verificar o diagnóstico de GLD 4. Neuropatologia da GLD revela desmielinização generalizada, atrofia neuronal, astrogliosis e presença de microglia multi-nucleadas ingurgitadas chamadas células Globóides 5-7. A identificação de células Globóides, muitas vezes contendo inclusões tubulosas no seu citoplasma, tem sido uma característica de definição de GLD para os últimos 97 anos, embora a função específica destas células visíveis tem permanecido elusiva.

A participação das organizações não-myelinating glia (microglia e astrócitos) na patogênese da GLD tem sido considerada uma resposta secundária à profunda desmielinização nesta doença 8. Curiosamente, a primeira descrição da doença, feita por Knud Krabbe em 1916 5, formação relatado dos fagócitos multinucleadas contendo detritos lipídica que foram nomeados 'Globóides células "e são uma característica desta doença.

Células Globóides são a característica marca de GLD patologia, apesar de seu papel na GLD tem sido ignorado. Curiosamente, estas células estão entre as primeiras alterações características no tecido do SNC de GLD. Esta falta de conhecimento pode ter sido devido à suposição de que a formação de fagócitos multinucleadas, chamadas de células gigantes em outras doenças, são normalmente considerados como uma consequência de uma patologia, em vez de uma força motriz patogénico inicial 9. Portanto, há poucos estudos sobre os mecanismos pelos whicélulas Globóides ch são formados a partir de fagócitos, em particular no sistema nervoso central de GLD. O procedimento descrito no presente relatório centra-se na importância da formação de células Globóides no SNC e nossa manifestação anterior que multinucleações induzida por psicosina de microglia in vitro e essas células apresentaram níveis mais altos de atividade fagocitária. Consistente com essas observações, as células Globóides em cérebros Twitcher contêm freqüentemente detritos PAS-positivo, sugerindo níveis elevados de atividade fagocitária. Células Globóides também são encontrados para ser imunopositivas para ferritina (um marcador de microglia) 10, KP-1 / CD68 (um marcador de monócitos), e alguns também são positivas para vimentina (uma proteína intermediária filamento e marcador de astrócitos e microglia ativada) 11, HLA-RDa (um receptor da superfície MHCII), e TNF-α 7, e Iba-1 (uma proteína de ligação de cálcio utilizado para identificar microglia) 12. Com base neste conjunto de marcadores, células Globóides originam de microglia que desenvolvemum fenótipo original.

Apesar de sua singularidade, a função ea contribuição dos GCs para GLD patogênese específica tem sido largamente ignorado. Células Globóides ter sido pensado para ser uma consequência secundária de desmielinização crônica. No entanto, estudos anteriores examinaram a relação temporal de células Globóides para a patologia da substância branca de GLD identificaram a presença de células no final do Globóides embrionário para períodos de pós-natais; tempos que precederam a apoptose de oligodendrócitos e desmielinização evidente 13. Assim, a sequência temporal do desenvolvimento da neuropatologia no GLD sugere que as células Globóides são formadas antes da desmielinização nesta doença 14. Isto levou a nossa hipótese de que o início da formação de células Globóides em GLD pode representar um evento patogénico definindo, em vez de, uma resposta secundária a danos reactivo oligodendrócitos 15. Além disso, a desregulação da atividade da microglia em GLD tem sido considerado um factor limitando a sua eficácia a longo prazo da terapia de células estaminais hematopeotic para tratar esta doença 16. Assim, investigando as funções celulares e regulação da microglia e células Globóides, em resposta a psicosina deverá fornecer novos insights na patogênese da GLD.

