Summary
우리는 병변 부위에 이식 팔주 배아 뇌간 신경 줄기 세포 후 T4 척수 가로로 쥐 심혈관 매개 변수를 기록하기 위해 무선 원격 측정 시스템을 사용하기위한 프로토콜을 제시한다. 텔레 메 트리 정확하게 의식이 자유롭게 이동 척수 손상 쥐의 심장 기능을 평가하는 첨단 기술이다.
Abstract
높은 흉추 또는 경추 척수 손상 (SCI)는 심장 혈관 기능 장애로 이어질 수 있습니다. 심혈관 매개 변수를 모니터하기 위해 또는 녹색 형광 단백질을 발현하는 배아 뇌간 유래의 신경 줄기 세포의 그라프없이 T4 척수 절개를받은 쥐의 대퇴 동맥에 무선 송신기에 연결된 카테터를 주입. 이러한 캐뉼라 삽입 또는 꼬리 - 커프와 같은 다른 방법에 비해, 원격 측정은 연속적으로 자유롭게 움직이는 동물에서 혈압 및 심박수를 모니터링하는 것이 유리하다. 또한 장기적으로 다수의 데이터 획득이 가능하다. 척수 손상 쥐에서 대장 팽창 님의 억제되지 않은 상태와 자율 dysreflexia에서 기저 심혈관 데이터가 성공적으로 기록되었다. 송신기는 척수 절개 전에 주입되는 경우 또한, 전 및 후의 SCI 심혈관 파라미터가 동일한 쥐에 비교 될 수있다. 설명 telemet의 한 가지 제한RY 과정은 대퇴 동맥에 주입이 동측 뒷다리에 혈액 공급에 영향을 미칠 수 있다는 것이다.
Introduction
심장 혈관 장애는 높은 수준에서 척수 손상 (SCI) 이후에 발생합니다. 이 무질서 혈압과 심박 휴지, 기립 성 저혈압, 운동 유발 성 저혈압 및 부상 레벨 아래 1,2 감각 자극에 응답하여 고혈압과 압력 반사 매개 서맥 에피소드 특징 자율 dysreflexia에 명시된다. 이러한 현상은 척수 손상 환자의 일상 생활을 방해. 따라서, SCI 및 실험 동물의 치료와 심장 혈관 변화의 조사를 위해 효과적인 도구를 확립하는 것이 중요하다.
동물에서 심혈관 기능을 조사하기 위해, 여러 가지 기술들은 혈압과 심박을 모니터링하는데 사용되어왔다. 비침 꼬리 커프스 말초 혈압 3을 측정하기 위해 이용 될 수있는 반면 중앙 심혈관 파라미터는, 캐 뉼러 삽입 및 원격 측정에 의해 기록 될 수있다. 다른 방법에 비해 텔레metry가 자유롭게 움직이는 동물 및 심혈관 기능 (4)의 장기 모니터링 연속 기록 가능 주요 장점을 갖는다. SCI의 동물 모델에서 실험적 자극 후 말초 혈압의 변화를 검출 할 수있을만큼 크지 않을 수있다. 따라서, 적합한 심장 모니터링 기술은 SCI와 동물 선정되어야한다.
본 연구에서, 무선 원격 측정 시스템은 완전한 척수 절개 후 성인 쥐 심장 기능을 모니터링하기 위해 도입되었다. 쥐 병변 사이트에서 동계 쥐 배아 일 14 (E14) 뇌간 유래 신경 줄기 세포 (BS-NSCs의)의 이식을 받았다. 부상없이 이식하고 순진한, 손상되지 않은 쥐와 쥐 컨트롤 역임했다. 원격 측정 절차는 송신기 및 멸균 주입 (도 1), 기저 심혈 관계 파라미터의 기록, 결장 팽만 유도 응답 및 전송기 청소 등을 포함저장.
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Protocol
모든 동물 프로토콜은 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 하였다. 실험실 동물 관리 및 안전에 대한 NIH의 지침을 반드시 따라야한다. 수술 절차와 동물을 적절하게 고통과 불편을 최소화하기위한 처리 하였다.
1 척수 Curgery 및 셀 접목
- 모든 수술 이전에 오토 클레이브 수술 도구. 다른 동물에 대한 절차와 악기에서 병원균 및 미생물 오염 물질을 제거 할 수있는 핫 구슬 살균기 (파인 과학 도구)를 사용합니다. 수술시 무균 수술 장갑, 가운 및 커튼을 사용합니다. 각 수술에 대한 무균 수술 기법을 사용한다.
