Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

התחדשות בכליות למבוגרי דג הזברה על ידי גנטמיצין מושרה פגיעה

Published: August 3, 2015 doi: 10.3791/51912

Introduction

הכליות היא חיוניות להומאוסטזיס נוזל, ויסות לחץ דם וסינון של פסולת מהגוף. למרות יונקים מסוגלים לתקן nephrons הקיים לאחר פציעה באמצעות תאים אפיתל מובחנים 1-4, נראה שהם חסרי מאגר של תאי גזע שמורים 5 ולא מצליחין ליצור nephrons החדש דה נובו. בניגוד ליונקים, דגים בוגרים יכולים ליצור nephrons החדש לאורך כל חיים בוגרים כדי לתמוך בצמיחה של הדגים ובתגובה לפציעה 6,7. דג הזברה, Danio rerio, הוא אורגניזם מודל לא יסולא בפז לחקר התחדשות איבר 8-10 ויש לו הפוטנציאל לספק תובנות רבות עוצמה ליישומים להנדסת התיקון של כליות אנושיות. Tg (Lhx1a: EGFP) transgene 11 הוכח תווית בריכה של תאי נפרון בכליות דג הזברה המבוגר 12, לעומת זאת מנגנוני שליטה התגובה של lhx1a + תאים לימין פציעהemain לא ברור.

גנטמיצין aminoglycoside הוא אנטיביוטיקה בשימוש נרחבת עם אפקטי nephrotoxic וototoxic ידועים בבני אדם 13. זריקת intraperitoneal של גנטמיצין היא שיטה מבוססת של גרימת ניזק כלייתי חריף בדגים 6. פגיעה זו במחקה דגי אובדן אפיתל וצלקות של glomeruli המתרחשת בבני אדם לאחר גנטמיצין מנת יתר 14 צינור. גרימת פציעה בדג זברה על ידי הזרקת גנטמיצין היא דרך נוחה של גרימת תגובת התחדשות חזקה, סינכרוני, עם הרבה nephrons החדש מיוצר ובו זמנית ממשיך דרך שלבים של היווצרות, שגשוג והתמיינות.

פרוטוקול זה מפרט את השיטה שלנו לפגיעה חזקה ושחזור בכליות דג הזברה המבוגר על ידי ניצול תהליך מיון חזותי לא פולשנית כדי למזער חריגים. אנו מנצלים את העובדה שפציעה עם גנטמיצין מובילה למוות של רקמת הכליה אפיתל ופורמטיון של יציקות צינורי כליות, אשר לאחר מכן לצבור להמונים בצינורות וביב mesonephric. אלה הועברו על ידי הדגים וניתן לצפות מבחינה ויזואלית במים. זה מאפשר לנו להקרין לדגים עם פגיעה קטלנית חזקה, אשר לאחר מכן ניתן נקוותה לניסויים נוספים. מזעור המספרים של דגים או דגים ללא כל פגע שימותו לפני שהם מגיעים לנקודת הסיום של הניסוי מובילה ליותר אחיד ואיסוף נתונים יעיל וניתוח. בנוסף, אין התקנים או חומרים כימיים מיוחדים נדרשים, מה שהופך את השיטה זו חסכונית ומתאימה לשימוש בסביבה אקדמית או הוראה. שימוש בשיטה שלנו, כאן אנו מראים את ההשפעות הגוברים של מינון גנטמיצין על התחדשות בכליות, כמו גם את ההשפעה של טמפרטורה עלתה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הצהרת אתיקה:: הערה כל הניסויים נערכו בהתאם להנחיות בית החולים כלליים מסצ'וסטס לשימוש בבעלי חיים במחקר.