Até recentemente, a falta de um modelo adequado para estudar a formação de células globoso limitou a compreensão da função e contribuição exacta destas células para a patologia de GLD. Em estudos recentes, foi determinado que as células-Globóides como pode ser formado em resposta directa a Psicosina, uma toxina lípido patogénico que se acumula em GLD. Descobrimos que a microglia, mas não macrófagos, são activadas e transformado em células Globóides em culturas gliais primários, em resposta a Psicosina 15. Esta transformação em células Globóides foi encontrado para ser mediada pela protease extracelular, as metaloproteinases de matriz (MMP) -3 15. Mais recentemente,estenderam estas conclusões e determinou que microglia e Globóides células ativadas por psicosina desenvolvidos neste sistema in vitro modelo são potencialmente tóxicos para os oligodendrócitos e as células progenitoras de oligodendrócitos. Assim, quando considerado no contexto de GLD, a acumulação inicial de psicosina e formação de células Globóides anteriores à desmielinização apoiam um papel patogénico primário e eventualmente em microglias emergente para esta doença.

Propomos que o estudo da formação de células Globóides irá revelar novas informações sobre a patogenia da GLD que irá contribuir para a nossa compreensão da doença. Além disso, esse novo modelo de celular da GLD pode fornecer um novo formato a partir do qual novas abordagens terapêuticas para lidar com alterações patológicas esta doença poderia ser testada. Assim, neste relatório nós fornecemos um protocolo detalhado para o desenvolvimento in vitro de células Globóides induzida por psicosina de culturas primárias de células da glia não myelinating.

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Protocol

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Todos os procedimentos envolvendo animais foram realizados de acordo com a Política de Atenção Humanizada e Uso de Animais de Laboratório estabelecido pelo Office of Laboratory Animal Welfare (NIH) e somente com a aprovação do Comitê de Cuidados e Uso Animal Institucional (IACUC) da Universidade de Centro de Saúde de Connecticut.

1 Preparação de culturas mista glial

  1. Esterilizar todos os instrumentos antes de usar. Adicione 3 mL de solução gelada estéril salina equilibrada de Hank (HBSS) contendo catiões não (Mg2 + ou Ca2 +) para 60 milímetros estéreis três placas de Petri mantidos em gelo para manter frio.
  2. Isolar os córtices de pós-natais P0-P2 rato filhotes, como descrito anteriormente 17,18.
    NOTA: As estruturas subcorticais, como o hipocampo, não estão incluídos nestas culturas.
  3. Retire cuidadosamente as meninges e, em seguida, transferir os córtices isoladas de HBSS e dissociar os tecidos enzimática, utilizando um nekit dissecção dos tecidos ural de acordo com o protocolo do fabricante.
  4. Placa as células em estéreis frascos T-175 e incubar durante a noite em meio [meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) com 10% de soro fetal bovino (FBS) contendo 1x penicilina / estreptomicina].
  5. Substituir todos os meios de comunicação social no dia seguinte com meio fresco. Continue-se a incubar as culturas, com mudanças de meio regulares, durante cerca de 3 semanas ou até que uma monocamada celular é estabelecida.
    NOTA: Este monocamada será compreendido de astrócitos e microglia com cerca de 10: 1 19.