- 암컷 피셔에게 복강 내 주사 (IP)를 통해 투여 케타민 (25 ㎎ / ㎖), 자일 라진 (1.3 ㎎ / ㎖), 및 아세 프로 마진 (0.25 ㎎ / ㎖)의 조합으로 344 래트 (2 ㎖ / kg)을 마취.
- 다시 영역을 면도하고 Betadine 및 에탄올로 반복적으로 피부를 청소합니다.
- # 10 블레이드를 사용하여 피부를 잘라 퉁명스럽게 근육 층을 해부하다. , 척추를 분리 T3 척추를 노출하고, 뾰족한 rongeurs를 사용하여 지느러미 후궁 절제술을 수행하기 위해 메스를 사용합니다.
- 종 방향 및 경막을 절개 척수 덩어리 사이에 약 1mm rostrocaudal 간극을 만드는 홍채 절제술 위 및 microaspiration의 조합을 사용 T4 수준에서 척수를 쪼개다.
- 3-0 Vycril와 완전히 출혈이 중지되며, 봉합 근육까지 2 분, 상처 클립 피부를 닫습니다 -에 대한 일을 기다립니다.
- 락 테이트 링거액 (5 ㎖), 부 프레 노르 핀 (0.035 ㎎ / ㎏), 피하 즉시 수술 후 암피실린 (33 ㎎ / ㎏)을 주입하고 깨어 때까지 따뜻한 인큐베이터에서 쥐를 유지한다.
- 주사 링거와 회 삼일 또는 통증과 고통의 흔적이 사라질 때까지 암피실린 회 십일까지 솔루션 및 부 프레 노르 핀. F까지 다른 동물의 회사에 동물을 반환하지 않습니다ully 복구.
- 수동 비우는 휘어진 방광의 설립까지 두번 약 2 주 동안 하루 방광을 비우고, 필요한 경우 다음 생존에 걸쳐 하루에 한번 방광을 비울.
- 2 주 후 전술 한 바와 같이, SCI 래트를 다시 마취 및 척수 병변 사이트를 재 노출. 병변 사이트에서 이식 된 세포를 유지하기 위해 폐쇄 경질을 유지합니다.
- 병변 공동의 진원지 여러 주입 병변의 주동이와 꼬리 인터페이스로, 10 E14 유비쿼터스 GFP 유전자 변형 쥐의 배아에서 수집 피브리노겐에 포함 된 세포 용액 (3.5 × 10 5 μL), ㎕의 트롬빈 5,6 주입 해밀턴 주사기에 연결된 40 μM의 내경으로 뽑아 유리 마이크로 피펫을 사용하는 사이트.
- 근육 층을 봉합하고 상처 클립 피부를 닫습니다.
- 1.8 - 1.6 단계에 설명 된대로 수술 후 주입 및 방광 관리를 수행합니다.
- 한 주 수이물 관류는 척수 7 복강 역행 라벨 교감 신경절 뉴런 0.5 % Fluorogold (FG, 증류수 0.4 ㎖) 주사.
2 송신기 주입
- 멸균을 실온에서 2 시간 (최대 10 시간까지) - 적어도 1 transmittersin보기 2 % 글루 타르 알데히드 용액 (증류수 96 ㎖ 중의 50 % glutaraldhyde 4 ml)에 담근다.
- 철저하게 멸균 된 0.9 %의 생리 식염수로 3 회 송신기를 세척하고 사용 (더 이상 일 이상 시간)까지 식염수에 저장합니다.
- 여덟 주 E14 세포 이식 (10 주 포스트 부상) 후, 또는 세포 이식 및 순진한 대조군없이 SCI을 시행 한 쥐를 reanesthetize.
- 복부와 뒷다리를 면도. Betadine로 피부를 청소합니다. 앙와위에서 수술 테이블에 쥐를 놓습니다.
- # 15를 이용하여 블레이드 우측 복부 복부와 허벅 다리의 피부를 절개.
- 의를 통해 잘라ubcutaneous 결합 조직은 작은 가위를 사용하여 대퇴 혈관과 신경의 번들을 노출합니다.
- 곡선 팁 미세 집게를 사용하여 혈관과 신경의 대퇴 동맥을 분리합니다.
- 동맥 아래 세 실크 봉합사를 넣고 각 봉합의 느슨한 매듭을합니다.
- 이후 카테터에 대한 혈관 확장을 유도하는 동맥의 표면에 0.1 ㎖의 리도카인 (2 %)를 적용한다.