1. הכנה מראש

  1. לקבוע כמה מבוגרים דג הזברה ישן 6-12 חודשים כדי לפגוע. תכנית לפגוע בדגים 10-20% יותר מאשר יהיה צורך. על מנת למזער את השונות, גיל שימוש בהתאמת דגי אח שגדלו יחד באותו טנק, כך שהם בערך באותו גודל ויש לי שונות גנטיות פחות. דגי נקבה הם הרבה יותר קלים להזריק בהשוואה לדגי זכרים, בשל הקיבולת הגדולה יותר של הבטן. עם זאת, זכרים ונקבות לתת תוצאות דומות.
  2. כאשר עושה הניסוי בפעם הראשונה, עלילה עקומת מינון כדי לקבוע את המינון המתאים לגנטמיצין זן ספציפי של דגים. לבדוק כל אצווה חדשה של גנטמיצין לפני השימוש בניסויים מאז טוהר גנטמיצין משתנה מיצוו אצווה. מינון נכון צריך להיקבע על ידי הערכת expressiעל פציעה של סמנים כגון lhx1a. (ראה איור 1 א - ד).
  3. הכן פתרון גנטמיצין. פתרון מניות גנטמיצין עשוי להיות מאוחסן ב-20 ° C ומופשר לשימוש מאוחר יותר. לדוגמא, עבור 80 מ"ג / קילוגרם מינון (80 גנטמיצין מ"ג / קילוגרם ממשקל הגוף) בדגים במשקל 0.5 גרם, להכין 2 מ"ג / מיליליטר של גנטמיצין בופר פוספט כפתרון נוח עבודה. זה מספק 20 μl של גנטמיצין לזריקת intraperitoneal לדגים.
    הערה: באופן כללי, 80-120 מ"ג / קילוגרם להשיג תוצאות טובות, אך במינונים נמוכות כמו 40 מ"ג / קילוגרם עשוי להיות מתאים. גנטמיצין גם ניתן לרכוש בפתרון כדי למזער את החשיפה מסוכנת לאנשי מעבדה.
    הערה: גנטמיצין במינונים גבוהים יכול להיות רעיל. ללבוש כפפות ומסכה כאשר משקל אבקה.
  4. הכן של 0.016% מים tricaine 100 מיליליטר להרדמת דגים. הכן מלאי 25x של tricaine (4 g / L 1) מומסת במי MilliQ סטרילי להתאים לpH 7 וחנות על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש. לדלל 4 מ 'l במי דגים 100 מיליליטר לריכוז עבודה של 0.016%.
    הערה: Tricaine הוא גירוי הרדמה ועור, ללבוש כפפות בעת הטיפול.
  5. הפוך דגים לגרוף מתוך pipet העברת פלסטיק על ידי חיתוך את הנורה לצורת כדור וחיתוך 2 חריצים בתחתית לניקוז מים. מזרקים 1ml העומס (עם 10 דרגות μl) עם פתרון גנטמיצין מוכן ולצרף מחט G 30½. הסר את כל בועות אוויר. לסובב את המחט על המזרק כדי לוודא שקצה הזווית על המחט פונה משם ואת סימוני המזרק הם פונים קדימה וקריאים. לזריקות שליטה, להכין מזרק ומחט עם PBS סטרילי.
  6. הכן בקנה מידה עם משטח נקי או לשקול סירה, כמו גם מגבות נייר לייבוש דגים ולהחזקת דגים להזרקה.
  7. הכן מכולות חצי ליטר קטנים בודדות עם מכסים להחזקת דגים לפוסט לילה תצפית הזרקה. כלובי הזדווגות פלסטיק שקופים קטנים שימושיים למטרה זו. אלהמכולות לא צריכים להיות לבנה - באופן אידיאלי הם צריכים להיות ברורים כדי שיציקות אפיתל הלבנות לשפוך על ידי הדגים יכולות להיות שנצפו על גבי שחור ספסל. ממלא כל מיכל עם מספיק מים דגים לדגים לשחות בנוחות.