2. Globóides Indução celular em culturas mista glial

  1. Prepare as lamelas revestidos de ECM.
    1. Soak lamelas circulares com ácido clorídrico 1 N estéril (HCl) em uma placa de Petri esterilizada, durante 30 minutos. Lavar 3x lamelas com água esterilizada e depois imersão em 95% de EtOH, durante pelo menos 20 min. e deixe secar ao ar.
    2. Coloque gotas de matr extracelular diluídomateriais ix (ECM) de revestimento de proteína sobre uma folha de Parafilm (por exemplo, 150-250 mL / gotícula da laminina de 10 ug / ml dissolvido em solução tampão de fosfato estéril [PBS]). Distribua as gotas para que lamelas não vai tocar quando colocada sobre essas gotículas. Delicadamente, coloque cada lamela seca em uma gota com a pinça.
    3. Deixe as lamelas sobre as gotas de aprox. 4-6 horas dentro da capa de cultura com a faixa fechada.
    4. Coloque as lamelas revestidas com MEC (revestido de ECM secundários acima) em cada um dos poços de uma placa de 24 poços. Lavar cada poço com 3 x PBS estéril e manter a 4 ° C até ser necessário.
  2. Preparação da glia As células para plaqueamento em Lamelas.
    1. Aspirar a mídia das culturas gliais e lavar cuidadosamente as 3x monocamada gliais com 10 ml de PBS estéril. Em seguida, adicionar 8-10 ml de solução de tripsina-EDTA para o T-175, e incubar durante 5-10 min a 37 ° C.
    2. Quando a maioria da monocamada foi individual, adicionar 20 ml de meio completoao frasco para parar a tripsinização. Recolher os meios contendo as células isoladas num tubo de 50 ml e girar durante 10 min a 300 xg à temperatura ambiente.
    3. Aspirar o sobrenadante sem perturbar o sedimento, e, em seguida, re-suspender as células em 2 ml de meio completo fresco pipetando suavemente a solução usando uma pipeta P1000.
    4. Determinar o número de células utilizando um hemocitómetro e, em seguida, re-suspender as células em meio completo com uma densidade desejada (por exemplo 10 5 células / ml). Placa as células nas lamelas de cobertura revestidas com ECM (por exemplo, 500 ul em cada poço da placa de 24 poços). Adicionar meio completo fresco adicionais a cada poço para 3-5 dias de incubação a 37 ° C, ou até que as células crescer até à confluência desejado visual.
  3. O tratamento com Psicosina.
    1. Reconstituir o psicosina a uma concentração de estoque (108,3 mM) em dimetil sulfóxido (DMSO). Diluir esse estoque em 100% EtOH para fazer um estoque de trabalho que pode on ser adicionado em cada poço da placa de 24 poços para atingir uma concentração final de 10 uM.
    2. No momento da adição do psicosina, agite suavemente a placa de cultura para misturar o psicosina em meios de cultura. Suplementar o psicosina adicionando o equivalente a 10 uM em dias alternados durante uma semana.
  4. Após 7 dias de tratamento psicosina, recolher os meios de comunicação e de pipeta 500 mL de frio paraformaldeído 4% (PFA) em cada poço. Incubar à temperatura ambiente durante 20 minutos para fixar as células. Em seguida, lavar cada poço 3 vezes com PBS e, em seguida, manter as placas a 4 ° C até serem processadas para imunocitoquímica (ver abaixo).
    NOTA: meios de cultura de células podem ser recolhidas para enzimática ou ensaio ELISA, neste ponto, se desejado.

3. Imunocitoquímica (ICC) para visualizar Globóides Células

  1. Substituir PBS com tampão [PBS + 0,3% de Tween-20 + 5% de soro normal de cabra (NGS)] de bloqueio, e incuba-se as células durante 1 h à temperatura ambiente.
  2. EmCubate as células fixadas em anti-soros contra o primário Iba-1 [(1: 1000), diluído em PBS + 0,3% de Tween-20 + 2% de NGS] durante pelo menos 1 hora à temperatura ambiente, em seguida lavar cada poço com PBS 3 x 5 min / lavar.
  3. Adicionar o anticorpo secundário conjugado de fluorescência adequado para identificar a marcação de anticorpos e anti-mancha principal com 4 ', 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI, 1: 1000) para identificar os núcleos. Incubar em solução de anticorpo secundário durante 1 h à temperatura ambiente e lava-se com PBS, 3x 5 minutos.
  4. Monte cada lamela a lâminas de microscópio utilizando um meio de montagem. Exibir slides em um microscópio de fluorescência para análise visual e quantitativa.