- 근위 느슨한 실크 봉합사를 스트레칭에 의해 영구적 인 실크 매듭 및 임시 블록 원심 용기를 고정합니다.
- 20 게이지 바늘을 사용하여 곡선을 천공하고 동맥 카테터 삽입 도구를 사용 측거기 카테터 (8 ㎝ 길이)의 선단을 삽입한다.
- rostrally까지하여 흉부 대동맥에 팁을 배치 4cm에 카테터를 삽입합니다.
- 대퇴 동맥 주위에 세 실크 봉합사를 묶는하여 혈관 내 카테터를 고정합니다.
- 흉곽과 t의 꼬리 가장자리 사이의 측면을 따라 피하 주머니 만들기그는 무딘 가위로 무릎의 범위를 대부분의 두개골 확장.
- 과도한 움직임을 방지하기 위해 송신기 주변 결합 조직에 포켓과 봉합에 송신기 몸체를 삽입한다.
- 제 6 비단실로 피부를 봉합.
- 락 테이트 링거액 (5 ㎖), 부 프레 노르 핀 (0.035 ㎎ / ㎏), 피하 즉시 수술 후 암피실린 (33 ㎎ / ㎏)을 주입하고 깨어 때까지 따뜻한 인큐베이터에서 쥐를 유지한다.
3 기초 평균 동맥압 (MAP) 및 심박수 (HR) 녹화
- 일찍이 송신기 주입 다음 일일로, 수신기 패드에 하나의 동물을 넣고에 송신기를 켜십시오. 심장 혈관 매개 변수를 동물을 길들과 안정 15 분 - 약 10 기다립니다.
- 적어도 1 시간 동안 전산 데이터 수집 시스템과 펄스 동맥압로부터 유도되는 기록 쉬고 MAP 및 HR. 데이터마다 5 초를 수집합니다.
- 모니터imals 연속적으로 가시 경련의 발생시 데이터 요소를 제거한다. 각각의 동물의 경우, 평균 데이터 포인트의 평균값을 얻는다.
4 대장 자율 Dysreflexia 팽만에 의한
- 송신기 수신기 내부의 음식 펠릿와 함께 제공되는 수건에 NSC-이식 또는 SCI 제어 쥐를 제지합니다. 보통 쥐 절차를 수행하는 동안 협력 머물 수 있습니다.
- 약 2cm의 직장에 라텍스 풍선 팁 카테터를 삽입하고 테이프 팔과 꼬리에 고정.
- 에 송신기의 전원을 켜고 10 기다립니다 - 15 분은 혈압이 preinsertion 기준에 응답 할 수 있습니다.
- 약 30 mmHg로의 압력을 발생하기 위해, 서서히 1 분간 공기 1.4 mL를 10 초 동안 풍선의 팽창에 의해 결장 팽창을 유도한다.
- 기록 MAP 및 전 HR 1 분 동안 1 분, 대장 팽창 후 1 분; 샘플 데이터를 3 분의 절차를 수행하는 동안 3 초마다.
- 이 시험 사이에 적어도 15 분 복구 간격으로 동물 당 3 시험 - 2를 수행합니다.
- 만약 더 이상의 평가 위에서 설명한 두 번 투여 마취 조합으로 과다 복용 동물 (IP). 4 % 파라 포름 알데히드이어서 식염수 동물들을 관류.
- 각각의 동물의 경우, 이전에 각각 결장 팽만 동안 값을 평균; 기준 및 각 시험에 대한 팽만에 의한 MAP와 HR의 변화 사이의 차이를 계산; 2 평균 이상 - 3 시험은 평균값을 얻었다.
5 송신기 청소
- 마취 후와 관류하기 전에 동물의 몸에서 송신기를 제거합니다. 청소 때까지 증류수로 가득 비커에 즉시 담근다; 텔레 장치의 건조를 방지.
- 실온에서 24 시간 동안 1 % Terg-A-Zyme 효소 세척 용액 (10g / L의 물)로 텔레을 전송합니다.
- 무딘 30 게이지 바늘로 송신기 카테터의 끝을 Regelregel 주사기에 연결.
- 조심스럽게 접힌 부드러운 티슈를 사용하여 송신기를 건조하고 원래 플라스틱 트레이에 보관합니다.
