Summary
여기에서 우리는 망막 있도록 지연 및 재생과 성인 제브라 피쉬에서 N 메틸 N의 -nitrosourea을 사용하여 시각 기능에 미치는 영향의 정량화를 보여줍니다. 시력의 손실 및 감소 감광체 번호는 내부 핵 층에 확산하여 관찰 하였다. 완전한 형태 학적 및 기능적 재생은 30 일 초기 치료 후 발생했습니다.
Abstract
산업계에서 시력 손실의 대부분 감광체 손상 계정 얻어진 망막 퇴행성 질환, 예를 들면 색소 성 망막염,. 동물 모델은 질병을 연구하는 중요한 중요하다. 이 점에있어서의 N - 메틸 - N -nitrosourea (MNU)가 설치류에서 널리 사용되어왔다 감광체 특정 독소는 약리 망막 변성을 유도한다. 이전에, 우리는 제브라 피쉬의 MNU에 의한 망막 변성 모델, 시각 연구에서 또 다른 인기 모델 시스템을 설립했다.
포유 동물 매혹적인 차이는 성인 zebrafish의 망막 손상 후의 재생의 지속적인 신경이다. 우리는 성인 zebrafish의 시력 측정을 채용 한이 관찰을 정량화합니다. 이로써, optokinetic 휘어진 비 마취 물고기 기능적 변화를 수행하는 데 사용되었다. 이것은 면역 staini뿐만 아니라 조직 학적으로 보충 하였다세포 사멸에 대한 NG (TUNEL) 및 확산 (PCNA)의 개발 형태 학적 변화의 상관 관계를합니다.
요약하면, 광 수용체 세포 자멸 사흘 외부 핵 층 (ONL)에서 세포의 현저한 감소로 이어진다 MNU 치료 후 발생한다. 그 후, 내부 핵 층 (INL)와 ONL에서 세포의 증식이 관찰된다. 여기서, 우리는 완전한 조직 학적뿐만 아니라 또한 재생 기능 30 일의 시간을 걸쳐 발생하는 것을 알 수있다. 이제 우리는 정량화 및 비디오 형식으로 MNU를 사용하여 제브라 피쉬의 망막 있도록 지연 및 재생을 수행하는 방법을 설명한다.
Introduction
비전은 인간의 가장 중요한 감각과 손상은 높은 사회 경제적 영향을 미친다. 선진국에서는 망막 퇴행성 질환은 노인 1 중 시력 손실과 실명의 주요 원인이다. 대부분의 퇴행성 망막 질환의 원인은 부분적으로 만 이해하고 치료 적 솔루션은 잃어버린 시력을 회복하는 것은 매우 제한되어 있습니다. 색소 성 망막염이 N의 -nitrosourea (MNU) 망막 변성을 유도를 메틸 차 감광체 손실 2-3. N과 망막 퇴행성 질환의 전형적인 예이고 따라서 광범위 일차 시각 세포 사멸 4 질환을 모델링 설치류에서 사용된다. 그것은 알킬화제이며 일반적으로 노출 5-7 후 몇 개월을 나타 양성과 악성 종양으로 이어집니다. 또한, 단기간의 관찰 기간 내에 특정 시각 세포 사멸시킨다. 이로써, 망막 층 structu의 손실다시 상당한 망막 박화는 농도 의존적 방식으로 관찰되었다. 망막 글 리아 세포는 활성화되었지만, 망막 색소 상피 세포 (RPE)의 변경이 발견되지 않음. 소포체 (ER) 스트레스와 관련된 세포 사멸은 망막 8 MNU 조치의 주요 통로가 될 것으로 보인다.
