Summary
שיטות המייצרות עוברי morphant חיוניות ללמוד מנגנוני התפתחות ורשתות רגולציה גן. כוכב הים Patiria miniata הוא מערכת מודל מתעורר ללימודים אלה. כאן אנו מציגים פרוטוקול לקבלת תאי רבייה, בהפקת תרבויות של עוברים, וmicroinjection המהיר של zygotes ממין זה.
Abstract
Echinoderms כבר זמן רב מערכת מודל מועדף למחקרים של רבייה והתפתחות, ולאחרונה לחקר ויסות הגנים והאבולוציה של תהליכים התפתחותיים. כוכב הים, Patiria miniata, הוא צובר שכיחות כמערכת מודל למחקרים מסוג שבוצעו באופן כמעט בלעדי בעבר בקיפודי הים, purpuratus Strongylocentrotus וvariegatus Lytechinus. יתרון של מערכות מודל אלה הוא הקלות של יצירת עוברים שונה שבגן מסוים הוא למעלה או downregulated, תיוג קבוצה של תאים, או החדרת גן כתב. שיטת microinjection בודדת מסוגלת לייצר מגוון רחב של עוברים שונה כגון. כאן, אנו מציגים שיטה לקבלת תאי רבייה מפ miniata, הפקת zygotes, והחדרת חומרים כימיים מדאיגים באמצעות microinjection. עוברי morphant בריאים מבודדים לאחר מכן למחקרים כמותיים ואיכותיים של geפונקצית ne. הזמינות של נתוני הגנום וtranscriptome לאורגניזם זה הגדילה את סוגי מחקרים שמבוצעים ואת הקלות של ביצועם.
Introduction
כוכב הים, Patiria miniata, (הידוע בכינויו כוכב העטלף) מסתמן כמערכת מודל מעניינת ותכליתית עבור מגוון רחב של 1 סלולארי 3, התפתחותיות 4,5, אבולוציוני 6 8, ומחקרים אקולוגיים 9- 11. פ למבוגרים miniata מופצים לאורך חוף האוקיינוס השקט מסיטקה, אלסקה לאחה, 12 קליפורניה ונשמר בקלות באקווריום ימי. ביציות הן ימות השנה ברת השגה וכל נקבה יכולה לשפוך עשרות אלפי ביצים. ביציות הבשילו בקלות ומופרה חיצוני 13. העוברים וכתוצאה מכך הם שקופים ומאפשרים להתבוננות קלה; הם מפתחים באופן סינכרוני, ודורשים מים ים רק לפיתוח. הרכבה הגנום כולו וtranscriptomes מרובה זמינות גם עבור P. miniata (Echinobase.org). יתרונות כגון להפוך אותם אידיאליים עבור מגוון רחב של מחקרומטרות הוראה.
בשנים האחרונות, פ ' miniata הפך מערכת מודל לרשת רגולציה גן התפתחותי מנתחת 14- 16. מטרת מחקרים מסוג זה היא לזהות את כל המחמאה של גני רגולטורים ולקבוע את הרשת של יחסי הגומלין שלהם. חלק ניכר מהעבודה כרוכה בביטוי גנים מדאיג דרך כניסתה של oligonucleotides antisense או בmRNAs מבחנה מסונתזת. בנוסף, ניתוחי רגולציה cis משמשים כדי לאפיין את הפונקציה של DNA הרגולציה 15. ניתוחים אלה דורשים הקדמה של חומרים כימיים ההפרעות ו / או כתב הבונה DNA לעוברי. יתר על כן, כדי לאפיין את ההשפעות במורד הזרם של הפרעות אלה, יש assay עוברים רבים לשינויים בביטוי הגנים של מטרות פוטנציאליות. טכניקות לmicroinjection של מאות רבות של zygotes הן מרכזיות לעבודה זו.
Echinoderms, כולל P. miniata דה נובו באמצעות microinjection. Microinjection מציע הזדמנות לשנות עוברים עם ריאגנטים שאינם תא חדיר. הפרוטוקול הבא מתאר שיטה להציג את DNA, mRNA, קליעים נותבים תא, וoligonucleotides antisense morpholino למאות ביצים מופרות בשעה אחת 2-3 יושבת דרך microinjection. זה מייצר חומר מספיק עבור מגוון רחב של ניסויים במורד הזרם כולל, אך לא מוגבל ל, qPCR, הכלאה באתר, RNA-Seq, ומערבי סופג.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
שמור את כל מי הים או מי ים מלאכותי (SW), גורים ובוגרים, ותרבויות ב15 ° C עד כמה שהוא מעשי. ביצים וzygotes להבטיח שמתקיימים שקועים בSW.
מלחי ים מסחרי מוכנים מחדש עם מים אוסמוזה מזוקקים או הפוכים משמש גם כמקור של SW. בדוק מליחות באמצעות הידרומטר ולהתאים מלחים או מים כדי להשיג רמות אופטימליות. לשמור על רמות משקל סגולי בין 1.020-1.025. שמור את כל כלי הזכוכית וplasticware להיפרד מכל מעבדתי האחרים, כדי למנוע כל זיהום בכימיקלים. מעבדתי נקי עובר כיתה על ידי שטיפה במים ללא יונים או שריה מזדמנת בהיפוכלוריט נתרן לדלל ואחריו שטיפה מספר פעמים במים.
1 קבלת והתבגרות תאי רבייה ממבוגרי miniata Patiria
- בחר בעלי חיים שיחתכו בלוטות מין. לקבוע מין לאחר כריתה על ידי מחפש את נוכחותו של השחלות או אשכים בגלל פ miniata אינו sexually דימורפית.
- לחתוך פתח קטן, לא גדול יותר מ 1 סנטימטר, בצד של זרוע כוכב ים עם להב אזמל (איור 1 א). בעזרת מלקחיים הסתיימו בוטים קטנים למשוך בחזרה קצוות של החתך כדי לגשת לרקמת בלוטת המין ולמשוך רקמת אשך החוצה דרך החתך.
הערה: יש להימנע מתלישת רקמת מעי, שהוא רקמה אפורה או חום רופף (איור 1). השחלות הן בדרך כלל כתומות, צהובות, או בצבע חום בהיר (איור 1 ג), ואילו אשכים הם לבנים או בז'ים וכאשר שיבשו יגרמו מים ים על מנת להפוך לחלבי או מעונן בהופעה (1D איור). - חזור נקבות לאקווריום. לבודד זכרים לשעה או שעות במכל של SW מאז הלחץ מטיפול עשוי לגרום להשרצה. בעלי חיים לרפא לאורך אתר החתך ולהמשיך לספק תאי מין במשך כמה חודשים.
- לאסוף אשכים לתוך צינור 1.5 Eppendorf מ"ל עם SW הקטן ככל האפשר, ולאחסן על קרח עד לשימוש. לאחסן כל אשכים לאעורך ביום האיסוף בשעה 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע.
- לאסוף השחלות בצלחת תרבות זכוכית קטנה בכמה מיליליטרים של SW. כדי לשחרר את הביציות מרקמת השחלה, להפריד את הרקמה עם שני זוגות מלקחיים עד שלא יישארו חתיכות גדולות.
הערה: באופן אופטימלי, רוב הביציות מפותחות באופן מלא. ביציות כאלה הן גדולות, עגולים, וברורים צהוב או חום בהיר עם שלפוחית נבטיה מובהקת בביצית (איור 2 א), בהשוואה לקבוצת המשנה של ביציות לא מפותחות, כי הם קטנים, בצבע חום, מגורענים, ואטומים (איור 2). אם גדול יותר סביב 25 מאשר% מהביציות הם של המגוון בלתי מפותח, בחר נשי שונה כדי להשיג ביציות. - יוצקים את הביציות ורקמה שנותרה באמצעות כוס מסנן רשת עם גודל נקבובית 200 מיקרומטר ולאסוף לזרום. זה יכלול את כל הסוגים של ביציות אבל להסיר את רקמת השחלה. לסלק ביציות שנותרו מהרקמה נתפסה על ידי המסנן על ידי ריסוס wSW ith מבקבוק להשפריץ. כוסות מסנן מבוצעות באמצעות צינור חרוטי 50 מ"ל (איור 3A-').
- יוצקים את הזרימה דרך מהצעד 1.6 באמצעות כוס מסנן רשת 100 מיקרומטר. בטל ביציות קטנות בזרימה דרך. ביציות גדולות שפותחו באופן מלא כי הם מוכנים להתבגרות יישאר על המסנן. יש לשטוף את הביציות לתוך מבחנה 200 מ"ל נקייה.
- הוספת 95 מ"ל של SW לכוס זכוכית 200 מ"ל של ביציות. הוסף 5 מ"ל של 200 1 מיקרומטר-methyladenine לריכוז סופי של 10 מיקרומטר.
- מעבירים את הביציות לצלחת גדולה רדודה תרבות ומקום ב15 ° C. שטח פנים גבוה למנת תרבות נפח מאפשר לחילופי חמצן. הביציות לא בשלות או לא עשוי לפתח גם אם הם צפופים בשלב התבגרות זה. התפצל לכמה מנות של SW תוספת 10 1 מיקרומטר-methlyadenine עד התרבות היא פחות מ -200 מ"ל / ביציות.