4 Análise e caracterização de células Globóides em cultura primária

  1. Use as três seguintes critérios morfológicos para identificar uma célula Globóides na cultura:
    1. Identificar células Globóides usando microscopia de fluorescência através da marcação imunoistoquímica para o marcador de microglia, Iba-1 +.
    2. IdentificarGlobóides como células polinucleadas (isto é, contendo dois ou mais núcleos positivos DAPI).
    3. Identificar células Globóides por uma morfologia arredondada distinta da aparência muito ramificado de descansar micróglias.
      NOTA: As células também podem ser recolhidos para análise de marcadores de superfície das células e quantificação por citometria de fluxo a partir de destas culturas.
  2. Medir a ativação fagocitária de microglia e células Globóides
    1. Para avaliar a atividade fagocítica de microglia tratados com psicosina, adicione esferas de látex FITC identificados nos poços, de acordo com as instruções do fabricante. Adicionar pérolas de látex fluorescentes conjugados 48 horas antes da fixação com PFA. Corrigir as células tratadas com pérolas (como mencionado na seção 2.4), e processo para imunocitoquímica (como descrito na seção 3).
    2. Seleccionar anticorpos secundários fluoróforos de modo que eles não se sobreponham os espectros de emissão de fluorescência do fluoróforo às contas de rotulado.
    3. Analyze os perfis de fagoc�ica Iba-1 + microglia por identificação das células que co-localizados com os grânulos fluorescentemente marcado.
      NOTA: Psicosina ativará microglia. Grânulos fagocitados serão identificados dentro Iba-1 células mononucleares e multinucleadas + neste cenário cultura.

5. indução de células Globóides de culturas puras Microglial

Observação: Uma abordagem alternativa para decifrar a sinalização intercelular entre astrócito e microglia é outra vantagem deste modelo in vitro de células globoso. A purificação de células microgliais primárias para replating ou de co-cultura pode ser obtida pela sua propriedade de aderência inferior em cultura, tal como descrito nos passos seguintes (ver Secção 5.2).

  1. Recolha a mídia das culturas gliais mistas confluentes em tubo de 50 ml e mantê-la a 37 ° C na incubadora.
  2. Isolamento da microglia de culturas mista glial primários.
    1. Depois de remover a mídia de uma garrafa mista confluente T175 cultura glial, adicionar mídia agitação quentes [consistindo de mídia completo + 25 mM 4 (2-hidroxietil) -1-piperazina (HEPES) de bicarbonato de sódio + 25 mM (Sigma)]. Agitar os frascos durante 3-4 horas num agitador orbital a 100 rpm (37 ° C). Recolha os media destes frascos agitados em 50 ml tubos cônicos.
      NOTA: Este suporte vai incluir a microglia menos aderente dos frascos.
    2. Girar os meios de comunicação a 300 xg durante 10 min à temperatura ambiente. Aspirar o sobrenadante e voltar a suspender as células em 2 ml do meio condicionado de astrócitos (coletados na etapa 5.1).
    3. Estabelecer o número de células obtidas utilizando um hemocitômetro e depois a chapa micróglias em lamelas revestido de substrato (ver secção 2.1) para imunocitoquímica ou placa na ULTRALOW placas aderência bem para o futuro conjunto de células Globóides para co-cultura com outros tipos de células, tais como oligodendrócitos (como described na seção seguinte).
      NOTA: Uma vez banhado a microglia pode ser tratada com psicosina (10 mM), como descrito acima (ver secção 2.3).
  3. Co-cultura com Primários Oligodendrócitos para Análise de citotoxicidade.
    NOTA: Recolha de microglia tratado psicosina das baixas para as placas de aderência subsequente co-cultura em culturas primárias de oligodendrócitos, ou células progenitoras de oligodendrócito, pode ser utilizado para examinar o potencial citotóxico função destas células-globoso, como in vitro.
    1. Desenvolver culturas de oligodendrócitos primário utilizando métodos estabelecidos 18,20. Para recolher a microglia tratado psicosina, pipetar suavemente para separar as células fracamente aderentes a partir do fundo dos poços. Recolher as células, centrifugar a 300 xg durante 10 min, e em seguida ressuspender cuidadosamente em meios de diferenciação de oligodendrócitos [composto de meios Neurobasal, L-glutamina (1x), B-27, suplemento (1x) e triiodotironina (T3, 10 ng / mL )].
    2. Conte o número de células utilizando um hemocitómetro e as sementes, em seguida, para a cultura de microglia oligodendrócitos a 1 x 10 5 células / ml, resultando num aproximada proporção de 1: 2 a microglia / oligodendrócito. Incubar como uma co-cultura durante 3 dias.
    3. Fixar as células para imunocitoquímica (ver secção 2.4). Recolhe meios de cultura de células para o ELISA ou análises químicas, conforme necessário.