우리는 최근에 제브라 피쉬 구에서 광 수용체의 변성을 유도하는 화학 모델로 MNU를 도입했습니다. 다른 이유의 사이에, 제브라 피쉬 (다니오 rerio)가 있기 때문에 다른 척추 동물 (10)의 그것의 시각 시스템의 유사성 시각 연구에 중요 해지고있다. 외부 망막은 자외선, 짧은, 중간에 피크 감도, 가시 스펙트럼의 장파장 한로드 광 수용체의 유형 네 가지 콘 유형으로 분류 될 수있는 광 수용체를 포함하고 있습니다. 내부 핵 계층 (INL)에서, 바이폴라, 수평 및 무 축삭의 interneurons의 세포 기관은 아 같이 발견뮐러 글 리아 세포의 세포 소마 같은 리터. 외측 얼기 층 (OPL)에서 감광체와 내측 망막 사이의 연접은 렌즈에 가장 가까운 세포층 반면 시신경 및 시신경 요로로 이루어지는 긴 축삭을 형성 성분 신경절 세포 층 (GC)이다 형성된 . 신경절 세포 및 내부 핵 층에있는 세포 간의 연접은 내측 얼기 층 (IPL) (11)에 형성된다. RPE는 감각 신경 망막의 외측에있는 긴 혀끝의 미세 융모 (12) 감광체 외부 세그먼트를 둘러싼 다. 또한, 제브라 피쉬는 매우 회생 및 병변 뇌, 망막, 척수, 심장, 및 기타 조직 (13)를 다시 자라게 할 수 있습니다. 망막 손상이 발생하면, 뮐러 세포 것으로 생각된다 INL에서 세포 활성화 및 각종 망막 세포 유형으로 분화 할 수있는 잠재력을 가지고있다. 또한, 그들은 또한 ONL에있는로드 전구 세포를 생성한다. 또 이렇게새로운 세포로 성인 제브라 피쉬의 망막을 공급, 나아가이 섬모 한계 영역입니다. 이 소스는 연속적으로 성장하는 피쉬 아이 (14)에로드 감광체의 일정한 밀도를 달성하기 위해 필요하다.
MNU 모델은 망막 조직에 대한 단순하고 재현성 퇴화 / 재생 방법으로 사용될 수있다. 때문에 제브라 피쉬의 생물학적 과정의 특정 유사성과 인간이 관여 세포 사멸 경로를 확인하기 위해 문을 열 수있는 잠재적 신경 보호 약물을 선별. 우리 그룹에서 이전의 연구를 바탕으로, 우리는 지금 망막 있도록 지연 및 실험실 동영상 구에 따라 기능적인 변화를 포함 필연적 재생이 MNU 유도 제브라 피쉬 모델의 방법을 설명한다.
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Protocol
모든 실험은 안과 및 비전 연구 협회의 비전 연구 및 안과 (ARVO)에서 동물의 사용에 대한 정책을 준수.
1 동물
- 26.5 ° C의 온도 및 14/10 시간의 명 / 암주기를 15 물에 표준 조건 하에서 6~12개월 세 사이의 AB (오레곤) 균주의 야생형 제브라 피쉬 (다니오 rerio)를 유지한다.
- 분할 한 동물 병원의 승인 후 동물 실험에 대한 관련 기관의 동물 관리 가이드 라인을 따르십시오.
2 MNU 처리
- N 메틸 N의 -nitrosourea (MNU)의 150 ㎎ / ℓ 건조 물질을 함유 물을 준비합니다. 주의! MNU는 독성; 태아에 암, 유전 적 손상이나 상해가 발생할 수 있습니다.
- 실온에서 60 분 동안 MNU를 함유하는 물에서 배양 지브라 피쉬.
- 빨리와 제브라 피쉬를 씻어신선한 물과는 MNU 않고 새 수조에 물고기를 넣어. 실험을 위해 원하는만큼 표준 조건에서 물고기를 유지한다.
3 시력 측정
- , optomotor 체제를 시작 메뉴에서 '테스트'를 선택하고 옵션을 설정 "단순 계단", "시력 (주파수)"과 "무작위 / 분리"(16)이다.
- optomotor 시스템 위 1m에 대해 500 ml의 물을 가득 주입 병을 설치합니다.
- 시험 챔버에서 한 제브라 피쉬를 놓고 주입 병에 연결합니다. optomotor 시스템의 시험 챔버를 놓습니다.
- 측정을 시작하고, 컴퓨터 화면에 실시간으로 안구의 움직임을 관찰한다. 따라서, 긍정적 인 응답이 ( "예") 부정 응답 ( "아니오") 반면, 올바른 방향으로 연속 안구 단속 운동으로 정의된다 역으로 관찰하는 사람과 유사한 임의 눈동자의 움직임을 나타냅니다진 격자. 제브라 피쉬 전시의 눈 경우 세 이상의 후속 optokinetic 응답 (OKR), '예'버튼을 누르면; 그렇지 않은 경우, Enter 키를 누르면 '없음'.
- 메뉴의 "결과"에, optokinetic 자극의 공간 주파수의 임계 값을 결정하여 소프트웨어에 의해 계산 된 시력을 추출합니다.
4 조직학
- 에틸 3 - 아미노 벤조 에이트 메탄 (200 ~ 300 ㎎ / ℓ)의 과다 복용으로 제브라 피쉬를 안락사와 눈을 명백히하다.
