Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Histolojik ve Fonksiyonel Özellikleri: Methylnitrosourea (MNU) Retina Dejenerasyonu ve Rejenerasyon Zebra balığı -kaynaklı

doi: 10.3791/51909 Published: October 20, 2014

Summary

Bu yazıda retina de- ve rejenerasyon ve yetişkin zebrabalıkları N-metil-N -nitrosourea kullanarak görme fonksiyonu üzerindeki etkisinin ölçümü göstermektedir. Görme keskinliği kaybı ve azalmış fotoreseptör numaraları iç nükleer tabakada çoğalması ile takip edildi. Komple morfolojik ve fonksiyonel rejenerasyon 30 gün ilk tedaviden sonra meydana geldi.

Abstract

Endüstriyel dünyada görme kaybının çoğunluğu için fotoreseptör hasar hesabı ile sonuçlanan retina dejeneratif hastalıklar, örneğin retinitis pigmentosa,. Hayvan modelleri, bu tür hastalıkları incelemek için temel bir öneme sahiptir. Bu bağlamda, N-metil-N -nitrosourea (ÇUB) yaygın olarak kemirgenlerde kullanılmıştır fotoreseptör spesifik toksin farmasötik olarak retina dejenerasyonuna tetiklemek için karıştırılabilir. Daha önce, Zebra balığı bir MNU kaynaklı retina dejenerasyonu modeli, görsel araştırmalar başka popüler model sistem kurduk.

Memelilere büyüleyici bir fark yetişkin zebrabalıkları retina ve hasar sonra rejenerasyon kalıcı nöron olduğunu. Biz yetişkin zebrabalıkları görme keskinliği ölçümleri istihdam var bu gözlemi ölçmek için. Böylece, optokinetik refleks olmayan anestezi balık fonksiyonel değişiklikleri izlemek için kullanılmıştır. Bu immünhistokimyasal staini yanı sıra histoloji ile takviye edildiapoptosis için ng (TÜNEL) ve çoğalması (PCNA) gelişmekte morfolojik değişiklikler ilişkilendirmek için.

Özet olarak, fotoreseptör apoptoz üç gün dış çekirdek katmanında (ONL) hücrelerin belirgin bir azalma izler ÇUB tedaviden sonra ortaya çıkar. Bundan sonra, iç nükleer tabaka (INL) ve onl hücre çoğalması gözlenmiştir. Burada, bir tam histolojik kalmaz, aynı zamanda etkin bir yenilenmesi, 30 günlük bir süre boyunca oluşturduğunu ortaya koymuştur. Şimdi ölçmek ve video formatında MNU kullanarak Zebra balığı retina DE- ve yenilenmesini takip yöntemleri açıklamaktadır.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Vizyon insan için en önemli duyu ve değer düşüklüğü, yüksek sosyo-ekonomik etkisi vardır. Gelişmiş dünyada, retina dejeneratif hastalıklar yaşlı yetişkinler 1 arasında görme kaybı ve körlük önde gelen nedenidir. En dejeneratif retina hastalıklarının nedeni kısmen anlaşılır ve tedavi çözümleri kayıp vizyon kazanmak için çok sınırlı. Retinitis pigmentosa N -nitrosourea (ÇUB), retinal dejenerasyon meydana metiltio, primer fotoreseptör kaybı 2-3. N retinal dejeneratif bir hastalığın tipik bir örneğidir ve bu nedenle yaygın primer fotoreseptör hücre ölümü ile 4 hastalıkların modellemek için kemirgenlerde kullanılır. Bu bir alkilleyici madde ve genellikle 5-7 maruz bir kaç ay sonra görünür huylu ve kötü huylu tümörler, yol açar. Buna ek olarak, kısa süreli bir gözlem süresi içinde özel bir fotoreseptör hücre ölümüne neden olur. Böylece, retina tabaka Yapıdaki kaybıre ve anlamlı bir retina incelmesi konsantrasyona bağlı bir şekilde tespit edilmiştir. Retina glia hücreleri aktive edildi, ancak retina pigment epiteli (RPE) hiçbir değişiklik bulundu. Endoplazmik retikulum (ER), stres ile ilgili apoptoz retinada 8 ÇUB etkisinin en temel bir yol olarak görünmektedir.

Biz son zamanlarda Zebrafish 9 fotoreseptör dejenerasyonu ikna etmek için bir kimyasal model olarak MNU girmiştik. Diğer nedenler arasında, Zebra balığı (Br.rerio) çünkü diğer omurgalıların 10 o kendi görsel sistemin benzerlikler görsel araştırma önemli hale gelmiştir. Dış retina ultraviyole, kısa, orta tepe hassasiyetleri ve görünür spektrumu uzun dalga boyu ve bir çubuk fotoreseptör türüyle dört farklı koni gruba ayrılabilir olabilir fotoreseptörleri içerir. Iç nükleer tabaka (INL) olarak, bipolar, yatay ve amacrine internöron hücre gövdeleri, wel olarak bulunurlarMuller, glia hücreleri, hücre soma olarak L.. Dış pleksiform katman (OPL) içinde fotoreseptör ve iç retina arasındaki sinaptik iletişim lensin en yakın hücre tabakası ise optik sinir ve optik sistemini içeren uzun aksonlar oluşturan bileşenler ve ganglion hücre tabakası (GC) olan oluşturulmaktadır . Salgı bezleri ve iç nükleer tabakadaki hücrelerin arasında olduğu, sinaptik temasların olarak iç pleksiform tabakasındaki (IPL) 11 oluşur. RPE nörosensöriyel retina dışında yer alır ve uzun apikal mikrovilluslu 12 ile fotoreseptör dış segmentleri çevreler. Ayrıca, Zebrafish yüksek rejeneratif ve lezyonlu beyin, retina, omurilik, kalp ve diğer dokuları 13 yetiştirmeleri için yapabiliyor. Retinal hasar oluştuğunda, Muller hücreleri olduğu düşünülmektedir INL hücreleri, aktive edilmiş ve çeşitli retinal hücre tipleri içine ayırt etmek için bir potansiyele sahiptir. Buna ek olarak, aynı zamanda ONL bulunan çubuk progenitörlerle üretir. Başka bir nedenleYeni hücreler ile yetişkin zebrafish retina malzemeleri urce siliyer marjinal bölgesidir. Bu kaynak, sürekli olarak büyüyen Zebrafish göz 14 çubuk fotoreseptör sabit bir yoğunluğu elde etmek için gereklidir.

ÇUB modeli retina dokusu için basit ve tekrarlanabilir bir dejenerasyon / yenilenmesi yaklaşımı olarak da kullanılabilir. Nedeniyle Zebra balığı biyolojik süreçler bazı benzerlikleri ve insanlarda bu ilgili hücre ölümü yolları belirlemek için kapıları açmak ve potansiyel nöroprotektif ilaç ekrana. Bizim gruptan bir önceki çalışmaya göre, biz şimdi retina de- ve laboratuvar videoları 9 uygun fonksiyonel değişiklikler dahil olmak üzere izleyen rejenerasyon bu MNU kaynaklı zebrabalıkları modelinin yöntemlerini göstermektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bütün deneyler Oftalmik ve Vizyon Araştırma Derneği Vizyon Araştırma ve Oftalmoloji (ARVO) Hayvanların Kullanım Bildirimi yapıştırılır.

1. Hayvanlar

  1. 26.5 ° C'lik bir sıcaklıkta ve 14/10 saatlik aydınlık / karanlık döngüsünde 15, su içinde standart koşullar altında, 6-12 ay arasında değişen AB (Oregon) soyunun, vahşi tip zebrafish (Br.rerio) koruyun.
  2. Kanton Veteriner Dairesi tarafından onaylandıktan sonra hayvan deneyleri için ilgili kurumların hayvan bakım yönergeleri izleyin.

2. MNU Tedavi

  1. N-metil-N -nitrosourea (ÇUB) 150 mg / L kuru madde ihtiva eden su hazırlayın. DİKKAT! ÇUB toksiktir; Doğmamış çocuğa kanser, kalıtsal genetik hasara veya zarar görmesine neden olabilir.
  2. , Oda sıcaklığında 60 dakika boyunca MNU ihtiva eden su içinde zebrafish inkübe edin.
  3. Hızlı bir şekilde Zebra balığı durulayıntatlı su ve MNU olmadan yeni bir balık tankına balık koymak. Deneyler için arzu edildiği sürece, standart koşullar altında balık koruyun.

3. Görme Keskinliği Ölçümü

  1. , Optomotor sistemini başlatmak menüden 'test' seçin ve seçenekleri ayarlayın "Basit Staircase", "Keskinliği (Frekans)" ve "Tesadüf / Ayrı" 16.
  2. Optomotor sistemi üzerinde 1 m ile yaklaşık 500 ml su ile doldurulmuş bir infüzyon şişesi takın.
  3. Sınav odasında bir Zebra balığı yerleştirin ve infüzyon şişesi bağlayın. Optomotor sistemde muayene odasına yerleştirin.
  4. Ölçümü başlatın ve bilgisayar ekranında gerçek zamanlı olarak göz hareketi gözlemlemek. Böylece, olumlu bir yanıt ("evet") olumsuz yanıt ("hayır") ise, doğru yönde ardışık sakkadlardan olarak tanımlanır istasyonu ile gözlenen benzeyen rastgele göz hareketleri temsilary ızgaralar. Zebra balığı sergi gözünde ise üç veya daha fazla sonraki optokinetik tepkiler (OKR), basın 'evet'; değilse, basın 'hayır'.
  5. Menüsünden "Sonuçlar" başlığı altında, optokinetik uyaranın uzaysal frekansa eşik belirleyerek yazılım tarafından hesaplanmıştır görme keskinliği, ayıklayın.

4. Histoloji

  1. Etil 3-aminobenzoat metansülfonat (200-300 mg / L) bir doz aşımı zebrafish Euthanize ve gözleri enükleasyonu.
  2. Bir kademeli alkol serisi içinde dehidre örnekleri daha sonra 12 saat boyunca 4 ° C'de fosfat tamponlu tuz içerisinde% 4 paraformaldehit (PFA) (PBS) içinde bütün gözleri saptamak ve.
  3. Parafinde örnekleri embed optik sinir başı (OSB) ile 5 mikron bölümleri kesip bir cam slaytlar monte ederek.
  4. 4 dakika boyunca hemalum ile deparaffized parafin kesitleri Leke ve% 0.2 hidroklorik ACI, ardından damıtılmış su içinde slaytlar iki kez daldırmad ve% 0.8 amonyak. En az 10 dakika (H & E) musluk suyu hemalum boyamanın geliştirilmesi sonra 3 dakika boyunca eosin ile bölümleri Leke.
  5. Orta montaj susuz slaytlar embed ve ışık mikroskobu altında slaytlar gözlemlemek.

5. İmmünhistokimya

  1. Terminal deoksinükleotidil transferaz dUTP çentik uç etiketleme (TÜNEL)
    1. 15 dakika boyunca, oda sıcaklığında 20 ug / ml proteinaz K ile inkübe bölümleri deparafınize edildi. Tris ile bölümlerinin üç kez yıkayın 5 dakika her biri için tuzlu su (TBS) tamponlu.
    2. 60 dakika boyunca 37 ° C'de nemlendirilmiş bir haznede 50 ul TÜNEL tepkime karışımıyla (% 10 etiketleme çözeltisi ve% 90 enzim solüsyonu) ile inkübe bölümleri. 5 dakika her biri için üç kez TBS ile yıkayın.
    3. DAPI içeren yerleştirme ortamı ile slaytlar takın ve flöresanlı mikroskop altında slaytlar izleyin.
  2. Prolifere Hücre Nükleer Antijen (PCNA) boyama
    1. 3 dakika boyunca antijen geri alma tamponu (Tris-EDTA +% 0.05 Tween 20, pH 9.0) içinde deparafinize edilmiş kesitlerin kaynatılır ve 5 dakika her biri için üç kez TBS ile yıkayın. 100 ul, 1 saat boyunca oda sıcaklığında çözeltisi (TBS +% 10 normal keçi serumu +% 1 sığır serum albümini, pH 7.6) ile bloke ile bloklayın.
    2. Gece boyunca 4 ° C'de nemlendirilmiş bir haznede 200 seyreltme: 1 anti-PCNA primer antikorlar ile Leke. 5 dakika her biri için TBS + Tween 20 ile üç kez yıkayın.
    3. 1 saat boyunca oda sıcaklığında 500 seyreltme: 1 uygun sekonder antikor ile algılamayı bitirin.
    4. DAPI içeren yerleştirme ortamı ile slaytlar takın ve flöresanlı mikroskop altında slaytlar izleyin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Görme keskinliği:

Deneysel set-up [mekansal frekans: 0.042 daireler / derecesi (c / d); kontrast: 100%; sürüklenme hızı: 20 derece / saniye (d / src); arka ışık parlaklık: 152 cd / m 2] Bu çalışmada, yetişkin zebrabalıkları OKR değerlendirmesini sağladı. Iyi prosedürü tolere her zebrabalıkları, 10 dakika - VA ölçüm süresi ortalama yaklaşık 5 oldu. MNU maruz önce görme keskinliği 0.577 ± 0.014 devir / derece (c / d) idi. 1 150 mg / L MNU'nun uygulamasından sonra görme keskinliği sürecini gösterir. 1 günden başlayarak, ölçümler, görme keskinliğinde belirgin bir azalma olduğunu ortaya günden 8 itibaren 3. günde minimum değerleri ulaşan, görme keskinliği artışı 30 gün MNU maruz kaldıktan sonra görme keskinliğine tam bir iyileşme gösteren oluşur. İstatistiksel analiz için Bonferroni çoklu karşılaştırma testi ile, bir tek-yönlü ANOVA uygulanmıştır. Böylece, görme keskinliği betwe farklılıklarBaşlangıçta ve ölçümler tedavi günlerinde 1, 3, 5 için anlamlıydı sonra, ve 8 (p <0.001, her biri), ama gün 15 ve 30 için tr.

Retinal dejenerasyon histolojik olarak değerlendirilmesi:

H & E boyama zaman noktası başına Zebrafish bir gözde (n = 3) taban yanı sıra, 3, 8, 15, ve tedaviden sonra 30 gün içinde (Şekil 2) morfolojik değişiklikleri ölçmek için kullanıldı. Tappeiner ve arkadaşları tarafından tarif edildiği gibi histolojik gerçekleştirilmiştir. 9. Böylece, ONL bir INL ve oyuk oluşumunun bozulması dahil olmak üzere retinal dejenerasyon 3. günde başlayarak gözlenmiştir ganglion hücre tabakası (GC) olarak hücre sayısı, iç çekirdek katmanı (INL) ve çubuğun numarası (RN) ve koni (CN) fotoreseptör göz bölümün her iki yanında el ile 250 um OSB merkezinden belirlenmiştir (sayılır alanın büyüklüğü 100 um uzunluğunda bir retina bölümleri anlamına gelir). Dejenerasyon 30 takip edildiBöylece gün gün 8 'de bulunan çubuk onl kaybı maksimum ile muamele edildikten sonra, çubuk, fotoreseptör numarası (RN) 3. günde% 82 oranında düşmüştür, 8. günde% 71 ve 15 gün% 77 ve orijinal sayı 30 . Ayrıca, hücre kümeleri birikimi esas INL olarak bulunmuştur.

Apoptozun Miktar Tayini:

TÜNEL boyama üreticiye göre gerçekleştirilmiştir (in situ hücre ölümü algılama kiti olarak, Roche Applied Sciences, Rotkreuz, İsviçre). ÇUB tedaviden sonra gözlenen retinal dejenerasyon apoptoz ile kaynaklanmıştır. Bu duyusal retinada, farklı hücre pozitif TÜNEL lekelemesi ile ortaya çıkmıştır. Ölçümü için, TÜNEL-pozitif hücre sayısı, retinanın dış başlayarak, 450 um uzunluğunda, her iki retina alanda elle belirlenmiştir. Böylece, TÜNEL-pozitif hücrelerin büyük çoğunluğunun Ancak 3. günde ONL bulundu, boyama hücreleri de bu zaman noktasında INL görüldü (Şekil 3). İlişkili bir TÜNEL-pozitif hücreleri, tedaviden önce tespit edilebilmiştir.

Hücre çoğalmasının değerlendirilmesi:

Hücre ölümünden sonra proliferasyonunu değerlendirmek için, retinalar Tappeiner ve diğ. 9 ile tarif edildiği gibi, hücre çekirdeği antijeni (PCNA) çoğalan için boyandı. Yukarıda tarif edildiği gibi ölçümü için, PCNA-pozitif hücre sayısı, manuel olarak belirlenmiştir. Hücre ölümü PCNA-pozitif hücreleri (Şekil 4) olarak görülmektedir ile indüklenen çoğalmasının izledi. Böylece, çoğalan hücrelerin maksimum ek olarak 5. günde ölçüldü INL, ONL (özellikle çubuk) hücreleri çalışmaya (gün 30) sonuna kadar PCNA pozitif boyanma gösterdi. Siliyer marjinal bölgesinde az sayıda PCNA-pozitif hücreler, tedaviden önce ve sonra bütün zaman noktalarında tespit edilebilmiştir.

d / 51909 / 51909fig1highres.jpg "width =" 500 "/>
Şekil 1:. 150 mg / L MNU'nun uygulamasından sonra erişkin zebrabalıkları görme keskinliği görme keskinliği ölçümü. Gün 3 tedavi sonrası bir minimum görme keskinliği anlamlı bir azalma günde 30 kadar (ortalama ± SD, n = 3), 5. günde başlayan, tam iyileşme izledi.

Şekil 2
Şekil 2: Histoloji ÇUB tedaviden sonra başlangıçta (A) ve 3 (B), 8 (C), 15 (D), 30 (D) gün Zebrafish retinanın histolojik kesitlerin H & E ile örnekler.. CN, koni çekirdekler; RN, çubuk çekirdekler; INL, iç nuklear tabaka; GC, ganglion hücre tabakası. Oklar INL hücre kümeleri işaretleyin. Ölçek çubuğu 50 mikron eşittir.


Şekil 3:. ÇUB tedavi sonrası 3. günde zebrabalıkları retinada TÜNEL-pozitif hücreler TÜNEL pozitif hücreler (kırmızı). Hücreler, esas olarak ONL bulunur, ancak aynı zamanda INL bulundu. B panelinde ÇUB tedaviden sonra görüntüleri gösterir ise, Panel A kontrol göstermektedir. Ölçek çubuğu 50 um gösterir.

Şekil 4
Şekil 4:. Kontrol numunesine kıyasla ÇUB tedaviden 5 gün sonra zebrabalıkları retinada PCNA-pozitif hücreler, PCNA-pozitif hücreler (kırmızı). B panelinde ÇUB tedaviden sonra görüntüleri gösterir ise, Panel A kontrol göstermektedir. Ölçek çubuğu 100 mikron gösterir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Daha önce, bizim grup Zebrafish sistemine 9 içine kemirgenler fotoreseptör dejenerasyonu MNU modelini transfer etti. Takip eden olaylar anlatılmış ve 30 güne kadar takip edildi. Bu süre içinde tam retina morfolojik dejenerasyon ve rejenerasyon ilk tedaviden sonra meydana geldi. İlk olarak, histoloji azalmış bir çubuk hücre Buna 8. günde en az on gün 3 saymak ortaya, TUNEL boyama 3 gün MNU tedaviden sonra çubuk fotoreseptör apoptozisini tanımlar. Rejenerasyon Prolifere eden hücreler, bu çoğalması artmıştır INL aksine bulunmaktadır 5. günde maksimum gözlem döneminin sonuna kadar gözlemlenebilir, ONL olarak 5. günde, maksimum 3. günde INL başlar 15. günde Silier marjinal bölge sonra gözlenmiştir bazı PCNA pozitif hücrelerin muamele edilmemiş retinada bulunmuştur retina tek bir konumdur. Bu sürekli retina nöron throug bir alanı gösterirhout ömrü 14. Zebra balığı farmakolojik hasarlı fotoreseptör rejenerasyon katılan hücre tiplerinin belirlenmesi, bu yazının odak değildi. Bununla birlikte, daha önceki yayınlarda işlem Müller hücrelerinin 9,17,18 olduğu önerilmiştir INL yenileyici hücrelere izlenmiştir.

Bu çalışmada, aynı zamanda zebra balığı ÇUB kaynaklı fonksiyonel değişiklikler modelinde değerlendirilmiştir. Yetişkin balıklarda görme fonksiyonunu ölçmek için, okr değerlendirilmesi çeşitli tekniklerden biri güvenilir küçük hayvanların 19 görme keskinliği (GK) ölçmek için, istihdam edilmiştir. Böylelikle, bir doğuştan gelen davranışına dayanan OKR, hayvanların 20 önceki zaman alıcı eğitim gerek yoktur. OKR defalarca hayvanların işbirliğinin bağımsız elicited olabilir ve büyük gözleri kolayca görülebilir Dahası, okr değerlendirilmesi durin görme keskinliği takip için ideal bir yöntemdirZebra balığı g dejenerasyon ve rejenerasyon. Bu çalışmada OKR ölçümler apoptoz maksimum gösterileri Bu MNU uygulamasından sonra histolojik de- ve rejeneratif değişiklikler uyarınca bir günde 30. görme işlevinde tam bir restorasyon ardından 3 günlük kadar azalan görme keskinliği, ortaya 3. gün.

ÇUB hazırlanması için hızlı ve doğrudan zebrabalıkları su tankı içinde eritilebilir gibi modelin bir yararı basitliğidir. MNU'nun ile Zebrafish tedavisi, bir saat içinde gerçekleştirilir. Topluca tedavi edilebilir balık sayısı sadece akvaryum büyüklüğü ile sınırlıdır. Genel olarak, bu tek tek balık manipülasyon gerek kalmadan Zebrafish çok sayıda retina dejenerasyonu basit indüksiyon sağlar. Bu nedenle, bu model intravitreal veya cerrahi kaynaklı teknikleri 21-23 kullanmak retina dejenerasyonu diğer modellere göre daha az invaziv ve böylelikle daha iyi bir tekrarlanabilirlik sergileyebilir.

Genel olarak, bu zebra balığı MNU modeli fotoreseptör özgü dejenerasyon teşvik etmek ve sadece morfolojik değil, aynı zamanda işlevsel aşağıdaki yenilenmesini görselleştirmek için çok yönlü bir araçtır. Bu nedenle, biz modeli daha genel olarak duyusal retina dejenerasyonu ve yenilenme sürecini anlamak için yardımcı olur ve memeli sistemi ile sonuçlarını karşılaştırmak için olasılığını açar eminiz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland A6283
Ammonia Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland 294993 0.80%
Bovine serum albumine (BSA) Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland 05470
Dako Pen Dako, Glostrup, Danmark S2002
DAPI mounting medium Vector Labs, Burlingame, CA, USA H-1200
Eosin Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland 45260
Ethanol Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland 2860 100%, 96%, 70%
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland ED
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland E10521 Tricaine
Eukitt Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland 3989
Goat anti-rabbit Alexa 594 Life Technologies, Zug, Switzerland  A11012
Goat normal serum Dako, Glostrup, Danmark X0907
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland 320331 0.20%
In situ Cell Death Detection Kit Roche Applied Sciences, Rotkreuz, Switzerland 11684795910 TUNEL Kit
Mayer's hemalum solution Merck, Darmstadt, Germany 109249
Methylnitrosourea (MNU) Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland N4766 Toxic
OptoMotry CerebralMechanics, Lethbridge, AB, Canada n.a.
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland P6148
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland P5368
Proteinase K Dako, Glostrup, Danmark S3004
Rabbit anti-PCNA  Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA sc-33756
Superfrost Plus glass slides Gehard Menzel GmbH, Braunschweig, Germany 10149870
Tris buffered saline (TBS) Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland P5912
Trizma base Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland T1503
Tween 20 Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland P1379
Xylene Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland 534056
Zebrafish (Danio rerio) AB (Oregon) strain University of Fribourg, Dept. of Biology n.a. Own fish facility

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Haddad, S., Chen, C. A., Santangelo, S. L., Seddon, J. M. The genetics of age-related macular degeneration: a review of progress to date. Surv. Ophthalmol. 51, (4), 316-363 (2006).
  2. Bhatti, M. T. Retinitis pigmentosa, pigmentary retinopathies, and neurologic diseases. Curr. Neurol. Neurosci. Rep. 6, (5), 403-413 (2006).
  3. Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. Retinitis pigmentosa. Lancet. 368, 1795-1809 (2006).
  4. Tsubura, A., Yoshizawa, K., Kuwata, M., Uehara, N. Animal models for retinitis pigmentosa induced by MNU; disease progression, mechanisms and therapeutic trials. Histol. Histopathol. 25, 233-248 (2010).
  5. Machida, K., Urano, K., Yoshimura, M., Tsutsumi, H., Nomura,, Usui, T. Carcinogenic comparative study on rasH2 mice produced by two breeding facilities. J. Toxicol. Sci. 33, 493-501 (2008).
  6. Morton, D., et al. N-Methyl-N-Nitrosourea (MNU): A positive control chemical for p53+/- mouse carcinogenicity studies. Toxicol. Pathol. 36, 926-931 (2008).
  7. Terracini, B., Testa, M. C. Carcinogenicity of a single administration of N-nitrosomethylurea: a comparison between newborn and 5-week-old mice and rats. 24, 588-598 (1970).
  8. Zulliger, R., Lecaudé, S., Eigeldinger-Berthou, S., Wolf-Schnurrbusch, U. E. K., Enzmann, V. Caspase-3-independent photoreceptor degeneration by N-methyl-N-nitrosourea (MNU) induces morphological and functional changes in the mouse retina. Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 249, 859-869 (2011).
  9. Tappeiner, C., et al. Characteristics of rod regeneration in a novel zebrafish retinal degeneration model using N-methyl-N-nitrosourea (MNU). PLOS One. 12, (2013).
  10. Bilotta, J., Saszik, S. The zebrafish as a model visual system. Int. J. Dev. Neurosci. 19, 621-629 (2001).
  11. Fleisch, C., Neuhauss, S. Visual Behavior in Zebrafish. Zebrafish. 3, 191-201 (2006).
  12. Hodel, C., Neuhauss, S. C. F., Biehmaier, O. Time course and development of light adaptation processes in the outer zebrafish retina. InterScience. 288, 653-662 (2006).
  13. Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends Genet. 29, (11), 611-620 (2013).
  14. Brockerhoff, S. E., Fadool, J. M. Genetics of photoreceptor degeneration and regeneration in zebrafish. Cell Mol. Life Sci. 68, 651-659 (2011).
  15. Brand, M., Granato, M., Nüsslein-Volhard, C. Keeping and raising zebrafish. Zebrafish: A Practical Approach. Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. IRL Press. 7-38 (2002).
  16. Tappeiner, C., Gerber, S., Enzmann, V., Balmer, J., Jazwinska, A., Tschopp, M. Visual acuity and contrast sensitivity of adult zebrafish. Front. Zool. 9, (1), 10 (2012).
  17. Bailey, T. J., Fossum, S. L., Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Hyde, D. R. The inhibitor of phagocytosis, O-phospho-L-serine, suppresses Müller glia proliferation and cone cell regeneration in the light-damaged zebrafish retina. Exp. Eye Res. 91, 601-612 (2010).
  18. Nelson, C. M., Hyde, D. R. Müller glia as a source of neuronal progenitor cells to regenerate the damaged zebrafish retina. Adv. Exp. Med. Biol. 723, 425-430 (2012).
  19. Prusky, G. T., Alam, N. M., Beekman, S., Douglas, R. M. Rapid quantification of adult and developing mouse spatial vision using a virtual optomotor system. Invest. Ophthalmol Vis. Sci. 45, (12), 4611-4616 (2004).
  20. Beck, J. C., Gilland, E., Tank, D. W., Baker, R. Quantifying the ontogeny of optokinetic and vestibulo-ocular behaviors in zebrafish, medaka, and goldfish. J. Neurophysiol. 92, (6), 3546-3561 (2004).
  21. Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Burket, C. T., Hyde, D. R. Regeneration of Inner Retinal Neurons after Intravitreal Injection of Ouabain in. Zebrafish. J. Neurosci. 27, 1712-1724 (2007).
  22. Sherpa, T., et al. Ganglion cell regeneration following whole-retina destruction in zebrafish. Dev. Neurobiol. 68, 166-181 (2008).
  23. Yurco, P., Cameron, D. A. Responses of Müller glia to retinal injury in adult zebrafish. Vision Res. 45, 991-1002 (2005).
Histolojik ve Fonksiyonel Özellikleri: Methylnitrosourea (MNU) Retina Dejenerasyonu ve Rejenerasyon Zebra balığı -kaynaklı
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Maurer, E., Tschopp, M., Tappeiner, C., Sallin, P., Jazwinska, A., Enzmann, V. Methylnitrosourea (MNU)-induced Retinal Degeneration and Regeneration in the Zebrafish: Histological and Functional Characteristics. J. Vis. Exp. (92), e51909, doi:10.3791/51909 (2014).More

Maurer, E., Tschopp, M., Tappeiner, C., Sallin, P., Jazwinska, A., Enzmann, V. Methylnitrosourea (MNU)-induced Retinal Degeneration and Regeneration in the Zebrafish: Histological and Functional Characteristics. J. Vis. Exp. (92), e51909, doi:10.3791/51909 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter