Summary
Wir präsentieren ein Protokoll für die Verwendung eines Radio-Telemetrie-System, Herz-Kreislauf-Parameter in das Rückenmark durchtrennt T4 Ratten acht Wochen nach der embryonalen Hirnstamm neuronalen Stammzelltransplantation in die Läsion Website aufzuzeichnen. Telemetrie ist eine fortgeschrittene Technik, um Herz-Kreislauf-Funktion in der bewussten frei bewegenden Ratten mit Rückenmarksverletzungen genau zu bewerten.
Abstract
Hoch thorakalen oder zervikalen Rückenmarksverletzungen (SCI) kann zu Herz-Kreislauf Dysfunktion führen. Herz-Kreislauf-Parameter zu überwachen, implantiert man einen Katheter mit einem Funksender in die Oberschenkelarterie von Ratten, die eine Durchtrennung des Rückenmarks T4 mit oder ohne Pfropfung von embryonalen Hirnstamm abgeleiteten neuralen Stammzellen grün fluoreszierendes Protein exprimieren, unter verbunden. Im Vergleich zu anderen Verfahren wie Kanülen-Einsteckteil oder Schwanz-Manschette ist Telemetrie vorteilhaft, den Blutdruck und die Herzfrequenz in frei beweglichen Tieren zu überwachen. Es ist auch in der Lage, Langzeit mehrerer Datenerfassungen. In Rückenmark verletzt Ratten wurden basalen Herz-Kreislauf-Daten unter ungebremst Zustand und autonome Dysreflexie in Reaktion auf kolorektale Dehnung erfolgreich registriert. Zusätzlich können kardiovaskuläre Parameter vor und nach der SCI in derselben Ratte verglichen werden, wenn ein Sender vor einer Rückenmarksdurchtrennung implantiert. Eine Einschränkung der beschriebenen Telemetry Verfahrens ist, daß die Implantation in die A. femoralis kann die Blutversorgung der ipsilateralen Hinterlauf beeinflussen.
Introduction
Herz-Kreislauf Dysfunktion tritt nach Rückenmarksverletzungen (SCI) auf hohem Niveau. Es wird in ungeordneten Blutdruck und Herzfrequenz in Ruhe, orthostatische Hypotonie, Ausübung-induzierten Blutdruckabfall, und autonome Dysreflexie durch Episoden von Bluthochdruck und Baroreflex-vermittelten Bradykardie als Reaktion auf Sinnesreize unterhalb der Verletzungsebene 1,2 gekennzeichnet manifestiert. Diese Symptome beeinträchtigen die das tägliche Leben von Patienten mit Ruckenmark verletzt. Somit ist es wichtig, wirksame Werkzeuge zur Untersuchung von kardiovaskulären Veränderungen in Tieren mit SCI und experimentelle Behandlungen herzustellen.
Herz-Kreislauf-Funktion bei Tieren zu untersuchen, wurden mehrere Techniken eingesetzt, um den Blutdruck und die Herzfrequenz überwachen. Zentralen Herz-Kreislauf-Parameter können durch eine Kanüle Einsetzen und Telemetrie aufgezeichnet werden, während nicht-invasive Schwanz-Manschetten eingesetzt werden, um periphere Blutdruck 3 zu messen. Im Vergleich zu anderen Methoden, TeleMetrie hat den Vorteil, dass es für eine kontinuierliche Aufzeichnung in sich frei bewegenden Tieren und langfristige Überwachung der Herz-Kreislauf-Funktion 4. SCI in Tiermodellen, können die Änderungen in den peripheren Blutdrucks nach experimentellen Stimulation nicht groß genug, um erkannt zu werden. Dementsprechend sollten geeignete Herzüberwachungstechnik für Tiere mit SCI ausgewählt werden.
In der vorliegenden Studie wurde ein Radio-Telemetrie-System eingeführt, um Herz-Kreislauf-Funktion bei erwachsenen Ratten nach der vollständigen Durchtrennung des Rückenmarks zu überwachen. Ratten erhielten Transplantate von syngenen Ratten embryonalen Tag 14 (E14) Hirnstamm abgeleitete neurale Stammzellen (BS-NSCs) in der Läsion. Ratten, die mit Verletzungen und ohne Transplantation und naiv, unverletzt Ratten dienten als Kontrollen. Das Verfahren von Telemetriesender umfasst Sterilisation und Implantation (Abbildung 1), Aufzeichnung der basalen Herzkreislaufparameter, kolorektales Spannungsgefühl induzierte Reaktionen und Reinigungs Sender undLagerung.
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Protocol
Alle Tier Protokolle wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) zugelassen. NIH-Richtlinien für Labortierpflege und Sicherheit strikt befolgen. Tiere, die mit chirurgischen Eingriffen wurden ausreichend zur Minimierung Schmerzen und Beschwerden behandelt.
1. Rückenmark-und Zelltransplantation Curgery
- Autoklaven chirurgische Instrumente vor allen Operationen. Verwenden Hot Bead-Sterilisator (Fine Science Tools), um Krankheitserreger und mikrobielle Verunreinigungen von Instrumenten zwischen Verfahren auf verschiedene Tiere zu entfernen. Verwenden Sie sterile Handschuhe, Kittel, und Vorhänge während der Operation. Beschäftigen aseptischen chirurgischen Technik für jeden chirurgischen Eingriff.
- Betäuben weiblichen Fischer 344-Ratten mit einer Kombination (2 ml / kg) von Ketamin (25 mg / ml), Xylazin (1,3 mg / ml) und Acepromazin (0,25 mg / ml) durch intraperitoneale (ip) Injektion verabreicht.
- Rasieren Sie die Rückenbereich und reinigen Sie die Haut mehrmals mit Betadine und Ethanol.
- Schneiden Sie die Haut mit einem # 10 Klinge und unverblümt sezieren Muskeln Schichten. Verwenden Sie ein Skalpell, um die Wirbel zu isolieren, setzen den T3 Wirbel, und führen Sie einen dorsalen Laminektomie mit einem spitzen Rongeure.
- Inzision der Dura in Längsrichtung und durchschneiden das Rückenmark bei T4 Niveau mit einer Kombination aus Schere und Iridektomie microaspiration, um eine etwa 1 mm rostrokaudalen Lücke zwischen den Rückenmarksstümpfe erstellen.
- Warten Sie ungefähr 1 - 2 min, bis die Blutungen vollständig stoppt, dann Naht Muskeln mit 3-0 Vycril und schließen Sie die Haut mit Wundklammern.
- Injizieren Ringer-Lactat (5 ml), Buprenorphin (0,035 mg / kg), und Ampicillin (33 mg / kg) subkutan unmittelbar nach der Operation und Wartung Ratten in einer warmen Inkubator bis wach.
- Injizieren die Ringer-und Ampicillin-Lösung einmal täglich bis zu 10 Tage, und Buprenorphin zweimal täglich für 3 Tage, oder bis Anzeichen von Schmerzen und Leiden verschwinden. Nicht ein Tier an die Firma von anderen Tieren, bis f zurückUlly erholt.
- Manuell entleeren die Blase zweimal täglich für etwa zwei Wochen, bis die Einrichtung von Blasenentleerungsreflex, und leeren die Blase einmal am Tag in der gesamten Lebens, wenn nötig.
- Zwei Wochen später, erneut zu betäuben SCI Ratten wie oben beschrieben und wieder aussetzen das Rückenmark Läsion. Halten Sie die Dura geschlossen, um implantierten Zellen in der Läsion zu behalten.
- Injizieren 10 ul Zelllösung (3,5 x 10 5 ul), von der E14 allgegenwärtig GFP transgenen Rattenembryonen gesammelt und in Fibrinogen und Thrombin 5,6 eingebettet in das Epizentrum der Läsion Hohlraum und dem rostralen und kaudalen Schnittstelle Läsion mit Mehrfacheinspritzung Webseiten unter Verwendung einer Glaspipette gezogen mit einem Innendurchmesser von 40 um, auf einer Hamilton-Spritze verbunden.
- Naht der Muskelschichten und schließen Sie die Haut mit Wundklammern.
- Führen Sie nach der Operation Injektion und Blasenpflege wie in den Schritten 1.6 beschrieben - 1.8.
- Eine WocheVordergrund Perfusion, injizieren 0,5% Fluorogold (FG, 0,4 ml in destilliertem Wasser) intraperitoneal retrograd Label sympathischen präganglionären Neuronen im Rückenmark 7.
2. Sender Implantation
- Einweichen transmittersin 2% Glutaraldehyd-Lösung (4 ml 50% Glutaraldehyd in 96 ml destilliertem Wasser) für mindestens werden 1 - 2 h (bis 10 h) bei Raumtemperatur für die Sterilisation.
- Waschen Sender gründlich mit steriler Kochsalzlösung 0,9% 3-mal und speichern sie in Kochsalzlösung bis zur Verwendung (nicht mehr als 1 h).
- Acht Wochen nach E14 Zell-Transplantation (10 Wochen nach der Verletzung), reanesthetize die Ratten, die eine SCI mit oder ohne Zelltransplantation und naiven Kontrollratten unterzogen.
- Rasieren Sie die Bauchbereich und Hinterbeine. Reinigen Sie die Haut mit Betadine. Legen Sie die Ratte auf dem OP-Tisch in Rückenlage.
- Einzuschneiden die Haut auf der ventralen Bauch und Innenschenkel auf der rechten Seite unter Verwendung einer # 15 Klinge.
- Durch die s Cutubcutaneous Bindegewebe, das Bündel der Oberschenkelgefäße und Nerven mit einem kleinen Schere aus.
- Trennen Sie die Oberschenkelarterie aus der Vene und der Nerv mit einer feinen Pinzette mit gebogenen Spitzen.
- Legen Sie drei Seidenfäden unterhalb der Arterie und eine lockeren Knoten in jeder Naht.
- Anwenden 0,1 ml Lidocain (2%) auf der Oberfläche der Arterie an Vasodilatation für nachfolgende Katheter hervorrufen.
- Sichern Sie das Gefäß distal mit einem dauerhaften Seide Knoten und temporäre Block proximal durch Strecken einer lockeren Seidennaht.
- Punktion der Arterie mit einem 20-Gauge-Nadel gekrümmt und legen Sie die Spitze des Katheters Entfernungsmesser (8 cm lang) mit einem Katheter Einsatzwerkzeug.
- Legen Sie den Katheter rostral bis zu 4 cm wodurch der Spitze in der thorakalen Aorta.
- Zu verankern, den Katheter im Gefäß durch Anbinden drei Seidenfäden um die Oberschenkelarterie.
- Machen Sie eine subkutane Tasche entlang der Flanke zwischen dem kaudalen Rand des Brustkorbs und Ter am meisten Schädel Erweiterung des Knies Bereich mit einem stumpfen Schere.
- Legen Sie die Sender Körper in die Tasche und Naht an den Sender Umgebung, um übermäßige Bewegungen zu vermeiden Bindegewebe.
- Naht der Haut mit Nr. 6 Seidenfaden.
- Injizieren Ringer-Lactat (5 ml), Buprenorphin (0,035 mg / kg), und Ampicillin (33 mg / kg) subkutan unmittelbar nach der Operation und Wartung Ratten in einer warmen Inkubator bis wach.
3. Basal mittleren arteriellen Druck (MAP) und Herzfrequenz (HR) Aufnahme
- Bereits einen Tag nach Senderimplantation setzen ein einzelnes Tier auf dem Empfänger-Pad und den Sender einschalten. Warten Sie etwa 10 - 15 min, um das Tier zu gewöhnen und Stabilisierung der Herz-Kreislauf-Parameter.
- Rekordruhe MAP und HR, die sich aus der Puls arteriellen Druck mit einem computergestützten Datenerfassungssystem für mindestens 1 h abgeleitet werden. Daten sammeln alle 5 Sekunden.
- Überwachen die einimals beim Auftreten sichtbarer Spasmen kontinuierlich und Datenpunkte zu entfernen. Für jedes Tier durchschnittlichen Datenpunkte Schnittswerte zu erhalten.
4. Das kolorektale Distension-induzierte Autonomic Dysreflexie
- Rain NSC-gepfropft oder SCI Kontrollratten in einem Tuch mit Futterpellets im Inneren auf dem Sender-Empfänger geliefert. In der Regel Ratten kooperativ während des Verfahrens zu bleiben.
- Legen Sie eine Latexballon Katheters in das Rektum für ca. 2 cm und befestigen Sie es an den Schwanz mit Klebeband 8.
- Schalten Sie den Sender ein und warten Sie 10 - 15 min so dass der Blutdruck zu Präinsertions Grundlinie zurück.
- Induzieren kolorektale Ausdehnung durch Aufpumpen des Ballons langsam über 10 Sekunden mit 1,4 ml Luft für 1 min, um einen Druck von etwa 30 mmHg zu erzeugen.
- Rekord MAP und HR 1 min vor, während 1 min und 1 min nach kolorektalen Spannungsgefühl; Beispieldaten alle 3 Sekunden während der 3 min Verfahren.
- Führen Sie 2 - 3 Versuchen pro Tier mit mindestens 15 Minuten Wiederherstellungsintervall zwischen zwei Studien.
- Überdosierung Tiere (ip) mit Doppel oben, wenn keine weiteren Auswertung beschrieben Dosis Narkose-Kombination. Tiere mit Kochsalzlösung perfundiert, gefolgt von 4% Paraformaldehyd.
- Für jedes Tier, der Mittelwert der Werte vor und während kolorektalen Ausdehnung sind; Berechnung der Differenz zwischen dem Ausgangswert und Spannungsgefühl-induzierte MAP und HR Änderungen für jeden Versuch; Durchschnitt der 2 - 3 Versuche, Mittelwerte zu erhalten.
5. Sender Reinigung
- Nehmen Sie den Sender aus dem Tierkörper nach der Narkose, aber vor Perfusion. Sofort genießen in einem Becherglas mit destilliertem Wasser aufgefüllt, bis die Reinigung; vermeiden Trocknung des Telemeter-Gerät.
- Übertragen Sie die Telemeter bis 1% Terg-A-Zyme enzymatische Reinigungslösung (10 g / L Wasser) für 24 Stunden bei Raumtemperatur.
- REGEL die Spitze des Senders Katheter mit einem stumpfen 30-Gauge-Nadelzu der regel Spritze verbunden.
- Trocknen Sie den Sender sorgfältig mit einem gefalteten Weichgewebe und speichern Sie es in der Originalplastikschale.
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Representative Results
Verwendung des oben beschriebenen Telemetrietechnik haben wir erfolgreich kardiovaskulären Parameter in Rückenmark verletzten Tiere aufgezeichnet. Bei Tieren mit allein SCI, MAP wurde deutlich reduziert wohin h erhöht, naive Tiere, im Einklang mit früheren Berichten 9 verglichen. Bei Tieren mit BS-NSC Pfropfen, MAP und HR näherte Ebenen in naiven Tieren gemessen (Abbildung 2). Bei kolorektalen Dehnung wurde eine Ratte als dysreflexic angesehen, wenn die schädliche Stimulierung erzeugt einen Anstieg der Karte und eine Abnahme der HR 3,8. Episodischen Bluthochdruck und Baroreflex-vermittelten Bradykardie wurden zwangsläufig bei allen Tieren ausgelöst, aber das Ausmaß zwischen den Gruppen unterschieden. MAP Erhöhung Tiere mit BS-NSC gepfropft war viel geringer (16,9 ± 3,1 mmHg, n = 3), als Tiere mit allein Schädigung (64,1 ± 1,6 mmHg, n = 3) (Abbildung 3). Allerdings ist die Abnahme der HR bei kolorektalen Dehnung nicht signifikant zwischen den Gruppen unterscheidens. Als Bradykardie wird durch Baroreflex Mechanismen vermittelt, kann diese Diskrepanz durch eine verminderte Empfindlichkeit der Barorezeptoren nach SCI 10 sein. Krampf trat während kolorektalen Dehnung in den meisten Ratten unabhängig von der Behandlung.
Auf die histologische Analyse, Immunmarkierung angezeigt hervorragende Transplantatüberleben in Rückenmark mit BS-NSCs implantiert, aber eine Lücke in der Wirbelsäule von verletzten Tieren ohne Steuer Transplantat. Fetal NSCs die Läsion vollständig gefüllt und nur geringe Hohlräume wurden nicht beobachtet. Implantate in den Host-grauen und weißen Substanz integriert sowohl rostral und kaudal. Eine große Anzahl von TH + katecholaminerge und 5-HT + serotonergen Neuronen wurden in BS-NSC Implantate gefunden, und zahlreiche Axone topographisch in der intermediolateralen Zellenspalte über lange Strecken (Abbildung 4) innerviert Schwanz sympathischen präganglionären Neuronen. Im Gegensatz dazu verletzten Tieren ohne Transplantat, TH + / 5-HT + fIbers nicht in thoracolumbar Rückenmark unterhalb der Läsion nachgewiesen (nicht gezeigt).
Abbildung 1:. Diagramm zeigt Katheterisierung der Arteria femoralis Die Arteria femoralis (A.) wird aus dem Nerv (N.) und Vene (V.) seziert, und dann mit einer gebogenen Nadel punktiert. Die mit dem Sender verbunden Katheter in die Arterie eingeführt, indem die Spitze des Katheters auf der Ebene der Brustaorta für kardiovaskuläre Aufzeichnungs (ca. 4 cm).
Abbildung 2: Basal MAP und HR erholen in Rückenmark verletzt Ratten mit BS-NSCs gepfropft In einer repräsentativen Kohorte (n = 3 / Gruppe), Telemetrie Aufnahme zeigt deutlich niedrigeren basalen MAP und HR höher bei Ratten mit SCI und keine Behandlung 10 wee. ks nach der Verletzung (* p <0,05). Im Gegensatz zu erholen kardiovaskuläre Parameter auf die Ebene der naiven Ratte 8 Wochen nach der BS-NSC Pfropfen (10 Wochen nach der Verletzung) (beide p <0,05; ANOVA, gefolgt von Fisher-post-hoc).
Abbildung 3: Das kolorektale Dehnung (CRD) induzierten autonomen dysreflexic Autonomic Dysreflexie während einer 1 min CRD in beiden SCI und BS-NSC gepfropft Tiere ausgelöst, manifestiert sich als episodische Bluthochdruck begleitet von Bradykardie.. (A) In einem verletzten Kontrollratte, MAP erhöht sich um ca. 60 mmHg bei Dickdarm Blähungen. 20 mmHg in einer Ratte mit BS-NSCs gepfropft - (B) jedoch die Erhöhung der MAP ist stark auf 10 reduziert.
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Abbildung 4: Veredelte BS-NSCs in die Wirts erwachsenen Rückenmark zu integrieren und differenzieren sich in katecholaminerge und serotonergen Neuronen (A) Acht Wochen nach BS-NSC Pfropfen, GFP und GFAP Doppelimmunmarkierung zeigt Füllung der Läsion mit implantierten GFP-markierten Zellen in. ein Längsschnitt des Rückenmarks. (B) Im Gegensatz dazu besteht eine Lücke in einem durchtrennten Rückenmark ohne Transplantat. (C, D) Immunmarkierung für Tyrosinhydroxylase (TH) und Serotonin (5-HT) zeigt viele TH und 5-HT-positiven Neuronen im Transplantat. (E, F) abgeleitet Graft-TH + und 5-HT + Axone erweitern und innervieren Schwanz sympathischen präganglionären Neuronen mit Fluorogold in der Spalte mit der Bezeichnung intermediolateralen Zelle. Maßstabsbalken: 1 mm (B), 25 um (D) und 50 um (F).
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Discussion
Traditionell wird ein mit Flüssigkeit gefüllter Kanüle in die Arterie eingeführt und mit einem Druckwandler verbunden ist, um Herz-Kreislauf-Parameter als Terminal Snapshot in jedem Tier 11 aufzunehmen. Kardiovaskulärer Leistung für eine lange Zeit kontinuierlich zu überwachen, werden radiotelemetrische Systeme in vielen Labors eingesetzt. Diese verfeinerte Werkzeug kann den Blutdruck in der bewussten aufzeichnen, sich frei bewegenden Tieren. Vergleich zu Kathetern Flüssigkeit gefüllt wird Telemetrie als eine fortgeschrittene Technik, um genau zu bewerten Herz-Kreislauf-Funktion in SCI Tiere. Obwohl in der vorliegenden Studie wurde ein Sender nur 1 Tag vor der Aufzeichnung eingepflanzt, kann es vor oder nach der SCI für mehrere Datenerfassung in Abhängigkeit von den experimentellen Anforderungen 12 implantiert werden. Für die basale Blutdruck und HR, entweder zentralen oder peripheren Aufnahme erreicht werden kann. Allerdings kann Herz-Kreislauf Reaktion auf kolorektale Dehnung nicht durch nicht-invasive Schwanz-Manschette-basierten Verfahren erfasst werdenunserer Erfahrung. Neueste telemetrische Analyse verifiziert die langfristige Persistenz von Hypotonie und Tachykardie nach vollständiger hohen thorakalen Rückenmarkes Trennung bei Ratten 9,13. Die untere basale MAP und HR höher in unserem SCI Kontrollratten sind konsistent mit früheren Bericht mit gleichen Aufnahmetechnik. Kolorektalen-induzierten autonomen Dysreflexie wurde bei Ratten, die das Zelltransplantat erhalten gelindert. Basierend auf unserer histologischen Befund, katecholaminerge und serotonerge Eingänge zu SPNs über mehrere Wirbelsäulensegmente können für die physiologische Verbesserungen ausmachen.
Sender Katheterisierung ist entscheidend für eine erfolgreiche Implantation und Aufnahme. Im Rückenmark durchtrennt Ratten, ist der Durchmesser der A. femoralis kleiner als üblich aufgrund des Fehlens von motorischen und sensorischen Funktion der Hinterbeine. Vollständige Lähmung führt in der Regel Muskelatrophie. Chirurgen können die Spitze des Katheters zu finden größer als die Arterie zu sein. In diesem Fall wurde unter Anwendung von 2% Lidocain auf dieFläche der Arterie Hervorrufen Vasodilatation ermöglicht der Spitze des Katheters, um einfach in den punktierten Gefäße eingesetzt werden. Bemerkenswert ist, besteht Lidocain induzierte Vasodilatation-ca. 4 - 5 min. Somit sollte Gefäßpunktion und Katheterisierung so schnell wie möglich durchgeführt werden. In der Zeit der Datenerfassung der basalen Parameter, sammelten wir Datenpunkte alle 5 Sekunden für 1 Stunde. Während der 3 min kolorektalen Dehnung induzierte Aufzeichnungs jedoch Daten wurden alle 3 Sekunden um mehr Datenpunkte für eine genaue Mittelwertbildung in diesem kurzen Zeitraum erhalten abgetastet.
Implantation eines Katheters in die Oberschenkelarterie kann mit der Blutversorgung der hinteren Gliedmaßen beeinträchtigen und Gewebsnekrose induzieren, besonders wenn die distale Arterie genäht. Abdichten des Katheter-Einführungsstelle in die Arterie mit einem kleinen Tropfen der Gewebekleber anstelle einer Seidennaht zumindest teilweise Wiederherstellung des Blutflusses. Dabei Tiere wäre gesünder für die Langzeitüberwachung.Alternativ kann der Katheter der Sender direkt in die Bauchaorta Platzieren der Senderkörper in die Bauchhöhle implantiert werden. Dieses Verfahren vermeidet Gewebezerfall im ipsilateralen Hinterlauf hat aber ein Risiko von Magen-Darm-Funktion zu beeinflussen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibrinogen (rat) | Sigma | F6755-25MG | 2 hr at 37 oC to dissovle |
| Thrombin (rat) | Sigma | T5772-100UN | Dissovle in 10 mM CaCl2 |
| 1% Terg-A-Zyme | Sigma | Z273287 | Enzymatic solution for telemeter cleaning |
| Fluorogold | Fluorochrome | Dissovle in distilled water and avoid light | |
| Telemeter (PA-C40) | Data Sciences International | ||
| Telementric recording and analysis system | Data Sciences International | Signal stimulator, Data Exchange Matrix, receivers, Ambient pressure reference monitor | |
| Balloon-tipped catheter | Edward Lifesciences | 111F7-P | For colorectal distension |
References
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