Summary
在这里我们展示视网膜脱离和再生，对以N甲基 -N- -nitrosourea在成年斑马鱼的视觉功能的影响进行量化。其次是在内核层扩散视力丧失和降低光感受器号。发生完整的形态和功能恢复的初步治疗后30天。
Abstract
视网膜退行性疾病， 如视网膜色素变性，用得到的，为广大视力下降，在工业领域感光伤害帐户。动物模型是至关重要的意义，研究这种疾病。在这方面，在感光体特异性毒素N-甲基-N- -nitrosourea（MNU）已被广泛用于在啮齿动物药理学诱导的视网膜变性。此前，我们已经建立了MNU诱导的视网膜变性模型中的斑马鱼，在视觉研究的另一种流行的模型系统。
一个迷人的区别是哺乳动物在成年斑马鱼视网膜损伤后的再生持续神经。为了量化这一观察，我们在成年斑马鱼使用视力的测量。由此，视动反射被用于跟随在非麻醉的鱼的功能变化。这补充了组织学以及免疫staini吴凋亡（TUNEL）和增殖（PCNA）关联的发展形态变化。
综上所述，光感受器细胞凋亡MNU治疗，随后是细胞中的外核层（ONL）的显着降低三天之后出现。此后，将细胞在内核层（INL）和ONL的增殖被观察。在此，我们表明，不仅是一个完整的组织，而且功能性再生发生在30天的时间过程。现在我们说明的方法来量化和跟进的视频格式使用的MNU斑马鱼视网膜脱离和再生。
Introduction
视觉是最重要的意义的人及其损害具有较高的社会经济影响。在发达国家，视网膜变性疾病是视力减退和失明的老年人中1的主要原因。最退行性视网膜疾病的原因只是部分了解和治疗方案，以夺回失去的视力是非常有限的。视网膜色素变性是视网膜变性疾病的原发性感光损失2-3。n的典型例子甲基 -N -nitrosourea（MNU）诱导的视网膜变性，因此被广泛应用在啮齿类动物模型与主光感受器细胞死亡4疾病。它是一种烷化剂，并导致良性和恶性肿瘤，通常会出现曝光5-7后几个月。此外，它会导致短期的观察期间内特定光感受器细胞死亡。由此，视网膜层structu的损失重和显著视网膜变薄了以浓度依赖性方式观察到。视网膜神经胶质细胞被激活，但在视网膜色素上皮细胞（RPE）没有变化被发现。内质网（ER）应激相关的细胞凋亡似乎是MNU作用的主要途径在视网膜8。
我们最近推出的MNU作为一种化学模型诱导光感受器变性斑马鱼9。除了 其他原因，斑马鱼（ 斑马鱼 ）已成为因为它的视觉系统对其他脊椎动物10的相似之处在视觉研究很重要。外层视网膜包含感光体，它可被分成四个不同的锥面类型具有峰值灵敏度的紫外线，短，中等，和可见光谱的长波长和一个视杆型。在内核层（INL）的双极性，水平和无长突的interneurons细胞体被发现，如WELl与穆勒胶质细胞的胞体。在所述外丛状层（OPL）的光感受器和视网膜内层之间的突触联系形成的，而最接近透镜的细胞层是神经节细胞层（GC），该组件形成长轴突包括视神经和视束。神经节细胞和细胞中的内核层之间的突触联系形成于内网层（IPL）11。视网膜色素上皮所在的视网膜神经上皮层外，并围绕光感受器外段长微绒毛顶端12。此外，斑马鱼是高度再生，并能够再生毁损脑，视网膜，脊髓，心脏和其他组织13。当视网膜损伤时，细胞中的INL，这被认为是Müller细胞，被激活并具有分化成多种视网膜细胞类型的潜力。此外，它们还产生棒祖细胞，它们分别位于外核层。另一个让urce供给成年斑马鱼视网膜有新生细胞的纤毛边缘区。这个源是需要实现的视杆细胞的恒定密度的不断增长的斑马鱼眼14。
在MNU模型可以用作视网膜组织的简单和可再现的变性/再生方法。由于在斑马鱼中的生物过程的某些相似性和在人体中，这可能打开门，以确定参与细胞死亡途径，筛选潜在的神经保护药物。根据我们组先前的研究，我们现在说明这MNU诱导斑马鱼视网膜脱离和随之而来的再生包括根据实验室影片9功能变化模型的方法。
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Protocol
所有实验坚持以声明的动物眼科及研究协会在视觉视觉研究与眼科（ARVO）使用。
1，动物
- 维持公司（俄勒冈州）水标准条件下6-12个月之间以26.5℃的温度和14/10小时的光/暗周期15株野生型斑马鱼（ 斑马鱼 ）。
- 按照参与机构的审批由州兽医局后，经动物实验动物照护指引。
2，MNU处理
- 制备含有氮甲基 -N- -nitrosourea（MNU）150毫克/升干燥物质的水。注意！ MNU是有毒的;可能会导致癌症，遗传性的损害或伤害胎儿。
- 孵育斑马鱼中含有MNU，在室温下60分钟的水。