2. הזרקת Intraperitoneal של גנטמיצין

  1. להרדים את הדגים ב0.016% פתרון tricaine במי דגים. חכה לקצב תחלופת אוויר הזימים כדי להאט ולדגים להגיב כבר לא לגעת.
  2. לאסוף את הדגים באמצעות הסקופ הדגים, עובר מהראש לכיוון זנב על מנת למנוע פגיעה בזימים או סנפירים. מניחים את הדג על מגבות נייר לספיגת עודפי המים על ידי הפיכת הדגים החוצה בעדינות על צידו ולהתנער מעודפי מים מהכדור.
  3. לאסוף את הדגים שוב ולמקם אותו בסירה לשקול בסולם מאופס ולשקול את הדגים. עגול ל0.25 גר 'הקרוב, ולחשב את הכמות המתאימה של גנטמיצין להזריק.
    הערה: לדגים 0.5 גרם להשתמש הזרקת 20 μl בשעה 80 מ"ג / קילוגרם מינון.
  4. לאסוף את הדגים שוב ומניח אותו על מגבת נייר מקופלת יבשה. אם הזרקה באמצעות יד ימין, להחזיק את מגבת נייר ביד השמאל והנח את ראשו של הדג הצביע שמאלה, עם הבטן נגישה בקלות.
  5. החזק את המזרק עם המחט בזווית של 45 מעלות לעור של הבטן, הקדמי לביב. לדחוף את המחט מתחת לעור, ואז להקטין את הזווית והחלק את המחט קדימה מתחת לעור, הימנעות האיברים הפנימיים. לוחץ על המתג הכמות המתאימה, להשהות כדי לוודא שאף נוזל יוצא סביב המחט, אז למשוך את המחט. אם מחזיק את הדגים יציבים הוא בעיה, מרפקי סד נגד פלג גוף עליון כדי לייצב אותם.
    הערה: יש להשתמש בכפפות בעת הטיפול בפתרון גנטמיצין.
  6. זרוק כל דגים למכל בודד. שים לב לדגים ולהבטיח ההתאוששות שלה מהרדמה. לשמור על דגים על 28.5 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    הערה: אם הדג לא להחיות באופן מיידי, להשתמש טרנס פלסטיקpipet FER להשקיית מים על פני הזימים שלו להחיות אותו.
  7. השתמש באותו מזרק ומחט כאשר הזרקת דגים מרובים עם אותו המינון של גנטמיצין. השלך את המזרק המשומש ומחט לתוך המכל החדים Biohazard המתאים.

3. תצפית הזרקת הודעה של פגיעה

  1. למחרת (יום לאחר פציעת 1), למקם את הדגים המוזרקים במכל שלה על משטח כהה. יציקות לבנה של רקמת האפיתל המתה מופרשת על ידי הדגים נפצעו צריכה להיות גלויות. (ראה איור 1E - H). אם אין יציקות, גם הדגים לא נפגע על ידי הזרקת גנטמיצין (או המינון היה נמוך מדי, או חלק מגנטמיצין דלף במהלך תהליך ההזרקה) או הדג נפצע קשה וכתוצאה מכך החסימה של השופכנים וביב מלא עם רקמת שהושל.
    הערה: אם הדגים אינם יכולים לנקות את היציקות מהגוף שלה זה בדרך כלל ימותו תוך 2-3 ימים ולכן לא שמיש למשך זמן ארוך יותרמבחני. אם לא יציקות גלויות, להרדים את הדג במי tricaine ידי טבילה לפחות 10 דקות אחרי תנועת הזימים מפסיקה.
  2. אם יציקות רקמה הלבנות גלויות, להגדיר את הדגים בצד ולהמשיך לבדוק את הדגים האחרים. מינון מתאים של גנטמיצין יגרום 80-90% מלהיות שמיש הדגים. בריכת הדגים נפצעו ואז לפצל אותם לקבוצות טיפול שונות אם תרצה בכך.

4. טיפול בדגי שחזור

  1. לשמור על דגים במים נקיים וסביבה צפופות. מים וצפיפות מלוכלכים יובילו לזיהומים ומוות בלתי צפויה. נסה לשמור על לא יותר מ 6 דגים / 500 מיליליטר של מים דגים ולהחליף את המים מדי יום במידת האפשר.
    הערה: זהו היקף מינימאלי לשימור של שטח או אם החוקר מבקש לבצע ניסויים באמצעות טיפולים תרופתיים יקרים.
  2. לא להאכיל את הדגים עד 3 ימים לאחר פציעה. דגי שחזור לא לאכול בהתחלה, ואוכל כל שבטנק לפרק ולקדם גר חיידקיםowth. החל מ 3 ימים לאחר פציעה, להאכיל כמות קטנה פעם אחת ביום.

