Summary
Ici, nous démontrons la quantification des ment de la rétine et de la régénération et de son impact sur la fonction visuelle en utilisant la N -nitrosourea de N chez le poisson zèbre adulte. Baisse de l'acuité visuelle et une diminution du nombre de photorécepteurs ont été suivis par une prolifération dans la couche nucléaire interne. Régénération morphologique et fonctionnelle complète a eu lieu 30 jours après le traitement initial.
Abstract
Maladies dégénératives de la rétine, par exemple, la rétinite pigmentaire, avec des dommages de photorécepteur compte résultant pour la plupart de la perte de vision dans le monde industriel. Les modèles animaux sont d'une importance cruciale pour étudier ces maladies. À cet égard, la toxine spécifique photorécepteur N de -nitrosourea de N (MNU) a été largement utilisé chez les rongeurs pour induire pharmacologiquement dégénérescence rétinienne. Auparavant, nous avons établi un modèle de dégénérescence rétinienne MNU-induite chez le poisson zèbre, un autre système de modèle populaire dans la recherche visuelle.
Une différence fascinant pour les mammifères est la neurogenèse persistante chez l'adulte rétine de poisson zèbre et sa régénération après une lésion. Pour quantifier cette observation, nous avons utilisé des mesures de l'acuité visuelle chez le poisson zèbre adulte. De ce fait, le réflexe optocinétique a été utilisé pour suivre les changements fonctionnels chez les poissons non-anesthésié. Ceci a été complété par l'histologie ainsi que staini immunohistochimiqueng de l'apoptose (TUNEL) et la prolifération (PCNA) afin de corréler les changements morphologiques en développement.
En résumé, l'apoptose des photorécepteurs se produit trois jours après le traitement MNU, qui est suivie par une réduction marquée de cellules dans la couche nucléaire externe (ONL). Par la suite, la prolifération des cellules de la couche nucléaire interne (INL) et ONL est observée. Ici, nous révélons que non seulement une complète histologique mais aussi une régénération fonctionnelle se produit sur un parcours de temps de 30 jours. Maintenant, nous illustrons les méthodes de quantification et le suivi ment de la rétine de poisson zèbre et la régénération utilisant MNU dans une vidéo au format.
Introduction
Vision est le sens le plus essentiel pour l'être humain et sa dépréciation a un impact socio-économique élevé. Dans le monde développé, les maladies dégénératives de la rétine sont la principale cause de perte de vision et de cécité chez les personnes âgées 1. La cause de la plupart des maladies dégénératives de la rétine n'est que partiellement comprise et solutions thérapeutiques pour retrouver la vision perdue sont très limitées. La rétinite pigmentaire est un exemple typique d'une maladie dégénérative de la rétine avec une perte des photorécepteurs primaire 2-3. N-méthyl-N -nitrosourea (MNU) induit la dégénérescence rétinienne et est donc largement utilisée chez les rongeurs pour modéliser les maladies avec photorécepteur primaire mort cellulaire 4. Il s'agit d'un agent d'alkylation et conduit à des tumeurs bénignes et malignes, qui apparaissent habituellement plusieurs mois après l'exposition 7.5. En outre, il provoque photorécepteur spécifique de mort cellulaire dans une période d'observation de courte durée. De ce fait, la perte de la couche rétinienne structure et l'amincissement de la rétine significative a été observée d'une manière dépendante de la concentration. Les cellules gliales de la rétine ont été activés, mais aucun changement dans l'épithélium pigmentaire rétinien (EPR) ont été trouvés. Réticulum endoplasmique (ER) de l'apoptose liée au stress semble être la principale voie d'action MNU dans la rétine 8.