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Representative Results
상기 원격 측정 기술을 이용하여, 우리는 성공적 척수 손상 동물에서 심혈관 매개 변수를 기록했다. HR 이전 보고서 9과 일치 순진한 동물에 비해 증가하는 반면 단독으로 SCI와 동물에서 MAP은 크게 감소 하였다. BS-NSC 이식,지도 및 HR과 동물에서 순진한 동물에서 측정 된 수준 (그림 2)에 접근했다. 유해 자극 MAP 상승 및 3,8 HR의 감소를 생성하면 결장 팽만 동안, 래트는 dysreflexic으로 간주 하였다. 에피소드 고혈압과 압력 반사 매개 서맥은 필연적으로 모든 동물에서 발생되었지만 정도는 그룹간에 차이. BS-NSCs의 그라프 동물의 MAP의 증가는 훨씬 낮았다 (16.9 ± 3.1 mmHg로, N = 3) 단독으로 부상 (64.1 ± 1.6 mmHg로, N = 3) (그림 3)과 동물보다. 그러나, 결장 팽만 동안 HR의 감소가 현저 그룹간에 차이가 없었다의. 서맥이 압력 반사 메커니즘에 의해 매개되는 바와 같이,이 차이는 SCI 10 후 압 수용체의 민감도가 떨어 때문일 수 있습니다. 경련에 관계없이 치료 대부분의 쥐에서 대장 팽창하는 동안 오류가 발생했습니다.
조직 학적 분석에 우수한 그래프트 BS-NSCs의 주입 척수 생존하지만 그라프없이 부상 대조 동물의 척수에서 틈을 나타낸 immunolabeling. NSCs의 태아 완전히 병변 사이트를 충전하고 사소한 충치가 관찰되었다. 임플란트는 모두 rostrally 및 하방 호스트 회색과 흰색 물질에 통합. TH + 카테콜아민 및 5-HT + 세로토닌 신경 세포의 큰 숫자는 BS-NSC 임플란트 내에서 발견되었고, 많은 축색 돌기는 지형적으로 긴 거리 (그림 4)를 통해 intermediolateral 셀 열에서 꼬리 교감 신경절 신경 세포의 지배를. 이식하지 않고 부상당한 동물의 대비에서, TH는 + / 5-HT의 + f를ibers이 병변 아래 흉 척수에서 검출되지 않았다 (도시되지 않음).
그림 1 :. 대퇴 동맥 카테터를 보여주는 다이어그램 대퇴 동맥 (A.)는 신경 (N.) 및 정맥 (V.)에서 해부 한 다음 곡선 바늘로 구멍이있다. 상기 송신기에 연결된 도관 심혈관 기록 용 흉부 대동맥 (~ 4cm)의 수준에서 카테터 팁을 배치, 동맥 내로 삽입된다.
그림 2 : 기초 MAP 및 HR은 BS-NSCs의 그라프 척수 손상 쥐에서 복구 대표 코호트에서 (N = 3 / 그룹), 원격 측정 기록이 상당히 낮은 기저 MAP 및 SCI와 쥐의 높은 HR없이 치료 열 꼬마를 나타냅니다. 손상 후 KS (* p <0.05). 대조적으로, 모두 심장 혈관 매개 변수 팔주 BS-NSC 이식 후 순진한 쥐의 수준 (10 주 후 부상)로 복구 (모두 p> 0.05; ANOVA 피셔의 포스트 혹 다음에).
그림 3 :. 대장 팽창 (CRD)는 자율 dysreflexia 모두 SCI 및 BS-NSC 이식 동물에서 1 분 CRD에서 방아쇠되는 자율 dysreflexic 유도 된 서맥을 동반 등의 일시적인 고혈압이 나타난다. 부상 제어 쥐에서 (A), 대장 팽창 동안 약 60 mmHg로하여 MAP 증가한다. BS-NSCs의 그라프 래트에서 20 mmHg로 - (B)는하지만, MAP의 증가는 강하게 10로 감소된다.
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그림 4 : 이식 BS는-NSCs의 호스트 성인 척수로 통합하고 카테콜아민과 세로토닌 신경 세포로 분화 (A) BS-NSC 이식 후 여덟 주, GFP 및 GFAP 두 번 immunolabeling는 이식 GFP 표지 세포 병변 사이트의 충만을 보여줍니다. 길이 척수 절을 참조하십시오. 이것에 (B)는, 간극없이 그래프트 가로로 척수에 존재한다. 티로신 수산화 효소 (TH) 및 세로토닌 (5-HT)에 대한 Immunolabeling (C, D)는 많은 TH 이식 내에서 5-HT 신경 세포를 알 수있다. (E, F) 이식 유래 TH + 및 5-HT + 축삭 확장하고 intermediolateral 세포 열에 fluorogold으로 표시 꼬리 교감 신경절 신경 세포에 분포. 스케일 바 : 1mm (B), 25 μm의 (D), 및 50 μm의 (F).
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Discussion
전통적으로, 유체가 채워진 뉼러 동맥에 삽입하고, 각 동물 11 스냅 단자로서 심혈관 매개 변수를 기록하기 위해 압력 변환기에 연결된다. 연속적으로 장시간 심혈관 성능을 모니터링하는, 무선 원격 측정 시스템은 여러 실험실에서 사용된다. 이 세련 도구는 자유롭게 동물을 이동, 의식의 혈압을 기록 할 수 있습니다. 유체 가득 카테터에 비해 원격 측정은 정확하게 SCI 동물에서 심장 혈관 기능을 평가하기 위해 고급 기술을 간주됩니다. 본 연구에서 송신기가 기록되기 전에 단지 일일 이식되었지만 전 또는 SCI가 다중 데이터 수집을위한 실험 조건에 따라 12 일 후 주입 될 수있다. 기저 혈압과 HR 어느 중추 또는 말초 기록 달성 될 수있다. 그러나, 결장 팽만 심혈관 반응은 비 침습적으로 꼬리 커프 기반의 방법에 의해 검출 할 수없는우리의 경험. 최근 원격 측정 분석은 쥐 9, 13에 완벽한 높은 흉부 척수를 절단 한 후 저혈압과 빈맥의 장기 지속성을 확인했습니다. 우리 SCI 제어 쥐의 하부 기저 MAP 이상 HR은 동일한 기록 기술을 이용하여 이전의보고와 일치한다. 대장에 의한 자율 dysreflexia 세포 이식을받은 쥐에서 완화되었다. 여러 척추 세그먼트에 걸쳐 SPN을 우리의 조직 학적 증거, 카테콜아민과 세로토닌 입력을 바탕으로 생리적 인 개선을 설명 할 수 있습니다.
송신기 카테터 삽입이 성공적으로 주입 및 기록을 위해 중요하다. 척수 가로로 래트에서, 대퇴 동맥의 직경으로 인해 모터와 뒷다리의 감각 기능의 부족에 평소보다 작다. 완전 마비는 일반적으로 근육의 위축을 초래. 외과 의사는 동맥보다 큰 것으로 카테터의 끝을 찾을 수 있습니다. 이 경우에 2 % 리도카인을인가혈관 확장을 도출 동맥의 표면에 용이하게 천공 혈관에 삽입되는 카테터의 팁을 허용한다. 5 분 - 특히, 리도카인 유도 혈관 확장 약 4 지속. 따라서, 혈관 천자와 도관은 가능한 한 신속하게 수행해야합니다. 기저 파라미터 데이터 수집 기간에서는 1 시간 동안 데이터 점마다 5 초를 모았다. 3 분 결장 팽만 유도 기록 동안, 그러나, 데이터는이 짧은 기간 동안 더 정확한 평균화 대한 데이터 점을 얻기 위해 3 초마다 샘플링 하였다.
대퇴 동맥에 카테터의 주입은 뒷다리의 혈액 공급을 방해하고 말초 동맥 봉합 특히, 조직 괴사를 야기 할 수 있음. 대신에 실크 봉합사의 조직 접착제의 작은 방울로 동맥 카테터 삽입 포인트 씰링 적어도 부분적으로 혈류를 복원 할 수있다. 이에 따라, 동물의 장기 모니터링 건강한 것.대안 적으로, 송신기 카테터 복강 송신기 몸체를 배치 복부 대동맥에 직접 주입 될 수있다. 이 방법은 동측의 뒷다리에 조직의 붕괴를 피할 수 있지만, 위장 기능에 영향을 미치는 위험이 있습니다.
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibrinogen (rat) | Sigma | F6755-25MG | 2 hr at 37 oC to dissovle |
| Thrombin (rat) | Sigma | T5772-100UN | Dissovle in 10 mM CaCl2 |
| 1% Terg-A-Zyme | Sigma | Z273287 | Enzymatic solution for telemeter cleaning |
| Fluorogold | Fluorochrome | Dissovle in distilled water and avoid light | |
| Telemeter (PA-C40) | Data Sciences International | ||
| Telementric recording and analysis system | Data Sciences International | Signal stimulator, Data Exchange Matrix, receivers, Ambient pressure reference monitor | |
| Balloon-tipped catheter | Edward Lifesciences | 111F7-P | For colorectal distension |
References
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