5. ניתוח של כליות נפגעים

  1. לכלאה באתר לביטוי mRNA lhx1a, ניתן לקצור כליות מדגים בנקודתי זמן רצויים. להרדים דג במי tricaine על קרח לפחות 10 דקות עד שתנועת זימים מפסיקה, ולאחר מכן להסיר את הראש עם סכין גילוח ולפתוח את חלל הגוף ולהסיר את האיברים הפנימיים עם מלקחיים.
  2. השאר את הכליות במקום (איבר פיגמנט מחובר לקיר גוף הגב) ולתקן את הדגים בparaformaldehyde 4% ב- ​​PBS לילה. לנתח את הכליות 15 ותמשיך עם תקן הכלאה באתר.
    1. בקצרה, לשטוף את הכליות בPBST (פוספט Tween 0.5% שנאגרו המלוח 20), permeabilized עם proteinase K בPBST (10 מיקרוגרם / מיליליטר) במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר. פוסט לתקן עם paraformaldehyde 4%, ושטף שוב עם PBST.
    2. אז לפני להכליא כליות לילה בשעה 68; ° C במאגר הכלאה (פוראמיד 50%, SSC 5x, 50 מיקרוגרם / מיליליטר הפרין, 500 מיקרוגרם / מיליליטר tRNA, 0.1% Tween20, pH 6.0).
    3. דגירה הדגימות עם הבדיקה digoxigenin שכותרתו במאגר הכלאה, ולאחר מכן לשטוף למשך 5-10 דקות כל אחד עם 100%, 75%, 50%, 25% חיץ הכלאה 68 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן עבר לטמפרטורת חדר ולשטוף פעמיים למשך 30 דקות עם 2x SSC עם 0.1% Tween20, ולשטוף פעמיים למשך 30 דקות עם SSC 0.2X עם 0.1% Tween20.
    4. לאזן דקות המדגם 3x 5 בMAB (0.1 חומצת M maleic, 0.15 מ 'NaCl, pH 7.5) וחסמו את הלילה ב 4 מעלות צלזיוס בMAB עם סרום עיזים 10%. אז דגירה דגימות לילה באנטי digoxigenin-AP Fab 1: 5,000 בMAB.
    5. שטוף את 5x המדגם עבור שעה 1 בMAB, ולאזן 3x במשך 15 דקות בNTMT (0.1 מ 'טריס pH9.5, 0.05 M MgCl 2, 0.01 M NaCl, 50 μl Tween20).
    6. לאחר מכן לטפל בכליות עם NBT / BCIP כדי לזהות אותות. תקן את הכליות עם paraformaldehyde 4% וטופחו בdimethylformamide לרםיש עודף NBT / BCIP, מולבן לילה במים ללא יונים. לשטוף את הכליות ולאחר מכן לצלם בPBST עם גליצרול 50% מתחת coverslip.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

פציעת גנטמיצין ניתן לאשר באופן חזותי על ידי ההתבוננות ביציקות אפיתל כליות במים (איור 1). מינונים שונים של גנטמיצין שמשו לפגוע דג הזברה TuAB wildtype מבוגר, וכתוצאה מכך הגדלת מספרם של lhx1a + אגרגטים הסלולר בכליות ההתחדשות (איור 1 א - ד). יכולות בקלות לראות יציקות לבנים במי היום 1 לאחר פציעה (איור 1E - H). מינון נמוך של גנטמיצין הביא ברוב הדגים שאין לי יציקות, ואילו במינונים גבוהים יותר הביאו למעל 75% מיציקות דגים שיש (איור 1 ט). בכל הקבוצות, בחירת דגים עם יציקות הביאה רמת פגיעה ממוצעת גבוהה יותר (איור 1J).