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Representative Results

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Este protocolo, como está escrito, deverá ter cerca de 36 dias para ser concluído do início ao fim (veja a Figura 1: Esquema de Fluxo de Trabalho Experimental). Tem sido nossa experiência que o desenvolvimento de células "Globóides-like 'neste sistema de cultura primária é confiável e reprodutível: a formação de células multinucleadas em resposta a psicosina é observado de forma consistente com 7 dias de tratamento.

Coloração imunocitoquímica de microglia usando Iba-1 em conjunto com um contra-coloração nuclear vai permitir a identificação de grandes, arredondadas células multinucleadas (Figura 1b). Em alguns casos, o conteúdo nuclear nestas células Globóides-like aparecerá com núcleos distintos. No entanto, em muitas instâncias, o aumento do tamanho total do núcleo reflecte o estado destas células multinucleadas (Figura 1b). O número de células Globóides-como pode variar a partir de campo visual de campo visual,mas é interessante notar que a proporção de células Globóides formado in vitro representa <5-10% da população total de células da microglia. Também é importante salientar que o tratamento psicosina também evoca uma activação generalizada de microglia (por exemplo, aumento mensurável na actividade fagocítica) que ocorre em resposta a tratamento Psicosina entre microglia e as células mononucleadas Globóides multinucleadas (GCs) nestas culturas. Tal como mostrado na Figura 1c, perfis fagociticamente activas de Iba-1 + microglia pode ser facilmente identificado quando colocados em co-cultura com as células progenitoras de oligodendrócito (OPCs).

Este sistema de cultura de células é susceptível de manipulação experimental como um meio para avaliar a biologia de células Globóides. Por exemplo, demonstramos recentemente um novo papel para a protease extracelular, metaloproteinase-3 (MMP-3 / estromelisina-1) como um mediador importante da formação de GC induzida por psicosina usando este culensaio ture 15.

Figura 1
Figura 1:. Fluxo de trabalho experimental para cultura primária in vitro de modelo celular Formação Globóides (A) Diagrama de fluxo que descreve os passos principais e os tempos de intervenção (em dias) para o desenvolvimento das células em cultura Globóides. Cada passo é marcado com a sua secção de texto associado a partir do protocolo. Esse fluxo de trabalho fornece uma progressão lógica do misto (astrócitos e microglia culturas, Seção 1) e de uma cultura de partida alternativo de microglia purificado (Seção 5) (B) coloração immuncytochemical Representante de uma célula microglial multinucleadas após 7 dias consecutivos de psicosina (10. mM tratamento) identificado pela Iba1 (verde) e DAPI (azul). (C) Exemplo de células fagocíticas microglial presuntivo (verde) a seguir ao tratamento psicosina em co-cultura com OLIG2 + (vermelho) OPC. Barra de escala (no painel B) = 90 mm ​​para 'B' e = 150 mm para 'C'. Clique aqui para ver uma versão maior da Figura 1B, e aqui para ver uma versão maior da Figura 1C.