- לאפשר הביציות להבשיל ל45-90 דקות, אבל כבר לא כמו זה יהפוך את הביציות מסוגלות להיות fertilized. כדי לקבוע אם ההתבגרות היא מלאה, מסתכל על הביציות תחת היקף לנתח. המהלכים הנבטיים שלפוחית לכיוון ונתיכים עם קרום התא במהלך התבגרות. לאחר מכן הוא מתפרק ולכן הוא כבר לא נראה לעין בביציות בוגרות (איור 2 ג).
.2 הפריה של ביציות בוגר
- בחר מקבץ קטן של רקמת אשך, בערך בגודל אפונה, ובשר טחון בצלחת תרבות זכוכית קטנה עם כ 1 מ"ל של SW.
- השתמש בפיפטה פסטר להעביר 2-3 טיפות של מי ים החלבי וכתוצאה מכך לכ 100 מ"ל של הביציות הבשלות ולערבל את המנה התרבות לערבב. הימנע מהעברת חתיכות של רקמת אשך. הימנע מהוספת כמויות גדולות יותר של זרע כפי שזה עלול לגרום לpolyspermy ופיתוח עני שלאחר מכן.
- לאחר כמה דקות לצפות בביציות תחת היקף לנתח. ביצים מופרות, או zygotes, יש מעטפת הפריה, שבו היא בועה ברורה שעולה מcelקרום l (איור 2 ד).
הערה: אל להמשיך עם התרבות אם פחות סביב 90 מאשר% מביצים להפרות שכן שיעורי הפריה ירודים הם אינדיקציה של תרבות לא בריאה שגם לא יכול להתפתח היטב. - לאחר ההפריה היא מלאה, לשנות את SW על zygotes על ידי שפיכה דרך מסנן רשת 100 מיקרומטר ושטיפה לתוך צלחת תרבות עם SW הטרי. חשוב להסיר את הזרע העודף כדי למנוע רעב חמצן. מניחים את צלחת התרבות ב15 מעלות צלזיוס למשך 15-30 דקות.
.3 De-רוטט וחתירת ביצים מופרות
- הכן מנות הזרקה על ידי לקיחה את המכסה מצלחת פטרי 60 x 15 קלקר מ"מ.
- למתוח קו בטוש קבוע בחלק האחורי של הצלחת, באזור שמתאים לשדה הראייה במיקרוסקופ microinjection. הדבר מבטיח כי כל העוברים חתרו הם גם בתחום מיקרוסקופ מבט.
- השתמש בפיפטה פסטר זכוכית להבקיע קו דרך המעגל, עמ 'referably בצד אחד של המעגל (איור 3 ב). להשתמש בקו זה בהמשך לשבור מחטי הזרקה (שלב 4.5).
הערה: ריאגנטים נפוצים לדבוק עוברי קיפודי ים, למשל, סולפט protamine או פולי-L ליזין, הם מיותרים. De-קרוש פ zygotes miniata להיצמד היטב לפלסטיק ללא ציפוי. שים לב שהם לא מקל גם על כלים מזכוכית.
- להוסיף סביב 10 מ"ל SW לכל מנה, כך שהמשטח מכוסה, אבל המים לא להתיז יתר על המידה בצלחת מכיוון שהדבר עלול להפריע עוברים חתרו.
- הסר את פ מעיל miniata הזיגוטה ג'לי עם SW חומצה לפני החתירה. מעיל ג'לי זה יותר נרחב מזה שנצפה עבור מיני קיפודי ים מודל.
- הכן SW חומצה בטווח של pH 4.0-4.2. PH הוא קריטי כדי לאפשר ההסרה יעילה של מעיל ג'לי תוך התרת התפתחות תקינה.
- מוסיף טיפה אחת של 1 N (1 M) HCl בSW למניית 1 ליטר של SW. לאפשר לכל טיפה לערבב לחלוטיןולפקח pH לפני הוספה יותר HCl.
הערה: אחת לכמה מ"ל של תוצאות HCl בpH המתאים, אבל לא להוסיף את כל הנפח בבת אחת.
הערה: הכן 1 N HCl במנדף עם SW ו12 N (12 M) HCl. - הסר SW על zygotes במזיגה על מסנן רשת 100 מיקרומטר. יש לשטוף לתוך מבחנה מ"ל 200 בכמות הקטנה ביותר של SW האפשרי (כ 10 מ"ל). מלא את הכוס עד 150 מ"ל עם SW החומצה (pH 4.0) ולאפשר zygotes לשבת בSW החומצה במשך 3 דקות.
- להפשיט מעיל ג'לי מzygotes על ידי שפיכתם הלוך ושוב בין שתי 200 מ"ל כוסות, בכל פעם שעברה את zygotes דרך מסנן רשת 200 מיקרומטר. יוצקים את zygotes דרך המסנן סביב 5-10x על על חלון זמן 2 דק '.
- הסר SW חומצה על ידי שפיכת zygotes על מסנן רשת 100 מיקרומטר. יש לשטוף את zygotes לתוך צלחת תרבות זכוכית קטנה עם SW. zygotes קורש-De עשוי להיצמד לצלחות פלסטיק. עוברי שורה באופן מיידי; הם מתחילים לייצר יותר jמעיל Elly שמוביל להידבקות עניה לצלחות פלסטיק לאורך זמן.
- השתמש בפה פיפטה (איור 3 ג-C ') לאסוף את zygotes ממנת תרבות הזכוכית ולמקם אותם לתוך קווים ישרים על מנות ההזרקה. ממסים את המרכז בצד הדק של פיפטה פסטר על אש עד שהזכוכית היא רכה. במהירות למשוך את הקצוות של הזכוכית זו מזו כדי לייצר מתיחה מאוד דקה של זכוכית. ברגע שהזכוכית היא מגניב, לשבור את הקצה הקטן של פיפטה פסטר (למידע נוסף על הכנת פיפטה פה לראות וסל et al. 2,004 17 או מתוק et al. 2004 18).
- הפוך פיפטה חתירה כך שהקוטר הוא רק גדול יותר מאשר הקוטר של העוברים, כך שרק הזיגוטה יחידה תהיה להיכנס ולצאת פיפטה בכל פעם. זה יאפשר שורה אחת כדי ליצור. טפטפות קוטר קטנה יותר יכולה להפשיט את מעטפת ההפריה ולשבש את zygotes כפ אין לי zygotes miniata קרום hyalinend הם די רך.
- אם zygotes לא מקל על צלחת הפלסטיק, לשמור אותם לזמן נוסף בSW החומצה (עד יותר כמה דקות). לחלופין פיפטה בקוטר קטנה יותר עשויה לסייע בהסרת מעיל ג'לי לאפשר zygotes לדבוק בצורה יעילה יותר.
- Zygotes הם מעט חיובי קלילים ונוטה לצוף או לרחף ממש מעל לתחתית הצלחת. במקרה זה, למקם את פיפטה החתירה כך שzygotes נלחץ בעדינות על פני השטח של הצלחת כפי שהם יציאת פיפטה (איור 3D).
הערה:. מותר להתאים שורות רבות במנות אלה פ קרומים עובריים miniata אינם הופכים קשים יותר לחדור לאורך זמן ולכן ניתן להזריק מאות zygotes על צלחת אחת.
.4 הזרקה של Zygotes
- הכן את פתרונות הזרקה עם ריכוזים מתאימים של oligonucleotides antisense morpholino (Maso), mRNA, או DNAs בקונצרט כלשהו סופיentration של 200 מ"מ KCl. 400-800 מיקרומטר Maso ו2.5 ng / μl של DNA נוטים לייצר פנוטיפים morphant תוך מזעור רעילות. הריכוז הסופי בביצה יהיה 1/125 ה ריכוז ההתחלה 14. לפתרונות הזרקה המכילים משוש, חום עד 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות מייד לפני שימוש ולאחר מכן לאחסן בטמפרטורת חדר.
- על מנת להקל על מיון עוברים מוזרקים, להוסיף נותב dextran rhodamine לפתרון ההזרקה להשיג ריכוז של .0.1%.
- הכן מחטי הזרקה על ידי משיכת צינור זכוכית נימים (ID OD x 0.75 מ"מ 1.0 מ"מ, אורך מ"מ 100) במחט מושכת מכשיר הבא הוראות יצרן. מחטים מתאימות להזרקה בקיפודי ים גם לעבוד גם עבור כוכבי ים, כל כך להשתמש בפרמטרים דומים 19.
- לטעון כ 2 μl של פתרון זריקה לתוך מחט זריקה באמצעות קצה פיפטה microloader.
- הכנס את הקצה הקהה של המחט לתוך מ 'anipulator. Picospritzer מוגדר 100 דופק אלפיות שני ולחץ אוויר של 40 PSI.
- מניחים צלחת של עוברים חתרו לבמה מיקרוסקופ וכל העוברים בשדה הראייה. להתמצא הצלחת כך ששורת הבקיע היא בצד הקרוב למחט. מקם את המחט בזווית של כ -60 ° כך הטיפ הוא קרוב לאמצע של הקו ורק מעל פני השטח של המים.
- דגש על קו השער ולהוריד את המחט עד הקצה מתחדד. מנמיכים את הקצה קטן יותר ולשבור אותו פתוח על ידי הפעלתו בעדינות לתוך הרכסים של הקו קלע. הרם את הקצה את פני השטח של הצלחת ולמקם אותה בחלק העליון של השורה הראשונה של zygotes ולהתמקד בzygotes.