לאחר אישור חזותי של פציעה, ניתן נקווה דגים ולאחר מכן התחלקו לקבוצות שליטה וטיפול לניסויים (איור 2). דג הזברה מבוגרת wildtype TuAB נפצעו עם 80מ"ג / קילוגרם מינון של גנטמיצין. יום אחד לאחר פציעה, דגים עם יציקות נבחרו, ולאחר מכן אספו התפצלו להלם חום ולא קבוצות הלם חום. דגי הלם חום נחשפו עד 37 מעלות צלזיוס במשך 16 שעות הלילה ותקופת מנוחת 8 שעות על 28.5 מעלות צלזיוס בכל יום. ב 4 ימים ודגי 7 ימים לאחר פציעה היו קבוע להר שלם הכלאה באתר ואת רמת פגיעה הוערכה על ידי צפיפות של אגרגטים lhx1a +. הלם חום לבד אינו מייצר תגובת פציעה (איור 2 א, ד), אבל הלם חום מאיץ את התגובה בדגים נפצעו בהשוואה ללא שולט הלם חום (איור 2, C, G). על ידי 7 ימים לאחר פציעה כבר לא היה הבדל משמעותי בין קבוצות פצועות (איור E, F, H).

איור 1
<strong> איור 1: הדור בתגובה לפגיעה בכליות חריפה בגנטמיצין הוא תלוי מינון (- D) ביטוי lhx 1 mRNA מסמן אגרגטים הסלולר, שהם אבות נפרון חדשים.. (א) 7 ימים לאחר הזרקת ה- IP השליטה, דג הזברה מבוגר TuAB wildtype בדרך כלל יש 1a 0-2 lhx + אגרגטים סלולריים בכל הכליה. (B - D) 7 ימים לאחר 1a תצוגת דגי הזרקת גנטמיצין רב lhx + אגרגטים סלולריים, המצביע על תגובת neonephrogenesis.This החזקה הוא תלוי מינון, עם ריכוזים גבוהים יותר של גנטמיצין וכתוצאה מכך יותר + אשכולות lhx 1. (E - H) 1 יום לאחר ההזרקה של גנטמיצין, דגים להפריש יציקות הלבנות מורכבות מרקמת האפיתל המתה מהכליות. (ה) אוסף של יציקות מהסכום כולל של 12 דגים מראה את המגווןשל צורות וגדלים. שים לב להיבדל בין יציקות הלבנות מצביעים על פגיעה בהשוואה לארטמיה מתעכל כתומה-אדמדמה. (F - H) דוגמאות ליציקות שנאספו מדגים בודדים יום 1 לאחר פציעה ידי מתן אפשרות למים במכל להתיישב, pipetting המשקעים החוצה והתבוננות תחת מיקרוסקופ. צואה (F) ללא יציקות, המציין אין פגיעה מדגים שטופלו במינון 40 מ"ג / קילוגרם המינון. (ז) בגודל בינוני מטיל המצביע פציעה מדגים שטופלו במינון 60 מ"ג / קילוגרם המינון. (H) יציקות גדולות עם רקמת שהושל נוספת המצביעה על פגיעה מדגים שטופלו במינון 80 מ"ג / קילוגרם המינון. (I) אחוז הדג נפצע ביציקות גדל ב 60 מ"ג / קילוגרם ו -80 מ"ג / קילוגרם. (י) לאחר 7 ימים, הזריק דגים עובדו להר שלם הכלאה באתר להעריך פציעה. Lhx1a + אגרגטים נספרו בתמונת 5x יחידה שנלקחה בPO הרחבint של כל אזור כליות וכליות נמדד באמצעות ImageJ. המספר הממוצע של אגרגטים / 2 מ"מ מוצג לכל מנה. בכל מקרה, דגים עם יציקות היו ממוצע גבוהה יותר מאשר בקבוצה הכוללת בכל מנה. <0.5 במשך 40 מ"ג / קילוגרם p לעומת 80 מ"ג / קילוגרם. בר סולם בספירה = 0.2 מ"מ, מ"מ E = 1, FH = 2 מ"מ.

