眼底摄影作为一种方便的工具，研究微血管回应流行病学研究心血管疾病的风险因素

Summary

视网膜图像分析是一个不显眼的过程可视化微循环。心血管疾病危险因素的影响，可能会导致视网膜血管口径的变化。的程序，以取得眼底图像和步骤，用于计算口径是所述的容器中。

Abstract

微循环是由血管直径小于150微米。它构成了循环系统的很大一部分并在维持心血管健康具有重要作用。视网膜是一种组织的线眼的内部，这是允许的微血管的非侵入性分析的唯一组织。现在，高品质的眼底图像可以使用数码相机来获取。视网膜图像可以被收集在5分钟或更少，即使没有瞳孔的扩张。这不显眼的和快速的程序的可视化微循环是有吸引力的流行病学研究应用，并从幼年到老年监测心血管的健康。

影响循环全身性疾病可以导致在视网膜脉管渐进的形态学变化。例如，改变在视网膜动脉和静脉的血管口径已患有高血压，动脉粥样相关硬化和中风和心肌梗死的风险增加。容器的宽度是使用图像分析软件和六个最大的动脉的宽度衍生和静脉总结在中央视网膜小动脉当量（CRAE）和中央视网膜小静脉当量（CRVE）。后者的功能已经显示，研究可修改的生活方式和环境心血管疾病的危险因素的影响是有用的。

该程序以获取眼底图像和分析步骤，以获得CRAE和CRVE描述。的CRAE和CRVE重复测量的变异系数是小于2％，并在信度是非常高的。使用面板的研究中，视网膜血管口径在微粒空气污染的短期变化的快速反应，对心脑血管发病率和死亡率的一个已知危险因素，报道。总之，视网膜成像提议作为一种方便的工具的工具流行病学studies到学习微血管应对心血管疾病的危险因素。

Introduction

微循环是由血管直径小于150微米，并且包括最小的阻力动脉，小动脉，毛细血管和小静脉。这些血管弥补循环系统的很大一部分并在维持心血管健康具有重要作用。 150微米的血管直径是一种生理和物理限制。容器，直径小于150微米的流变学特性，从大动脉不同。此外，大多数的自动调节的电阻发生变化，从150微米的下游在血管床表现出血流自动调节^1。微循环有两个重要的功能。其主要功能是提供细胞与氧和代谢底物以匹配组织需求和排出废物和二氧化碳。在交换血管和微血管血流模式的数目的改变降低了有效交换的表面积，并且可以LEAd，来次优的组织灌注，未能满足代谢需求^2。此外，静压力降低的血管床内的微循环在调节整体外周阻力³的作用。

视网膜是层状组织衬眼睛内部。它的主要功能是将入射光转换成被进一步传播到视觉皮层用于处理视觉信息的神经信号。视网膜的功能是看外界和所有参与该过程的眼结构是光学透明的。这使得视网膜组织访问的微血管⁴的非侵入性的成像。视网膜成像被用来识别眼疾。例如，黄斑变性的一种高级形式可以导致由于异常的血管生长成黄斑视力丧失。这些血管往往更可渗透的，可能会流血克和内或下方的视网膜渗漏血液和蛋白质。后者的事件是负责向光感受器的不可逆损伤。青光眼的相关发展具有破坏性的神经节细胞及其轴突。这一过程的作用导致拔罐视盘，它可以在视网膜图像⁵可以观察到的。糖尿病视网膜病变是高血糖导致的视网膜血管壁损伤造成的。这可能导致局部缺血，新血管的生长和在血管几何网络的变化。此外，血-视网膜屏障可能会受到破坏，从而引起扩张hyperpermeable毛细血管和动脉瘤⁶的泄漏。

视网膜微血管显示同源性在心脏，肺和大脑⁷中发现的微血管床。经确定了影响大脑的微循环全身性疾病可引起视网膜平行的变化。动脉NArrowing和视网膜小动脉增强光的反射与血管发育异常，脑白质病变与腔隙是由脑小血管病变引起的⁸有关。 à显著关系较窄视网膜静脉，改变的视网膜微血管网络和早老性痴呆症的发生之间被发现。因此建议患者大脑具有改变的脑微血管那也是可观察到的视网膜中的^9。