- מנמיכים את הקצה כך שהוא ישפד מרכז הזיגוטה מגיע מרחבי זווית 60 °. המחט בקלות חודרת פ zygotes miniata. לדרוך על דוושת הרגל (או באמצעים אחרים של כפיית חומר ממחט הזריקה) להציג את בולוס של inje פתרון ction לעובר.
- לשאוף לבולוס שהיא 20-30% בקוטר של העובר, או בין 25 ו80 pl. אם בולוס הוא גדול יותר או קטן יותר מזה, להתאים את משך הזמן של הזרקה בPicospritzer ולהזריק את העובר הבא. המשך להתאים את משך הזמן עד לקבל את גודל בולוס הרצוי. התחל מ100 משך אלפיות שני. -לשבור מחדש את המחט אם יש צורך גדול יותר מסביב 200 אלפיות השני להציג את בולוס המתאים. מחק את המחט ולהכין אחד חדש, אם יש צורך בפחות מ 15-20 אלפית שני כדי להשיג גודל בולוס זה כגודל המחט גדול מדי ועלולה לשבש התפתחות תקינה.
- המשך להזריק zygotes שנותר על צלחת ההזרקה. בקלות ניתן להזריק עוברים עד התחלות מחשוף וללסטומרים בודד לאחר המחשוף ראשון. מעת לעת להרים את המחט מעל פני השטח של המים כדי להסיר zygotes שידביק אותם על המחט. במידת צורך מחדש לשבור את קצה המחט או לטעון מחט חדשה, אם חסימה מתרחשת.
ss = "jove_title"> 5. איסוף יצוקה עוברים לניתוח במורד זרם
- לאפשר את העוברים להתפתח ב15 מעלות צלזיוס בSW. לשמור על שטח פנים גבוה לנפח בתרבויות כדי לאפשר חילופי חמצן. ודא עוברים אינם צפופים; לשמור על תרבויות בבית או מתחת 200 מ"ל / עוברים. בהתאם לשלב הרצוי של עובר, מתכנן לאסוף עוברים הוחדרו בסביבות 20-24 שעה לאחר הפריה.
הערה: לעתים קרובות זהו זמן אידיאלי כדי למיין ולאסוף וכי עוברים בדרך כלל מתפתחים בקלות להבחין מורפולוגית, אך עדיין לא שוחים. - אם עוברים בקעו, בעדינות מלח זעזועים למניעה שחייה. הוסף 200 μl של 5 M NaCl ל10 מ"ל של SW בצלחת ההזרקה תוך מתערבל SW בעדינות. אחרי כמה דקות, העוברים ייפלו לתחתית הצלחת. לאסוף אלה ולהעביר אותם לSW מליחות הנורמלי.
- איסוף עובר מוזרק תחת מקור אור ניאון מתאים בקנה אחד עם נותב בשימוש בinjectiעל פתרון. אם לא נותב שימש, סוג עוברים כדי לבחור למורפולוגיה נורמלית.
- בעזרת פיפטה פה, לצייר fluorescing את עוברים עם כמות מינימאלית של SW ולפוצץ אותם לתוך צלחת תרבות קטנה מלאות SW. יש לי טפטפות פה האידיאלית מספיק פתיחה גדולה לעוברים להיות משך פנימה והחוצה מבלי לפגוע בהם, אבל לא כל כך גדולה, שעוברים לא רצויים וSW הזר גם עצרו.
- ברגע שכל העוברים הרצויים כבר נאספו לתוך הצלחת החדשה, להתבונן בעוברים תחת אור הניאון ולהסיר כל עוברים מוזרקים בלתי או עוברים מפותחים.
- תרבות מסודרים עוברים לשלבים רצויים בחממה ולהמשיך בהדמיה או בפרוטוקולים רצויים אחרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
המטרה של פרוטוקול זה היא להציג את חומרים כימיים לעוברי. אנו מדגימים את היעילות של הפרוטוקול על ידי הזרקה לבנות כתב DNA שמניע את הביטוי של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP). עובר מוזרק להביע GFP בתיקונים משובטים (איור 4A-B) כDNA משלב במהלך המחשוף מוקדם. ריאגנטים רבים הנמצאים רצויים להציג לעוברי הם רעילים בכמויות גבוהות וקבוצות לא טובות של עוברים. מניפסטים רעילות על ידי עיכוב התפתחות, שעצר את הפיתוח במחשוף מוקדם או בשלב הביצית המופרה, או על ידי הטלת פיתוח חריג (איור 5A-C).
איור 1 תאי מין קבלת מפ מבוגרים miniata. ) כדי לכרות בלוטות מין עושים חתך בצד של הפרוקסימלי זרועלמרכזו של בעל חיים. B) חומר החום הכהה משך מהחתך הזה הוא רקמת מעי. הימנע ממשייכת רקמת מעי כפי שיפגע בבעלי החיים. C) רקמת שחלה היא בדרך כלל בצבע כתום כפי שמוצג כאן, אבל יכול להיות גם צהוב או חום בהיר. אשכי D) הם לבנים או בז' בצבע, כפי שמוצגים. כל הברים בקנה מידה נסמן 1 סנטימטר.
