En radio-telemetri system för att övervaka hjärtfunktionen hos råttor med ryggmärgstransection och embryonala Neural Stem Cell Transplantat

Summary

Vi presenterar ett protokoll för att använda en radio-telemetriska system för att registrera kardiovaskulära parametrar i T4 ryggmärg avskurna råttor åtta veckor efter embryonala hjärnstammen neurala stamceller ympning in i skadestället. Telemetri är en avancerad teknik för att noggrant utvärdera kardiovaskulär funktion vid medvetande fritt rörliga ryggmärgsskador råttor.

Abstract

Hög bröstkorg eller cervikal ryggmärgsskada (SCI) kan leda till hjärt-dysfunktion. För att övervaka kardiovaskulära parametrar, implanterade vi en kateter ansluten till en radiosändare i lårbensartären av råttor som genomgick en T4 ryggmärg transektion med eller utan ympning av embryonala hjärnstamshärledda neurala stamceller som uttrycker grönt fluorescerande protein. Jämfört med andra metoder såsom kanyl insättning eller svans-manschett är telemetri fördelaktigt att kontinuerligt övervaka blodtryck och hjärtfrekvens i fritt rörliga djur. Det är också möjligt att på lång sikt flera dataförvärv. I ryggmärgsskador råttor basala hjärt data under ohämmad skick och autonoma dysreflexi som svar på kolorektal buk framgångsrikt registreras. Dessutom kan kardiovaskulära parametrar före och efter SCI jämföras i samma råtta, om en sändare implanteras innan en ryggmärgstransektion. En begränsning hos den beskrivna Telemetry förfarande är att implantation i lårbensartären kan påverka blodtillförseln till ipsilaterala bakbenen.

Introduction

Kardiovaskulär dysfunktion inträffar efter ryggmärgsskada (SCI) på höga nivåer. Det manifesteras i oordnade blodtryck och hjärtfrekvens i vila, ortostatisk hypotension, ansträngningsutlöst hypotoni och autonoma dysreflexi kännetecknas av episoder av hypertoni och baroreflex medierad bradykardi som svar på sensoriska stimuli nedanför skadenivån ^1,2. Dessa symptom stör dagliga livet av ryggmärgsskadade patienter. Därför är det viktigt att skapa effektiva verktyg för undersökning av kardiovaskulära förändringar i djur med SCI och experimentella behandlingar.

För att undersöka kardiovaskulär funktion hos djur, har flera tekniker använts för att övervaka blodtryck och hjärtfrekvens. Centrala kardiovaskulära parametrar kan registreras av kanyl insättning och telemetri, medan icke-invasiva stjärt manschetter kan användas för att mäta perifert blodtryck ^3. Jämfört med andra metoder, teleMetry har den största fördelen att den möjliggör kontinuerlig inspelning i fritt rörliga djur och långsiktig övervakning av kardiovaskulär funktion ^4. I SCI djurmodeller, kan förändringarna i perifert blodtryck efter experimentell stimulans inte vara tillräckligt stor för att upptäckas. Därför bör lämpliga hjärtövervakningsteknik väljas för djur med SCI.

I den aktuella studien, var en radio-telemetri system som införs för att övervaka hjärtfunktionen hos vuxna råttor efter fullständig ryggmärgstransektion. Råttor mottog transplantat av syngena rått embryonala dag 14 (E14) hjärnstammen härledda neurala stamceller (BS-NSCs) i skadestället. Råttor med skada och ingen transplantation och naiva, oskadade råttor tjänade som kontroller. Proceduren för telemetri omfattar sändar sterilisering och implantation (figur 1), inspelning av basal hjärt-parameter, kolorektal utspänning-inducerade svar, och rengöring sändare ochlagring.

Protocol

Alla djurprotokoll godkändes av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC). NIH riktlinjer för laboratorie djuromsorg och säkerhet följs noga. Djur med kirurgiska ingrepp var tillräckligt behandlas för att minimera smärta och obehag.

1 Ryggmärgs Curgery och Cell Ympning

1. Autoklav kirurgiska instrument före alla operationer. Använd Hot Bead Sterilizer (Fine Science Tools) för att avlägsna patogener och mikrobiella föroreningar från instrument mellan förfaranden på olika djur. Använd sterila operationshandskar, klänning och draperier under operationen. Anställ aseptisk kirurgisk teknik för varje kirurgisk procedur.
2. Bedöva kvinnlig Fischer 344-råttor med en kombination (2 ml / kg) av ketamin (25 mg / ml), xylazin (1,3 mg / ml), och acepromazin (0,25 mg / ml) som administreras via intraperitoneal injektion (ip).
3. Raka området tillbaka och rengör huden upprepade gånger med Betadine och etanol.
4. Skär huden med användning av en # 10 blad och rakt på sak dissekera muskler skikt. Använd en skalpell för att isolera kotor, exponera T3 kotan, och utför en dorsal laminektomi använder en spetsig rongeurs.
5. Incise dura längdled och transekt ryggmärgen vid T4 nivå med användning av en kombination av iridektomi sax och microaspiration att skapa en approximativt 1 mm rostrocaudal gapet mellan ryggmärgsstumpar.
6. Vänta ca 1-2 min tills blödnings helt stannar, då sutur muskler med 3-0 Vycril och stäng huden med sårklämmor.
7. Injicera Ringer-laktat (5 ml), buprenorfin (0,035 mg / kg), och ampicillin (33 mg / kg) subkutant omedelbart efter kirurgi och upprätthålla råttor i en varm inkubator tills vaken.
8. Injicera Ringers och Ampicillin lösning en gång dagligen upp till 10 dagar, och buprenorfin två gånger dagligen i 3 dagar eller tills tecken på smärta och ångest försvinner. Skicka inte tillbaka ett djur till sällskap med andra djur tills fully utvinnas.
9. Tömma manuellt blåsan två gånger om dagen i ungefär två veckor fram till upprättandet av reflexblåstömning, och sedan tömma blåsan en gång om dagen under hela överlevnaden vid behov.
10. Två veckor senare, åter söva SCI-råttor såsom beskrivits ovan och återexponera ryggmärgen lesionsstället. Håll dura stängt behålla implanterade celler i skadestället.
11. Injicera 10 ìl av celllösning (3,5 x 10 ⁵ l), som samlats in från E14 ubiquitous GFP transgen råttembryon och inbäddade i fibrinogen och trombin ^5,6, i epicentrum av lesionen hålrum och rostrala och kaudala gränssnitt av skada med flera injektion platser, med hjälp av en drog glasmikropipett med en innerdiameter av 40 pm, kopplad till en Hamilton-spruta.
12. Sutur muskelskikten och stäng huden med sår klipp.
13. Utför postoperativ injektion och urinblåsa vård som beskrivs i steg från 1,6 till 1,8.
14. En vecka varaförgrunden perfusion, injicera 0,5% fluorguld (FG, 0,4 ml i destillerat vatten) intraperitonealt till retrograd label sympatiska preganglionära neuronerna i ryggmärgen ^7.