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Discussion

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O protocolo aqui descrito fornece um novo sistema modelo para estudar o desenvolvimento e caracterização funcional de microglia ativados e células Globóides. Trabalhos anteriores por Im et al. utilizando uma linha celular HEK293 fornecido um modelo para o desenvolvimento do presente protocolo para o estudo da formação de células globoso 21. É também importante salientar que as células derivadas Globóides no modelo diferem das células nativas Globóides identificáveis ​​em GLD. Por exemplo, temos observado rotineiramente quadranucleation de microglia em nossas culturas murino, enquanto as células Globóides em GLD têm sido frequentemente observados contendo mais de 10 núcleos. Em segundo lugar, as células Globóides formadas no sistema in vitro também são pequenos em diâmetro, em comparação com as observadas in vivo. Há provavelmente várias razões para estas diferenças fenotípicas que podem incluir a relativa simplicidade do sistema de cultura utilizado. Por exemplo, já não háneurónios ou oligodendrócitos presentes durante a fase de indução da formação de células globoso usando este procedimento glial cultura primária. Além disso, a temporização do protocolo de sete dias produz uma densidade significativa de células Globóides; No entanto, tempos de tratamento mais longos podem aumentar ainda mais a semelhança das células Globóides murino formadas por este protocolo com os recursos nativos de células Globóides observados em GLD.

Uma característica importante deste modelo é que ele usa culturas gliais mistos primários, que incluem tanto os astrócitos e microglia 15,19. Esta é uma importante vantagem deste modelo celular Globóides para a sua utilidade na avaliação das contribuições e interação entre astrócitos e microglia. Ambos os tipos de células não-myelinating são ativados em GLD, embora suas funções nesta doença são, até agora, mal caracterizado. É importante ressaltar que tínhamos anteriormente determinado que os astrócitos em GLD expressam níveis mais elevados de MMP-3 expressão e que este presumivelmente astrócitos-derivfator ed é crítica para a transformação da microglia, em resposta a psicosina. As aplicações futuras deste modelo in vitro de formação de células Globóides poderia envolver culturas quiméricos de astrócitos e microglia de origens genéticas diferentes, que poderiam ser utilizados para fazer avançar nossa compreensão das contribuições específicas de células para os efeitos patogênicos da psicosina na microglia.

Em resumo, este protocolo proporciona uma nova abordagem para o estudo da patogênese da GLD. O papel das células Globóides foi enigmático e hipóteses sobre as suas funções de proteção ou deletérios em GLD têm sido propostas. A identificação precoce de células Globóides na história natural de GLD apoiaria ainda mais a nossa visão no momento que a ativação da microglia em GLD são uma resposta patogênica primária e um mediador provável de mielina patologia nesta doença. A adaptação deste sistema modelo in vitro é esperado para promover nossa compreensão sobre o e celulartiology de GLD.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hank’s balanced salt solution (HBSS) containing no cations (Mg2+ and Ca2+). Life technologies 14175-095
Neural Tissue Dissociation Kit Miltenyi 130-092-628
40 μm cell-strainer Fisherbrand 22363547
Hank’s balanced salt solution (HBSS) containing cations (Mg2+ and Ca2+). Gibco 14025-092
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) Gibco 11995-065
fetal bovine serum (FBS) Atlanta Biologicals S11150
Penicilin/Streptomycin Life technologies 15070-063
Laminin Sigma L2020
Trypsin-EDTA solution Life technologies 25299-056
Psychosine Sigma P9256
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D2650
Paraformaldehyde (PFA) Electron Microscopy Science 19208
Normal Goat Serum (NGS) Invitrogen PCN5000
Iba-1 WAKO 019-19741
Alexa Fluor conjugated antisera Life Technologies Various
Mounting Media Southern Biotech OB100-01
Phagocytic Assay Kit Cayman Chemicals 500290
HEPES Sigma BP310-500