איור התבגרות .2 והפריה של ביציות. ) ביציות בריאים כי הם מוכנים להתבגרות הן גדולות וברורות עם שלפוחית נבטיה גלויה. B) ביציות, כי הם לא מוכנים להתבגרות הם קטנים יותר, בצבע חום, ומגורענים במראה. C) ביצית שכבר התבגרה עם 1-methyladenine . השלפוחית הנבטיה התקלקלה. D) הזיגוטה המוקפת FERTמעטפת ilization. E) הימנע מתרבויות עם ביציות גדולות שלא ניתן התבגרו כי ביציות אלה לא יוסרו על ידי סינון. ביציות כאלה הן מעט קטנות יותר מאחד בא 'והם בצבע חום כהה ומרקם מגורען. סרגל קנה המידה במציין 50 מיקרומטר ומייצג את קנה המידה עבור תמונות AE.
איור 3 מכשירים להרכבה. AA ') מסנן רשת המחובר לצינור חרוטי 50 מ"ל. מחודד הקצה של הצינור ואמצע המכסה נחתכים החוצה כדי לאפשר לשפכו תרבויות דרך הצינור ומסנן. צלחת הזרקה בנויה מהמכסה של צלחת תרבות קלקר 60 x 15 מ"מ B). מעגל נמשך סביב המרכז מתאר את שדה הראייה של המיקרוסקופ ההזרקה ומשמש כמדריך לעוברי חתירה. שורת הבקיע into הצלחת שימושית לשבירת מחטי הזרקה. הגדרת פיפטה הפה CC "). תתאים שופר לקצה אחד של צינור גומי ארוך ברגל כמה. התאם את הקצה השני לפיפטה פסטר, שעוצב על ידי התכה בקצרה ומושך את הקצה הצר של זכוכית. D) סכמטי הוכחת חתירה צורה אידיאלית פסטר פיפטה ורוחב כדי לקדם את דבק מבלי לפגוע בעוברים. כאשר שוברים את הסוף את של פיפטה משכה, זה מועיל אם הסוף הוא מחודד כדי למנוע zygotes מתעורר מצף מהצלחת. כל הברים בקנה מידה נסמן 3 סנטימטר.
ריאגנטים .4 איור הציג בהצלחה על ידי Microinjection. ) DIC של עובר שלב blastula מוזרק עם פלסמיד כתב GFP. יש עובר מורפולוגיה נורמלית. expre B) GFPssion בתמונה DIC של שני עוברי מורפולוגית נורמלים שלב blastula. ד) העובר אחת מC העובר מוצג בC א) פולט קרינה אדומה מההקדמה של dextran טקסס האדום. העובר השני הוא מוזרק האו"ם ומציג שום הקרינה. ברים סולם לציין 50 מיקרומטר. סרגל קנה מידה במייצג את קנה המידה ולB. סרגל קנה מידה בC מייצג את קנה המידה לC וד
איור 5 Overinjection ותוצאת רעילות מגיב בנעצר או פיתוח חריג. כל התמונות הן של עוברים 24 שעות שלאחר הזרקה מאותה אצווה הזרקה. AA ') הזיגוטה overinjected נעצרה בשלב אחד התא. BB ") נעצר עובר במחשוף מוקדם. עובר בריא יחלק באופן סימטרי, ואילו נעצר עובר זהעקב חלוקות תא נורמליות. CC ") עובר עם פיתוח בפראות חריג בשל רעילות. בעוד עובר זה בצורה פחות או יותר כמו עובר blastula (ד '), זה לא סימטרי ואופן חריג מעובה. DD') כראוי פיתוח הזריק blastula עובר שלב. סרגל קנה מידה במציין 50 מיקרומטר ומייצג את קנה המידה לכל הפנלים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ישנם שני שלבים קריטיים שקשה עבור משתמשים מתחילים בטכניקה זו, אך הם חיוניים ליצירת הצלחת עוברי morphant. הוא הבחירה הראשונה ביציות בריאים שתבשלנה ולדשן כראוי. אחוז של התפתחות נורמלית בתרבות תלויה בעונה, על בריאותם של בעלי החיים, ואת מספר פעמים שביציות כבר נקצרו מאדם אחד. ביציות נוטות להיות באיכות טובה יותר מאפריל עד אוקטובר. חשוב לבחון בזהירות את הביציות לפני שתמשיך כדי לוודא שהרוב נראה כמו איור 2 א ולא איור 2. מותר לי מספר קטן של ביציות שאינם בשלות, במיוחד אם הם קטנים מספיק כדי לסנן כביציות מעובדות. מדי פעם, ביציות שאינן מפותחים כמעט גדולות כמו ביציות שפותחו באופן מלא כי הם מוכנים להתבגרות. הם נבדלים על ידי colorin המגורען, החום שלהםg (איור 2E). אל תשתמשו בקבוצות של ביציות מסוג זה, כי סינון לא לבודד ביציות שפותחו באופן מלא מביציות לא מפותחות והם לעתים קרובות תוצאה בתרבויות עובר לא נורמליות שיש סיכוי גבוה יותר להציג את הפגמים ניתן לראות באיור 5.
השלב הקריטי האחר הוא גודל בולוס ההזרקה. להציג את הסכום של מגיב מדאיג כי הוא גדול מספיק כדי להפעיל השפעה, אבל לא כל כך גדולה כמו לגרום לתופעות שאינן ספציפיות. בפעם הראשונה שמגיבה מדאיג משמש, כדאי לבצע טיטרציה שבכמה ריכוזים של מגיב הם ניסו. בצע microinjections הבא עם הריכוז הגבוה ביותר שאינו גורם למומים התפתחותיים שאינם קשורים לפנוטיפ הצפוי, או פיתוח עיכוב (איור 5 א). הימנע מהזרקת בולוס כי הוא גדול יותר מ30% הקוטר של העובר כמו זה עלול לשבש את ההתפתחות תקינה. גדלי בולוס יתר על המידה קטן, על ידי שיתוףntrast, קשה לבדוק מבחינה ויזואלית לשינוי גודל עקבי אשר יכול להוביל למגוון מוגזם של פנוטיפים ההפרעות פני משכפל.
ריאגנטים מדאיגים עלולים לגרום לעיכובים התפתחותיים או פנוטיפים שאינם ספציפיים בטווחי ריכוז יעילים. זה מאוד חשוב, ולכן, כדי להזריק בקרות אח עם מגיב שפיר כגון שליטה סטנדרטית Maso, בונה DNA סטנדרטית, או נותב rhodamine. עוברי morphant assay רק אם בקרות אלה מראות התפתחות תקינה. עוברים מוזרקים, לרבות בקרות, לפעמים להפגין פנוטיפ blastula מקומט אבל הם לעתים קרובות ימשיכו דרך שאר התפתחות בדרך כלל. בנוסף, אם מגיב מסוים גורם באופן עקבי עיכובים התפתחותיים בעוברי morphant וכתוצאה מכך, להשוות עוברים אלה כדי לשלוט עוברים כדי לקבוע כמה שעות של עיכוב שהם חווים.
יש כמה תכונות של שיטה זו שעלולה להגביל את השימושיות שלה ביםתרחישים ניסיוניים pecific. נושא אחד כזה הוא העובדה שאחד יכול רק להציג את חומרים כימיים בביצית מופרה או שלבי מחשוף מוקדמים. זו היא בעייתית במיוחד אם הגן או המסלול של ריבית הוא קריטי במיוחד בהתפתחות מוקדמת ועוברי morphant הנגזרים inviable מדי או מבחינה התפתחותית נורמלי למחקר משמעותי. לפעמים בעיה זו נפתרה על ידי הזרקת כמות עותקים קטנים של המגיב המדאיג, וכתוצאה מכך מציאה עדינה, לא שלמה. אם תרופת תא חדיר מתאימה לגן המטרה או מסלול קיימת, כדאי להשוות את הפנוטיפ של עוברים מוזרקים עם ריאגנטים בשלב הביצית המופרה עם עוברים שטופלו בתרופה בשלב מאוחר יותר, מתאים יותר. בגלל זריקה של משוש או mRNAs מציעה לפרט יותר, הוא חזק יותר להשתמש בשיטה זו בשילוב עם מחקר תרופה לטיפול בניגוד לנטישת microinjection לטובת טיפול תרופתי.