证据也越来越多关于视网膜血管的改变与冠状动脉心脏疾病^10,11之间的相关性。视网膜动脉与视网膜静脉（A / V）的直径之间的比例已被证明是一个敏感的代理，以反映高血压和动脉粥样硬化^12。变窄的动脉和静脉增宽，导致降低的A / V比，证实了中风和心肌梗死的风险^13。高血压可以引起直接的视网膜缺血，视网膜梗塞的变得像棉絮斑和深层视网膜白斑¹⁴可见。塞尔和Sasongko最近总结了文献中，他们得出的结论是暴露在生活方式和环境危险因素（ 如饮食，体力活动，吸烟和空气污染），可诱导的视网膜微血管床¹⁵的形态变化。重要的是，这样的眼底改变与心血管危险因素有关，甚至在疾病的^16个临床表现。

显著增加心血管疾病发病率和死亡率的发生归因于长期和短期暴露于颗粒物质空气污染^17,18。研究表明，颗粒物（PM），空气污染的一个重要部分，导致心血管病的发展和诱发心血管事件^19,20。功能的损害微血管床认为在观察协会的作用。在这方面，暴露于空气污染和动脉变窄的视网膜之间的关联已经报道由亚达和同事^21。视网膜动脉管径较窄和小静脉管径是4607参与者动脉粥样硬化（MESA）是生活在地区增加长期和短期暴露于PM _2.5（颗粒物的多种族研究之间更广泛≤2.5微米直径^）21。引起的慢性空气污染暴露全身性炎症可导致较宽的小静脉的直径^22。这证实了报道吸烟对视网膜微血管床²³的影响研究。短期空气污染暴露与健康成人微血管的变化（22-63岁）与视网膜眼底照相²⁴测量之间的关系最近出版的报告。一个increa本身在PM _10（粒子状物质≤10微米的直径）和BC（黑碳，燃烧副产物可以被用作用于与交通有关的柴油机废气的代理）用在小动脉口径^24,25的减少相关联。

在这个科学视频协议，该程序的描述来收集眼睛的眼底图像，进行图像分析，以获得小动脉和小静脉血管的口径，并且计算中央视网膜小动脉当量（CRAE）和中央视网膜小静脉当量（CRVE）。视网膜成像是获得越来越多的关注，因为视网膜，使微血管和图像的一个不显眼的分析，可以从早期收集到老年^26,27的唯一组织。 CRAE和CRVE似乎反映改变的生活方式和环境的心血管疾病危险因素对微血管的影响敏感的参数。在手稿中，可重复性容器的分析论证。此外，在流行病学研究视网膜微血管分析的应用如通过总结我们在重复测量设计，获得了专注于微粒空气污染暴露²⁴的影响的研究结果。

Protocol

哈瑟尔特大学的伦理委员会和大学医院安特卫普批准了研究。参加了他们的书面知情同意参加。

1，仪器设置

1. 从数字眼底相机和该单元的主块取出黑色保护壳。
2. 打开电池仓，将电池放在相机。不要断开连接电池和主机的电线。
3. 用螺丝将摄像头到主单元和连接的两根导线。主机连接到电网和计算机附带的USB电缆。
4. 通过开关的开/关按钮“上的”启动主单元。通过开关的开/关按钮“上的”启动相机。
5. 启动计算机。这将防止在主单元和计算机之间的连接错误。

2，采集照片

1. 启动视网膜意马NG控制软件（并填写所需的密码）。该软件是数码相机视网膜的一部分（见资料表的链接）。
2. 通过点击在屏幕的左上部分的“学习”图标展开研究。对于新患者，填写所有的细节，如患者ID，患者姓名，出生日期等，如果患者已经在系统中，填写“病人ID”和使用“搜索历史记录列表”。对患者的名字双击展开研究。
3. 让患者在镜头前要坐一坐，把他/她的下巴的下巴休息，对其余的额头和额头上“锁定”头拍摄照片。
4. 让患者直视摄像机的镜头。移动摄像机在水平（XY）平面的右眼或左眼。
5. 使用颚台来定位，出现在照相机显示器上的两个圆圈内的患者的角膜。微调用车轮上的操纵杆。
6. 移动相机向前，向后，侧向和在XY平面上，以定位在圆内的病人的瞳孔。确保学生形成了一个连贯的圆圈。通过这样做，在患者的虹膜将在两片被分割。
7. 使用操纵杆上的“背面触发”，从角膜到视网膜的切换。在这个阶段，患者应注意观察了绿灯。让病人看开了绿灯。
8. 通过比对两条线，弹出当车轮在操纵杆的基部被接通聚焦照相机。转动车轮，直至两条线形成一条连续的线。
9. 使用绿色光源放置在眼睛的照片的最佳位置。如果需要，可使用箭头按钮的右侧照相机的移动灯光。定位在绿色光的方式，视盘为中心的照相机显示器上。
10. 搜索2的白色斑点的出现switchi后ng到视网膜（在步骤2.7）。要找到点，移动设备在XY平面上。这些点是作为一个模糊的色斑明显。移动单元向前或向后，直到模糊污点变成明亮的白色斑点。在明亮的圆斑，画面的质量越好。定位点，直到两个是可见的。使用操纵杆上的小轮带来的斑点到相机显示屏的中间。
11. 确认两行（步骤2.8），形成一条连续的线。视盘为中心的照相机显示器上，并通过两个明亮的白点侧接。采取了射击上的操纵杆顶部的按钮视网膜照片。
12. 通过按电脑屏幕右下角的“研究完成”按钮来保存照片。完成研究会自动保存在地图画面，并关闭研究。

视网膜照片3。分析

1. 确定由MEAS规模比例uring的黄斑（黄斑）的中心之间以及视神经盘中心（盲区）的距离。解剖学这个距离被确定为4500微米或2.5倍视盘的直径，而后者是约1800微米。确保该距离测量像素。由黄斑和盲区之间除以4500的距离（以像素为单位）计算的缩放比例。
2. 打开视网膜血管分析软件“伊万”。
   注：该软件是在美国威斯康星大学麦迪逊分校创建。详细信息伊万的使用是从手册。
3. 在规模比例填充，然后继续完成配置。
4. 验证三黄圈出现在视网膜照片。缩放比例确定的内圆的半径，并且包围视盘。验证该中间点的内圈是在中间点的视盘。如果不是这种情况，调整圆的，使用光标键位置。中间和外层圆的半径分别为2倍和3倍比内侧圆的半径大，分别为。在这种方式中，区域A和B在从视盘的固定距离被创建。
5. 检查视网膜图像中，在照片的中央视盘。这可确保在区域B中的图像的锐聚焦，这将有利于分级处理（ 图4A）。
6. 注意，该软件会自动检测血管和分配这些船只为小静脉（ 图4B）。
7. 区分的基础上的生理差异小动脉和微静脉之间的血管。动脉将被指示在红色和小静脉中的蓝色（ 图4C）。使用以下准则来确定每艘船：
   1. 确定容器颜色。动脉有一个打火机橙红色具有强烈的中心光反射。脉有较深的紫色- 红颜色很少或没有中央对光反射消失。
   2. 确定容器中的过程。动脉往往是直的，更流畅的轮廓;他们都是路径和轮廓更加规整。静脉一般都比较曲折，而在外形和直径更不规则。静脉是更广泛的，直径在盘缘比相应的动脉。
   3. 通过观察前述容器的注释识别容器。原则上，小动脉相间的小静脉。因此，如果在不同的微静脉被测量，下一容器是更可能是一个小动脉。
   4. 定义交叉的方式。作为一般规则，小动脉不交叉小动脉和小静脉不交叉的小静脉。如果不明身份的船只穿过内静脉分支或远端B区，则未知船只的动脉。如果它穿过内动脉分支或远端B区，那么它是一个小静脉。
   5. 通过跟踪他们找出更小的分支proximally的从母体血管分支，它的身份可以是显而易见的，从前两个准则。使用船舶之间的角度来区分通道和支化。
      注意：关卡常常几乎垂直（90°），或者，如果两个容器都追猎平行，相交的角可以是非常浅的（小于30°）。支化通常比垂直稍差（与从30°到45°的两个分支之间的角度）。
   6. 选择在分级区域中的容器的整个长度上。确保所选容器的标准偏差不超过10小于标准偏差的值指示了良好的测量。
8. 使用软件工具来选择未由软件本身选择的船只。同样的规则也适用于这些船只是由软件自动选择的船只。
9. 确定中央视网膜小动脉和小静脉当量（CRAE和CRVE自动伊凡）。
10. 使用帕尔和哈伯德^28日修订后的公式各自的分支血管的女儿计算CRAE和CRVE。
    注：树干和树枝之间的关系，用实验导出的支化系数，给出了下面的两个公式来近似容器当量。 IVAN使用六大小动脉和小静脉计算CRAE和CRVE。该公式应用在迭代过程来配对六大动脉（或静脉）获得中央动脉（或小静脉）血管相当于罚金。
    动脉： （1）
    静脉： （2）
    其中W _{1，W 2}和W的窄分支部，该宽分支部，并且父躯干的宽度，分别。
    注：假设塔吨视网膜照片六大动脉是120，110，100，90，80，和70微米宽。放120和70代入式（1），以及110和80，和100和90的第一次迭代之后有三个值：122.2，120.0和118.4。通过配对122.2和118.4，得到149.8执行下一次迭代。携带在中间数（120.0）的最后一次迭代。对149.8和120.0，得到168.7的CRAE。