Nous avons récemment introduit MNU comme un modèle chimique pour induire une dégénérescence des photorécepteurs chez le poisson zèbre 9. Parmi d'autres raisons, le poisson zèbre (Danio rerio) a pris de l'importance dans la recherche visuelle en raison des similitudes de son système visuel à celle des autres vertébrés 10. La rétine externe contient les photorécepteurs, qui peuvent être regroupés en quatre types de cônes différents avec des sensibilités de pointe dans l'ultraviolet, à court, moyen et à long longueur d'onde du spectre visible et une tige type de photorécepteur. Dans la couche nucléaire interne (INL), les corps cellulaires des bipolaires, horizontales et amacrines interneurones se trouvent, comme well en tant que corps cellulaire des cellules gliales Muller. Dans la couche plexiforme externe (OPL) des contacts synaptiques entre les photorécepteurs et la rétine interne sont formées, tandis que la couche cellulaire la plus proche de la lentille est la couche des cellules ganglionnaires (GC), les composants qui forment de longs axones comprenant le nerf optique et la bandelette optique . Des contacts synaptiques entre les cellules ganglionnaires et les cellules de la couche nucléaire interne sont formées dans la couche plexiforme interne (IPL) 11. L'EPR est en dehors de la rétine neurosensorielle et entoure les segments externes des photorécepteurs avec longues microvillosités apicale 12. En outre, le poisson zèbre est très régénérative et en mesure de repousser cerveau lésé, la rétine, la moelle épinière, le cœur et d'autres tissus 13. Lorsque se produit une lésion rétinienne, les cellules dans la INL, qui l'on pense être les cellules de Müller, sont activés et ont le potentiel de se différencier en différents types de cellules rétiniennes. De plus, ils produisent également des progéniteurs de la tige, qui sont situés dans l'ONL. Une autre manièreurce qui fournit la rétine de poisson zèbre adulte avec de nouvelles cellules est la zone marginale ciliaire. Cette source est nécessaire pour obtenir une densité constante de photorécepteurs de la tige dans le poisson zèbre œil croissance continue 14.
La MNU modèle peut être utilisé comme une approche simple et reproductible dégénérescence / régénération de tissu rétinien. En raison de certaines similitudes entre les processus biologiques chez le poisson zèbre et chez l'homme ce qui pourrait ouvrir les portes à identifier impliqués voies de mort cellulaire et de cribler des médicaments potentiellement neuroprotecteurs. Basé sur une étude précédente de notre groupe, nous illustrons maintenant les méthodes de ce modèle de poisson zèbre MNU induite par ment de la rétine et la régénération conséquente y compris les changements fonctionnels avec selon laboratoire vidéos 9.
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Protocol
Toutes les expériences ont adhéré à la Déclaration de l'utilisation d'animaux dans ophtalmique et Vision Research de l'Association pour la recherche en vision et en ophtalmologie (ARVO).
1. Animaux
- Maintenir le poisson zèbre de type sauvage (Danio rerio) de la souche AB (Oregon) âgés de 6-12 mois dans des conditions standard dans l'eau avec une température de 26,5 ° C et un 14/10 h cycle lumière / obscurité 15.
- Suivez les directives de protection des animaux des établissements concernés pour les expériences sur les animaux après l'approbation par l'Office vétérinaire cantonal.
2. Traitement MNU
- Préparez de l'eau contenant 150 mg / L de matière sèche de la N -nitrosourea de N (MNU). ATTENTION! MNU est toxique; peut causer le cancer, des dommages génétiques héréditaires ou néfastes pour l'enfant à naître.
- Incuber le poisson-zèbre dans de l'eau contenant le MNU pendant 60 min à température ambiante.
- Rincez le poisson zèbre rapidement avecl'eau douce et de mettre le poisson à un nouveau réservoir de poissons sans MNU. Maintenir le poisson dans des conditions standard aussi longtemps que désiré pour les expériences.
3. acuité mesure
- Démarrez le système optomoteur, choisissez «testing» dans le menu et définissez les options pour "Escalier simple», «Acuity (Freq)» et «randomisés / indépendante» 16.
- Installez une bouteille de perfusion remplie de 500 ml d'eau environ 1 m au-dessus du système de optomoteur.
- Placez un poisson zèbre dans la chambre d'examen et le connecter à la bouteille de perfusion. Placer la chambre d'examen dans le système optomoteur.
- Lancer la mesure et observer le mouvement de l'œil en temps réel sur l'écran de l'ordinateur. Ainsi, une réponse positive ("oui") est défini comme saccades consécutives dans le bon sens, alors qu'une réponse négative («non») représente les mouvements aléatoires des yeux semblables à ceux observés avec la stationréseaux aires. Si les yeux de l'exposition du poisson zèbre trois ou plusieurs réponses optocinétiques ultérieures (OKR), appuyez sur «oui»; sinon, appuyez sur «non».
- Extrait de l'acuité visuelle, qui a été calculé par le logiciel en déterminant le seuil de la fréquence spatiale de la stimulation optocinétique, dans "Résultats" dans le menu.
4. histologie
- Euthanasier le poisson zèbre par une surdose d'éthyle 3-aminobenzoate méthanesulfonate (2-300 mg / L) et énucléer les yeux.
- Fixer les yeux entiers dans 4% de paraformaldehyde (PFA) dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à 4 ° C pendant 12 heures et ensuite déshydrater les échantillons dans une série graduée d'alcool.
- Intégrer les échantillons dans de la paraffine, couper 5 um sections à travers la tête du nerf optique (TNO) et les monter sur une lame de verre.
- Colorer les coupes de paraffine deparaffized avec Hémalun pendant 4 min et plongez les lames deux fois à l'eau distillée puis de 0,2% aci chlorhydriqued et 0,8% d'ammoniac. Colorer les sections avec de l'éosine pour 3 mn après le développement de la coloration à l'hémalun dans l'eau du robinet pendant au moins 10 min (H & E).
- Intégrer les diapositives déshydratés dans un milieu de montage et d'observer les lames au microscope optique.
5. immunohistochimie
- Désoxynucléotidyltransférase Terminal dUTP nick étiquetage de fin (TUNEL)
- Incuber les sections déparaffinées avec 20 ug / ml de protéinase K à la température ambiante pendant 15 min. Laver les sections trois fois avec une solution saline tamponnée Tris (TBS) pendant 5 minutes chacun.
- Incuber les sections du mélange de réaction de 50 ul TUNEL (marquage de la solution de 10% et une solution d'enzyme à 90%) dans une chambre humidifiée à 37 ° C pendant 60 min. Laver trois fois avec du TBS pendant 5 minutes chacun.
- Monter les lames avec un milieu contenant DAPI de montage et d'observer les lames au microscope à fluorescence.
- Cellulaire antigène nucléaire (PCNA) coloration
- Faire bouillir les sections déparaffinées dans du tampon de récupération d'antigène (Tris-EDTA + 0,05% de Tween 20, pH 9,0) pendant 3 minutes et laver trois fois avec du TBS pendant 5 minutes chacun. Bloquer avec 100 ul de solution (TBS + 10% sérum de chèvre + 1% d'albumine de sérum de bovin normal, pH 7,6) à la température ambiante pendant 1 heure blocage.
- Colorer avec des anticorps primaires anti-PCNA dans une dilution 1: 200 dans une chambre humidifiée à 4 ° C pendant une nuit. Laver trois fois avec du TBS + Tween 20 pendant 5 minutes chacun.
- Terminer la détection avec des anticorps secondaires appropriés à une dilution de 1: 500 à température ambiante pendant 1 heure.
- Monter les lames avec un milieu contenant DAPI de montage et d'observer les lames au microscope à fluorescence.
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Representative Results
Acuité visuelle:
Le dispositif expérimental [de fréquence spatiale: 0.042 cercles / degré (c / d); contraste: 100%; vitesse de dérive: 20 degrés / seconde (d / src); retour luminance lumineuse: 152 cd / m 2] de cette étude a permis évaluation Oberkirchenrätin de poisson zèbre adulte. La durée moyenne de mesure VA était d'environ 5 - 10 minutes pour chaque poisson zèbre, qui bien toléré la procédure. L'acuité visuelle avant l'exposition MNU était 0,577 ± 0,014 cycles / degré (c / d). Figure 1 montre l'évolution de l'acuité visuelle après application de 150 mg / L MNU. À partir du jour 1, les mesures ont révélé une nette diminution de l'acuité visuelle, atteignant des valeurs minimales à jour 3. partir du jour 8, une augmentation de l'acuité visuelle se produit, indiquant une reprise complète de l'acuité visuelle 30 jours après l'exposition MNU. Pour une analyse statistique ANOVA à une voie suivie par le test de comparaisons multiples de Bonferroni a été appliquée. De ce fait, les différences de l'acuité visuelle between référence et des mesures après le traitement était significative pour les jours 1, 3, 5 et 8 (p <0,001, chacun), mais pas pour les jours 15 et 30.
L'évaluation histologique de la dégénérescence de la rétine:
Coloration H & E a été utilisée pour quantifier des changements morphologiques dans un oeil du poisson zèbre par point de temps (n = 3) au début du traitement, ainsi que 3, 8, 15, et 30 jours après le traitement (figure 2). L'histologie a été réalisée comme décrit par Tappeiner et al. 9. De ce fait, la dégénérescence de la rétine y compris la perturbation de l'INL et cavité formation de l'ONL a été observée en commençant au jour 3, le nombre de cellules dans la couche des cellules ganglionnaires (GC), la couche intérieure nucléaire (INL) et le nombre de tige (RN) et du cône (CN) ont été déterminés manuellement photorécepteurs 250 um à partir du centre de la papille optique sur les deux côtés de la section de l'oeil (la taille de la zone compté se réfère à un article de la rétine de 100 pm de longueur). La dégénérescence a été suivie pendant 30jours après le traitement avec le maximum de perte tige ONL trouvé le jour 8 De ce fait, le nombre de photorécepteurs de tige (RN) a diminué de 82% au jour 3, 71% au jour 8 et 77% en 15 jours et 30 du nombre initial . En outre, l'accumulation des agrégats de cellules a été constaté, notamment dans le INL.