איור 2
איור 2:. דג הזברה מבוגרת TuAB wildtype התחדשות תלויה טמפרטורה 24 שעות לאחר הזרקת גנטמיצין, נפצע ביציקות היו נקווה ולאחר מכן התפצלה לקבוצת הלם חום ולא קבוצת הלם חום. דגים נשמרו על 37 מעלות צלזיוס למשך לילה שעה 16 בכל לילה אחר כך עם תקופת מנוחה 8 שעות על 28.5 מעלות צלזיוס במהלך כל יום. (A, D) בקרה ללא פגע דגים לא הביעה lhx1a לאחר הלם חום. (B, C) ​​sh חוםOck מאיץ את תגובת ההתחדשות, עם יותר אשכולות כבר מופיעים ב-4 ימים לאחר פציעה בהשוואה לדגים נפצעו בלי הלם חום (p <0.5, מבחן t). (E, F) לאחר 7 ימים, אין הבדל משמעותי בין דגים נפצעו טופלו בהלם חום ולא הלם חום. כימות (G, H) של פגיעה על ידי ספירת lhx1a + אגרגטים למ"מ 2. כל נקודה מייצגת דגים בודדים. מספר הדגים והתגובה הממוצעת מצוין מעל כל קבוצה. בר סולם = 0.2 מ"מ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

דג הזברה היא אידיאלי ללימוד התחדשות של איברים בוגרים כולל המבוגרים כליות mesonephric 6. מחקרים שנעשו לאחרונה ניצלו סמנים מולקולריים וקווי כתב מהונדס חדשים לאפיין טוב יותר את הצעדים המתרחשים במהלך התחדשות נפרון ומה תאים עשויים להיות אחראי 7,12. תצפית של יציקות שתן הייתה בשימוש כבר יותר ממאה שנה כדי לאבחן מחלת כליות בבני אדם 16. כאן אנו משתמשים הנוכחות של יציקות כאינדיקטור קל, לא פולשנית והמוקדם של היקף פגיעה בכליות חריפה לאחר הזרקת גנטמיצין. אנו צופים כי דגים שאינם מייצרים יציקות הם גם נפגעו במידה המועטה בלבד (ולא יוצרים nephrons החדש) או פצוע מדי כדי להתאושש ובדרך כלל מתים בתוך 3 הימים הראשונים. לכן, שלב קריטי בפרוטוקול הוא התצפית בודדת של דגים לאחר פציעה, ואת הנוכחות של שתן מטילה כמדד לרמות פציעה הנכונה. כמו כן, אנו רואים ביטוי lhx1aבאגרגטים מתחילים ביום 4 לאחר פציעה. זה מצביע על כך 3 הימים הראשונים לאחר פציעה הם תקופה קריטית להתאוששות.

אם מספר גדול של דגים וללא כל פגע, או דגים רבים מדי מתים במהלך הניסוי, לבדוק כדי לוודא שזריקות intraperitoneal נעשות כראוי. זה עשוי לעזור כדי להוסיף צבע רעיל כגון פנול אדום לפתרון גנטמיצין לדמיין כל דליפה במהלך הזרקה. סימון המחט עם סמן קבע או חתיכת סרט 2 מ"מ מהקצה יכול לשמש כמדריך למניעה דוחפת את המחט עמוקה מדי בדגים. בנוסף, המינון של גנטמיצין ייתכן שיצטרך להיות מותאם. הזרק דגים עם מגוון של מנות גנטמיצין ולבדוק את הכליות לביטוי של mRNA lhx1a או על ידי הכלאה באתר או RT-PCR.