2. Sändare Implantation

1. Blöt transmittersin 2% glutaraldehyd-lösning (4 ml av 50% glutaraldhyde i 96 ml destillerat vatten) under minst 1-2 tim (upp till 10 h) vid rumstemperatur under sterilisering.
2. Tvätta sändare noggrant med steril 0,9% koksaltlösning 3 gånger och lagra dem i saltlösning fram till användning (inte mer än 1 timme).
3. Åtta veckor efter E14 celltransplantation (10 veckor efter skada), reanesthetize råttorna som genomgick en SCI med eller utan cell ympning och naiva kontrollråttor.
4. Raka buken och bakben. Rengör huden med Betadine. Placera råttan på operationsbordet i ryggläge.
5. Incise huden på den ventrala buken och inre lår på den högra sidan med hjälp av en # 15 blad.
6. Skär igenom subcutaneous bindväv att exponera bunt av lårbens fartyg och nerver med en liten sax.
7. Separera lårbensartären från venen och nerven med hjälp av en fin pincett med böjda spetsar.
8. Sätt tre silkessuturer under artären och gör en lös knut i varje sutur.
9. Applicera 0,1 ml lidokain (2%) till ytan av artären för att framkalla vasodilatation för efterföljande kateterisering.
10. Säkra kärlet distalt med en permanent siden knut och tillfälligt blockera proximalt genom att sträcka en lös silkessutur.
11. Punktera artären med hjälp av en 20 gauge böjd nål och för in spetsen på telemeter kateter (8 cm lång) med hjälp av en kateter insättningsverktyg.
12. Sätt katetern rostrally upp till 4 cm varigenom spetsen i bröstaortan.
13. Förankra katetern i kärlet genom att binda tre silkessuturer runt lårbensartären.
14. Lägg till en subkutan ficka längs flanken mellan den bakre spetsen på bröstkorgen och than mest hjärn förlängning av knät sortiment med en trubbig sax.
15. Sätt i sändaren kroppen in i fickan och sutur i bindväven som omger sändaren för att undvika alltför stora rörelser.
16. Sutur huden med nr 6 silkestråd.
17. Injicera Ringer-laktat (5 ml), buprenorfin (0,035 mg / kg), och ampicillin (33 mg / kg) subkutant omedelbart efter kirurgi och upprätthålla råttor i en varm inkubator tills vaken.

3 Basal medelartärtrycket (MAP) och hjärtfrekvens (HR) Inspelning

1. Redan en dag efter sändare implantation, satte ett enda djur på mottagaren plattan och slå på sändaren. Vänta cirka 10 - 15 min att vänja djuret och stabilisera kardiovaskulära parametrar.
2. Spela vila MAP och HR, som härrör från pulsartärtrycket med ett datoriserat datainsamlingssystem i minst 1 timme. Samla in data var 5 sek.
3. Övervaka enDJUR kontinuerligt och ta bort datapunkter under förekomsten av synliga spasmer. För varje djur, till genomsnittliga datapunkter erhålla medelvärden.

4. kolorektal utspänning-inducerad Autonomic dysreflexi

1. Hindra NSC-ympade eller SCI kontrollråttor i en handduk medföljer mat pellets inne på mottagaren sändaren. Vanligtvis råttor kan bo kooperativt under förfarandet.
2. Sätt i en latexballongspets kateter i ändtarmen i ca 2 cm och fäst den på svansen med tejp ^8.
3. Slå på sändaren och vänta 10-15 minuter att tillåta blodtrycket att återgå till preinsertion baslinjen.
4. Framkalla kolorektal utspänning genom uppblåsning av ballongen långsamt under 10 sek med 1,4 ml luft under 1 min, för att generera ett tryck av cirka 30 mm Hg.
5. Spela MAP och HR 1 min före, 1 min under och 1 min efter kolorektal buk; exempeldata varje 3 sek under 3 min förfarandet.
6. Utför 2-3 försök per djur med minst 15 min återhämtning intervall mellan två försök.
7. Överdosering djur (ip) med dubbel dos anestesi kombination som beskrivs ovan om ingen ytterligare utvärdering. BEGJUTA djur med salin följt av 4% paraformaldehyd.
8. För varje djur, medelvärde av värdena före och under kolorektal utspänning respektive; beräkna skillnaden mellan baslinjen och utspändhet-inducerad MAP och HR förändringar för varje försök; genomsnittet för de 2 - 3 försök att få medelvärden.

5. Sändare Rengöring

1. Ta bort sändaren från djurkroppen efter anestesi men före perfusion. Blöt omedelbart i en bägare fylld med destillerat vatten tills rengöring; undvika torkning av telemeteranordningen.
2. Överför telemeter till en% Terg-A-zyme enzymatisk rengöringslösning (10 g / L vatten) under 24 h vid rumstemperatur.
3. Regel spets sändar kateter med en trubbig 30 gauge nålansluten till Regel sprutan.
4. Försiktigt torka sändaren med hjälp av en vikt mjukdelar och förvara den i originalplastbrickan.

Representative Results

Med användning av ovan beskrivna telemetri teknik, vi framgångsrikt registrerats kardiovaskulära parametrar i ryggmärgsskador djur. Hos djur med SCI ensam, var MAP minskade signifikant medan HR ökade jämfört med naiva djur, som överensstämmer med tidigare rapporter ^9. Hos djur med BS-NSC ympning, MAP och HR närmade nivåer som uppmätts i naiva djur (Figur 2). Under kolorektal buk, var en råtta anses dysreflexic om skadlig stimulering producerade en ökning av MAP och en minskning i HR ^3,8. Episod hypertoni och baroreflex förmedlade bradykardi var oundvikligen utlöstes i alla djur men omfattningen skilde mellan grupperna. MAP ökning av djur ympade med BS-NSCs var mycket lägre (16,9 ± 3,1 mmHg, n = 3) än djur med skador enbart (64,1 ± 1,6 mmHg, n = 3) (Figur 3). Däremot ville minskningen av HR under kolorektal buk inte signifikant skiljer sig mellan gruppenar. Som bradykardi förmedlas av baroreflex mekanismer, kan denna skillnad bero på minskad känslighet baroreceptorer efter SCI ^10. Spasm inträffade under kolorektal distension i de flesta råttor oavsett behandling.

Vid histologisk analys, immunomärkning indikerade utmärkt graft överlevnad i ryggmärgen implanterade med BS-NSCs men en lucka i ryggmärgen av skadade kontrolldjur utan transplantat. Fostrets NSCs fyllde helt lesionsstället och endast mindre håligheter observerades. Implantat integrerade i värd grå och vit substans både rostrally och kaudalt. Ett stort antal av TH ⁺ katekolaminerga och 5-HT ⁺ serotonerga neuroner påträffades inom BS-NSC implantat, och många axoner topografiskt innerverad kaudala sympatiska preganglionära neuronerna i det intermediolateral cell kolonn över långa avstånd (Figur 4). Däremot i skadade djur utan transplantat, TH ⁺ / 5-HT ⁺ fIBERS inte registreras i torakolumbala ryggmärgen nedan lesionen (ej visad).

Figur 1:. Diagram som visar kateterisering av lårbensartären lårbensartären (A.) dissekeras från nerv (N.) och ven (V), och sedan punkteras med en böjd nål. Katetern är ansluten till sändaren sätts in i artären, placera spetsen på katetern på nivån för bröstaortan för kardiovaskulär inspelning (~ 4 cm).

Figur 2: Basal MAP och HR återhämta sig med ryggmärgsskador råttor ympade med BS-NSCs I en representativ kohort (n = 3 / grupp), indikerar telemetri inspelning betydligt lägre basal MAP och högre HR hos råttor med SCI och ingen behandling 10 wee. ks efter skada (* p <0,05). Däremot båda kardiovaskulära parametrar återhämta sig till nivån av naiva råttor 8 veckor efter BS-NSC ympning (10 veckor efter skada) (båda p> 0,05; ANOVA följt av Fishers post hoc).

Figur 3: kolorektal distension (CRD) -inducerad autonoma dysreflexic Autonoma dysreflexi utlöses under en 1 min CRD både SCI och BS-NSC ympade djur, manifesterad som episodisk hypertoni åtföljd av bradykardi.. (A) I en skadad kontroll råtta, MAP ökar med cirka 60 mmHg under kolon buk. (B) Men ökningen av MAP är starkt reducerad till 10 - 20 mm Hg i en råtta ympad med BS-NSCs.

14 / 51914fig4highres.jpg "/>
Figur 4: Ympade BS-NSCs integreras i värd vuxna ryggmärgen och differentierar till katekolaminerga och serotonerga neuroner (A) Åtta veckor efter BS-NSC ympning, GFP och GFAP dubbel immunomärkning visar fyllning av skadestället med implanterade GFP märkta celler i. en longitudinell ryggmärgen sektion. (B) Däremot föreligger en lucka i ett transected ryggmärgen utan transplantat. (C, D) immunomärkning för tyrosin hydroxylas (TH) och serotonin (5-HT) avslöjar många TH och 5-HT-positiva neuroner inom transplantat. (E, F) Graft-härledda TH ⁺ och 5-HT ⁺ axoner utvidga och innerverar caudal sympatiska preganglionära nervceller märkta med fluor i intermediolateral cellen kolumnen. Skala barer: 1 mm (B), 25 m (D) och 50 pm (F).

Discussion

Traditionellt är en vätskefylld kanyl insatt i artären och ansluten till en tryckomvandlare för att registrera kardiovaskulära parametrar som en terminal snapshot i varje djur ^11. För att kontinuerligt övervaka hjärt prestanda under en lång tid, är radio telemetriska system som används i många laboratorier. Denna mer förfinade verktyg kan spela blodtryck i medvetna, fritt rörliga djur. Jämfört med vätskefyllda katetrar är telemetri anses en mer avancerad teknik för att exakt värdera kardiovaskulär funktion i SCI djur. Även i föreliggande studie en sändare implanterades endast 1 dag före inspelningen, kan det implanteras före eller efter SCI för flera datainsamling beroende på experimentella krav ^12. För basal blodtryck och HR, antingen centrala eller perifera inspelning kan uppnås. Däremot kan hjärt svar på kolorektal utspänning inte synlig för icke-invasiv svans-manschett-baserad metod ivår erfarenhet. Nyligen telemetriska analys verifierade långsiktiga ihållande hypotension och takykardi efter fullständig hög bröstkorg ryggmärgen transektion hos råttor ^9,13. Den lägre basala MAP och högre HR i våra SCI kontrollråttor överensstämmer med tidigare rapport med hjälp av samma inspelningsteknik. Kolorektal-inducerad autonom dysreflexi lindrades hos råttor som fick celltransplantat. Utifrån våra histologiska bevis, katekolaminerga och serotonerga ingångarna till SPN över flera spinal segment kan förklara de fysiologiska förbättringar.

Sändare kateterisering är avgörande för framgångsrik implantation och inspelning. I ryggmärgen avskurna råttor, är diametern hos lårbensartären mindre än vanligt på grund av bristen på motorisk och sensorisk funktion av bakbenen. Komplett förlamning resulterar vanligtvis i muskelatrofi. Kirurger kan hitta spetsen av katetern att bli större än artären. I detta fall tillämpa 2% lidokain påytan av artären framkalla vasodilatation tillåter spetsen av katetern för att lätt kunna införas i de punkterade kärl. Noterbart kvarstår lidokain inducerad-vasodilatation ca 4 - 5 min. Sålunda bör utföras punkterade kärl och kateterisering så snabbt som möjligt. Under perioden för datainsamling av basala parametrar, vi samlade datapunkter var 5 sek i 1 timme. Under 3 min kolorektal buk-inducerad inspelningen var dock data som provtas varje 3 sekunder för att få fler datapunkter för en mer exakt medelvärdes under denna korta period.

Implantation av en kateter i lårbensartären kan störa blodtillförseln av bakbenen och inducera vävnadsnekros, i synnerhet om den distala artären sutureras. Tätningskateterinsättningspunkten in i artären med en liten droppe av vävnad lim i stället för en silkessutur kan åtminstone delvis återställa blodflödet. Därigenom skulle djuren vara hälsosammare för långtidsövervakning.Alternativt kan katetern sända implanteras direkt in i bukaortan placera sändaren kroppen in i bukhålan. Denna metod undviker vävnads förfall i ipsilaterala bakbenen men har en risk att påverka mag-tarmfunktion.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fibrinogen (rat)	Sigma	F6755-25MG	2 hr at 37 oC to dissovle
Thrombin (rat)	Sigma	T5772-100UN	Dissovle in 10 mM CaCl2
1% Terg-A-Zyme	Sigma	Z273287	Enzymatic solution for telemeter cleaning
Fluorogold	Fluorochrome		Dissovle in distilled water and avoid light
Telemeter            (PA-C40)	Data Sciences International
Telementric recording and analysis system	Data Sciences International		Signal stimulator, Data Exchange Matrix, receivers, Ambient pressure reference monitor
Balloon-tipped catheter	Edward Lifesciences	111F7-P	For colorectal distension