La quantification de l'apoptose:
Coloration TUNEL a été réalisée selon le fabricant (Dans la cellule in situ kit de détection de la mort; Roche Applied Sciences, Rotkreuz, Suisse). La dégénérescence de la rétine observée après le traitement MNU a été causé par apoptose. Cela a été révélé par coloration TUNEL positif dans différentes couches de cellules de la rétine sensorielle. Pour la quantification, le nombre de cellules TUNEL-positives a été déterminé manuellement à deux zones de la rétine de 450 pm de longueur chacun, à partir de la périphérie de la rétine. De ce fait, la majorité des cellules positives au TUNEL a été trouvée dans l'ONL à 3 jours Cependant, les cellules mourantes ont également été observés dans l'INL à ce point dans le temps (Figure 3). Pas de cellules TUNEL positives pertinentes étaient détectables avant le traitement.
La quantification de la prolifération cellulaire:
Afin d'évaluer la prolifération cellulaire après la mort, les rétines ont été colorées pour antigène nucléaire de prolifération cellulaire (PCNA), comme décrit par Tappeiner et al. 9. Pour la quantification, le nombre de cellules positives pour PCNA a été déterminée manuellement comme décrit ci-dessus. La mort cellulaire a été suivie par la prolifération induite par les cellules considérées comme PCNA-positif (figure 4). De ce fait, le maximum de cellules en prolifération a été mesurée à l'INL à J5 En outre, les cellules dans la ONL (principalement des tiges) ont présenté une coloration positive pour PCNA jusqu'à la fin de l'étude (jour 30). Peu de cellules PCNA-positives dans la zone marginale ciliaire étaient détectables avant et à tous les points de temps après le traitement.
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Figure 1:. Acuité visuelle Mesure de l'acuité visuelle chez le poisson zèbre adulte après l'application de 150 mg / L MNU. Diminution significative de l'acuité visuelle avec un minimum à un post-traitement jour 3 a été suivie par un rétablissement complet, à compter du jour 5, jusqu'au jour 30 (moyenne ± SD, n = 3).
Figure 2: Histologie exemples de H & E colorées coupes histologiques de la rétine de poisson zèbre au départ (A) et 3 (B), 8 (C), 15 (D), et 30 (E) jours après le traitement MNU.. NC, les noyaux coniques; RN, des noyaux de la tige; INL, couche nucléaire interne; CG, couche de cellules ganglionnaires. Les flèches indiquent des agrégats de cellules dans la INL. La barre d'échelle est égal à 50 um.
Des cellules de TUNEL positif TUNEL-positives (rouges) dans la rétine de poisson zèbre à jour 3 après le traitement MNU: Figure 3.. Les cellules ont été principalement situées dans l'ONL, mais ont également été trouvés dans l'INL. Un panneau représente le contrôle, tandis que le panneau B montre les images après le traitement MNU. La barre d'échelle indique 50 um.
Figure 4:. Cellules PCNA-positifs cellules PCNA-positives (rouges) dans la rétine de poisson zèbre à 5 jours après le traitement MNU par rapport à l'échantillon témoin. Un panneau représente le contrôle, tandis que le panneau B montre les images après le traitement MNU. La barre d'échelle indique 100 um.
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Discussion
Auparavant, notre groupe a transféré le modèle MNU de dégénérescence des photorécepteurs de rongeurs dans le système poisson-zèbre 9. Les événements qui ont suivi ont été décrits et suivis pendant 30 jours. En cette période de dégénérescence rétinienne morphologique complet et la régénération se sont produits après le traitement initial. Tout d'abord, l'histologie révèle une cellule de tige réduite compter du jour 3 avec un minimum à jour 8 En conséquence, la coloration TUNEL identifie l'apoptose des photorécepteurs à bâtonnets 3 jours après le traitement MNU. La régénération commence dans la INL au jour 3, avec un maximum à 5 jours Dans la ONL, les cellules en prolifération peuvent être observées à la fin de la période d'observation, avec un maximum à 5 jours Ceci est en contraste avec l'INL où aucune prolifération accrue a été observée après 15 jours de la zone marginale ciliaire est le seul emplacement de la rétine où quelques cellules positives PCNA ont été trouvés dans la rétine non traité. Cela indique une zone de la rétine en permanence la neurogenèse Throughout vie 14. L'identification des types cellulaires impliqués dans la régénération des photorécepteurs endommagés pharmacologique chez le poisson zèbre n'était pas dans la mise au point de ce manuscrit. Cependant, dans les publications précédentes la procédure a été suivie pour les cellules régénératrices de l'INL qui ont été proposées pour les cellules de Müller 9,17,18.
Dans la présente étude, nous avons également évalué les changements fonctionnels dans le modèle de poisson zèbre MNU-induite. Pour quantifier la fonction visuelle chez les poissons adultes, l'évaluation de la Oberkirchenrätin a été utilisé, une de plusieurs techniques pour mesurer de manière fiable l'acuité visuelle (VA) des petits animaux 19. Ainsi, l'OKR, basé sur un comportement inné, n'a pas besoin de formation de temps avant de les animaux 20. En outre, comme le Oberkirchenrätin peut être obtenue de façon répétée indépendamment de la coopération entre les animaux, et les grands yeux peut facilement être observé, l'évaluation de l'OKR est une méthode idéale pour suivre l'acuité visuelle During dégénérescence et régénération chez le poisson zèbre. OKR mesures dans la présente étude ont révélé une diminution de l'acuité visuelle jusqu'à ce jour 3, suivie d'une remise en état complète de la fonction visuelle le jour 30 Ceci est en accord avec les changements histologiques de dégivrage et de régénération après l'application MNU qui présente un maximum à l'apoptose 3 jours.
Un avantage de ce modèle est que sa simplicité MNU est rapide à préparer et peut être directement dissoute dans le réservoir d'eau du poisson zèbre. Le traitement du poisson zèbre avec MNU est effectuée en une heure. Le nombre de poissons qui peut être traité en masse est limitée seulement par la taille de l'aquarium. Dans l'ensemble, ce qui permet induction simple de la dégénérescence de la rétine dans un grand nombre de poissons zèbres sans la nécessité de manipulation d'individus. Par conséquent, ce modèle est moins invasive que les autres modèles de la dégénérescence de la rétine qui utilisent intravitréennes ou chirurgicales techniques induites 21-23 et il peut ainsi présenter une meilleure reproductibilité.
En général, ce modèle MNU poisson zèbre est un outil polyvalent pour induire une dégénérescence spécifique au photorécepteur et à visualiser la régénération suivante, non seulement morphologique mais aussi fonctionnel. Par conséquent, nous sommes convaincus que le modèle permet de mieux comprendre la dégénérescence et le processus de régénération de la rétine sensorielle en général et ouvre la possibilité de comparer ses résultats avec le système de mammifère.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | A6283 | |
| Ammonia | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 294993 | 0.80% |
| Bovine serum albumine (BSA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 05470 | |
| Dako Pen | Dako, Glostrup, Danmark | S2002 | |
| DAPI mounting medium | Vector Labs, Burlingame, CA, USA | H-1200 | |
| Eosin | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 45260 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 2860 | 100%, 96%, 70% |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | ED | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | E10521 | Tricaine |
| Eukitt | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 3989 | |
| Goat anti-rabbit Alexa 594 | Life Technologies, Zug, Switzerland | A11012 | |
| Goat normal serum | Dako, Glostrup, Danmark | X0907 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 320331 | 0.20% |
| In situ Cell Death Detection Kit | Roche Applied Sciences, Rotkreuz, Switzerland | 11684795910 | TUNEL Kit |
| Mayer's hemalum solution | Merck, Darmstadt, Germany | 109249 | |
| Methylnitrosourea (MNU) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | N4766 | Toxic |
| OptoMotry | CerebralMechanics, Lethbridge, AB, Canada | n.a. | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P6148 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5368 | |
| Proteinase K | Dako, Glostrup, Danmark | S3004 | |
| Rabbit anti-PCNA | Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA | sc-33756 | |
| Superfrost Plus glass slides | Gehard Menzel GmbH, Braunschweig, Germany | 10149870 | |
| Tris buffered saline (TBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5912 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | T1503 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P1379 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 534056 | |
| Zebrafish (Danio rerio) AB (Oregon) strain | University of Fribourg, Dept. of Biology | n.a. | Own fish facility |
References
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