Summary
Vi presentiamo un protocollo per l'utilizzo di un sistema radio-telemetrico per registrare i parametri cardiovascolari in T4 midollo spinale ratti transected otto settimane successive tronco cerebrale embrionale delle cellule staminali neurali innesto nel sito della lesione. Telemetria è una tecnica avanzata per valutare con precisione la funzione cardiovascolare in coscienti liberi di muoversi midollo spinale topi feriti.
Abstract
Lesione alta del midollo spinale toracico o cervicale (SCI) può portare a disfunzioni cardiovascolari. Per monitorare i parametri cardiovascolari, abbiamo impiantato un catetere collegato ad un trasmettitore radio in arteria femorale di ratti che hanno subito una resezione del midollo spinale T4 con o senza innesto di cellule staminali neurali del tronco encefalico-embrionali derivate che esprimono la proteina fluorescente verde. Rispetto ad altri metodi come l'inserimento cannula o la coda-bracciale, telemetria è vantaggioso per monitorare costantemente la pressione arteriosa e la frequenza cardiaca in animali liberi di muoversi. E 'anche in grado di lungo termine acquisizioni multiple di dati. Nei ratti midollo spinale feriti, sono stati registrati con successo dati cardiovascolari basali sotto condizione sfrenato e disreflessia autonomica in risposta alla distensione del colon-retto. Inoltre, i parametri cardiovascolari prima e dopo SCI possono essere confrontati nello stesso ratto se un trasmettitore viene impiantato prima una transezione del midollo spinale. Una limitazione del Telemet descrittoprocedura ry è che l'impianto nell'arteria femorale può influenzare l'apporto di sangue al arti posteriori omolaterale.
Introduction
La disfunzione cardiovascolare si verifica dopo la lesione del midollo spinale (SCI) ad alti livelli. Essa si manifesta in disordinata pressione sanguigna e la frequenza cardiaca a riposo, ipotensione ortostatica, ipotensione indotta da esercizio fisico, e disreflessia autonomo caratterizzato da episodi di ipertensione e bradicardia baroriflesso-mediata in risposta a stimoli sensoriali al di sotto del livello di pregiudizio 1,2. Questi sintomi interferiscono con la vita quotidiana dei pazienti del midollo spinale danneggiato. Pertanto, è importante stabilire strumenti efficaci per lo studio dei cambiamenti cardiovascolari negli animali con SCI e trattamenti sperimentali.
Per studiare la funzione cardiovascolare negli animali, sono state utilizzate diverse tecniche per monitorare la pressione sanguigna e la frequenza cardiaca. Parametri cardiovascolari centrali possono essere registrati mediante inserimento cannula e telemetria, mentre non invasive coda polsini possono essere utilizzati per misurare la pressione del sangue periferico 3. Rispetto ad altri metodi, telemetria ha il vantaggio principale che permette la registrazione continua in animali liberi di muoversi e di monitoraggio a lungo termine della funzione cardiovascolare 4. In modelli animali di SCI, i cambiamenti della pressione del sangue periferico dopo stimolazione sperimentale non possono essere abbastanza grandi per essere rilevato. Di conseguenza, adatto tecnica di monitoraggio cardiaco dovrebbe essere selezionato per animali con SCI.
Nel presente studio, un sistema radio-telemetrico è stato introdotto per monitorare la funzione cardiovascolare in ratti adulti dopo resezione completa del midollo spinale. I ratti hanno ricevuto innesti di ratto singenico giorno embrionale 14 (E14), le cellule staminali neurali del tronco encefalico-derivato (BS-NSC) nel sito della lesione. I ratti con lesioni e senza trapianto e ingenui, ratti infortunati serviti come controlli. La procedura di telemetria comprende trasmettitore sterilizzazione e impianto (Figura 1), la registrazione dei parametri cardiovascolari basali, risposte distensione indotta colorettali e pulizia trasmettitore estoccaggio.
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Protocol
Tutti i protocolli di animali sono stati approvati dalla cura e l'uso Comitato Istituzionale Animal (IACUC). Linee guida NIH per il laboratorio la cura e la sicurezza degli animali sono rigorosamente seguite. Gli animali con procedure chirurgiche sono stati adeguatamente trattati per ridurre al minimo il dolore e il disagio.
1. midollo spinale Curgery e innesto cellulare
- Strumenti chirurgici autoclave prima di tutti gli interventi chirurgici. Utilizzare Hot Bead Sterilizzatore (Fine Science Tools) per rimuovere gli agenti patogeni e contaminanti microbici dagli strumenti tra procedure su animali diversi. Utilizzare guanti sterili chirurgici, abito e tende durante l'intervento chirurgico. Impiegare tecnica chirurgica asettica per ogni procedura chirurgica.
- Anestetizzare femminile Fischer 344 ratti con una combinazione (2 ml / kg) di ketamina (25 mg / ml), xilazina (1,3 mg / ml), e acepromazina (0,25 mg / ml) somministrato per via intraperitoneale (ip).
- Radere la zona posteriore e pulire la pelle ripetutamente con Betadine ed etanolo.
- Tagliare la pelle con una lama # 10 e senza mezzi termini sezionare muscoli strati. Utilizzare un bisturi per isolare le vertebre, esporre la vertebra T3, ed eseguire una laminectomia dorsale usando una punta fine rongeurs.
- Incidere la dura longitudinalmente e transetto il midollo spinale a livello T4 utilizzando una combinazione di iridectomia forbici e microaspirazione per creare un gap rostrocaudale circa 1 mm tra i monconi del midollo spinale.
- Attendere circa 1 - 2 minuti fino a quando il sanguinamento completamente ferma, poi i muscoli di sutura con 3-0 Vycril e chiudere la pelle con clip ferita.
- Iniettare Ringer lattato (5 ml), buprenorfina (0,035 mg / kg), e ampicillina (33 mg / kg) per via sottocutanea immediatamente dopo l'intervento chirurgico e mantenere i ratti in un incubatore caldo fino svegli.
- Iniettare la soluzione Ampicillin una volta al giorno fino a 10 giorni, e buprenorfina due volte al giorno per 3 giorni o fino a quando i segni di dolore e di sofferenza scompaiono di Ringer e. Non restituire un animale per la compagnia di altri animali fino a fUlly recuperato.
- Svuotare manualmente la vescica due volte al giorno per circa due settimane fino all'istituzione della vescica svuotamento riflesso, e quindi svuotare la vescica una volta al giorno per tutta la sopravvivenza, se necessario.
- Due settimane dopo, ri-anestetizzare ratti SCI come descritto sopra e ri-esporre il sito cordone lesione spinale. Mantenere la dura chiusa per mantenere le cellule impiantate nel sito della lesione.
- Iniettare 10 ml di soluzione di cella (3,5 × 10 5 ml), raccolti da E14 GFP onnipresente embrioni transgenici ratto e incorporato in fibrinogeno e trombina 5,6, nel epicentro della cavità lesione e l'interfaccia rostrale e caudale della lesione con iniezione multipla siti, usando una micropipetta di vetro tirato con un diametro interno di 40 micron, collegato ad una siringa Hamilton.
- Suturare gli strati muscolari e chiudere la pelle con clip ferita.
- Eseguire l'intervento chirurgico dopo l'iniezione e la cura della vescica, come descritto nei passaggi 1,6-1,8.
- Una settimana essereribalta perfusione, iniettare 0,5% Fluorogold (FG, 0,4 ml di acqua distillata) per via intraperitoneale per etichetta retrograda neuroni simpatici pregangliari nel midollo spinale 7.
2. Trasmettitore impianto
- Bagnare transmittersin soluzione di glutaraldeide al 2% (4 ml di 50% glutaraldhyde in 96 ml di acqua distillata) per almeno 1 - 2 ore (fino a 10 ore) a temperatura ambiente per la sterilizzazione.
- Lavare accuratamente con trasmettitori sterile allo 0,9% soluzione salina 3 volte e memorizzarli in soluzione salina fino al momento dell'uso (non più di 1 ora).
- Otto settimane dopo il trapianto di cellule E14 (10 settimane lesioni post), reanesthetize i ratti che hanno subito un SIC, con o senza innesto di cellule e ratti di controllo ingenui.
- Radere la zona addominale e arti posteriori. Pulire la pelle con Betadine. Posizionare il ratto sul tavolo operatorio in posizione supina.
- Incidere la pelle sulla coscia addome e interno ventrale sul lato destro con una lama # 15.
- Tagliare le stessuti connettivi ubcutaneous per esporre il fascio di vasi femorali ed il nervo utilizzando una piccola forbice.
- Separare l'arteria femorale dalla vena e il nervo utilizzando una pinza sottile con punte curve.
- Mettere tre punti di sutura in seta sotto l'arteria e fare un nodo allentato in ogni sutura.
- Applicare 0,1 ml di lidocaina (2%) alla superficie dell'arteria per suscitare vasodilatazione per la successiva cateterizzazione.
- Fissare il vaso distale con un nodo di seta permanente e blocco temporaneo prossimalmente allungando una sutura di seta allentato.
- Puntura dell'arteria utilizzando un ago curvo calibro 20 e inserire la punta del catetere telemetro (lunga 8 cm) utilizzando uno strumento di inserimento del catetere.
- Inserire il catetere rostralmente fino a 4 cm determinando così la punta in aorta toracica.
- Ancorare il catetere all'interno del vaso legando tre suture in seta intorno all'arteria femorale.
- Fare una tasca sottocutanea lungo il fianco tra il bordo caudale del torace e tche proroga la maggior parte craniale della gamma di ginocchio con un paio di forbici spuntate.
- Inserire il corpo del trasmettitore nella tasca e sutura al tessuto connettivo che circonda il trasmettitore per evitare movimenti eccessivi.
- Suturare la pelle con n ° 6 filo di seta.
- Iniettare Ringer lattato (5 ml), buprenorfina (0,035 mg / kg), e ampicillina (33 mg / kg) per via sottocutanea immediatamente dopo l'intervento chirurgico e mantenere i ratti in un incubatore caldo fino svegli.
3. basali di pressione arteriosa media (MAP) e frequenza cardiaca (HR) di registrazione
- Già il giorno successivo trasmettitore impianto, mettere un singolo animale sul pad ricevitore e accendere il trasmettitore. Attendere per circa 10 - 15 minuti per abituare l'animale e stabilizzare i parametri cardiovascolari.
- Record MAP riposo e HR, che derivano dalla pressione del polso arterioso con un sistema di acquisizione dati informatizzata per almeno 1 ora. Raccogliere i dati ogni 5 secondi.
- Monitorare l'unaimals rimuovono continuamente e punti dati durante il verificarsi di spasmi visibili. Per ogni animale, punti dati medi per ottenere valori medi.
4.-retto distensione indotta autonomica disreflessia
- Trattenere ratti NSC-innestate o di controllo SCI in un asciugamano fornito con pellet di cibo all'interno del ricevitore trasmettitore. Di solito i ratti possono rimanere cooperativo durante la procedura.
- Inserire un catetere a palloncino con punta in lattice nel retto per circa 2 cm e fissarlo alla coda con nastro 8.
- Accendere il trasmettitore e attendere 10 - 15 minuti permette la pressione del sangue per tornare alla preinsertion basale.
- Indurre distensione del colon-retto dal gonfiaggio del palloncino lentamente oltre 10 secondi con 1,4 ml di aria per 1 min, a generare una pressione di circa 30 mmHg.
- Record MAP e HR 1 minuti prima, 1 min durante e 1 min dopo distensione del colon-retto; dati di esempio ogni 3 sec durante la procedura di 3 min.
- Eseguire 2 - 3 studi clinici per animali con almeno 15 min intervallo di recupero tra le due prove.
- Animali Overdose (ip) con doppia combinazione anestesia dosaggio sopra descritto, se non ulteriore valutazione. Profumato animali con soluzione fisiologica seguita da paraformaldeide al 4%.
- Per ogni animale, la media dei valori prima e durante rispettivamente distensione del colon-retto; calcolare la differenza tra il basale e distensione indotta MAP e HR modifiche per ciascuna prova; media dei 2 - 3 prove per ottenere valori medi.
5. Trasmettitore Pulizia
- Rimuovere il trasmettitore dal corpo animale dopo l'anestesia, ma prima di perfusione. Bagnare immediatamente in un becher riempito con acqua distillata fino pulizia; evitare l'essiccamento del dispositivo telemetro.
- Trasferire il telemetro al 1% soluzione detergente enzimatica Terg-A-Zyme (10 g acqua / L) per 24 ore a temperatura ambiente.
- Regel la punta del catetere trasmettitore con un ottuso ago 30 gaugecollegato alla siringa regel.
- Asciugare con cura il trasmettitore con un panno morbido piegato e riporlo nel cassetto di plastica originale.
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Representative Results
Utilizzando la tecnica di telemetria sopra descritto, abbiamo registrato con successo parametri cardiovascolari in midollo spinale degli animali feriti. Negli animali con il solo SCI, MAP è stata significativamente ridotta, mentre HR aumentato rispetto agli animali naïve, in linea con le precedenti relazioni 9. Negli animali con BS-NSC innesto, MAP e HR avvicinato livelli misurati negli animali naïve (Figura 2). Durante la distensione del colon-retto, un topo era considerato dysreflexic se la stimolazione nocicettiva prodotto un aumento della MAP e una diminuzione della HR 3,8. Ipertensione episodica e bradicardia baroriflessa-mediata sono stati inevitabilmente attivati in tutti gli animali, ma nella misura in cui differivano tra i gruppi. MAP aumento negli animali innestati con BS-NSC era molto più bassa (16.9 ± 3.1 mmHg, n = 3) rispetto agli animali con solo lesioni (64.1 ± 1.6 mmHg, n = 3) (Figura 3). Tuttavia, la diminuzione delle risorse umane durante la distensione del colon-retto non differiva significativamente tra il gruppos. Come bradicardia è mediata da meccanismi baroriflesso questa discrepanza potrebbe essere dovuta a una ridotta sensibilità dei barocettori dopo SCI 10. Lo spasmo si è verificato durante la distensione del colon-retto nella maggior parte dei ratti indipendentemente dal trattamento.
Dopo l'analisi istologica, immunomarcatura indicato eccellente sopravvivenza del trapianto in midolli spinali impiantati con BS-cellule staminali neurali, ma una lacuna nel midollo spinale degli animali di controllo feriti senza innesto. NSC fetali riempito completamente il sito di lesione e solo stati osservati cavità minori. Gli impianti integrati nel grigio host e sostanza bianca sia rostralmente e caudalmente. Un gran numero di TH + catecolaminergici e 5-HT + neuroni serotoninergici sono stati trovati all'interno di impianti BS-NSC, e numerosi assoni topograficamente innervato neuroni pregangliari caudale simpatici nella colonna cella intermediolaterale su lunghe distanze (Figura 4). Al contrario, negli animali feriti senza innesto, TH + / 5-HT + fIBERS non sono stati rilevati nel midollo spinale toraco sotto della lesione (non mostrati).
Figura 1:. Schema cateterizzazione dell'arteria femorale L'arteria femorale (A.) è sezionato dal nervo (N.) e vena (V), e poi forato con un ago curvo. Il catetere collegato al trasmettitore viene inserito nell'arteria, posizionando la punta del catetere a livello dell'aorta toracica per la registrazione cardiovascolare (~ 4 cm).
Figura 2: MAP basale e HR recuperare nel midollo spinale danneggiato ratti innestate con BS-cellule staminali neurali in una coorte rappresentativa (n = 3 / gruppo), la registrazione telemetria indica significativamente inferiore MAPPA basale e superiori HR nei ratti con SCI e nessun trattamento 10 wee. ks dopo la lesione (* p <0,05). Al contrario, entrambi i parametri cardiovascolari recuperare al livello di ratti naive 8 settimane dopo BS-NSC innesto (10 settimane post-infortunio) (entrambi p> 0.05; ANOVA seguito dal post-hoc di Fisher).
Figura 3: distensione del colon-retto (CRD) indotta dysreflexic autonomo disreflessia autonomo viene attivato durante un 1 min CRD sia negli animali innestati SCI e BS-NSC, manifesta ipertensione episodica accompagnata da bradicardia.. (A) In un ratto di controllo ferito, MAP aumenta di circa 60 mmHg durante la distensione del colon. (B) Tuttavia, l'aumento del MAP è fortemente ridotta a 10-20 mmHg in un topo innestato con BS-NSC.
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Figura 4: Innestata BS-NSC integrarsi nella adulto ospitante midollo spinale e si differenziano in neuroni serotoninergici e catecolaminergici (A) Otto settimane dopo BS-NSC innesto, GFP e GFAP doppia immunomarcatura dimostra il riempimento del sito di lesione con GFP etichettato cellule impiantate in. una sezione del midollo spinale longitudinale. (B) Al contrario, un divario esiste in un midollo spinale sezionato senza innesto. (C, D) immunomarcatura di tirosina idrossilasi (TH) e serotonina (5-HT) rivela molti TH e 5-HT neuroni positivi all'interno dell'innesto. (E, F) Graft-derivato TH + e 5-HT + assoni si estendono e innervano neuroni pregangliari simpatici caudale etichettati con fluorogold nella colonna intermedio-cella. Barre di scala: 1 mm (B), 25 micron (D), e 50 micron (F).
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Discussion
Tradizionalmente, un fluido riempito cannula viene inserito nell'arteria e collegato ad un trasduttore di pressione per registrare parametri cardiovascolari come un'istantanea terminale di ciascun animale 11. Per monitorare continuamente le prestazioni cardiovascolare per lungo tempo, sistemi radio-telemetrica sono impiegati in molti laboratori. Questo strumento più raffinato in grado di registrare la pressione arteriosa in coscienza, muoversi liberamente gli animali. Rispetto al fluido riempito cateteri, telemetria è considerata una tecnica più avanzata per valutare con precisione la funzione cardiovascolare negli animali SCI. Sebbene nel presente studio è stato impiantato un trasmettitore solo 1 giorno prima della registrazione, può essere impiantato prima o dopo SCI di acquisizione dati multipli a seconda delle esigenze sperimentali 12. Per basale della pressione sanguigna e HR, sia la registrazione centrale o periferico può essere raggiunto. Tuttavia, la risposta cardiovascolare alla distensione del colon-retto non può essere rilevato da non invasivo metodo basato-coda-bracciale inla nostra esperienza. Recenti analisi telemetrica verificata la persistenza a lungo termine di ipotensione e tachicardia dopo la completa toracica alta recisione del midollo spinale nei ratti 9,13. Il MAP basale inferiori e superiori HR nei nostri ratti di controllo SCI sono coerenti con la precedente relazione con stessa tecnica di registrazione. Colorettale indotta disreflessia autonomica è stata alleviata in ratti che hanno ricevuto trapianto di cellule. Sulla base dei nostri ingressi evidenza istologica, catecolaminergici e serotoninergici a SPN in più segmenti spinali può spiegare i miglioramenti fisiologici.
Trasmettitore cateterizzazione è fondamentale per l'impianto di successo e di registrazione. In spinali ratti cavo transected, il diametro dell'arteria femorale è più piccolo del solito a causa della mancanza di funzioni motorie e sensoriali degli arti posteriori. Paralisi completa solito si traduce in atrofia muscolare. I chirurghi possono trovare la punta del catetere per essere più grande della arteria. In questo caso, applicando 2% lidocaina sullasuperficie dell'arteria suscitare vasodilatazione consente la punta del catetere per essere inserito facilmente nei vasi forati. In particolare, lidocaina indotta-vasodilatazione persiste circa 4 - 5 minuti. Così, puntura nave e cateterizzazione devono essere effettuate il più rapidamente possibile. Nel periodo di acquisizione dei dati dei parametri basali, abbiamo raccolto i punti dati ogni 5 secondi per 1 ora. Durante la registrazione distensione indotta del colon-retto 3 minuti, però, i dati sono stati campionati ogni 3 secondi in modo da ottenere più punti dati per una media più precisa in questo breve periodo.
L'impianto di un catetere nell'arteria femorale può interferire con l'irrorazione del hindlimb e indurre necrosi tissutale, soprattutto se l'arteria distale viene suturata. Sigillatura il punto di inserimento del catetere nell'arteria con una piccola goccia di colla tessuto invece di una sutura di seta può almeno parzialmente ripristinare il flusso sanguigno. In tal modo, gli animali sarebbero più sani per il monitoraggio a lungo termine.In alternativa, il catetere del trasmettitore può essere impiantato direttamente nell'aorta addominale posizionando il corpo del trasmettitore nella cavità addominale. Questo metodo evita il decadimento dei tessuti in arti posteriori ipsilaterale ma ha un rischio di influenzare la funzione gastrointestinale.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibrinogen (rat) | Sigma | F6755-25MG | 2 hr at 37 oC to dissovle |
| Thrombin (rat) | Sigma | T5772-100UN | Dissovle in 10 mM CaCl2 |
| 1% Terg-A-Zyme | Sigma | Z273287 | Enzymatic solution for telemeter cleaning |
| Fluorogold | Fluorochrome | Dissovle in distilled water and avoid light | |
| Telemeter (PA-C40) | Data Sciences International | ||
| Telementric recording and analysis system | Data Sciences International | Signal stimulator, Data Exchange Matrix, receivers, Ambient pressure reference monitor | |
| Balloon-tipped catheter | Edward Lifesciences | 111F7-P | For colorectal distension |
References
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