- 등급 알코올 시리즈에서 샘플을 탈수 한 후 12 시간 동안 4 ° C에서 인산염 완충 생리 식염수에 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) (PBS)에 전체의 눈을 고정합니다.
- 파라핀에 샘플을 포함, 시신경 유두 (시신경 유두)를 통해 5 μm의 섹션을 잘라 유리 슬라이드에 그들을 탑재합니다.
- 4 분간 hemalum와 deparaffized 파라핀 섹션 얼룩과 0.2 % 염산 ACI이어서 증류수 슬라이드 두 번 찍어D와 0.8 % 암모니아. 적어도 10 분 (H & E)에 대한 수돗물 hemalum 염색 현상 후 3 분 동안 에오신 섹션 얼룩.
- 매질에 부착 탈수 슬라이드를 포함하고 광학 현미경 슬라이드를 관찰한다.
(5) 면역 조직 화학
- 터미널 deoxynucleotidyl 전이 된 dUTP 닉 엔드 라벨링 (TUNEL)
- 실온에서 15 분간 20 μg / ㎖ 프로 테이나 제 K와 탈 파라핀 섹션 부화. 트리스 절을 세 번 씻어 5 분마다 식염수 (TBS)을 버퍼.
- 60 분 동안 37 ° C에서 가습 챔버 내에서 50 μL TUNEL 반응 액 (10 % 라벨링 용액 및 90 %의 효소 용액)와 섹션을 부화. 5 분마다 TBS로 3 회 세척 할 것.
- DAPI를 포함하는 매체를 장착와 슬라이드 마운트 형광 현미경 슬라이드를 관찰한다.
- 증식 세포 핵 항원 (PCNA) 염색
- 3 분 동안 항원 검색 버퍼 (트리스-EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) + 0.05 % 트윈 20, 산도 9.0)에서 탈 파라핀 섹션을 삶아 5 분마다 TBS로 3 회 씻는다. 100 μl를 1 시간 동안 실온에서 용액을 (TBS + 10 % 염소 정상 혈청 + 1 % 소 혈청 알부민, pH7.6)로 블로킹 막기.
- 4 ° C에서 하룻밤 가습 챔버에서 200 희석 : 1 항 PCNA 차 항체와 얼룩. 5 분마다 TBS + 트윈 20으로 3 회 반복한다.
- 실온에서 1 시간 동안 500 희석 : 1 차 항체와 함께 해당 검출 마무리.
- DAPI를 포함하는 매체를 장착와 슬라이드 마운트 형광 현미경 슬라이드를 관찰한다.
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Representative Results
시력 :
실험 장치 [공간 주파수 : 0.042 원 /도 (C / D); 대비 : 100 %; 드리프트 속도 : 20도 / 초 (D / SRC); 백라이트 휘도 : 152 CD / m 2] 본 연구는 성인 제브라 피쉬의 OKR 평가 수 있었다. 물론 절차를 용인 각 제브라 피쉬, 10 분 - VA 측정의 평균 지속 기간은 약 5였다. MNU 노출 전 시력은 0.577 ± 0.014 사이클 /도 (c / d를)이었다. 1가 150 ㎎ / ℓ MNU의 적용 후 시력 과정을 보여줍니다. 일 하나에서 시작, 측정, 시력의 현저한 감소를 보여 일 8에서 시작 일 3시 최소 값에 도달, 시력의 증가는 삼십일 MNU 노출 후 시력의 전체 복구를 보여주는 발생합니다. 통계적인 분석을 위해 본 페로 니의 다중 비교 시험 하였다 일방향 ANOVA 적용되었다. 이에 따라, 시력 betwe의 차이기준 및 측정 처리 일 1, 3, 5에 대한 유의 한 후, 8 (p <0.001, 각각),하지만 15 일 및 30 일에 대한 엔.
망막 변성의 조직 학적 평가 :
H & E 염색 시간 포인트 당 제브라 피쉬의 한쪽 눈 (N = 3) 기준뿐만 아니라 3, 8, 15, 치료 후 30 일에 (그림 2)의 형태 학적 변화를 정량화하기 위해 사용되었다. Tappeiner 등에 의해 조직학 바와 같이 수행 하였다. 9. 이로써, ONL의 INL 캐비티 형성의 중단을 포함한 망막 변성은 매일 3에서 시작 관찰 신경절 세포 층 (GC)에있는 셀의 수, 내부 핵 층 (INL) 및로드의 수 (RN) 콘 (CN)는 눈 감광체 부의 양면에 수동으로 250 μm의 시신경 유두의 중심으로부터 결정 하였다 (계산 영역의 크기는 100 μm의 길이의 망막 부분을 말한다). 변성은 30 하였다일 이에 하루 8에서 볼로드 ONL 손실의 최대 처리 후,로드 감광체의 수 (RN)를 제 3 일에 82 % 감소, 8 일째에 71 % 및 15 일째에 77 %와 원래 번호 30 . 또한, 세포 클러스터의 축적은 주로 INL에서 발견되었다.