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References

  1. Rafi, M. A., Luzi, P., Chen, Y. Q., Wenger, D. A. A large deletion together with a point mutation in the GALC gene is a common mutant allele in patients with infantile Krabbe disease. Hum Mol Genet. 4, 1285-1289 (1995).
  2. Duffner, P. K., et al. The long-term outcomes of presymptomatic infants transplanted for Krabbe disease: report of the workshop held on July 11 and 12. Genet Med. 11, Holiday Valley, New York. 450-454 (2008).
  3. Duffner, P. K., Jalal, K., Carter, R. L. The Hunter's Hope Krabbe family database. Pediatr Neurol. 40, 13-18 (2009).
  4. Duffner, P. K., et al. Newborn screening for Krabbe disease: the New York State model. Pediatr Neurol. 40, 245-252 (2009).
  5. Krabbe, K. A new familial, infantile form of brain sclerosis. Brain. 39, 74-114 (1916).
  6. Percy, A. K., Odrezin, G. T., Knowles, P. D., Rouah, E., Armstrong, D. D. Globoid cell leukodystrophy: comparison of neuropathology with magnetic resonance imaging. Acta Neuropathol. 88, 26-32 (1994).
  7. Itoh, M., et al. Immunohistological study of globoid cell leukodystrophy. Brain Dev. 24, 284-290 (2002).
  8. Reddy, A. S., Patel, J. R., Vogler, C., Klein, R. S., Sands, M. S. Central nervous system pathology progresses independently of KC and CXCR2 in globoid-cell leukodystrophy. PLoS One. 8, (2013).
  9. McNally, A. K., Anderson, J. M. Macrophage fusion and multinucleated giant cells of inflammation. Adv Exp Med Biol. 713, 97-111 (2011).
  10. Kaneko, Y., Kitamoto, T., Tateishi, J., Yamaguchi, K. Ferritin immunohistochemistry as a marker for microglia. Acta Neuropathol. 79, 129-136 (1989).
  11. Graeber, M. B., Streit, W. J., Kreutzberg, G. W. The microglial cytoskeleton: vimentin is localized within activated cells in situ. J Neurocytol. 17, 573-580 (1988).
  12. Kondo, Y., Adams, J. M., Vanier, M. T., Duncan, I. D. Macrophages counteract demyelination in a mouse model of globoid cell leukodystrophy. J Neurosci. 31, 3610-3624 (2011).
  13. Pollanen, M. S., Brody, B. A. Fetal globoid cell leukodystrophy. Arch Pathol Lab Med. 114, 213-216 (1990).
  14. Martin, J. J., et al. Fetal Krabbe leukodystrophy. A morphologic study of two cases. Acta Neuropathol. 53, 87-91 (1981).
  15. Ijichi, K., et al. MMP-3 mediates psychosine-induced globoid cell formation: Implications for leukodystrophy pathology. Glia. (2013).
  16. Pellegatta, S., et al. The therapeutic potential of neural stem/progenitor cells in murine globoid cell leukodystrophy is conditioned by macrophage/microglia activation. Neurobiol Dis. 21, 314-323 (2006).
  17. Crocker, S. J., Milner, R., Pham-Mitchell, N., Campbell, I. L. Cell and agonist-specific regulation of genes for matrix metalloproteinases and their tissue inhibitors by primary glial cells. Journal of Neurochemistry. 98, 812-823 (2006).
  18. Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. J Vis Exp. (2013).
  19. Crocker, S. J., Frausto, R. F., Whitton, J. L., Milner, R. A novel method to establish microglia-free astrocyte cultures: comparison of matrix metalloproteinase expression profiles in pure cultures of astrocytes and microglia. Glia. 56, 1187-1198 (2008).
  20. Moore, C. S., et al. Astrocytic Tissue Inhibitor of Metalloproteinase-1 (TIMP-1) Promotes Oligodendrocyte Differentiation and Enhances CNS Myelination. J Neurosci. 31, 6247-6254 (2011).
  21. Im, D. S., Heise, C. E., Nguyen, T., O'Dowd, B. F., Lynch, K. R. Identification of a molecular target of psychosine and its role in globoid cell formation. J Cell Biol. 153, 429-434 (2001).
Um<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo para o Estudo da Cellular Fisiopatologia em Globóides Leucodistrofia celular
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Claycomb, K. I., Johnson, K. M., Bongarzone, E. R., Crocker, S. J. An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy. J. Vis. Exp. (92), e51903, doi:10.3791/51903 (2014).More

Claycomb, K. I., Johnson, K. M., Bongarzone, E. R., Crocker, S. J. An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy. J. Vis. Exp. (92), e51903, doi:10.3791/51903 (2014).

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