Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

Bir doi: 10.3791/51903 Published: October 21, 2014

Abstract

Globoid hücre lökodistrofi (GLD) merkezi sinir sisteminde benzersiz bol miktarda globoid hücreler olarak adlandırılan, çok-çekirdekli mikroglia işlevi tam, açık değildir. Bilginin bu boşluk çalışma için bir in vitro model uygun olmaması ile engellenmiştir. Bu yazıda, bir ilköğretim kemirgen glial kültür sistemi açıklanmaktadır GLD bulunan karakteristik globoid hücrelerini andıran mikroglianın multinükleasyon içinde psychosine sonuçları ile hangi tedavi olarak. Bu roman sistemi kullanarak, biz globoid hücrelerin çalışması için koşulları ve analiz modları tanımlanır. Bu model sisteminin potansiyel kullanım matriks metalloproteinaz (MMP) için potansiyel bir rol tespit önceki çalışmamızda, geçerliliği -3 GLD içinde. Vitro sistemde bu yeni bu eşsiz hücrelerin oluşumu ve işlevi, hem de potansiyel tedavi edici işleme, çalışılacak yararlı bir model olabilir.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Ayrıca, Krabbe hastalığı olarak da bilinir globoid hücre lökodistrofi (MP), galatocerebrosidase (galc) geni 1 mutasyonlar işlev kaybı olmasından kaynaklanan öldürücü bir demiyeline eden bir hastalıktır. GLD en yaygın şekli, erken çocukluk döneminde başlayan verebiliriz ve genellikle yaş 2,3 beş yaşından önce motor ve erken ölüme yol açan bilişsel gerileme agresif bir klinik seyri ile karakterizedir infantil çeşididir. Genetik test GLD 4 tanısını doğrulamak için kullanılır. GLD Nöropatoloji globoid hücreler 5-7 adlandırılan yaygın demiyelinasyon, nöronal atrofi, ve astrogliyozun tıkanmış çok çekirdekli mikroglia varlığını ortaya koymaktadır. Bu göze çarpan hücrelerinin spesifik işlevi belirsiz kalmıştır rağmen bunların sitoplazmalarında tubulous inklüzyonları içeren globoid hücrelerin tanımlanması, son 97 yıldır GLD belirleyici bir özelliğidir.

Olmayan MYEL katılımlarıGLD patogenezinde bertaraf eder glial (mikroglia ve astrositler) bu kadar uzun süre hastalık 8 derin demiyelinasyon ikincil yanıt olarak kabul edilmiştir. İlginçtir, 1916 5 Knud Krabbe tarafından yapılan bu hastalığın ilk açıklama, adını almış lipit enkaz içeren çok çekirdekli fagositlerin bildirdi oluşumu 'hücreleri GLOBOID' ve bu hastalığın belirleyici bir özelliği vardır.

GLD rollerini uzun ihmal edilmiş olsa Globoid hücreleri, GLD patoloji damgasını özelliğidir. İlginç bir şekilde, bu hücreler GLD CNS dokusunun bir erken karakteristik değişikliklere arasındadır. Bu bilgi eksikliği nedeniyle çok çekirdekli fagositler, diğer hastalıklar olarak adlandırılan dev hücrelerin oluşumu, tipik olarak, bir ilk patojenik itici gücü 9 daha patoloji sonucu olarak kabul edilir olduğu varsayımına olabilir. Bu nedenle, WHI tarafından mekanizmasını araştıran az sayıda çalışma vardırkanal globoid hücreleri özellikle GLD CNS'de, fagositoz oluşturulur. Bu raporda açıklanan prosedür CNS'de globoid hücre formasyonunun önemi ve fagositik aktivite daha yüksek seviyede sergilediği in vitro mikroglia ve bu hücrelerin bu psychosine kaynaklı multinükleasyon önceki gösteri odaklanmaktadır. Bu gözlemlerle tutarlı olarak, titrek beyinlerinde globoid fagositik hücreleri sıklıkla yüksek düzeyde aktivite gösteren, PAS pozitif kalıntı içermektedir. Globoid hücreler de ferritin için immünopozitif bulunmuştur (Mikroglia işaretleyici) 10, KP-1 / CD68 (bir monosit işaretleyici), ve biraz da vimentin için pozitif (bir ara filament proteini ve astrositlerde işaretleyici ve aktif mikroglia) 11, HLA DRA (MHC II bir yüzey reseptörü) ve TNF-α 7 ve IBA-1 12 (mikroglia tanımlamak için kullanılan bir kalsiyum bağlayıcı protein). Belirteçlerin bu koleksiyon dayanarak, globoid hücreleri geliştirmek mikrogliada kaynaklananeşsiz bir fenotip.