- 迅速用清水冲洗斑马鱼淡水把鱼到一个新的鱼缸没有MNU。维持标准的条件，只要所需的实验下的鱼。
3，视力测量
- 启动optomotor系统，从菜单中选择“测试”，并设置选项，以“简单楼梯”，“视力（频率）”和“随机/独立”16。
- 安装的输液瓶填充500ml水约1μm的optomotor系统之上。
- 将一个斑马鱼在考试室，并把它连接到输液瓶。放置在optomotor系统的检查室。
- 开始测量和观察计算机屏幕上实时眼球运动。因此，积极响应（“是”）被定义为连续扫视了正确的方向，而一个否定的答复（“无”）代表随机眼球运动相似，与那些观测站进制光栅。如果斑马鱼表现出的眼里三个或更多的后续视动反应（OKR），按“是”;如果没有，请按“不”。
- 提取的视力，其中已计算由软件通过确定视动刺激的空间频率的阈值时，根据菜单中的“结果”。
4，组织学
- 由乙基3 - 氨基苯甲酸酯（200-300毫克/升）的过量安乐死斑马鱼和去核的眼睛。
- 在4℃下12小时固定整个眼睛用4％多聚甲醛（PFA）在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，然后脱水的样品在梯度醇系列。
- 嵌入样品中石蜡，切5微米的部分通过视神经乳头（ONH）和它们安装在载玻片上。
- 染色deparaffized石蜡切片用hemalum为4分钟，浸在幻灯片两次蒸馏水中后0.2％的盐酸ACID和0.8％的氨。染色用曙红的部分自来水中发展hemalum染色至少10分钟（H＆E）后3分钟。
- 嵌入在安装介质中的脱水幻灯片，观察光镜下的幻灯片。
5，免疫组化
- 末端脱氧核苷酸转移酶缺口末端标记法（TUNEL）
- 孵育20微克/毫升的蛋白酶K的去石蜡切片在室温下搅拌15分钟。用Tris洗部分三次，每次5分钟缓冲盐水（TBS）。
- 孵化用50μlTUNEL反应混合物（10％标记溶液和90％的酶溶液）的部分，在湿润室中于37℃进行60分钟。用TBS，每次5分钟洗涤3次。
- 安装带安装含有DAPI介质的幻灯片，并观察在荧光显微镜下的滑动。
- 增殖细胞核抗原（PCNA）染色
- 沸腾在抗原修复缓冲液（Tris-EDTA + 0.05％吐温20，pH9.0）中的脱石蜡切片3分钟，洗三次，用TBS，每次5分钟。用100μl封闭溶液（TBS +10％山羊正常血清+1％牛血清白蛋白，pH7.6）中，在室温下搅拌1小时阻断。
- 用在1抗PCNA的初级抗体染色1:200稀释，在湿润室中于4℃下过夜。用TBS +吐温20，每次5分钟洗涤3次。
- 完成检测与在1相应的二级抗体1:500稀释，在室温下搅拌1小时。
- 安装带安装含有DAPI介质的幻灯片，并观察在荧光显微镜下的滑动。
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Representative Results
视力：
该实验装置[空间频率：0.042圆/度（C / D）;对比度：100％;漂移速度：20度/秒（D / SRC）;背光亮度：本研究的152 cd /米2]启用成年斑马鱼OKR评估。 VA测量的平均持续时间大约为5 - 10分钟，每一个斑马鱼，其耐受性的方法好。 MNU曝光前视力为0.577±0.014周/度（C / D）， 图1示出了视觉灵敏度当然150毫克/升的MNU后应用。从第1天开始，将测量结果显示在视敏度有显着减少，在第3天达到最低值，从第8天开始，增加视力的情况时，示出MNU暴露后30天完全恢复视力。用于统计分析的单向ANOVA，然后通过Bonferroni法的多重比较试验中得到应用。由此，在视力betwe的差异恩基线和测量治疗后几天1，3，5显著和8（P <0.001，每个），而不是15天及30。
的视网膜变性的组织学评价：
H＆E染色来定量的一只眼睛每时刻的斑马鱼的组（n = 3）在基线以及3,8，15，和处理后30天（ 图2）的形态变化。所描述的Tappeiner 等人进行组织学检查。9。由此，观察到开始在3天的视网膜变性包括INL和空腔形成的ONL的破坏细胞在神经节细胞层（GC）的数目，内核层（INL）和杆的号码（RN）和锥体（CN）的光感受器从视盘的中心手动250μm的确定在眼睛部分的两侧（计数区的大小是指为100μm长度的视网膜部分）。变性之后30与杆ONL损失对由此8天发现的最大治疗后的天数，视杆细胞的（RN）的数量减少到82％，第3天，和71％的在第8天，并在天15 77％30中的原始数。此外，细胞簇的聚集被发现，主要是在INL。
定量细胞凋亡：