Representative Results

的CRAE和CRVE测定重复性

22〜56岁，无临床诊断心血管疾病的61个人的小组被招募研究技术的可重复性和中央视网膜小动脉当量（CRAE）和视网膜中央小静脉当量（CRVE）确定的范围内评价者变异。每个单独的右眼睛眼底是5分钟使用眼底相机（ 图1和2）的时间内拍摄到的两倍。这个过程已完成的连续4天，大约在一天的同一时间。变化在±CRAE的标准偏差和5分钟的时间内拍摄的照片CRVE的平均系数分别为1.76±1.71和1.78±1.51，分别。 CRAE和CRVE值的平均值±标准偏差分别为151.31±13.53和213.20±18.44，分别为。没有显著DIFferences，观察CRAE和上连续4天获得CRVE值。

右眼的CRAE和CRVE值进行平均，以每天一CRAE和CRVE值。随后，测量重复性由内相关系数（ICC），无量纲统计由0和1的范围内描述的在人群中重复测量的可重复性的方法进行评价。测量是由一个单一的评估者完成。因此，单向随机效应模型可以估算中，评估者可变性^29。国际刑事法院是0.919（95％CI：0.883，0.946）和0.898（95％CI：0.854，0.932），用于CRAE和CRVE分别。这些ICC值大大高于0.6的阈值，这被认为是临床上显著和估计都落在内的广泛类别作为是在可靠性^30“几乎完美”。

小组研究，探讨微粒空气P的影响ollution

这项研究是2012年1月和2012年5月间进行，其中包括84个人。参加者为22〜63岁，无前和研究期间临床诊断心血管疾病。使用眼底相机上每三个独立的检查天右眼的眼底之一照相。的读者可以参考Louwies和合作者的纸张对空气污染的数据是如何被收集到²⁴的详细信息。在研究期间的过程中，环境PM ₁₀和BC水平高，比利时因空气污染来自东欧西行大气传输。这是可视化的时间推移视频（补充资料）。空气污染浓度，分配到每个参与者为2,4和6小时的视网膜考试前。空气污染水平进行了计算，从午夜临床就诊当天到视网膜前的时间是。空气污染水平也赋予了前一天和视网膜考试前两天。这些浓度的总结：lag2h，lag4h，lag6h，滞后24小时，和滞后2d上。污染物专用，进行使用混合模式暴露 - 反应分析。这些分析的详情，可在原公布²⁴被发现。有CRAE和空气污染浓度呈负相关的临床检查之前（测量为PM ₁₀和BC浓度）在每小时和每天接触的窗口。在0.93微米的CRAE降低（95％CI：-1.42，-0.45，P = 0.0003）是在24小时考试前（ 图3），观察各10微克/立方米增加，平均₁₀点。短每小时下午₁₀曝光的窗户和PM ₁₀浓度平均比上年2天还透露了一个显著下降的CRAE值。 1.84μ在CRAE的下降米（95％CI：-3.18，-0.51，P = 0.008）也被发现在考试前各1微克/立方米增加公元前24小时。无需额外的显著协会CRAE和其他计算公元前曝光窗口之间进行观察。在0.86微米CRVE降低（95％CI：-1.42，-0.30，P = 0.004），观察在24小时暴露窗口每10微克/立方米增加₁₀点的视网膜照片拍摄之前。较短的曝光窗口显示额外显著效果（ 图3）。观察检查前的24小时期间CRVE和BC暴露之间的负相关关系。不过，效果并没有达到统计学显着性水平（-1.18微米，95％CI：-3.11，0.75，P = 0.23）。

视网膜摄像头的 R /> 图1视网膜图像，例如，带注释的健康志愿者（左）和免散瞳数码眼底照相机（右）的照片的右眼视网膜眼底图像。 请点击这里查看一个更大的版本，这个数字。

图2：屏幕截图IVAN软件。是与伊万软件处理图片的例子。该软件识别血管和计算直径。操作员监督的结果，并确定动脉（显示为红色）和静脉（蓝色显示）。 CRAE和CRVE，然后自动计算。请点击这里查看该图的放大版本。

空气污染和视网膜血管口径与图3。协会估计变更的平均CRAE和CRVE（95％CI）联同10微克/立方米增加₁₀点（左）或1微克/立方米增加公元前（右）不同暴露滞后。这些数据是从84人的小组获得。 请点击这里查看该图的放大版本。

图4。904 / 51904fig4highres.jpg“目标=”_ blank将“>请点击这里查看该图的放大版本。

补充视频。空气污染物浓度的研究小组在时间推移视频。

Discussion

视网膜图像分析，提出作为一个方便的工具，用于研究在流行病学研究微血管反应。当操作者经验丰富，只需不到5分钟取眼底照片。此外，可用于从幼年到老年参与者这个不显眼的过程可视化的微循环。

文献在增加相对于形态学变化之间的关联，在视网膜脉管系统（例如改变在容器口径，几何图案等）和可修改的生活方式和环境风险因素^15,16。实验和流行病学的作品表明，短期和长期的空气污染暴露强​​烈的心血管发病率和死亡率。然而，方便的技术，如视网膜眼底照相已经被用得很少，研究可能由空气污染物诱发微循环障碍的影响。

jove_content“>所需要的获得高质量的眼底图像中的这个视频协议解释的不同的步骤，接着，该方法给出了用于获得小动脉和小静脉口径测量，并且更具体地，中央视网膜小动脉当量（CRAE）和中央视网膜小静脉当量^{（CRVE）13,28。}重复测量分析的结果表明，在评价者结果CRAE和CRVE是的四天时间内拍摄的照片高度重复性。这些研究结果是一致与报道的McCanna和同事最近的观测，后者作者报道CRAE和CRVE值稳定超过一个月期间，他们报道的相关性为对0.9进行考察的和的相关性与时间间隔的增加长度略有下降^31。

接着，它显示在一个面板研究与健康成人的Retinal微循环能够迅速颗粒物空气污染作出回应。更具体地，在CRAE，涉及到增加的短期暴露于PM ₁₀和BC的降低报告^24。缩小视网膜小动脉的是用于估计心血管疾病和心血管疾病的死亡率^32-35的风险的指标。可以想象到的是视网膜微血管可用于探测空气污染的心血管作用。在这方面，亚达和他的同事报告，首次对空气污染对台面队列²¹的横截面分析的人视网膜微血管的短期影响。报道Louwies 等微血管的变化。（2013年）补那些亚达等人发现。 （2010）。后者的作者报告了0.4微米减少CRAE（95％CI：-0.8，-0.04），每9微克/立方米增加平均PM2.5 _的前一天。基于重复测量，。Louwies等人 （2013年）报道-1.2微米的估计值（95％CI：-1.61，-0.61），它被认为较大的影响大小，可能是由于在下午和BC暴露浓度更大的变化在此面板中的研究^24。

肺部炎症，低档，全身炎症反应已经暴露于空气污染³⁶相关联。全身性炎症还与血管内皮功能障碍^37,38。这个过程可能影响视网膜血管³⁹的反应性。据推测，炎症反应导致改变的内皮活性，其可以反映在动脉口径变窄。从小组的研究结果表明，这可能发生在不到24小时的时间内，因为暴露于下午₁₀呈负CRAE在所有的时薪曝光窗口有关。这些意见均符合空气投票已知的影响ution健康。与暴露于空气中的污染物的峰值电平短期动物的研究表明，微血管会受到影响^40,41。此外，在受控环境中的人为干预的研究表明，内皮功能被曝光时受损到柴油机排气^42,43。

总之，许多发育和解剖相似之处视网膜血管和心脏，肺微血管和脑¹⁰之间存在。因此，视网膜血管的血液被认为是全身微循环的替代组织。视网膜血管的变化可能是一个有价值的预测心血管疾病的发展。视网膜图像的方便和不显眼的分析，现在认为是侧重于心血管流行病学人群研究非常有用。该协议文件应鼓励更多的研究小组利用眼底照相研究微血管EF环境及生活方式因素的fects。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Canon CR-2 nonmydriatic retinal camera	Hospithera (Brussels, Belgium)		http://www.usa.canon.com/cusa/healthcare/products/eyecare/digital_non_mydriatic_retinal_cameras/cr_2. Any other retinal camera with comparable resolution and specifications can be used for the analysis of the retinal microvasculature. Compatibility should  be checked before starting a study.
IVAN: Vessel Measurement Software			This software can be used without charge for scientific purpose. It can be obtained by contacting Dr. Nicola Ferrier (Madison School of Engineering and the Fundus Photograph Reading Center, Department of Ophthalmology and Visual Sciences, University of Wisconsin–Madison). http://directory.engr.wisc.edu/me/faculty/ferrier_nicola. Phone: (608) 265-8793, Fax: (608) 265-2316 or e-mail: ferrier@engr.wisc.edu