Onların teklik rağmen, belirli bir işlevi ve GLD patogeneze GClerin katkısı büyük ölçüde gözardı edilmiştir. Globoid hücreleri kronik bir demyelinizasyon ikincil sonucu olarak düşünülmektedir. Ancak, GLD beyaz cevher patoloji globoid hücrelerin zamansal ilişkiyi ele geçmiş çalışmaların erken doğum sonrası dönemlere geç embriyonik içinde globoid hücrelerin varlığını tespit ettik; olgodendrosit apoptoz ve aleni demiyelinizasyonu 13 önceki kez. Böylece gld içinde nöropatolojinin gelişme zamansal dizisi globoid hücreleri bu hastalığın 14 demyelinasyon önceden oluşturulmuş olduğunu göstermektedir. Bu GLD içinde globoid hücrelerin erken oluşumu olgodendrosit hasar 15 ikincil reaktif tepki yerine tanımlayan bir patojenik olayı temsil edebilir bizim hipoteze. Ayrıca, GLD mikrogliyal aktivite düzensizliği facto bir kabul edilmiştirR, bu hastalığın tedavi edilmesi için 16 hematopeotic kök hücre tedavilerinin uzun vadeli etkisini azaltır. Böylece, psychosine yanıt hücresel fonksiyonları ve mikroglianın düzenleme ve globoid hücreleri, soruşturma GLD patogenezinde yeni anlayışlar sağlaması bekleniyor.

Yakın zamana kadar, globoid hücre oluşumunu incelemek için uygun bir modelin eksikliği kesin fonksiyonu ve GLD patolojiye bu hücrelerin katkı anlayış olamadı. Son zamanlarda yapılan araştırmalarda, bu globoid benzeri hücreler gld biriken patojenik toksin lipit psychosine doğrudan tepki olarak oluşturulabilir olduğu belirlenmiştir. O mikroglia değil, ancak makrofajlar, aktive edilmiş ve 15 psychosine karşılık olarak birincil kültürde globoid glial hücrelere transforme edilir. Globoid hücrelere Bu dönüşüm, hücre dışı proteaz, matris metaloproteinaz (MMP) -3 15 aracılık ettiği bulunmuştur. Daha yakın zamanlarda,Bu in vitro model sisteminde geliştirilen psychosine-aktif mikroglia ve globoid hücreler genişletilmiş ve bu bulguları belirledikten oligodendrosit ve oligodendrosit projenitör hücreler için potansiyel olarak toksik değildir. Bu nedenle, GLD, psychosine ve bu hastalıkta mikroglia için, ortaya çıkan ilk ve muhtemelen patojenik bir rol destekleyecektir demiyelinasyon önce globoid hücrelerinin oluşumunun erken birikimi bağlamında dikkati çekmektedir.

Biz bu hastalığın anlaşılmasına katkıda bulunacaktır GLD patogenezi hakkında yeni bilgiler ortaya çıkacaktır globoid hücresi oluşumu bu çalışmayı öneriyorum. Dahası, GLD bu yeni hücresel modelin yeni tedavi yaklaşımları, bu hastalığın patolojik değişiklikler test edilebilir hitap hangi yeni bir biçimi sağlayabilir. Bu nedenle, bu raporda non-myelinating glia primer kültürlerinde psychosine kaynaklı globoid hücrelerinin in vitro olarak geliştirilmesi için ayrıntılı bir protokol sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Hayvanları ile ilgili tüm prosedürler Insancıl Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanımına İlişkin Politikasına uygun olarak yapıldı Laboratuvarı Hayvan Refahı Dairesi (NIH) tarafından ve yalnızca Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) onayı ile belirlenen Connecticut Sağlık Merkezi.

