Summary
Aqui demonstramos quantificação de mento de retina e de regeneração e seu impacto na função visual usando N-metil-N -nitrosourea no peixe-zebra adulto. Perda da acuidade visual e um decréscimo no número de fotorreceptores foram seguidos por proliferação na camada nuclear interna. Regeneração morfológica e funcional completa ocorreu 30 dias após o tratamento inicial.
Abstract
Doenças degenerativas da retina, por exemplo, retinite pigmentosa, do que resulta uma conta de fotorreceptores danos para a maioria da perda de visão no mundo industrial. Os modelos animais são de importância fundamental para o estudo dessas doenças. A este respeito, a toxina específica de fotorreceptores N-metil-N -nitrosourea (MNU) tem sido amplamente utilizado em roedores para induzir farmacologicamente a degeneração retiniana. Anteriormente, nós estabelecemos um modelo de degeneração da retina induzida pelo MNU no peixe-zebra, um outro sistema modelo popular na pesquisa visual.
A diferença fascinante para os mamíferos é a neurogênese persistente na retina do peixe-zebra adulto e sua regeneração após lesão. Para quantificar esta observação nós empregamos medidas de acuidade visual no peixe-zebra adulto. Desse modo, o reflexo optocinético foi usado para acompanhar as mudanças funcionais em peixes não anestesiado. Isto foi complementado com histologia, assim como staini imunohistoquímicang para a apoptose (TUNEL) e proliferação (PCNA) para correlacionar as alterações morfológicas em desenvolvimento.
Em resumo, a apoptose de fotorreceptores ocorre três dias após o tratamento MNU, que é seguida por uma redução acentuada das células na camada nuclear externa (ONL). Depois disso, a proliferação de células na camada nuclear interna (INL) e ONL é observada. Aqui, nós revelamos que não é apenas uma histológica completa, mas também a regeneração funcional ocorre ao longo de um curso de tempo de 30 dias. Agora vamos ilustrar os métodos para quantificar e acompanhar mento de retina do peixe-zebra e regeneração usando MNU em um formato de vídeo.
Introduction
A visão é o sentido mais importante para o ser humano e sua deficiência tem um impacto socio-económico elevado. No mundo desenvolvido, as doenças degenerativas da retina são a principal causa de perda de visão e cegueira entre idosos 1. A causa da maioria das doenças degenerativas da retina é apenas parcialmente compreendida e soluções terapêuticas para recuperar a visão perdida são muito limitadas. Retinite pigmentosa é um exemplo típico de uma doença degenerativa da retina com a perda de fotorreceptores primários 2-3. -nitrosourea N-metil-N (MNU) induz degeneração da retina e é, portanto, amplamente usado em roedores para modelar doenças com fotorreceptores da morte celular primário 4. É um agente de alquilação e leva a tumores benignos e malignos, que geralmente aparecem vários meses após a exposição 5-7. Além disso, isso provoca a morte celular de fotorreceptores específica dentro de um período de observação curto prazo. Deste modo, a perda da camada da retina structure e adelgaçamento da retina significativa foi observada de um modo dependente da concentração. Células da glia da retina foram ativados, mas sem alterações no epitélio pigmentar da retina (EPR) foram encontrados. Retículo endoplasmático (ER) apoptose relacionada ao estresse parece ser a principal via de ação MNU na retina 8.
Temos recentemente introduzido MNU como um modelo químico para induzir a degeneração de fotorreceptores no peixe-zebra 9. Entre outras razões, o peixe-zebra (Danio rerio) tornou-se importante na pesquisa visual por causa das semelhanças de seu sistema visual ao de outros vertebrados 10. A retina externa contém os fotorreceptores, que podem ser agrupados em quatro tipos de cones diferentes, com sensibilidades de pico no ultravioleta, a curto, médio e longo comprimento de onda do espectro visível e uma haste tipo de fotorreceptores. Na camada nuclear interna (INL), os corpos celulares dos bipolares, horizontais e amácrinas interneurônios são encontrados, como o well como a soma das células de células glia de Müller. Na camada plexiforme exterior (OPL), os contactos sinápticos entre os fotorreceptores e a retina interna são formados, enquanto que a camada de células mais próximo da lente é a camada de células ganglionares (CG), que formam os componentes que compreendem longos axónios do nervo óptico e do trato óptico . Contactos sinápticos entre as células ganglionares e as células da camada nuclear interna são formadas na camada plexiforme interna (IPL) 11. O RPE está fora da retina neurossensorial e envolve os segmentos externos dos fotorreceptores com longa microvilosidades apical 12. Além disso, o peixe-zebra é altamente regenerativa e capazes de regenerar cérebro lesionado, a retina, a espinal medula, coração e outros tecidos 13. Quando ocorre lesão da retina, células do INL, que se pensa serem células de Müller, são activadas e têm o potencial para se diferenciar em diferentes tipos de células retinais. Além disso, geram também progenitores da haste, que estão localizados na ONL. Outro modource que abastece a retina de adultos peixe-zebra com novas células é a zona marginal ciliar. Esta fonte é necessária para alcançar uma densidade constante de bastonetes no contínuo crescimento olho zebrafish 14.
O modelo MNU pode ser utilizado como uma abordagem de degeneração / regeneração simples e reprodutível para o tecido da retina. Devido a certas semelhanças entre os processos biológicos em peixes-zebra e em seres humanos isso poderia abrir as portas para identificar vias de morte celular envolvidos e no rastreamento de possíveis drogas neuroprotetoras. Com base em um estudo anterior do nosso grupo, que agora ilustram os métodos deste modelo zebrafish induzido por MNU de mento de retina e consequente regeneração incluindo alterações funcionais com acordo laboratório vídeos 9.
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Protocol
Todos os experimentos aderiu à Declaração de Uso de Animais em Oftálmica e Visão Pesquisa da Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia (ARVO).
1. Os animais
- Manter o peixe-zebra de tipo selvagem (Danio rerio) da estirpe AB (Oregon) com idades entre 6-12 meses, sob condições padrão em água com uma temperatura de 26,5 ° C e uma 14/10 horas de luz / escuridão de 15.
- Siga as orientações de cuidados de animais das instituições envolvidas para os experimentos com animais após a aprovação pelo Serviço Veterinário Cantonal.
2. MNU Tratamento
- Prepare a água contendo 150 mg / L de substância seca de N-metil-N -nitrosourea (MNU). CUIDADO! MNU é tóxico; pode causar cancro, danos genéticos hereditários ou dano ao feto.
- Incubar peixe zebra na água contendo o MNU durante 60 min à temperatura ambiente.
- Lavar com peixe-zebra rapidamenteágua fresca e coloque o peixe para um novo tanque de peixes sem MNU. Manter peixes sob condições padrão, desde que desejado para os experimentos.
3. aferição da acuidade visual
- Inicie o sistema optomotor, escolha "testar" a partir do menu e configurar as opções para "Escada Simples", "Acuity (Freq)" e "Randomized / separado" 16.
- Instale um recipiente para perfusão com 500 ml de água de cerca de 1 m acima do sistema optomotor.
- Coloque um peixe-zebra na câmara de exame e conecte-o ao frasco de infusão. Coloque a câmara de exame no sistema optomotor.
- Inicie a medição e observar o movimento dos olhos em tempo real na tela do computador. Desse modo, uma resposta positiva ("sim") é definida como sacadas consecutivas na direção correta, enquanto que uma resposta negativa ("não") representa os movimentos oculares aleatórios semelhantes aos observados com a estaçãoary grades. Se os olhos da exposição zebrafish três ou mais respostas optocinéticas subseqüentes (Okr), pressione "sim"; se não, pressione "não".
- Extraia a acuidade visual, que foi calculada pelo software através da determinação do limiar da freqüência espacial do estímulo optocinético, em "Resultados" no menu.
4. Histologia
- Eutanásia do peixe-zebra com uma sobredosagem de acetato de 3-aminobenzoato metanossulfonato de (200-300 mg / l) e enuclear os olhos.
- Fixar os olhos inteiros em paraformaldeído a 4% (PFA) em tampão fosfato salino (PBS) a 4 ° C durante 12 horas e depois desidratar as amostras numa série de álcoois graduados.
- Encaixe as amostras em parafina, cortadas 5 mm de através da cabeça do nervo óptico (ONH) e montá-los em uma lâmina de vidro.
- Manchar a parafina deparaffized com hemalum durante 4 minutos e mergulhe as lâminas duas vezes em água destilada seguido de 0,2% aci clorídricod e 0,8% de amônia. Manchar as seções com eosina para 3 min após o desenvolvimento da coloração hemalum em água corrente por pelo menos 10 min (H & E).
- Encaixe das lâminas desidratadas em meio de montagem e observar as lâminas ao microscópio óptico.
5. Imunohistoquímica
- Desoxinucleotidil-transferase terminal dUTP nick marcação terminal (TÚNEL)
- Incubar as secções desparafinadas com 20 ug / ml de proteinase K à temperatura ambiente, durante 15 min. Lavam-se as secções, três vezes com solução salina tamponada com Tris (TBS) durante 5 minutos cada.
- Incubar as secções com 50 ul mistura reaccional de TÚNEL (solução de etiquetagem 10% e solução de enzima de 90%) numa câmara humidificada a 37 ° C durante 60 min. Lavar três vezes com TBS durante 5 minutos cada.
- Montar as lâminas com meio contendo DAPI montagem e observar as lâminas ao microscópio de fluorescência.
- Antígeno Nuclear (PCNA) coloração em proliferação celular
- Ferver as secções desparafinadas em tampão de recuperação de antigénios (Tris-EDTA + 0,05% de Tween 20, pH 9,0) durante 3 minutos e lavar três vezes com TBS durante 5 minutos cada. Bloquear com 100 ul de solução (TBS + 10% de soro de cabra + 1% de albumina de soro normal de bovino, pH 7,6) à temperatura ambiente de bloqueio durante 1 hr.
- Coram com anticorpos primários anti-PCNA em uma diluição de 1: 200 numa câmara humidificada a 4 ° C durante a noite. Lavar três vezes com TBS + Tween 20 durante 5 minutos cada.
- Terminar a detecção com os anticorpos secundários apropriados de uma diluição de 1: 500 a temperatura ambiente durante 1 hora.
- Montar as lâminas com meio contendo DAPI montagem e observar as lâminas ao microscópio de fluorescência.
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Representative Results
A acuidade visual:
O set-up experimental [freqüência espacial: 0.042 círculos / grau (c / d); Contraste: 100%; A velocidade de flutuação: 20 graus / segundo (d / src); volta luminância de luz: 152 cd / m 2] Este estudo permitiu a avaliação OKR de peixe-zebra adulto. A duração média da medição VA foi de cerca de 5 - 10 minutos para cada peixe-zebra, que toleraram bem o procedimento. A acuidade visual antes da exposição MNU era 0,577 ± 0,014 ciclos / grau (c / d). Figura 1 mostra o decurso da acuidade visual após a aplicação de 150 mg / L MNU. A partir de dia 1, as medições revelaram uma diminuição acentuada da acuidade visual, atingindo valores mínimos no dia 3 Começando a partir do dia 8, um aumento da acuidade visual ocorre, mostrando uma recuperação total da acuidade visual de 30 dias após a exposição MNU. Para uma análise estatística ANOVA unidirecional, seguida pelo teste de comparações múltiplas de Bonferroni foi aplicado. Desse modo, as diferenças de acuidade visual entren linha de base e medidas após o tratamento foi significativa para os dias 1, 3, 5 e 8 (p <0.001, cada), mas não para os dias 15 e 30.
A avaliação histológica da degeneração da retina:
H & E de coloração foi utilizado para quantificar as alterações morfológicas no olho de um peixe-zebra por ponto de tempo (n = 3) na linha de base, bem como 3, 8, 15, e 30 dias após o tratamento (Figura 2). O estudo histológico foi realizado como descrito por Tappeiner et al. 9. Deste modo, degeneração da retina, incluindo a interrupção da formação do INL e da cavidade da ONL foi observada a partir de 3 dias o número de células na camada de células ganglionares (CG), a camada nuclear interna (INL) e o número de haste (RN) e cone (CN) fotorreceptores foram determinados manualmente 250 um a partir do centro da ONH em ambos os lados da secção de olho (tamanho da área contada refere-se a uma secção de retina de 100 mm de comprimento). A degeneração foi seguido por 30dias após o tratamento com o máximo de perda da haste ONL encontrado no dia 8 Deste modo, o número de fotorreceptores bastonete (RN) diminuiu para 82% no dia 3, 71% no dia 8 e 77% nos dias 15 e 30 do número original . Além disso, a acumulação de aglomerados de células foi encontrado, principalmente, no INL.
A quantificação da apoptose:
TUNEL foi realizada de acordo com o fabricante (In situ Morte celular Kit de Detecção; Roche Applied Sciences, Rotkreuz, Suíça). A degeneração da retina observada após tratamento MNU era causado por apoptose. Isto foi revelado por uma coloração positiva de TUNEL em diferentes camadas de células na retina sensorial. Para a quantificação, o número de células positivas TÚNEL foi determinada manualmente em duas áreas da retina de comprimento 450 uM cada, a partir da periferia da retina. Deste modo, a maioria das células positivas TÚNEL foi encontrado no ONL no dia 3 No entanto, as células moribundas foram também observadas no INL em que ponto de tempo (Figura 3). Não células TUNEL-positivas relevantes foram detectados antes do tratamento.
A quantificação da proliferação celular:
Para avaliar a proliferação, após a morte das células, as retinas foram coradas para a proteína nuclear de proliferação celular (PCNA), como descrito por Tappeiner et al. 9. Para a quantificação, o número de células PCNA positivas foram determinadas manualmente como descrito acima. A morte celular foi seguido pela proliferação induzida visto como células PCNA positivas (Figura 4). Deste modo, o número máximo de células em proliferação foi medida no INL no dia 5 Além disso, as células da ONL (principalmente bastonetes) apresentou coloração positiva para PCNA, até ao final do estudo (dia 30). Poucas células PCNA-positivas na zona marginal ciliar foram detectados antes e em todos os pontos de tempo após o tratamento.
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Figura 1:. Acuidade visual medida da acuidade visual no peixe-zebra adultos após a aplicação de 150 mg / L MNU. Diminuição significativa da acuidade visual com um mínimo no dia 3 pós-tratamento foi seguido de recuperação completa, começando no dia 5, até o dia 30 (média ± SD, n = 3).
Figura 2: Exemplos de Histologia H & E manchadas de cortes histológicos da retina do peixe-zebra na linha de base (A) e 3 (B), 8 (C), 15 (D) e 30 (E) dias após o tratamento MNU.. NC, núcleos de cone; RN, núcleos da haste; INL, camada nuclear interna; GC, camada de células ganglionares. As setas marcam grupos de células no INL. A barra de escala é igual a 50 um.
Células TUNEL-positivo TUNEL-positivo (vermelho) na retina do peixe-zebra no dia 3 após o tratamento MNU: Figura 3.. As células foram localizadas principalmente no ONL, mas também foram encontrados no INL. O painel A descreve o controlo, enquanto que o painel B mostra as imagens após tratamento MNU. A barra de escala indica 50 um.
Figura 4:. Células PCNA positivas células PCNA positivas (vermelho) em retina de peixe-zebra a 5 dias após o tratamento MNU comparação com a amostra de controlo. O painel A descreve o controlo, enquanto que o painel B mostra as imagens após tratamento MNU. A barra de escala indica 100 pm.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | A6283 | |
| Ammonia | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 294993 | 0.80% |
| Bovine serum albumine (BSA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 05470 | |
| Dako Pen | Dako, Glostrup, Danmark | S2002 | |
| DAPI mounting medium | Vector Labs, Burlingame, CA, USA | H-1200 | |
| Eosin | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 45260 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 2860 | 100%, 96%, 70% |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | ED | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | E10521 | Tricaine |
| Eukitt | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 3989 | |
| Goat anti-rabbit Alexa 594 | Life Technologies, Zug, Switzerland | A11012 | |
| Goat normal serum | Dako, Glostrup, Danmark | X0907 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 320331 | 0.20% |
| In situ Cell Death Detection Kit | Roche Applied Sciences, Rotkreuz, Switzerland | 11684795910 | TUNEL Kit |
| Mayer's hemalum solution | Merck, Darmstadt, Germany | 109249 | |
| Methylnitrosourea (MNU) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | N4766 | Toxic |
| OptoMotry | CerebralMechanics, Lethbridge, AB, Canada | n.a. | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P6148 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5368 | |
| Proteinase K | Dako, Glostrup, Danmark | S3004 | |
| Rabbit anti-PCNA | Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA | sc-33756 | |
| Superfrost Plus glass slides | Gehard Menzel GmbH, Braunschweig, Germany | 10149870 | |
| Tris buffered saline (TBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5912 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | T1503 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P1379 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 534056 | |
| Zebrafish (Danio rerio) AB (Oregon) strain | University of Fribourg, Dept. of Biology | n.a. | Own fish facility |
References
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