מגבלה של שיטה זו היא שהיא דורשת דגים בודדים דיור הלילה לפני הבחירה נפצע דגים לניסויים. כדי לחקור את האירועים בשלב מוקדם מאוד בהתחדשות (בשעות 24 הראשונות לאחר פציעה) דגים ייתכן שיהיו צורך לעבור טיפול ניסיוני רציף, אפילו בתקופת התצפית בודדת. עלות טיפול בדגים בודדים עם תרופות, לדוגמא, עשויה להיות גבוהה מאוד. הטכניקה שלנו היא שיפור בשיטה הקיימת של פגיעה בכליות חריפה באמצעות גנטמיצין, משום שהוא מאפשר לחוקר לחסל חריגים על ידי ניצול תהליך מיון חזותי לא פולשנית. מודל פציעה חזק, אחיד ושחזור זה עכשיו יכול לשמש לבדיקת יעילות השערות על התחדשות בכליות בדג הזברה מבוגרת.

הבחנו כי למרות התחדשות מתרחשת בשני דג הזברה הזכר ונקבה (כל הנתונים שמוצגים כאן הם מנשים), התחדשות בתגובה להזרקת גנטמיצין בגברים היא הרבה יותר משתנה. זה יכול להיות בגלל סיבות טכניות, משום שגופם הוא ארוכים, דקים ושרירי יותר, ואילו נקבות יש ב הרבה יותר גדולElly עם עור רפוי יותר, דק יותר, קלה יותר ומאפשר הזרקה וחלל הצפק גדול כדי להכיל כמויות הזרקה ללא דליפה. אפשרות חלופית היא שאנדרוגנים המיוצרים על ידי גברים עשויים להיות השפעה כלשהי על תהליך ההתחדשות 17. Nachtrab et al. מצא כי ההשפעה של אנדרוגנים הייתה זן תלוי, אשר מציין כי רקע גנטי עשוי לווסת את רמות אנדרוגן. שינויים קלים ברקע גנטי של דגי TuAB ששמשו במחקר שלנו עשויים להסביר את השונות ראו בגברים, אבל יש להניח שאנדרוגנים אינם המקור של וריאציה ולוקוסים גנטיים אחרים רק יכול לתרום להטרוגניות בתגובה לפציעה. יש לנו גם מצאו כי קווים מהונדסים שונים של דג הזברה עשויים להגיב באופן שונה לפגיעת גנטמיצין. לדוגמא, Tg (Lhx1a: GFP) 12 קו בידיים שלנו דורש 120 מ"ג / קילוגרם לזירוז יעיל של פציעה (מידע לא מוצג). תצפיות אלו מדגישות את החשיבות של שימוש SIB חד-המינילינג שולט במחקרי פציעה כדי למזער השתנות ניסיוניות.

קווים מהונדסים דג הזברה רבים משתמשים אמרגן רגיש הלם חום כאמצעי כדי לגרום לביטוי של transgene. מאז דג הזברה היא poikilothermic ולא לווסת את טמפרטורת הגוף שלהם, הם נאלצים לבצע פעולות פיסיולוגיות בטמפרטורה של סביבתם. בהקשר של ניסויים באמצעות אמרגן hsp70 להביע transgenes הדומיננטי לווסת את תגובת ההתחדשות, אנו באופן בלתי צפוי ציינו כי תגובת ההתחדשות הואצה על ידי טמפרטורה גבוהה יותר. לכן, קביעת השפעת הטמפרטורה על תגובת ההתחדשות במערכת נתונה הופכת חיונית לתכנון התזמון של ניסויים (לכידת השיא של תגובת ההתחדשות למשל) ועושה השוואה להתחדשות בטמפרטורות נורמליות בעייתיות. מערכות מושרה אחרות באמצעות למשל CreERT וטמוקסיפן לזירוז transgene עשויות להיות לא מתאים יותרמחקרי o של התחדשות בכליות מבוגרת. כמו כן, שיטות חדשות יותר גנטיות של אינדוקציה פציעה כגון הפעלת CreERT של transgenes הרעיל או פגיעה מושרה באמצעות nitroreductase / metronidazole חיידקי 18,19 יהיה להרחיב את הטווח של ניסויים אפשר להבין טובות יותר neonephrogenesis והתחדשות בכליות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
gentamicin sodium sulfate Sigma G1264 TOXIC, purity varies from batch to batch
plastic transfer pipets Fisher 13-711-7M
1 ml Norm-Ject syringes Electron Microscopy Sciences 72520 green plastic syringes, ordinary 1 ml syringes are OK, but harder to read accurately
30 G1/2 needles Becton Dickinson 305106
ethyl 3-aminobenzoaate methanesulfonate salt (tricaine) Sigma A5040 IRRITANT
16% paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710 Make 4% in 1x PBS for working solution

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Humphreys, B. D., et al. Intrinsic epithelial cells repair the kidney after injury. Cell Stem Cell. 2, 284-291 (2008).
  2. Humphreys, B. D., et al. Repair of injured proximal tubule does not involve specialized progenitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 9226-9231 (2011).
  3. Guo, J. K., Cantley, L. G. Cellular maintenance and repair of the kidney. Annu Rev Physiol. 72, 357-376 (2010).
  4. Cirio, M. C., de Groh, E. D., de Caestecker, M. P., Davidson, A. J., Hukriede, N. A. Kidney regeneration: common themes from the embryo to the adult. Pediatr Nephrol. , (2013).
  5. Little, M. H., Bertram, J. F. Is there such a thing as a renal stem cell. J Am Soc Nephrol. 20, 2112-2117 (2009).
  6. Reimschuessel, R. A fish model of renal regeneration and development. ILAR J. 42, 285-291 (2001).
  7. Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebrafish. Am J Physiol Renal Physiol. 299, F1040-F1047 (2010).
  8. Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T. Heart regeneration in zebrafish. Science. 298, 2188-2190 (2002).
  9. Goessling, W., et al. APC mutant zebrafish uncover a changing temporal requirement for wnt signaling in liver development. Dev Biol. 320, 161-174 (2008).
  10. Pisharath, H., Rhee, J. M., Swanson, M. A., Leach, S. D., Parsons, M. J. Targeted ablation of beta cells in the embryonic zebrafish pancreas using E. coli nitroreductase. Mech Dev. 124, 218-229 (2007).
  11. Swanhart, L. M., et al. Characterization of an lhx1a transgenic reporter in zebrafish. Int J Dev Biol. 54, 731-736 (2010).
  12. Diep, C. Q., et al. Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish. Nature. 470, 95-100 (2011).
  13. Lopez-Novoa, J. M., Quiros, Y., Vicente, L., Morales, A. I., Lopez-Hernandez, F. J. New insights into the mechanism of aminoglycoside nephrotoxicity: an integrative point of view. Kidney Int. 79, 33-45 (2011).
  14. Hentschel, D. M., et al. Acute renal failure in zebrafish: a novel system to study a complex disease. Am J Physiol Renal Physiol. 288, F923-F929 (2005).
  15. Gerlach, G. F., Schrader, L. N., Wingert, R. A. Dissection of the adult zebrafish kidney. J Vis Exp. , (2011).
  16. Fogazzi, G. B., Cameron, J. S. Urinary microscopy from the seventeenth century to the present day. Kidney Int. 50, 1058-1068 (1996).
  17. Nachtrab, G., Czerwinski, M., Poss, K. D. Sexually dimorphic fin regeneration in zebrafish controlled by androgen/GSK3 signaling. Curr Biol. 21, 1912-1917 (2011).
  18. Zhou, W., Hildebrandt, F. Inducible podocyte injury and proteinuria in transgenic zebrafish. J Am Soc Nephrol. 23, 1039-1047 (2012).
  19. Huang, J., et al. A zebrafish model of conditional targeted podocyte ablation and regeneration. Kidney Int. 83, 1193-1200 (2013).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גיליון 102 בכליות בינים גנטמיצין בהזרקה דג הזברה פציעה התחדשות Lhx1a הלם חום מבוגר
התחדשות בכליות למבוגרי דג הזברה על ידי גנטמיצין מושרה פגיעה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kamei, C. N., Liu, Y., Drummond, I.More

Kamei, C. N., Liu, Y., Drummond, I. A. Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury. J. Vis. Exp. (102), e51912, doi:10.3791/51912 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter