Summary
Metoder som produserer morphant embryoer er avgjørende for å studere utviklingsmessige mekanismer og gen regulatoriske nettverk. The sea star Patiria miniata er en ny modellsystem for disse studiene. Her presenterer vi en protokoll for å oppnå kjønnsceller, produsere kulturer av embryoer, og rask mikroinjeksjon av zygotes fra denne arten.
Abstract
Pigghuder har lenge vært en favoritt modellsystem for studier av reproduksjon og utvikling, og mer nylig for studiet av genregulering og utviklingen av utviklingsprosesser. The sea star, Patiria miniata, er å få utbredelsen som modellsystem for disse typer studier som tidligere ble utført nesten utelukkende i kråkeboller, Strongylocentrotus purpuratus og Lytechinus variegatus. En fordel av disse modellsystemer er den enkle fremstilling av modifiserte embryoer hvor et bestemt gen er opp eller nedregulert, merking av en gruppe av celler, eller ved å introdusere et reporter gen. En enkelt mikroinjeksjon fremgangsmåte er i stand til å skape et bredt utvalg av slike modifiserte embryoer. Her presenterer vi en metode for innhenting av kjønnsceller fra P. miniata, produsere zygotes, og innføre forstyrrende reagenser via mikroinjeksjon. Sunn morphant embryoer senere blir isolert for kvantitative og kvalitative studier av gene funksjonen. Tilgjengeligheten av genomet og transkriptom data for denne organismen har økt de typer studier som er utført og den enkle utfører dem.
Introduction
The sea star, Patiria miniata, (kjent som balltre stjerne) fremstår som en interessant og allsidig modellsystem for en rekke cellulære 1- 3, utviklings 4,5, evolusjonær 6- 8, og økologiske studier 9- 11. Voksen P. miniata er fordelt langs Stillehavskysten fra Sitka, Alaska til Baja, California 12 og er lett vedlikeholdt i marine akvarier. Ubefruktede egg er oppnåelig året og hver hunn kan kaste titusener av egg. Ubefruktede egg er lett modnet og befruktet eksternt 13. De resulterende embryoene er gjennomsiktige slik at for enkel observasjon; de utvikler seg synkront, og krever kun sjøvann for utvikling. Hele genomet montering og flere transcriptomes er også tilgjengelig for P. miniata ( Echinobase.org ). Slike fordeler gjør dem ideelle for en rekke forskningog undervisningsformål.
I de senere årene, P. miniata har blitt et modellsystem for utviklings genet regulatoriske nettverk analyserer 14- 16. Formålet med slike studier er å identifisere hele kompliment av regulatoriske gener og bestemme nettverk av deres vekselvirkninger. Mye av dette arbeidet innebærer perturbing genuttrykk gjennom innføring av antisense oligonukleotider eller in vitro syntetisert mRNA. I tillegg er cis-regulatoriske analysene brukt til å karakterisere funksjonen av regulatoriske DNA 15.. Disse analysene krever innføring av perturbasjons-reagenser og / eller reporter DNA konstruerer i embryoer. Videre, for å karakterisere de nedstrøms virkningen av disse forstyrrelser må man analysere mange embryoer for endringer i genekspresjon av potensielle mål. Teknikker for mikroinjeksjon av mange hundre zygotes er sentrale for dette arbeidet.
Pigghuder, inkludert P. miniata de novo gjennom mikroinjeksjon. Mikroinjeksjon tilbyr en mulighet til å modifisere embryoer med reagenser som ikke er cellepermeable. Den følgende protokoll beskriver en fremgangsmåte for å introdusere DNA, mRNA, celle tracere, og morfolino antisens oligonukleotider inn i hundrevis av befruktede egg i en 2-3 timers sitter gjennom mikroinjeksjon. Dette gir tilstrekkelig materiale for en rekke nedstrøms eksperimenter, inkludert, men ikke begrenset til, qPCR, in situ hybridisering, RNA-Seq, og western blotting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hold alle sjøvann eller kunstig sjøvann (SW), voksne dyr og kulturer ved 15 ° C så mye som praktisk mulig. Sørg for egg og zygotes holdes nedsenket i SV.
Kommersielt forberedt sjøsalt rekonstituert med destillert eller omvendt osmose vann fungerer godt som en kilde til SW. Kontroller saltinnhold ved hjelp av et hydrometer og justere salter eller vann for å oppnå optimale nivåer. Hold Spesifikk vekt nivåer mellom 1,020 til 1,025. Hold alle glass og plasticware atskilt fra alle andre laboratorie-utstyr for å unngå kontaminasjon med kjemikalier. Ren embryo grade labware ved skylling med deionisert vann eller annen bløtlegging i fortynnet natrium-hypokloritt, etterfulgt av skylling flere ganger i vann.
1. Innhenting og modning Kjønnsceller fra Patiria miniata Voksne
- Velg et dyr for å skjære gonadene. Bestem sex etter utskjæring ved å se på tilstedeværelsen av eggstokkene eller testiklene fordi P. miniata ikke sexually dimorphic.
- Skjær en liten åpning, ikke større enn 1 cm, langs siden av et sea star arm med en skalpell blad (figur 1A). Ved hjelp av små buttendet tang trekke tilbake kantene av snittet for å få tilgang til gonade vev og trekk gonade vev ut gjennom snittet.
MERK: Unngå å trekke ut gut vev, som er en løs grå eller brun vev (figur 1B). Eggstokkene er vanligvis oransje, gul eller lys brun (figur 1C), mens testiklene er hvite eller beige og når forstyrret vil føre sjøvann til å bli melkeaktig eller klart i utseende (figur 1D). - Returnere kvinner til akvarier. Isolere hanner for en time eller to i en beholder av SV siden stress fra håndtering kan indusere gyting. Dyr helbrede langs innsnitt området og fortsette å gi kjønnsceller i flere måneder.
- Samle testikler inn i et 1,5 ml Eppendorf-rør med så lite som mulig, og SW lagre på is inntil bruk. Oppbevar testiklene ikke ossed på dagen for innsamling ved 4 ° C i opp til en uke.
- Samle eggstokkene i et lite glass kultur fatet i en flere milliliter SW. For å løsne ubefruktede egg fra eggstokken vev, erte hverandre vevet med to par tang til det ikke store biter forbli.
MERK: Optimalt er flertallet av ubefruktede egg fullt utviklet. Slike oocytter er store, runde, og klar gul eller lysebrun med en tydelig Germinal vesikkel i eggcelle (figur 2A), sammenlignet med undergruppe av ubebygde ubefruktede egg som er mindre, brun, kornete, og ugjennomsiktig (figur 2B). Dersom den er større enn rundt 25% av ubefruktede egg er av den uutviklede variasjon, velge en annen kvinne å få oocytter. - Hell egg og gjenværende vev gjennom en maske filter kopp med en 200 mikrometer porestørrelse og samle strømme gjennom. Dette vil inneholde alle varianter av ubefruktede egg, men fjerne eggstokkvev. Løsne rester oocytter fra vevet fanges av filteret ved sprøyting wed SW fra en skvett flaske. Filter koppene er laget ved hjelp av et 50 ml konisk rør (figur 3A-A ').
- Hell strømmen gjennom fra trinn 1.6 gjennom en 100 pm mesh filterkoppen. Kast små ubefruktede egg i flyt gjennom. Store fullt utviklede ubefruktede egg som er klare for modning vil holde seg på filteret. Skyll oocyttene inn i et rent 200 ml begerglass.
- Legg 95 ml SV til 200 ml begerglass av ubefruktede egg. Tilsett 5 ml av 200 mM 1-methyladenine for en endelig konsentrasjon på 10 uM.
- Overfør ubefruktede egg til en stor grunne kultur parabol og sted ved 15 ° C. Et høyt overflateareal til volum dyrkningsskål tillater oksygen utveksling. Oocyttene ikke moden eller ikke kan utvikle seg godt hvis de er overbefolket i denne modningsfasen. Delt inn i flere retter av SV pluss 10 mm 1-methlyadenine til kultur er mindre enn 200 oocytter / ml.
- La de ubefruktede egg å modnes for 45-90 min, men ikke lenger, da dette vil gjengi ubefruktede egg som ikke kan være fertilized. For å avgjøre om modning er fullført, se på ubefruktede egg under en dissekere omfang. Germinal vesikkel beveger seg mot og sikringer med cellemembranen under modning. Det bryter deretter ned og derfor er ikke lenger synlig i modne oocytter (figur 2C).
2. Gjødsling av Eldre Oocytter
- Valgte en liten klynge av testikkel vev, omtrent ert størrelse, og kjøttdeig i et lite glass kultur tallerken med ca 1 ml av SW.
- Bruk en Pasteur-pipette for å overføre 2-3 dråper av den resulterende melkeaktig sjøvann til rundt 100 ml av den modne oocytter og virvle dyrkningsskål å blande. Unngå å overføre deler av testikkel vev. Unngå å legge større mengder sperm, da dette kan resultere i polyspermy og påfølgende dårlig utvikling.
- Etter flere minutter observere ubefruktede egg under en dissekere omfang. Befruktede egg, eller zygotes, har en befruktning konvolutt, som er en klar boble som stiger av cell membran (figur 2D).
MERK: Ikke fortsett med kulturen hvis mindre enn rundt 90% av egg befrukte Feilslåtte befruktning priser er en indikasjon på en usunn kultur som også kan ikke utvikle seg godt. - Etter befruktning er fullført, endrer SW på zygotes ved å helle gjennom en 100 mikrometer mesh filter og skylle inn i en kultur tallerken med frisk SW. Det er viktig å fjerne overflødig sperm for å forhindre oksygenmangel. Plasser dyrkningsskål ved 15 ° C i 15-30 min.
3. De-jellying and Rowing befruktede egg
- Forbered injeksjon retter ved å ta av lokket fra en 60 x 15 mm polystyren petriskål.
- Tegn en permanent tusj linje på baksiden av fatet, rundt området som samsvarer med synsfelt på mikroinjeksjon mikroskop. Dette sikrer at alle rodd embryoer er innenfor mikroskop synsfelt.
- Bruk et glass Pasteur pipette å score en linje gjennom sirkelen, pmml av på den ene side av sirkelen (figur 3B). Bruk denne linjen senere å bryte kanyler (trinn 4.5).
MERK: Reagenser vanligvis brukes til å overholde kråkebolle embryoer, f.eks, protaminsulfat eller poly-L lysin, er unødvendige. De-gelé P. miniata zygotes stokk veldig godt til ubestrøket plast. Vær oppmerksom på at de ikke kleber seg godt til glass retter.
- Legg rundt 10 ml SV til hver tallerken slik at overflaten er dekket, men vannet vil ikke sprute overdrevet i fatet da dette kan forstyrre rodd embryoer.
- Fjern P. miniata zygote gelé frakk med syre SV før roing. Dette gelé strøk er mer omfattende enn det som er observert for modell kråkebollearter.
- Forbered syre SV i området pH 4,0-4,2. PH er kritisk for å muliggjøre effektiv fjerning av gel coat samtidig tillater normal utvikling.
- Legg enkelt dråper 1 N (1 M) HCl i SV til en 1 L lager av SW. Tillat hvert fall for å blande fullstendigog overvåke pH før du legger mer HCl.
MERK: En til flere ml HCl resultater i riktig pH, men ikke legg hele volumet samtidig.
MERK: Forbered en N HCl i avtrekksskap med SV og 12 N (12 M) HCl. - Fjern SV på zygotes ved å helle dem på en 100 mikrometer mesh filter. Skyll inn i et 200 ml begerglass i den minste mengde av SW mulig (ca. 10 ml). Fyll begeret opp til 150 ml med syre SW (pH 4,0) og la zygotes å sitte i syre SW for 3 min.
- Strippe gelé frakk fra zygotes ved å helle dem frem og tilbake mellom to 200 ml begerglass, hver gang passerer zygotes gjennom en 200 mikrometer mesh filter. Hell zygotes gjennom filteret rundt 5-10x over ca 2 min tidsvinduet.
- Fjern syre SV ved å helle det zygotes på en 100 mikrometer mesh filter. Skyll zygotes i et lite glass kultur tallerken med SV. De-jellied zygotes kan feste seg til plast retter. Row embryoer umiddelbart; de begynner å produsere mer jelly belegge noe som fører til dårlig adhesjon til plast retter seg over tid.
- Bruk en munn pipette (Figur 3C-C ') for å plukke opp zygotes fra glasset kultur fatet og plassere dem i rette linjer på injeksjons retter. Smelt sentrum av den tynne side av en Pasteur-pipette over en flamme før glasset er mykt. Raskt trekke endene av glasset fra hverandre for å produsere en meget tynn strekning av glass. Når glasset er kult, brekke av den lille enden av Pasteur pipette (for mer informasjon om å utarbeide en munn pipette se Wessel et al. 2004 17 eller Søt et al. 2004 18).
- Lag ro-pipette slik at diameteren er bare større enn diameteren av embryoene, slik at bare en enkelt zygote vil inn og ut av pipetten på en gang. Dette vil tillate en enkelt rad for å danne. Mindre diameter pipetter kan strippe befruktning konvolutt og forstyrre zygotes som P. miniata zygotes ikke har en hyaline membran ennd er ganske myk.
- Hvis zygotes ikke holde seg til plast fatet, holde dem for ekstra tid i syre SW (opptil flere minutter). Alternativt kan en mindre diameter pipette kan hjelpe til å fjerne gel coat å tillate zygoter å feste mer effektivt.
- De zygoter er litt positiv oppdrift, og har en tendens til å flyte eller gli like over bunnen av skålen. I dette tilfellet plasseres ro-pipette slik at zygoter blir forsiktig presset på overflaten av skålen som de kommer ut av pipetten (figur 3D).
MERK:. Det er tillatt å passe mange rader på disse rettene P. miniata embryoniske membranene ikke blir mer vanskelig å trenge gjennom over tid, og derfor kan man injisere hundrevis av zygoter på en enkelt antenne.
4. Injeksjon av zygoter
- Forbered injeksjonsløsninger med passende konsentrasjoner av morpholino antisense oligonukleotider (Maso), mRNA, eller DNA-molekyler i en sluttkonsentrasjonentration på 200 mm KCl. 400-800 uM MASO og 2,5 ng / mL av DNA har en tendens til å produsere morphant fenotyper samtidig minimere toksisitet. Den endelige konsentrasjon i egget vil være 1/125 th startkonsentrasjon 14. For injeksjonsoppløsninger inneholdende Masos, varme til 65 ° C i 5 minutter umiddelbart før bruk, og deretter lagrer ved romtemperatur.
- For å lette sortering injiserte embryoer, tilsett rodamin dekstran tracer til injeksjonsløsning for å oppnå en konsentrasjon på 0,1%.
- Forbered kanyler ved å trekke glass kapillarrør (1,0 mm OD x 0,75 mm ID, 100 mm lengde) i en nål trekke instrument etter produsentens anvisninger. Nåler egnet for injeksjon i kråkeboller også fungere godt for sjøstjerner, så bruk lignende parametre 19.
- Laste ca 2 mL av injeksjon løsning i en kanyle ved hjelp av en microloader pipettespissen.
- Sett den butte enden av nålen inn i manipulator. Sett picospritzer til 100 ms puls og et lufttrykk på 40 psi.
- Legg en tallerken av rodd embryoer på mikroskopet scenen og har alle fostre i synsfeltet. Orientere fatet slik at den markerte linjen er på den siden som er nærmest til nålen. Posisjonering av nålen på en tilnærmet 60 ° vinkel, slik at spissen er i nærheten av midten av linjen og like over overflaten av vannet.
- Fokus på scoret linjen og senke nålen til spissen kommer i fokus. Senk litt mer tips og bryte den åpen ved å kjøre den forsiktig inn i rillene scoret linjen. Løft tuppen av overflaten av parabolen og plassere den på toppen av den første raden av zygotes og fokusere på de zygotes.
- Senk spissen slik at det vil spidde sentrum av zygoten som kommer inn fra omkring en 60 ° vinkel. Nålen lett penetrerer P. miniata zygotes. Trå på fotpedalen (eller annen anordning for pressing av materiale fra kanylen) for å innføre en bolus av injeDette skjer løsning i embryo.
- Målet for en bolus som er 20-30% av diameteren av embryoet, eller mellom 25 og 80 pl. Hvis bolus er større eller mindre enn dette, justere varigheten av injeksjon på picospritzer og injisere neste embryo. Fortsett å justere varigheten for å oppnå den ønskede størrelse bolus. Starter på 100 msek varighet. Re-bryte nålen dersom den er større enn omkring 200 millisekunder er nødvendig for å innføre den aktuelle bolus. Kast nålen og forberede en ny hvis mindre enn 15-20 msek er nødvendig for å oppnå dette bolus størrelse som p er for stor og kan forstyrre normal utvikling.
- Fortsett å injisere de rester zygotes på injeksjons parabolen. Embryoer kan lett bli injisert til cleavage starter og til enkle blastomeres etter første cleavage. Med jevne løfte nålen over overflaten av vannet for å fjerne zygoter som stikker ut mot nålen. Om nødvendig re-bryte nålespissen eller laste inn en ny nål hvis en blokkering oppstår.
- Tillate embryoene å utvikle ved 15 ° C i SV. Oppretthold høyt overflateareal til volum i kulturer for å tillate oksygen utveksling. Sørg embryoer ikke er overfylt; holde kulturer ved eller under 200 embryoer / ml. Avhengig av ønsket stadium av embryo, har tenkt å samle injiseres embryoer på rundt 20-24 timer etter befruktning.
MERK: Dette er ofte en ideell tid å sortere og samle og fordi normalt utviklings embryoer er lett skilles morfologisk, men er ennå ikke svømming. - Hvis embryoer er klekket, forsiktig salt sjokk å hindre svømming. Tilsett 200 ul av 5 M NaCl i 10 ml av SW i injeksjons fatet mens forsiktig virvlende SW. Etter noen minutter, vil embryoene falle til bunnen av fatet. Samle disse og flytte dem til normal saltholdighet SW.
- Samle injiserte embryoer under en passende fluorescerende lyskilde kompatibel med tracer brukes i injectioppløsning. Hvis ingen tracer ble brukt, liksom embryoer for å velge for normal morfologi.
- Ved hjelp av en munn pipette, tegne fluorescerende embryoer opp med en minimal mengde av SV og blåse dem ut i en liten kultur tallerken fylt med SV. Ideelle munnen pipetter har en stor nok åpning for embryo å bli trukket inn og ut uten å skade dem, men ikke så stor at uønskede embryoer og overflødig SV er også trukket opp.
- Når alle de ønskede fostre har blitt samlet inn i det nye fatet, observere embryoene under fluorescerende lys og fjern eventuelle un-injisert embryoer eller dårlig utviklede embryoer.
- Kultur sortert embryoer til ønskede stadier i en inkubator og fortsett med bildebehandling eller andre ønskede protokoller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Målet med denne protokollen er å innføre reagenser inn embryoer. Vi viser effektiviteten av protokollen ved å injisere en reporter DNA konstrukt som driver ekspresjonen av grønt fluorescerende protein (GFP). Injisert embryoer uttrykker GFP i klonale patcher (Figur 4A-B) som DNA inkorporerer under tidlig cleavage. Mange reagenser som er ønskelig å innføre i embryoer er giftige i høye mengder og til suboptimale grupper av embryoer. Toksisitet manifesterer ved å forsinke utvikling, arrestere utvikling i tidlig cleavage eller på befruktede egg stadiet, eller ved å pålegge avvikende utvikling (Figur 5A-C).
Figur 1. Skaffe kjønnsceller fra P. miniata voksne. A) For å skjære gonadene gjør et snitt på siden av en arm proksimaletil midten av dyret. B) Den mørkebrune materiale som trekkes fra dette snitt er tarmvevet. Unngå å trekke tarmvevet som det vil skade dyret. C) Ovary vev er typisk oransje i fargen, som vist her, men kan også være gul eller lys brun. D) Testikler er hvite eller beige i farge, som vist. Alle skala barer betegne en cm.
Figur 2. Modning og befruktning av ubefruktede egg. A) Sunn ubefruktede egg som er klare for modning er store og klare med en synlig Germinal vesikkel. B) Oocytter som ikke er klare for modning er mindre, brun, og kornete i utseende. C) En Oocyte som har blitt modnet med 1-methyladenine . Germinal vesikkel har brutt ned. D) En zygote omgitt av en FERTilization konvolutt. E) Unngå kulturer med store oocytter som ikke kan modnede oocytter fordi disse ikke vil bli fjernet ved filtrering. Slike oocytter er litt mindre enn den i A., og er mørkere brun og kornet struktur. Skalaen bar i A betegner 50 mikrometer og representerer skalaen for bilder AE.
Figur 3. Apparater for montering. AA ') A mesh filter festet til en 50 ml konisk rør. Den koniske-enden av røret, og i midten av lokket er skåret ut for å tillate kulturer som skal helles gjennom røret og filteret. B) En injeksjons fatet konstruert fra lokket på en 60 x 15 mm polystyren dyrkningsskål. En sirkel tegnet rundt sentrum skisserer synsfeltet av injeksjon mikroskop og fungerer som en guide for roing embryoer. En linje scoret into parabolen er nyttig for å bryte kanyler. CC ') Mouth pipette oppsett. Monter et munnstykke i en ende av en flere meter lang gummislange. Sett den andre enden til en Pasteur pipette, som har blitt formet av kort smelting og trekke den smale enden av glasset. D) Skjematisk demonstrere en ideell roing Pasteur pipette form og bredde for å fremme stikker uten å skade befruktede egg. Når bryte slutten av av de trukket pipette, er det nyttig at slutten er konisk for å hindre nye zygotes fra flytende bort fra fatet. Alle skala barer betegne 3 cm.
Figur 4. Reagenser Vellykket Introdusert av Mikroinjeksjon. A) DIC av en blastula stadiet embryo injisert med en GFP reporter plasmid. Embryoet har normal morfologi. B) GFP EXPREssion i embryo vist i A. C) DIC bilde av to morfologisk normale blastula scenen embryoer. D) Ett embryo fra C avgir en rød fluorescens fra innføringen av Texas Red dekstran. Den andre embryo er un-injisert og viser ingen fluorescens. Scale barer betegne 50 mikrometer. Skala bar i A representerer skalaen for A og B. Skala bar i C representerer skalaen for C og D.
Figur 5. Overinjection og reagent toksisitet resultat i arrestert eller avvikende utvikling. Alle bilder er av embryoer 24 timer etter injeksjonen fra samme injeksjon batch. AA ') En overinjected zygote arrestert på ett-cellestadiet. BB') Et embryo arrestert i begynnelsen av cleavage. En sunn embryo vil dele symmetrisk, mens dette embryo arrestertpå grunn av unormale celledelinger. CC ') Et embryo med vilt avvikende utvikling på grunn av toksisitet. Mens dette embryo er formet omtrent som en blastula embryo (D), er det asymmetrisk og unormalt tyknet. DD ') Et riktig utviklings injisert blastula stadiet embryo. Skala bar i A betegner 50 mikrometer, og representerer skalaen for alle paneler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det er to viktige skritt som er vanskelig for uerfarne brukere av denne teknikken, men er avgjørende for å lykkes med å skape morphant embryoer. Den første er å velge sunne ubefruktede egg som vil modnes og gjødsle riktig. Prosentandelen av normal utvikling i en kultur avhenger av årstid, helsen til dyret, og det antall ganger som oocytter er blitt høstet fra et enkelt individ. Ubefruktede egg har en tendens til å være av bedre kvalitet fra april til oktober. Det er viktig å se nøye på oocyttene før fortsetter for å sikre at de fleste ligne figur 2A fremfor figur 2B. Det er tillatt å ha et lite antall oocytter som ikke vil modnes, særlig hvis de er små nok til å filtrere ut som oocyttene behandles. Av og til, ubefruktede egg som er bebygd er nesten like stor som fullt utviklede ubefruktede egg som er klare for modning. De er lett gjenkjennelig med sin kornete, brun coloring (figur 2E). Ikke bruk grupper av ubefruktede egg av denne typen fordi filtrering ikke vil isolere fullt utviklede eggceller fra ubebygde oocytter og de ofte føre til unormale embryo kulturer som er mer sannsynlig vise defekter sett i figur 5.
Den andre kritiske trinnet er injeksjon bolus størrelse. Innføre en mengde av forstyrrende reagens som er stor nok til å utøve en effekt, men ikke så stor til å bevirke ikke-spesifikke virkninger. Første gang en forstyrrende reagens anvendes, er det nyttig å utføre en titrering hvor flere konsentrasjoner av reagens blir forsøkt. Utføre påfølgende microinjections med den høyeste konsentrasjonen som ikke forårsaker utviklingsavvik som ikke er relatert til forventet fenotype, eller forsinkelse utvikling (Figur 5A). Unngå å injisere en bolus som er større enn 30% av diameteren av embryoet, da dette kan forstyrre normal utvikling. Altfor små bolus størrelser, etter contrast, er vanskelig å visuelt inspisere for konsekvent dimensjonering som kan føre til en overdreven rekke perturbasjons fenotyper tvers replikater.
Forstyrrende reagenser kan føre til utviklingsmessige forsinkelser eller uspesifikke fenotyper på effektive konsentrasjonsområder. Det er svært viktig, og derfor å injisere søsken kontroller med en godartet reagens slik som en standard kontroll MASO, standard DNA-konstruksjoner eller rodamin tracer. Analyse morphant embryoer bare hvis disse kontrollene viser normal utvikling. Injisert embryoer, inkludert kontroller, viser noen ganger en rynkete blastula fenotype, men vil de ofte gå gjennom resten av utviklingen normalt. I tillegg, hvis en bestemt reagens konsekvent forårsaker utviklingsmessige forsinkelser i de resulterende morphant embryoer, sammenligne disse embryoene å kontrollere embryoer for å bestemme hvor mange timer med forsinkelse de opplever.
Det er noen egenskaper ved denne metoden som kan begrense dens nytte i specific eksperimentelle scenarier. En slik sak er det faktum at man bare kan introdusere reagenser ved befruktet egg eller tidlig cleavage stadier. Dette er spesielt problematisk hvis genet eller sti i området er spesielt viktig i tidlig utvikling og resulterende morphant embryoer inviable eller for utviklingshemmede unormal for meningsfull studie. Noen ganger dette problemet er løst ved å injisere færre kopier av perturbing reagens, som resulterer i en mildere, ufullstendig knockdown. Hvis en passende celle-gjennomtrengelig legemiddel for målgenet eller sti eksisterer, er det nyttig å sammenligne fenotypen av embryoer injisert med reagenser i det befruktede egg fasen med embryoer behandlet med medikamentet på et senere, mer passende stadium. Fordi injeksjon av Masos eller mRNA har større spesifisitet, er det mer kraftige å bruke denne fremgangsmåte i forbindelse med et medikament-behandlingsstudie i motsetning til å forlate mikroinjeksjon i favør av medikamentbehandling.
Til slutt, selv om denne mikroinjeksjon metode vil gi en tilstrekkelig mengde av embryoer for et bredt utvalg av nedstrøms applikasjoner, vil det i beste fall frem flere 100-1000 sunne, med hell injiserte embryoer. Noen ønskede eksperimenter kan kreve betydelig mer materiale enn denne. Andre metoder med hell brukes i kråkeboller systemet kan modifiseres for å skape enda større antall morphant sjø stjerne embryoer, slik som retrovirus pantropic 20, selv om denne fremgangsmåte er ny og har ikke fått omfattende bruk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært av forfatterne.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Science Foundation IOS 0844948 og IOS 1024811
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Methyladenine | Acros Organics (Fisher Scientific) | AC20131-1000 | |
| 190 micron nitex nylon filter | Small Parts (originally Sefar) | CMN-0185-C/5PK-05 | |
| 100 micron nitex nylon filter | Small Parts (originally Sefar) | CMN-0105-C/5PK-05 | |
| Polystyrene Petri dishes, 60 mm x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Capillary tubing | FHC, Inc | 30-30-0 | For pulling microinjection needles |
| Model P-97 Needle Puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| Dextran, Rhodamine Green | Life Technologies | D7163 | If injecting a GFP expression reporter, it is helpful to substitute Texas Red dextran as an injection tracer |
| Instant Ocean Sea Salt | Doctors Foster and Smith | CD-116528 | Also available in many pet stores |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242 956.003 |
References
- Terasaki, M. Quantification of fluorescence in thick specimens, with an application to cyclin B-GFP expression in starfish oocytes. Biol. Cell Auspices Eur. Cell Biol. Organ. 98, 245-252 (2006).
- Terasaki, M., Runft, L. Two-stage dependence for 1-methyladenine induced reinitiation of meiotic maturation in starfish oocytes. Exp. Cell Res. 316, 2654-2663 (2010).
- O'Neill, F. J., Gillett, J., Foltz, K. R. Distinct roles for multiple Src family kinases at fertilization. J. Cell Sci. 117, 6227-6238 (2004).
- McCauley, B. S., Akyar, E., Filliger, L., Hinman, V. F. Expression of wnt and frizzled genes during early sea star development. Gene Expr. Patterns GEP. 13, 437-444 (2013).
- Yankura, K. A., Koechlein, C. S., Cryan, A. F., Cheatle, A., Hinman, V. F. Gene regulatory network for neurogenesis in a sea star embryo connects broad neural specification and localized patterning. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 8591-8596 (2013).
- McCauley, B. S., Wright, E. P., Exner, C., Kitazawa, C., Hinman, V. F. Development of an embryonic skeletogenic mesenchyme lineage in a sea cucumber reveals the trajectory of change for the evolution of novel structures in echinoderms. EvoDevo. 3, 17 (2012).
- Annunziata, R., Martinez, P., Arnone, M. I. Intact cluster and chordate-like expression of ParaHox genes in a sea star. BMC Biol. 11, 68 (2013).
- Morino, Y., et al. Heterochronic activation of VEGF signaling and the evolution of the skeleton in echinoderm pluteus larvae. Evol. Dev. 14, 428-436 (2012).
- Hart, M. W. Structure and evolution of the sea star egg receptor for sperm bindin. Mol. Ecol. 22, 2143-2156 (2013).
- McGovern, T. M., Keever, C. C., Saski, C. A., Hart, M. W., Marko, P. B. Divergence genetics analysis reveals historical population genetic processes leading to contrasting phylogeographic patterns in co-distributed species. Mol. Ecol. 19, 5043-5060 (2010).
- Keever, C. C., et al. Discordant distribution of populations and genetic variation in a sea star with high dispersal potential. Evol. Int. J. Org. Evol. 63, 3214-3227 (2009).
- Lambert, P. Sea Stars of British Columbia, Southeast Alaska, and Puget Sound. , UBC Press. (2000).
- Dorée, M., Guerrier, P., Leonard, N. J. Hormonal control of meiosis: specificity of the 1-methyladenine receptors in starfish oocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 73, 1669-1673 (1976).
- Hinman, V. F., Nguyen, A. T., Cameron, R. A., Davidson, E. H. Developmental gene regulatory network architecture across 500 million years of echinoderm evolution. Proc. Natl. Acad. Sci. 100, 13356-13361 (2003).
- Hinman, V. F., Nguyen, A., Davidson, E. H. Caught in the evolutionary act: precise cis-regulatory basis of difference in the organization of gene networks of sea stars and sea urchins. Dev. Biol. 312, 584-595 (2007).
- McCauley, B. S., Weideman, E. P., Hinman, V. F. A conserved gene regulatory network subcircuit drives different developmental fates in the vegetal pole of highly divergent echinoderm embryos. Dev. Biol. 340, 200-208 (2010).
- Wessel, G. M., Voronina, E., Brooks, J. M. Obtaining and handling echinoderm oocytes. Methods Cell Biol. 74, 87-114 (2004).
- Sweet, H., et al. Blastomere isolation and transplantation. Methods Cell Biol. 74, 243-271 (2004).
- Cheers, M. S., Ettensohn, C. A. Rapid microinjection of fertilized eggs. Methods Cell Biol. 74, 287-310 (2004).
- Core, A. B., Reyna, A. E., Conaway, E. A., Bradham, C. A. Pantropic retroviruses as a transduction tool for sea urchin embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 5334-5339 (2012).