Karışık Glial Kültürler 1. Hazırlık

  1. Kullanmadan önce tüm aletleri sterilize edin. Soğuk muhafaza etmek için buz üzerinde muhafaza üç steril, 60 mm Petri tabaklarına (Mg 2 + ya da Ca +2) herhangi bir katyonları içeren buz soğukluğunda steril Hank dengeli tuz çözeltisi (HBSS) 3 ml ilave edilir.
  2. Daha önce 17,18 açıklandığı gibi, doğum sonrası P0-P2 fare yavrularından korteks izole eder.
    NOT: Hipokampuslardan gibi subkortikal yapıları, bu kültürlerde dahil değildir.
  3. Bir pı kullanarak, dikkatlice meninksler kaldırmak ve daha sonra taze HBSS'nin için izole korteks aktarmak ve enzimatik dokuları ayırmaküreticinin protokolüne uygun olarak ural doku diseksiyon kiti.
  4. Plaka steril, T-175 şişeleri içine hücre ve ortam içinde bir gece boyunca inkübe [Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle ortamı 1 x penisilin / streptomisin ve% 10 fetal sığır serumu ile (FCS) (FBS)].
  5. Taze medya ile ertesi gün tüm medyayı değiştirin. Yaklaşık 3 hafta süreyle veya bir hücresel mono-katman kurulana kadar, normal ortam değişiklikleri ile kültürleri inkübe devam edin.
    Not: 1 oranında 19: Bu tek-katmanın, yaklaşık 10, astrositler ve mikroglia oluşacaktır.

Karışık Glial Kültürlerde 2. Globoid Hücre İndüksiyon

  1. ECM-kaplı lamelleri hazırlayın.
    1. 30 dakika boyunca Steril bir Petri tabağında steril 1 N hidroklorik asit (HCI) olan dairesel lamelleri ıslatın. Steril su 3x lamelleri yıkayın ve sonra en az 20 dakika boyunca% 95 EtOH içinde bekletin. ve sonra hava kurumaya bırakın.
    2. Sulandırılmış dışı MATR Yeri damlacıklarıParafilm bir levha üzerine ix (ECM), protein bir kaplama maddesi (ml steril fosfat tampon çözeltisi içinde çözüldü, laminin 10 ug / örneğin, 150-250 ul / damlacık [PBS]). Bu damlacıklar üzerine yerleştirildiğinde lamelleri dokunmaz böylece damlacıkların dağıtın. Yavaşça forseps kullanarak bir damlacık üzerine her kurutulur lamel yerleştirin.
    3. Yaklaşık damlacıklarının lamelleri bırakın. Kanat ile kültürü kaputu içinde 4-6 saat kapalı.
    4. 24 oyuklu plakanın oyuklarından her ECM içine kaplı lamelleri (ECM ile kaplanmış tarafı) yerleştirin. Steril PBS içinde 3 kat ile de her bir yıkama, ve gerekli olana kadar, 4 ° C'de tutun.
  2. Lameller üzerine Kaplama için Glial hücreler hazırlanıyor.
    1. Glial kültürlerden ortamı aspire ve yavaşça steril, 10 ml PBS ile glial tek tabaka 3 kez yıkayın. Ardından, T-175 8-10 ml tripsin-EDTA çözeltisi ekleyin ve 37 ° C'de 5-10 dakika süreyle inkübe edin.
    2. Tek tabaka en ayrıldıktan sonra, tam bir ortamda 20 ml ekleyinşişeye tripsinizasyon durdurun. 50 ml'lik konik bir tüp içine müstakil hücreleri ihtiva eden ortam toplayın ve oda sıcaklığında 300 x g'de 10 dakika boyunca dönerler.
    3. Yavaşça P1000 pipeti kullanılarak çözeltisinin pipetlenmesiyle taze tam ortam, 2 ml hücrelerin yeniden askıya daha sonra pelet bozmadan süpernatanı havalandırın, ve.
    4. Istenen yoğunluğa (ör: 10 5 hücre / ml) tam ortam içinde hücrelerin askıya ve sonra tekrar bir hemositometre kullanılarak hücre sayısını belirlemek. ECM ile kaplanmış lamelleri (24 oyuklu plakanın her oyuğuna örneğin 500 ul) üzerine hücreleri Plate. 37 ° C'de inkübasyon her bir göze, 3-5 gün boyunca ek taze tamamlanmış ortam ekleyin, ya da hücrelerin istenilen görsel ortak akışa kadar büyümeye kadar.
  3. Psychosine ile tedavi.
    1. Bir stok konsantrasyonu dimetil sülfoksit (108,3 mM) içerir (DMSO) psychosine sulandırın. Bir çalışma stoğu elde etmek üzere% 100 EtOH içinde bu stokunu çıkarabilenn, 10 uM'lik bir son konsantrasyon elde etmek için 24 oyuklu plakanın her bir oyuğuna ilave edilebilir.
    2. Psychosine eklenmesi zamanda, kültür ortamı içine yavaşça psychosine karıştırmak için kültür plakası girdap. Bir hafta boyunca 10 uM her gün eşdeğer ekleyerek psychosine Ek.
  4. Psychosine tedaviden 7 gün sonra, ortam ve her kuyuya, soğuk% 4 paraformaldehit (PFA) pipetle 500 ul toplamak. 20 dakika sonra, hücrelerin tespit edilmeleri için oda sıcaklığında inkübe edilir. Daha sonra, her bir göze, PBS ile yıkayın ve 3x (aşağıya bakınız) İmmünositokimya için işlenene kadar 4 ° C'de plakalar tutun.
    Not: istenirse hücre kültür ortamı, bu noktada enzimatik ya da ELISA tahlili için toplanabilir.