세포 사멸의 정량화 :
TUNEL 염색은 제조 업체에 따라 수행 하였다 (현장 세포 죽음 탐지 키트, 로슈 응용 과학, Rotkreuz, 스위스). MNU 처리 후 관찰 된 망막 변성 세포 사멸에 의해 발생했다. 이 감각 망막 다른 세포 층에서 긍정적 TUNEL 염색에 의해 밝혀졌다. 정량, TUNEL-양성 세포의 수는 망막의 주변부로부터 시작 450 μm의 길이를 각각의 영역이 망막에 직접 결정 하였다. 이에 따라, TUNEL-양성 세포의 대부분이 단 3 일에 ONL에서 발견되었고, 세포 죽음은 또한 그 시점에서 관찰되었다 INL (그림 3). 아무 관련 TUNEL 양성 세포 치료 전에 검출 없었다.
세포 증식의 정량화 :
세포의 죽음 후 확산을 평가하기 위해, 망막 Tappeiner 등. 구에 의해 설명 된대로 세포 핵 항원 (PCNA)를 확산을 위해 염색 하였다. 전술 한 바와 같이 정량화, PCNA 양성 세포의 수를 수동으로 측정 하였다. 세포 사멸은 PCNA 양성 세포 (그림 4)으로 볼 유도 확산으로 이어졌습니다. 이로써, 세포의 증식이 별도로 최대 5 일에 측정 하였다 INL, ONL (주로로드)에있는 세포 연구 (30 일)이 끝날 때까지 PCNA 양성 염색을 나타내었다. 섬모 한계 영역에서 거의 PCNA 양성 세포 전과 치료 후 모든 시간 지점에서 검출되었다.
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그림 1 :. 150 ㎎ / ℓ MNU의 신청 후 성인 제브라 피쉬의 시력의 시력 측정. 3 일 후 처리에서 최소 시력의 상당한 감소는 일 30 일까지 (평균 ± 표준 편차, N = 3), 5 일에 시작하여 완전히 회복으로 이어졌습니다.
도 2 : MNU 조직학 처리 후의베이스 라인 (A) 및도 3 (B),도 8 (C), 15 (D), 30 (E)에 일 지브라 피쉬의 망막 조직 학적 섹션을 H & E 염색의 예.. CN, 콘 핵; RN,로드 핵; INL, 내부 핵 층; GC, 신경절 세포 층. 화살표는 INL 세포 클러스터를 표시합니다. 스케일 바는 50 μm의 같습니다.
그림 3 :. MNU 처리 후 3 일에서 제브라 피쉬의 망막에서 TUNEL 양성 세포 TUNEL 양성 세포 (빨간색). 세포는 주로 ONL에 위치 하였다 아니라 INL에서 발견되었다. 패널 B는 MNU 처리 후의 영상을 표시하는 반면 패널은 제어를 도시한다. 스케일 바는 50 μm의를 나타냅니다.
그림 4 :. 제어 샘플에 비해 MNU 처리 후 5 일에서 제브라 피쉬의 망막에서 PCNA 양성 세포 PCNA 양성 세포 (빨간색). 패널 B는 MNU 처리 후의 영상을 표시하는 반면 패널은 제어를 도시한다. 스케일 바는 100 μm의를 나타냅니다.
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Discussion
이전에, 우리 그룹은 제브라 피쉬의 시스템 구에 설치류에서 시세포 변성의 MNU 모델을 전송하고있다. 계속되는 이벤트 설명 및 최대 30 일 동안 추적 관찰 하였다. 이 기간에 완전한 형태의 망막 변성 및 재생이 초기 치료 후 발생. 첫째, 조직 학적가 감소 된로드 셀 상응 일 8에서 최소에 일 3에서 계산 계시, TUNEL 염색 삼일 MNU 처리 후로드 광 수용체의 세포 사멸을 식별합니다. 재생은 증식 세포는이없이 증식 증가 INL 대조적이다 하루 5에서 최대 관찰 기간이 끝날 때까지 관찰 할 수 ONL에서 하루 5에서, 최대 하루 3에서 INL에서 시작 15 일 후 모양체 변연 영역 관찰하면 일부 PCNA 양성 세포는 미처리 망막에서 발견 된 망막의 유일한 위치이다. 이것은 지속적으로 망막 신경의 통해 서있는 영역을 나타냅니다HOUT 수명 14. 제브라 피쉬의 약리학 적 손상 광 수용체의 재생에 관여하는 세포 유형의 식별이 원고의 초점이 아니었다. 그러나, 이전의 간행물 프로세스 뮐러 세포 9,17,18 것으로 제안되었다 INL에서 재생 세포 추적되었습니다.
본 연구에서, 우리는 또한 MNU 유도 제브라 피쉬 모델의 기능 변화를 평가했다. 성인 생선 시각 기능을 정량화하기 OKR의 평가는 여러 기술 중 하나를 신뢰성 작은 동물 (19)의 시력 (VA)을 측정하기 위해, 사용되어왔다. 이로써, 선천성 동작을 기반 OKR는 동물 (20)의 선행 시간 소모적 인 훈련을 필요로하지 않는다. OKR 반복적 동물들의 협력 독립적으로 도출 될 수 있고, 큰 눈이 쉽게 관찰 될 수있다 더욱이, OKR의 평가 durin 시력을 따르는 이상적인 방법제브라 피쉬의 g 변성 및 재생. 본 연구에서 OKR 측정은 세포 사멸의 최대를 보여줍니다이 MNU 응용 프로그램 후 조직 학적 있도록 지연 및 재생의 변화에 따라입니다 일 (30)에 시각 기능의 완전한 복원 다음 일 3까지 감소 시력을 밝혀 일 3.
MNU가 준비 빠르게 그리고 직접적 지브라 피쉬의 수조에 용해 될 수있는 모델의 장점은 단순성이다. MNU와 제브라 피쉬의 치료는 한 시간 안에 수행된다. 한꺼번에 처리 할 수있는 물고기의 수는 수조의 크기에 의해 제한된다. 전반적으로,이 개별 물고기의 조작없이 제브라 피쉬의 큰 숫자에서 망막 변성의 간단한 유도 할 수 있습니다. 따라서이 모델은 유리체 강내 또는 수술 유도 기술 21 ~ 23를 사용하여 망막 변성의 다른 모델에 비해 덜 침습적이고함으로써 더 나은 재현성을 나타낼 수있다.
일반적으로,이 제브라 피쉬 MNU 모델 감광체 특정 퇴행을 유도하고뿐만 아니라 기능적 형태 학적 다음 재생을 시각화하는 다용도 공구이다. 따라서, 우리는 모델이 더 일반적으로 감각 망막의 변성과 재생의 과정을 이해하는 데 도움이 및 포유 동물의 시스템과 그 결과를 비교 할 수있는 가능성을 열어 것을 확신합니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | A6283 | |
| Ammonia | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 294993 | 0.80% |
| Bovine serum albumine (BSA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 05470 | |
| Dako Pen | Dako, Glostrup, Danmark | S2002 | |
| DAPI mounting medium | Vector Labs, Burlingame, CA, USA | H-1200 | |
| Eosin | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 45260 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 2860 | 100%, 96%, 70% |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | ED | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | E10521 | Tricaine |
| Eukitt | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 3989 | |
| Goat anti-rabbit Alexa 594 | Life Technologies, Zug, Switzerland | A11012 | |
| Goat normal serum | Dako, Glostrup, Danmark | X0907 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 320331 | 0.20% |
| In situ Cell Death Detection Kit | Roche Applied Sciences, Rotkreuz, Switzerland | 11684795910 | TUNEL Kit |
| Mayer's hemalum solution | Merck, Darmstadt, Germany | 109249 | |
| Methylnitrosourea (MNU) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | N4766 | Toxic |
| OptoMotry | CerebralMechanics, Lethbridge, AB, Canada | n.a. | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P6148 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5368 | |
| Proteinase K | Dako, Glostrup, Danmark | S3004 | |
| Rabbit anti-PCNA | Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA | sc-33756 | |
| Superfrost Plus glass slides | Gehard Menzel GmbH, Braunschweig, Germany | 10149870 | |
| Tris buffered saline (TBS) | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P5912 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | T1503 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | P1379 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich, Buchs, Switzerland | 534056 | |
| Zebrafish (Danio rerio) AB (Oregon) strain | University of Fribourg, Dept. of Biology | n.a. | Own fish facility |
References
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