לבסוף, למרות שמייקרו זהשיטת הזרקה תפיק כמות מספקת של עוברים למגוון רחב של יישומים במורד הזרם, זה במקרה הטוב יהיה לייצר כמה 100-1000 עוברים בריאים, שהוחדרו בהצלחה. כמה ניסויים רצויים עשויים לדרוש הרבה יותר חומר מזה. שיטות אחרות המשמשות בהצלחה במערכת קיפודי הים עשויים להיות שונה כדי ליצור מספרים גדולים עוד יותר של עוברי כוכבים ים morphant, כגון רטרווירוסים pantropic 20, למרות ששיטה זו היא חדשנית ועדיין לא זכתה לשימוש נרחב.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים שהוכרזו על ידי המחברים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע IOS 0844948 וIOS 1024811
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Methyladenine | Acros Organics (Fisher Scientific) | AC20131-1000 | |
| 190 micron nitex nylon filter | Small Parts (originally Sefar) | CMN-0185-C/5PK-05 | |
| 100 micron nitex nylon filter | Small Parts (originally Sefar) | CMN-0105-C/5PK-05 | |
| Polystyrene Petri dishes, 60 mm x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Capillary tubing | FHC, Inc | 30-30-0 | For pulling microinjection needles |
| Model P-97 Needle Puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Dextran, Rhodamine Green | Life Technologies | D7163 | If injecting a GFP expression reporter, it is helpful to substitute Texas Red dextran as an injection tracer |
| Instant Ocean Sea Salt | Doctors Foster and Smith | CD-116528 | Also available in many pet stores |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242 956.003 |
References
- Terasaki, M. Quantification of fluorescence in thick specimens, with an application to cyclin B-GFP expression in starfish oocytes. Biol. Cell Auspices Eur. Cell Biol. Organ. 98, 245-252 (2006).
- Terasaki, M., Runft, L. Two-stage dependence for 1-methyladenine induced reinitiation of meiotic maturation in starfish oocytes. Exp. Cell Res. 316, 2654-2663 (2010).
- O'Neill, F. J., Gillett, J., Foltz, K. R. Distinct roles for multiple Src family kinases at fertilization. J. Cell Sci. 117, 6227-6238 (2004).
- McCauley, B. S., Akyar, E., Filliger, L., Hinman, V. F. Expression of wnt and frizzled genes during early sea star development. Gene Expr. Patterns GEP. 13, 437-444 (2013).
- Yankura, K. A., Koechlein, C. S., Cryan, A. F., Cheatle, A., Hinman, V. F. Gene regulatory network for neurogenesis in a sea star embryo connects broad neural specification and localized patterning. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 8591-8596 (2013).
- McCauley, B. S., Wright, E. P., Exner, C., Kitazawa, C., Hinman, V. F. Development of an embryonic skeletogenic mesenchyme lineage in a sea cucumber reveals the trajectory of change for the evolution of novel structures in echinoderms. EvoDevo. 3, 17 (2012).
- Annunziata, R., Martinez, P., Arnone, M. I. Intact cluster and chordate-like expression of ParaHox genes in a sea star. BMC Biol. 11, 68 (2013).
- Morino, Y., et al. Heterochronic activation of VEGF signaling and the evolution of the skeleton in echinoderm pluteus larvae. Evol. Dev. 14, 428-436 (2012).
- Hart, M. W. Structure and evolution of the sea star egg receptor for sperm bindin. Mol. Ecol. 22, 2143-2156 (2013).
- McGovern, T. M., Keever, C. C., Saski, C. A., Hart, M. W., Marko, P. B. Divergence genetics analysis reveals historical population genetic processes leading to contrasting phylogeographic patterns in co-distributed species. Mol. Ecol. 19, 5043-5060 (2010).
- Keever, C. C., et al. Discordant distribution of populations and genetic variation in a sea star with high dispersal potential. Evol. Int. J. Org. Evol. 63, 3214-3227 (2009).
- Lambert, P. Sea Stars of British Columbia, Southeast Alaska, and Puget Sound. , UBC Press. (2000).
- Dorée, M., Guerrier, P., Leonard, N. J. Hormonal control of meiosis: specificity of the 1-methyladenine receptors in starfish oocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 73, 1669-1673 (1976).
- Hinman, V. F., Nguyen, A. T., Cameron, R. A., Davidson, E. H. Developmental gene regulatory network architecture across 500 million years of echinoderm evolution. Proc. Natl. Acad. Sci. 100, 13356-13361 (2003).
- Hinman, V. F., Nguyen, A., Davidson, E. H. Caught in the evolutionary act: precise cis-regulatory basis of difference in the organization of gene networks of sea stars and sea urchins. Dev. Biol. 312, 584-595 (2007).
- McCauley, B. S., Weideman, E. P., Hinman, V. F. A conserved gene regulatory network subcircuit drives different developmental fates in the vegetal pole of highly divergent echinoderm embryos. Dev. Biol. 340, 200-208 (2010).
- Wessel, G. M., Voronina, E., Brooks, J. M. Obtaining and handling echinoderm oocytes. Methods Cell Biol. 74, 87-114 (2004).
- Sweet, H., et al. Blastomere isolation and transplantation. Methods Cell Biol. 74, 243-271 (2004).
- Cheers, M. S., Ettensohn, C. A. Rapid microinjection of fertilized eggs. Methods Cell Biol. 74, 287-310 (2004).
- Core, A. B., Reyna, A. E., Conaway, E. A., Bradham, C. A. Pantropic retroviruses as a transduction tool for sea urchin embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 5334-5339 (2012).