TUNEL染色，根据制造商的执行（ 原位细胞死亡检测试剂盒;罗氏应用科学，Rotkreuz的，瑞士）。 MNU治疗后所观察到的视网膜变性是由细胞凋亡引起的。这透露了积极的TUNEL染色在感官视网膜不同细胞层。对于定量，TUNEL阳性细胞的数目在450微米的长度的每两个视网膜区域手动确定，开始在视网膜的外围。由此，大多数TUNEL阳性细胞的发现在ONL在然而3天，将死的细胞也在该时间点出现在INL （ 图3）。没有相关的TUNEL阳性细胞在治疗之前检测的。
定量检测细胞增殖：
评估细胞死亡后的增殖，视网膜染色的增殖所描述的Tappeiner 等 9细胞核抗原（PCNA）。对于量化，如上所述PCNA阳性细胞的数量被人工确定。细胞死亡随后诱导的增殖看作PCNA阳性细胞（ 图4）。由此，增殖的细胞的最大测定在INL上另外5天，将细胞中的外核层（主要是棒）呈阳性染色PCNA直到研究（第30天）结束。少数PCNA阳性细胞在睫状边缘区被检出之前和处理之后的所有时间点。
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图1：视力测试的视敏度在成年斑马鱼的150毫克/升的MNU后应用的。显著降低视力，最低在3天的治疗后，其次是全面复苏，从第5天，直到第30天（平均值±标准差，N = 3）。
图2：在组织学基础（A）和3（B）8（C）15（D）和30（五）天MNU处理后的染色斑马鱼视网膜组织切片的H＆E的例子。 CN，锥细胞核;护士，棒核; INL，内核层;气相色谱法，神经节细胞层。箭头标记的细胞团中的INL。比例尺等于50微米。
图3：在斑马鱼视网膜在3天MNU处理后TUNEL阳性细胞的TUNEL阳性细胞（红色）。将细胞主要分布于视网膜外核层，但也发现了INL。 A组描绘了控制，而图B显示的MNU处理后的图像。比例尺为50微米。
图4：PCNA阳性细胞与对照相比，样品中的斑马鱼视网膜在5天MNU处理后，PCNA阳性细胞（红色）。 A组描绘了控制，而图B显示的MNU处理后的图像。比例尺为100微米。
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Discussion
此前，本集团已转移光感受器变性的MNU模式从啮齿动物到斑马鱼系统9。随后的事件进行了描述，并随访了30天。在这段时间内完整视网膜形态退化和再生的初始治疗后发生。首先，组织学显示，从3天减少杆细胞计数与最小的相应8天，TUNEL染色MNU处理后第3天确定的视杆细胞的凋亡。再生开始的INL为3天，最长为5天外核层，增殖细胞可观察到的观察期，最大的结尾处5天，这是与此相反的INL在没有增加扩散15天的睫状边缘区后观察是在发现一些PCNA阳性细胞在未处理的视网膜的视网膜的唯一位置。这表明了不断的视网膜神经throug面积豪特一生14。参与的药理损坏感光体在斑马鱼中的再生细胞类型的鉴定不是在该原稿的焦点。然而，在以前的出版物的过程中已经被跟踪到再生细胞在INL已被建议是Müller细胞9,17,18。
在本研究中，我们还评估了在MNU诱导的斑马鱼模型的功能变化。为了量化视觉功能的成年鱼的OKR评估已受聘，几种技术之一，可靠地测量小动物19的视力（VA）。由此，OKR，基于一种天生的行为，不需要对动物20的前费时的训练。另外，作为OKR可反复独立地引起动物的合作，以及大眼睛可以很容易地观察到的，OKR的评估是按照视力durin一个理想的方法克变性和再生的斑马鱼。在本研究中OKR测量显示减少的视力，直到第3天，接着在第30天的视觉功能，这是按照后MNU应用组织学设计器和再生的变化完全恢复，显示了最大的细胞凋亡中的第3天。
该模型的优点是它的简单性是MNU是快速制备，可以直接溶解在斑马鱼的水槽中。在一个小时内进行斑马鱼与MNU处理。鱼的数量可以治疗的集体仅由鱼缸的大小。总的来说，这使得简单的归纳视网膜变性的斑马鱼的大量无操纵个别鱼类的需要。因此，这种模式是侵入性比视网膜变性的使用玻璃体内或手术引起的技巧21-23其他车型少，可能从而具有更好的重现性。
在一般情况下，此斑马鱼MNU模型是一个通用的工具，以诱导光感受器特异性变性和形象化以下再生不仅在形态，而且在功能上。因此，我们有信心，该模型有助于更好地理解一般的感觉视网膜变性和再生过程，并打开其结果与哺乳动物的系统比较的可能性。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | A6283 | |
| Ammonia | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 294993 | 0.80% |
| Bovine serum albumine (BSA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 05470 | |
| Dako Pen | Dako, Glostrup, Danmark | S2002 | |
| DAPI mounting medium | Vector Labs, Burlingame, CA, USA | H-1200 | |
| Eosin | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 45260 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 2860 | 100%, 96%, 70% |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | ED | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | E10521 | Tricaine |
| Eukitt | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 3989 | |
| Goat anti-rabbit Alexa 594 | Life Technologies, Zug, Switzerland | A11012 | |
| Goat normal serum | Dako, Glostrup, Danmark | X0907 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 320331 | 0.20% |
| In situ Cell Death Detection Kit | Roche Applied Sciences, Rotkreuz, Switzerland | 11684795910 | TUNEL Kit |
| Mayer's hemalum solution | Merck, Darmstadt, Germany | 109249 | |
| Methylnitrosourea (MNU) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | N4766 | Toxic |
| OptoMotry | CerebralMechanics, Lethbridge, AB, Canada | n.a. | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P6148 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5368 | |
| Proteinase K | Dako, Glostrup, Danmark | S3004 | |
| Rabbit anti-PCNA | Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA | sc-33756 | |
| Superfrost Plus glass slides | Gehard Menzel GmbH, Braunschweig, Germany | 10149870 | |
| Tris buffered saline (TBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5912 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | T1503 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P1379 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 534056 | |
| Zebrafish (Danio rerio) AB (Oregon) strain | University of Fribourg, Dept. of Biology | n.a. | Own fish facility |
References
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