3. İmmünositokimya (ICC) Globoid Hücreleri Visualize'a

  1. Buffer [PBS +% 0.3 Tween-20 +% 5 normal keçi serumu (NGS)] bloke PBS ile değiştirin ve oda sıcaklığında 1 saat için kuluçkalayın.
  2. InIBA-1 karşı yapılan ilk antisera olarak sabit hücreler cubate [(1: 1000) PBS içinde seyreltilmiş + 0.3 +% 2 NGS% Tween-20], oda sıcaklığında en az 1 saat, daha sonra, PBS ile 5 dakika 3x, her oyuğa yıkama / yıkayın.
  3. Çekirdekleri tespit etmek: 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI 1000, 1) sahip antikor etiketleme ve karşı leke birincil tanımlamak için uygun bir ikincil floresan-konjuge antikor ekleyin. Oda sıcaklığında 1 st için bir ikincil antikor çözeltisi içinde inkübe ve PBS ile 5 dakika 3x ile yıkayın.
  4. Bir montaj orta kullanarak slaytlar mikroskop her coverglass monte edin. Görsel ve kantitatif analizler için bir floresan mikroskop gör slaytlar.

4. Analiz ve İlköğretim Kültür Globoid Hücrelerinin Karakterizasyonu

  1. Kültüründe globoid hücreyi tanımlamak için aşağıdaki üç morfolojik kriterleri kullanın:
    1. , Mikrogliyal işaretleyici için immünopozitif etiketleme tarafından İba-1 + floresan mikroskobu kullanarak globoid hücreleri tanımlayın.
    2. Belirlemek-çekirdekli (örneğin iki ya da daha DAPI pozitif çekirdeklerin) halinde globoid hücreleri.
    3. Mikroglial hücrelerinde dinlenme yüksek ölçüde dallanmış görünümünü farklı yuvarlak bir morfolojisi ile globoid hücrelerin belirlenmesi.
      Not: Hücreler, aynı zamanda bu kültürlerden akış sitometrisi ile hücre yüzey markör analizi ve miktar tayini için toplanabilir.
  2. Mikroglia ve globoid hücrelerinin fagositik aktivasyonunu ölçülmesi
    1. Psychosine ile muamele mikroglia fagositik aktivitesini değerlendirmek için, üreticinin talimatlarına uygun olarak kuyu FITC ile işaretlenmiş lateks boncuk ekleyin. Önceden PFA ile tespit için flüoresan konjuge edilmiş lateks boncukları 48 saat ekleyin. (3. bölümde açıklandığı gibi) immünsitokimya (2.4 bölümde belirtildiği gibi) boncuklarla işlenmiş hücreleri, ve süreç Fix.
    2. Bunlar fluorofor etiketli boncukların floresan emisyon spektrumlarına örtüşmeyen böylece fluorofor-konjuge sekonder antikor seçin.
    3. AnalyzE Bu hücrelerin belirlenmesi ile IBA-1 + mikroglia phagocytotic profilleri floresan etiketli boncuklar ile birlikte lokalize.
      NOT: Psychosine mikroglianın aktive edecektir. Fagosite boncuk bu kültür ortamında mononükleer ve çok çekirdekli İba-1 + hücreleri içinde tespit edilecektir.

Saf Mikroglial KÜLTÜRLERİNDEN Globoid Hücreleri 5. İndüksiyon

Not: astrosit ve mikroglia arasında hücreler arası sinyal deşifre alternatif bir yolu, in vitro globoid hücre modelinin bir diğer avantajdır. Aşağıdaki adımlardan (Bölüm 5.2) de tarif edildiği gibi ya da ko-şarjı kültür için ana mikroglial hücrelerinin saflaştırılması, kültür içerisinde daha düşük bir yapışma özelliği elde edilebilir.

  1. 50 mL konik tüp içine birleşik karışık kültürlerden glial ortamı toplayın ve inkübatör içinde 37 ° C'de korumak.
  2. İlköğretim Karışık Glial KÜLTÜRLERİNDEN Mikroglial İzolasyon.
    1. Konfluent karışık kültür glial T175 şişesi ortamı çıkarılmasından sonra, [+ 25 mM 4-(2-hidroksietil) -1-piperazinetansülfonik asit (HEPES), 25 mM + sodyum bikarbonat (Sigma) ile tam bir ortam maddelerini kapsayan] sıcak çalkalama ortamı eklenir. 100 rpm'de (37 ° C) bir yörüngesel karıştırıcıda 3-4 saat boyunca çalkalama. 50 ml konik tüpler içine bu sarsıldı matara medyayı toplayın.
      NOT: Bu ortam şişelerden daha az yapışık mikroglianın içerecektir.
    2. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g'de ortamı Spin. Astrosit-işlemi görmüş ortam 2 ml hücrelerin yeniden askıya sonra süpernatan aspire ve (adım 5.1 toplanmıştır).
    3. Bir hemasitometre kullanarak ve daha sonra alt-tabaka ile kaplanmış kapak slipleri üzerine mikroglial hücreleri plaka elde edilen hücre sayısını belirlemek için imünosito kimyasal olarak (bakınız bölüm 2.1), ya da diğer hücre tipleri ile ko-kültür için globoid hücre gelecek toplanması için, ultra yapışma gözlü levhalar üzerine plaka, Böyle oligodendrositlerin gibi (azalan olarak) Aşağıdaki bölümde ribed.
      NOT: Bir kez mikroglia (2.3 bölümü) yukarıda tarif edildiği gibi psychosine (10 uM) ile muamele edilebilir kaplama.
  3. Sitotoksisite Analizi için birincil oligodendrositler ile aynı kültür.
    Not: Primer oligodendrosit kültürleri, veya oligodendrosit progenitör hücreler üzerine takip eden ko-kültür için düşük yapışkan plakalardan psychosine ile muamele edilmiş mikroglia toplanması, bu in vitro globoid benzeri hücrelerin sitotoksik potansiyel işlevini incelemek için kullanılabilir.
    1. Kurulmuş yöntemleri 18,20 kullanılarak primer oligodendrositlerin kültürlerini geliştirme. Psychosine ile muamele mikroglia toplamak için, hafifçe kuyu altından gevşek bir biçimde bulunan hücreler ayırmak için pipetleyin. 10 dakika boyunca 300 x g'de, santrifüj hücreleri toplamak, ve daha sonra dikkatli bir şekilde, Neuro temelli ortam oluşan oligodendrosit farklılaşma medya [tekrar süspansiyon, L-glutamin (1x), B-27 ek (1x) ve triiyodotironin (T 3, 10 ng / ml )].
    2. Bir hemasitometre kullanarak hücrelerin sayısını ve daha sonra yaklaşık 1 ile sonuçlanır, 1 x 10 5 hücre / ml oligodendrosit bir kültüre mikroglia tohum: 2 mikroglia / oligodendrosit oranı. En fazla 3 gün boyunca ko-kültür olarak inkübe edin.
    3. Immünsitokimya hücreleri saptamak (bölüm 2.4). ELISA için hücre kültürü ortamı toplayın ya da gerektiği gibi kimyasal analizler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bu protokol, yazılı olarak, bitirmek (: Deneysel Akışı Şeması Bkz: Şekil 1) baştan tamamlamak için yaklaşık 36 gün sürmesi bekleniyor. Bu, birincil kültür sisteminde 'globoid benzeri' hücrelerin gelişimi, güvenilir ve tekrarlanabilir bir nitelikte olduğu deneyim olmuştur: psychosine yanıt olarak çok çekirdekli hücrelerinin oluşumu sürekli tedaviden 7 gün ile görülmektedir.

Büyük bir tespit edilmesine olanak verecektir nükleer karşı-boya ile bağlantılı olarak IBA-1 kullanılarak mikroglia imünositokimyasal lekeleme, çok çekirdekli hücreler yuvarlak (Şekil 1b). Bazı durumlarda bu globoid-benzeri hücreler nükleer içerik farklı çekirdekleri ile görünecektir. Bununla birlikte, bir çok durumda, çekirdeğin boyutu bütün genişleme, bu hücrelerde (Şekil 1b) 'nin çok çekirdekli durumunu yansıtır. Globoid-benzeri hücrelerin sayısı, görme alanı görsel alanda değişebilirama tüpte oluşturulan globoid hücrelerin oranı <toplam Mikroglial hücre popülasyonunun% 5-10 temsil fazlalaştı. Bu psychosine tedavisi de mononükleer mikroglia ve bu kültürlerde çok çekirdekli hücreler globoid (KR) arasında tedavi psychosine tepki olarak ortaya çıkar mikroglia genel bir aktivasyon (fagositik aktivitesi yani ölçülebilir bir artış) uyandırır işaret etmek de önemlidir. Şekil 1c'de gösterildiği gibi oligodendrosit progenitör hücreleri (OPC) ile ko-kültür koymak, IBA-1 + mikroglia phagocytically aktif profilleri kolaylıkla tespit edilebilir.

Bu hücre kültür sistemi globoid hücre biyolojisi değerlendirmek için bir araç olarak deneyden elverişlidir. Örneğin, son zamanlarda hücre-dışı proteaz için yeni bir rolü olduğunu göstermiştir, matris metaloproteinaz-3 (MMP-3 / stromelisin-1) psychosine kaynaklı GC formasyonu önemli bir aracısı olarak Cul kullanılarak,Ture tahlil 15.

Şekil 1
Şekil 1:. Globoid Hücre Formasyonu İlköğretim Kültür in vitro Modeli için Deneysel İş Akışı (A) Akış Şeması birincil aşamalarını gösteren ve kültür globoid hücrelerin gelişimi için (gün) kez müdahale. Her adım, protokol, ilişkin metin kısmında ile etiketlenir. (, Bölüm 1 ve astrosit kültürleri mikroglial) ile arıtılmış, mikroglia (Bölüm 5) (B) 'psychosine bölgesinin birbirini takip eden 7 gün sonra, çok çekirdekli mikroglial hücrenin Örnek immuncytochemical boyama için alternatif bir başlangıç ​​kültürü (10. Bu iş akışı karışık bir makul bir geçiş hem de sağlar Iba1 (yeşil) ve DAPI (mavi) ile tespit edilebilen uM) ile muamelesi. (C) olası fagositik mikroglial hücre örneği (Olig2 + (kırmızı) OPC ile ko-kültür psychosine işlemini takiben) yeşil. (Panel B) Ölçek çubuğu 'C' için 'B' ve = 150 um için 90 mikron =. Şekil 1B daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız ve buradan Şekil 1C daha büyük bir versiyonunu görmek için.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Burada tarif edilen protokol geliştirilmesi ve aktif mikroglia ve globoid hücrelerin fonksiyonel karakterizasyonu incelemek için olan yeni bir model sistemi sağlar. Im ve arkadaşları tarafından önceki iş. Bir HEK293 hücre hattı kullanılarak globoid hücre oluşumu 21 çalışma için mevcut protokol geliştirilmesi için bir şablon sağladı. Bu modelde elde edilen hücreler globoid GLD tanımlanabilir doğal globoid hücrelerden farklı olduğuna işaret etmek de önemlidir. GLD yılında globoid hücreler sıklıkla 10 çekirdeklerin aşan içeren gözlenmiştir iken Örneğin, rutin, bizim kemirgen kültürlerde mikroglianın quadranucleation gözlemledik. In vivo olarak gözlenen ile karşılaştırıldığında İkinci olarak, in vitro sistemde oluşan hücreler aynı zamanda globoid çapı küçüktür. Kullanılan kültür sisteminin görece basit içerebilir, bu fenotipik farklılık için çeşitli nedenleri olması muhtemeldir vardır. Örneğin, herhangi bir oradanöronlar veya bu birincil glial kültür prosedürü kullanarak globoid hücre oluşumu indüksiyon aşamasında mevcut oligodendrositler. Ayrıca, yedi günlük protokolünün triger globoid kayda değer bir hücre yoğunluğu elde edilir; Ancak, uzun tedavi süreleri daha GLD gözlenen globoid hücrelerin yerli özellikleri ile bu protokolü tarafından oluşturulan kemirgen globoid hücrelerinin benzerliği artırabilir.

Bu modelin önemli bir özelliği hem astrositleri ve mikroglianın 15,19 bulunmaktadır primer karma glial kültürler kullanıyor olmasıdır. Bu astrositlerde ve mikroglia arasındaki katkılarını ve etkileşimi değerlendirmede kendi programını bu globoid hücre modelinin önemli bir avantajdır. Bu hastalıkta rolleri olmasına rağmen, henüz çok az karakteristiktir olmayan bu Myelinating hücre tiplerinin her ikisinin de, gld etkinleştirilir. Daha da önemlisi, daha önce GLD olarak astrositler, MMP-3 ekspresyon yüksek seviyelerde ifade etmek ve tespit olan bu muhtemelen astrosit olduğunu İkinciled faktörü psychosine yanıt olarak mikroglia transformasyonu için çok önemliydi. Globoid hücre oluşumu, bu in vitro model Gelecek uygulamalar kimerik astrositlerde kültürlerini ve mikroglia üzerindeki psychosine patojenik etkileri, hücre-spesifik katkıları anlayışımızı ilerletmek için istihdam edilebilir farklı genetik geçmişe sahip mikroglianın istihdam olabilir.

Özetle, bu protokol GLD patojenezini incelemek için yeni bir yaklaşım sağlar. Globoid hücrelerinin rolü anlaşılmaz olmuştur ve GLD kendi koruyucu veya zarar işlevlerine hipotezler ileri sürülmüştür. GLD doğal tarihinin globoid hücrelerin erken belirlenmesi daha GLD mikroglia aktivasyonu primer patojen tepki ve bu hastalıkta miyelin patoloji olası bir arabulucu olduğunu bu zamanda bizim görüşümüzü desteklemektedir. Bu in vitro model sisteminin uyarlanması hücresel e anlayışımızı ilerletmek için bekleniyorGLD tiology.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hank’s balanced salt solution (HBSS) containing no cations (Mg2+ and Ca2+). Life technologies 14175-095
Neural Tissue Dissociation Kit Miltenyi 130-092-628
40 μm cell-strainer Fisherbrand 22363547
Hank’s balanced salt solution (HBSS) containing cations (Mg2+ and Ca2+). Gibco 14025-092
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) Gibco 11995-065
fetal bovine serum (FBS) Atlanta Biologicals S11150
Penicilin/Streptomycin Life technologies 15070-063
Laminin Sigma L2020
Trypsin-EDTA solution Life technologies 25299-056
Psychosine Sigma P9256
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D2650
Paraformaldehyde (PFA) Electron Microscopy Science 19208
Normal Goat Serum (NGS) Invitrogen PCN5000
Iba-1 WAKO 019-19741
Alexa Fluor conjugated antisera Life Technologies Various
Mounting Media Southern Biotech OB100-01
Phagocytic Assay Kit Cayman Chemicals 500290
HEPES Sigma BP310-500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rafi, M. A., Luzi, P., Chen, Y. Q., Wenger, D. A. A large deletion together with a point mutation in the GALC gene is a common mutant allele in patients with infantile Krabbe disease. Hum Mol Genet. 4, 1285-1289 (1995).
  2. Duffner, P. K., et al. The long-term outcomes of presymptomatic infants transplanted for Krabbe disease: report of the workshop held on July 11 and 12. Genet Med. 11, Holiday Valley, New York. 450-454 (2008).
  3. Duffner, P. K., Jalal, K., Carter, R. L. The Hunter's Hope Krabbe family database. Pediatr Neurol. 40, 13-18 (2009).
  4. Duffner, P. K., et al. Newborn screening for Krabbe disease: the New York State model. Pediatr Neurol. 40, 245-252 (2009).
  5. Krabbe, K. A new familial, infantile form of brain sclerosis. Brain. 39, 74-114 (1916).
  6. Percy, A. K., Odrezin, G. T., Knowles, P. D., Rouah, E., Armstrong, D. D. Globoid cell leukodystrophy: comparison of neuropathology with magnetic resonance imaging. Acta Neuropathol. 88, 26-32 (1994).
  7. Itoh, M., et al. Immunohistological study of globoid cell leukodystrophy. Brain Dev. 24, 284-290 (2002).
  8. Reddy, A. S., Patel, J. R., Vogler, C., Klein, R. S., Sands, M. S. Central nervous system pathology progresses independently of KC and CXCR2 in globoid-cell leukodystrophy. PLoS One. 8, (2013).
  9. McNally, A. K., Anderson, J. M. Macrophage fusion and multinucleated giant cells of inflammation. Adv Exp Med Biol. 713, 97-111 (2011).
  10. Kaneko, Y., Kitamoto, T., Tateishi, J., Yamaguchi, K. Ferritin immunohistochemistry as a marker for microglia. Acta Neuropathol. 79, 129-136 (1989).
  11. Graeber, M. B., Streit, W. J., Kreutzberg, G. W. The microglial cytoskeleton: vimentin is localized within activated cells in situ. J Neurocytol. 17, 573-580 (1988).
  12. Kondo, Y., Adams, J. M., Vanier, M. T., Duncan, I. D. Macrophages counteract demyelination in a mouse model of globoid cell leukodystrophy. J Neurosci. 31, 3610-3624 (2011).
  13. Pollanen, M. S., Brody, B. A. Fetal globoid cell leukodystrophy. Arch Pathol Lab Med. 114, 213-216 (1990).
  14. Martin, J. J., et al. Fetal Krabbe leukodystrophy. A morphologic study of two cases. Acta Neuropathol. 53, 87-91 (1981).
  15. Ijichi, K., et al. MMP-3 mediates psychosine-induced globoid cell formation: Implications for leukodystrophy pathology. Glia. (2013).
  16. Pellegatta, S., et al. The therapeutic potential of neural stem/progenitor cells in murine globoid cell leukodystrophy is conditioned by macrophage/microglia activation. Neurobiol Dis. 21, 314-323 (2006).
  17. Crocker, S. J., Milner, R., Pham-Mitchell, N., Campbell, I. L. Cell and agonist-specific regulation of genes for matrix metalloproteinases and their tissue inhibitors by primary glial cells. Journal of Neurochemistry. 98, 812-823 (2006).
  18. Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. J Vis Exp. (2013).
  19. Crocker, S. J., Frausto, R. F., Whitton, J. L., Milner, R. A novel method to establish microglia-free astrocyte cultures: comparison of matrix metalloproteinase expression profiles in pure cultures of astrocytes and microglia. Glia. 56, 1187-1198 (2008).
  20. Moore, C. S., et al. Astrocytic Tissue Inhibitor of Metalloproteinase-1 (TIMP-1) Promotes Oligodendrocyte Differentiation and Enhances CNS Myelination. J Neurosci. 31, 6247-6254 (2011).
  21. Im, D. S., Heise, C. E., Nguyen, T., O'Dowd, B. F., Lynch, K. R. Identification of a molecular target of psychosine and its role in globoid cell formation. J Cell Biol. 153, 429-434 (2001).
Bir<em&gt; İn Vitro</em&gt; Globoid Hücre lökodistrofi Hücresel Patofizyoloji Çalışması Modeli
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Claycomb, K. I., Johnson, K. M., Bongarzone, E. R., Crocker, S. J. An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy. J. Vis. Exp. (92), e51903, doi:10.3791/51903 (2014).More

Claycomb, K. I., Johnson, K. M., Bongarzone, E. R., Crocker, S. J. An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy. J. Vis. Exp. (92), e51903, doi:10.3791/51903 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter