Abstract
Trasmissione sinaptica è un processo estremamente rapido. Potenziale d'azione guidato afflusso di Ca 2 + nel terminale presinaptico, attraverso i canali del calcio voltaggio-dipendenti (VGCCs) situati nella membrana faccia rilascio, è l'innesco per fusione della vescicola e il rilascio dei neurotrasmettitori. Fondamentale per la rapidità di trasmissione sinaptica è la sincronia spaziale e temporale tra l'arrivo del potenziale d'azione, VGCCs e macchinari rilascio dei neurotrasmettitori. La possibilità di registrare direttamente Ca 2 + correnti dalla membrana di rilascio volto dei singoli terminali presinaptici è indispensabile per una precisa comprensione del rapporto tra presinaptica Ca 2 + e il rilascio dei neurotrasmettitori. L'accesso alla membrana di rilascio presinaptico viso per la registrazione elettrofisiologica non è disponibile nella maggior parte dei preparati e Ca 2 + presinaptico voce è stata caratterizzata mediante tecniche di imaging e macroscopica MeasureMe attualenti - tecniche che non hanno risoluzione temporale sufficiente per visualizzare Ca 2 + voce. La caratterizzazione di VGCCs direttamente presso i terminali presinaptici singoli non è stato possibile in sinapsi centrali ed è stato finora realizzato con successo soltanto nel calice-tipo sinapsi del ganglio ciliare pulcino e in calici di ratto. Abbiamo affrontato con successo questo problema nella sinapsi reticulospinal gigante del lampreda midollo spinale attraverso lo sviluppo di una preparazione acutamente dissociata del midollo spinale che produce isolati assoni reticulospinal con terminali presinaptici funzionali prive di strutture di post-sinaptici. Possiamo fluorescente etichettare e identificare i singoli terminali presinaptici e loro destinazione per la registrazione. Utilizzando questa preparazione, abbiamo caratterizzato VGCCs direttamente in faccia rilascio dei singoli terminali presinaptici utilizzando approcci di immunoistochimica e di elettrofisiologia. Ca 2 + correnti sono stati registrati direttamente al rilascio viso membrana of singoli terminali presinaptici, il primo di tali registrazioni da effettuare a livello delle sinapsi centrali.
Introduction
Trasmissione sinaptica è un processo estremamente rapido e preciso. Azione potenziale invasione del terminale presinaptico porta all'apertura dei VGCCs situati nella membrana di rilascio viso, il conseguente aumento della presinaptico Ca 2 + che funge da innesco per la fusione della vescicola e neurotrasmettitore rilascio 1. Tutti questi passaggi si verificano all'interno di centinaia di microsecondi 2, e quindi richiedono accoppiamento spaziale stretto VGCCs alle macchine di fusione delle vescicole 3. Presinaptici Ca 2 + flussi sono stati caratterizzati principalmente attraverso approcci di imaging utilizzando Ca 2 + coloranti sensibili 4. Integrare Ca 2 + buffer che modulano Ca 2 + nei neuroni presinaptici è stato utilizzato per caratterizzare indirettamente il rapporto tra calcio presinaptico e neurotrasmissione 3. Inoltre, modulando la presinaptico libera Ca 2 + concentrazione da uncaging Ca 2 + 5 o registrazione macroscopic Ca 2 + correnti sono stati utilizzati in combinazione con misure di fusione della vescicola e / o rilascio; quali misure di capacità di 6 o postsinaptici 2 risposte per affrontare la stessa domanda. Tuttavia, caratterizzando Ca 2 + correnti direttamente in faccia rilascio, la sezione specializzata della membrana presinaptica dove depolarizzazione della membrana viene tradotto in Ca 2 + correnti di attivazione sinaptica fusione delle vescicole e il rilascio dei neurotrasmettitori, è parte integrante di ottenere una misura precisa del Ca 2 + requisito per la fusione delle vescicole sinaptiche. Inoltre, la capacità di caratterizzare direttamente Ca 2 + correnti a singoli terminali presinaptici, accoppiato con misure simultanee accurate di fusione della vescicola e rilascio permette una spiegazione precisa della relazione temporale tra l'andamento temporale del potenziale d'azione, presinaptico Ca 2 + corrente, fusione della vescicola e rilascio. L'accesso alla membrana di rilascio visonon è disponibile nella maggior parte dei terminali presinaptici dovuti a chiudere apposizione da parte dei dendriti postsinaptici. Questa inaccessibilità è stato un grande ostacolo nella caratterizzazione di VGCCs quanto impedisce misure dirette di corrente a singoli terminali presinaptici. Caratterizzazione diretta di presinaptici Ca 2 + correnti a singoli terminali presinaptici non è finora stato possibile in sinapsi centrali ed è stato raggiunto solo in due terminali presinaptici di tipo caliceale; calice-tipo sinapsi delle pulcino ganglio ciliare 7-10 e ratto calici 11,12. In tutti gli altri terminali presinaptici tra cui la sinapsi reticulospinal gigante nella lampreda midollo spinale 13, la mancanza di accesso alla membrana di rilascio volto presinaptica ha reso necessario l'utilizzo di approcci indiretti come Ca 2 + di imaging per studiare presinaptici Ca 2 + flussi.
Figura 1 Lampreda gigante sinapsi reticulospinal. (A) Sezione di lampreda midollo spinale che indica l'orientamento dorso-ventrale. Assoni reticulospinal sono contrassegnati dall'asterisco verde. (B) 3-D ricostruzione della sinapsi reticulospinal nella lampreda midollo spinale che mostra presinaptico assone reticulospinal facendo numerosi en passant contatti (contrassegnato da frecce verdi) sul neurone postsinaptico 13. Terminali presinaptici sono stati etichettati con Alexa Fluor 488 hydrazide falloidina coniugato (verde), mentre il neurone postsinaptico è stato riempito con Alexa Fluor 568 hydrazide (rosso).
Lampreda assoni giganti reticulospinal, situato nella regione ventrale del midollo spinale parallelo al rostrale-caudale asse Figura 1a, forma multipla en passant contatti sinaptici sui neuroni delspinale corno ventrale 14 Figura 1b 13. Whole-cell macroscopica Ca 2 + correnti sono state registrate da assoni reticulospinal nel midollo spinale intatto 13,15. Tuttavia, precedenti tentativi ciechi a misura diretta di Ca 2 + correnti in assoni reticulospinal nel intatta lampreda midollo spinale utilizzando cellule-attached tecnica del patch clamp hanno provato senza successo 13 a causa della mancanza di accesso alla membrana presinaptica rilascio volto a causa dei processi di postsinaptici opposte Figura 1b. La membrana di rilascio volto è stato in precedenza reso accessibile dalla rimozione del neurone postsinaptico 11, perturbazione meccanica della sinapsi prima di registrare 12 o trattamento enzimatico accoppiato con dissociazione meccanica 16. Data la complessa organizzazione del midollo spinale, che si sarebbe rivelato estremamente difficile identificare il neurone postsinaptico e ritrarre meccanicamente o perturbare the sinapsi. Quindi, abbiamo deciso di utilizzare il trattamento enzimatico 17 seguita da dissociazione meccanica.
Usando questo approccio, abbiamo sviluppato una preparazione acutamente dissociata della lampreda midollo spinale che produce vitali isolati assoni reticulospinal con terminali presinaptici funzionali privi di qualsiasi processo post-sinaptici, fornendo così un accesso illimitato ai singoli terminali presinaptici. In combinazione con un microscopio invertito e standard di imaging di fluorescenza, che ci permette di identificare e indirizzare i singoli terminali presinaptici fluorescenti-identificato, con una pipetta di patch contenente una soluzione di registrazione che isola Ca 2 + correnti figura 4c e 4d figura, per la registrazione utilizzando cellulo- allegato tecnica voltage-clamp. Ca 2 + correnti sono state registrate direttamente a livello della membrana presinaptica del rilascio volto dell'individuo terminali presinaptici figura 4f. Questo è un significant passo avanti nel campo della trasmissione sinaptica poiché è la prima di tali registrazioni da effettuare in sinapsi centrali.
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Protocol
1 Preparazione di Poly-D-lisina Hydrobromide
- Preparare 1 mg / ml di poli-D-lisina bromidrato in 0,1 M tampone borato (pH 8,5).
- Aliquota e conservare a -20 ° C.
Rivestimento 2 Poly-lisina di vetrini
Nota: Eseguire tutte le operazioni di pulizia e di rivestimento in una camera di flusso laminare.
- Luogo coprioggetto in una capsula di Petri contenente 1 N acido cloridrico (HCl) per 2 ore.
- Aspirare tutto HCl e risciacquare con il 70% di etanolo (EtOH) 2-3x.
- Lasciare in 70% EtOH per 1 ora.
- Aspirare tutto il 70% EtOH e risciacquare con il 100% EtOH 2-3x.
- Lasciare in 100% EtOH per 2 ore. Aspirare tutto EtOH.
- Asciugare con carta da filtro e asciugare all'aria per pochi secondi.
- Luogo O / N in 1 mg / soluzione poli-lisina ml.
- Sciacquare coprioggetto giorno dopo con acqua Millipore 4-5x.
- Aria secca poli-lisina rivestite coprioggetto su rulli di vetro in un piatto pulito Petri.
- Per immunohistochemistry, utilizzare 35 x 10 mm Petri coperchi piatto. Preparare sylgard (polydimethylsilioxane, PDMS) fiancheggiata piatti versando PDMS (elastomero e induritore 10: 1 in peso) nella capsula ad uno spessore di 0,3 cm, permettono di fissare a 30 ° CO / N. Una volta che questo è impostato, tagliare 2 cm di 1 cm incastonate nelle PDMS. Pulire e ricoprire il riquadro con poli-lisina seguendo la stessa procedura di cui sopra per coprioggetto.
- Conservare coprioggetti e piatti rivestiti di poli-lisina coperti all'interno della camera a flusso laminare fino al momento dell'uso (fino a 2 settimane, ma ottenere i migliori risultati adesive preparando periodicamente ogni 3-4 giorni).
- Preparare un blocco PDMS, al pin del midollo spinale nel affettatrice tessuto vibrante. Mix Elastomero Elastomero A e B 1: 1 in peso. Versare in una piastra di Petri di 100 x 15 mm e permettono di impostare O / N a 30 ° C. Tagliare un pezzo rettangolare di PMDS e la colla alla piastra di base per affettare con colla epossidica. Lasciare che la colla per impostare fissa i PDMS in atto e affettare più sezioni sottili sulla superficie per ottenere un appartamentosuperficie al pin del tessuto su.
3. acuta dissociazione della Lampreda Spinal Cord cedere isolati reticulospinal assoni
- Anestetizzare un ammoecoete o adulto lampreda (Petromyzon marinus) con tricaine metansulfonato (MS-222, 100 mg / L). Aggiungere anestetico in acqua, in una tazza di plastica coperto da un coperchio, contenente la lampreda di essere sacrificato.
- Decapitare lampreda a freddo (4 ° C), soluzione di Ringer avente la seguente composizione (in mM): 130 NaCl, 2.1 KCl, 2,6 CaCl 2, 1.8 MgCl 2, 4 HEPES, 4 destrosio (pH 7.6, osmolarità 270 mOsm) e rimuovere il corpo muscoli della parete per esporre la superficie dorsale del midollo spinale.
- Rimuovere meninge primitiva dalla superficie dorsale del midollo spinale con una pinza sottile. Non rimuovere ventrale meninge primitiva in questa fase.
- Tagliare midollo spinale in 1 cm di lunghezza pezzi.
- Pin un pezzo del midollo spinale utilizzando sottili perni di insetti, lato dorsale rivolta verso l'alto, su un PDMS affettare pla di base foderatote (vedi 2.12) in un tessuto vibrante camera di affettatrice contenente soluzione ghiacciata di Ringer.
- Rimuovere una sezione centrale della colonna dorsale del midollo spinale mediante tranciatura lungo l'asse rostro-caudale con la lama, lasciando intatte le sezioni di colonna dorsale sul rostrale e caudale finisce per servire come maniglie durante il processo di dissociazione Figura 2a e la Figura 2b. Utilizzare l'impostazione più lenta della velocità che permette affettare e un ambiente profondità che rimuove solo la colonna dorsale lasciando sottostante colonna assone reticulospinal Figura 2b non danneggiato.
- Incubare pezzi del midollo spinale a fette a temperatura ambiente per 45 minuti in un cocktail di 1 mg / proteasi ml (tipo XIV da Streptomyces griseus) e 1 mg / collagenasi ml di preparato (tipo IA da Clostridium histolyticum) in soluzione di Ringer (adattato da El Manira & Bussières 1997 17).
- Pezzi del midollo spinale Pin enzimi trattati con perni sottili in un PDMS allineati Petri dish Contavorazio freddo (4 ° C), soluzione di Ringer.
- Rimuovere ventrale meninge primitiva con una pinza sottile.
- Tagliare tratti laterali del midollo spinale con una lama di bisturi a metà della sezione dorsale fette lasciando la colonna centrale di assoni reticulospinal intatti nel midollo spinale Figura 2d.
- Mettere una goccia di olio di immersione sulla lente.
- Posizionare il coprioggetto poli-lisina rivestito (figura 3a, pezzo superiore, rettangolo rosso) nella fessura della figura camera di registrazione 3 e applicare grasso per vuoto a tutti i bordi (spazio tra rettangoli rossi e blu in figura 3a, per facilitare un sigillo. Vite la parte superiore in posizione. Inserite la camera nel riquadro sulla piattaforma di registrazione.
- Aggiungere la soluzione di Ringer nella camera di registrazione con una pipetta Pasteur.
- Collegare il tubo di efflusso della bombola a pressione contenente soluzione antigelo per il tubo di ingresso del dispositivo di raffreddamento termoelettrico. Collegare il output tubo del dispositivo di raffreddamento termoelettrico al fine di ingresso della camicia di raffreddamento esterno e l'estremità di uscita al serbatoio Figura 3b.
- Mettete un pezzo di midollo spinale in un momento in camera di registrazione e separare delicatamente il midollo spinale mantenendo lungo il vetrino in ogni momento utilizzando pinze rivestite in teflon fino assoni sono isolati Figura 2e e 2f Figura.
- Portare la temperatura della soluzione di registrazione a 10 ° C facendo passare l'(azoto gassoso viene spinto nella bottiglia) pressurizzato soluzione antigelo (per spostamento), tramite il dispositivo di raffreddamento termoelettrico, attraverso la camicia di raffreddamento esterno della camera di Figura 3b registrazione.
- Consenti assoni di recuperare per 1 ora posto dissociazione a 10 ° C.
Figura 3 Schema di registrazione da camera per esperimenti di elettrofisiologia. Dimensioni previste sono in pollici. Rettangolo rosso mostrato nel diagramma basepiece (a) indica il posizionamento del coprioggetto nella scanalatura coprioggetto in basepiece. La regione tra il rettangolo rosso e blu, illustrato nel diagramma basepiece (a) è dove viene applicato il grasso alto vuoto. (B) mostra la camera di registrazione assemblato.
4. etichettatura e identificazione di terminali presinaptici con FM 1-43
- Etichetta terminali presinaptici, incorporando FM 1-43 in vesicles durante synaptic eso-endocitosi durante l'alta K + depolarizzazione. Profumato preparato con 5 mM FM 1-43 (in soluzione 5 ml di Ringer contenente KCl 30 mM).
- Profumato preparato con 1 mg / ml Advasep-7 (in 5 ml di soluzione di Ringer) per rimuovere l'eccesso di colorante FM) 18.
- Profumato preparazione con la soluzione di Ringer per 15 min a dilavamenti qualsiasi colorante Remant e la Advasep.
- Immagine con 100 X obiettivo a immersione in olio (NA 1,25) su un microscopio a fluorescenza invertito, in combinazione con una fotocamera digitale CCD e acquisizione delle immagini software micromanager, utilizzando protocolli di imaging di fluorescenza standard.
- Identificare i terminali presinaptici fluorescente a bersaglio per la registrazione Figura 4c e 4d Figura.
5. immunoistochimica di isolati reticulospinal assoni
- Riempire piatto inserto (sezione Protocol 2.10.) Con bivalente-ione (Ca 2 + e Mg 2 +) gratisSoluzione di Ringer.
- Realizzare pipette di patch in una micropipetta estrattore P-87. Mettere una piccola quantità di colla sutura ad una estremità del kit di poli-lisina utilizzando una pipetta di patch (1,5 millimetri di vetro di diametro esterno) e di aspirazione (utilizzando un tubo in silicone 0,89 millimetri di diametro interno con una punta micropipetta fissato all'estremità di aspirazione).
- Effettuare dissociazioni utilizzando la stessa procedura di cui alla sezione Protocollo 3 Figura 2. Posizionare un'estremità del midollo spinale sulla colla sutura e premere delicatamente con una pinza ad aderire con forza alla superficie. Mettere una goccia di colla sutura all'altra estremità del riquadro e allungare delicatamente il midollo spinale fino assoni sono dissociate e aderire l'estremità del midollo spinale libero trascinandola delicatamente sopra la colla sutura. Fissare in posizione da pressatura soffice verso il basso con le pinze.
- Bivalente Libero scambio soluzione di Ringer con la soluzione regolare di Ringer da perfusione.
- Consenti assoni di recuperare per 20 min dopo dissociation a 10 ° C.
- Fissare assoni dissociate in 4% paraformaldeide (PFA) {preparato in tampone fosfato salino (PBS, (mm) 137 NaCl, KCl 2.7, Na 2 HPO 4 10, KH 2 PO 4 1.8, pH 7,4)} per 20 min. Filtrare la soluzione PFA prima dell'uso passando attraverso un filtro a siringa da 0,2 micron.
- Lavare il PFA mediante perfusione 0,1 M glicina (in PBS) per 10 min.
- Incubare in 0,1% Triton-X (in PBS) per 10 min.
- Lavare mediante perfusione PBS per 20 min.
- Bloccare con latte non grasso 5% (in PBS) per 6 ore a 4 ° C.
- Aggiungi in anticorpo primario per VGCC di interesse (1: 200 diluizione in PBS) e incubare per 20 ore a 4 ° C.
- Lavare mediante perfusione PBS per 20 min.
- Bloccare con latte non grasso 5% (in PBS) per 10 min a 4 ° C.
- Aggiungi a anticorpo secondario (1: 400 diluizione in PBS) e incubare al buio per 2 ore a 4 ° C.
- Lavare mediante perfusione con PBS per 20 min.
- Blocco con 1% di siero bovino Albumin (in PBS) per 20 min.
- Aggiungi a Alexa Fluor 488 falloidina (5 unità / ml concentrazione di lavoro; magazzino preparato in metanolo 200 Unità / ml).
- Lavare mediante perfusione con PBS per 20 min.
- Immagine con obiettivo a immersione 100X acqua sul microscopio confocale.
6. elettrofisiologiche di registrazione
- Realizzare pipette di patch di vetro alluminosilicato (resistenza pipetta 2-5 MW) in una micropipetta estrattore P-87. Progettazione di patch pipetta in modo che la punta della pipetta abbraccia tutto il diametro del terminale presinaptico.
- PDMS pipette di patch cappotto immergendo la pipetta di patch sotto pressione 50-60 psi in PDMS 23 (allegare un tubo di silicone, 0,89 millimetri di diametro interno, collegato ad una bombola di gas di azoto, al back-end della pipetta di patch) e asciugare con un calore pistola. In alternativa, cappotto manualmente la pipetta con PDMS, applicando il rivestimento più vicino alla punta più possibile, sotto un microscopio composto.
- Fuoco pipette di patch smalto utilizzando un microforge (un filamento di platino su misura montata sul palco di un microscopio composto).
- Identificare assoni isolate dimostrano terminali presinaptici etichettati da microscopia a fluorescenza.
- Riempire soluzione di registrazione (progettata per isolare Ca 2 + correnti; 10 mM CaCl 2 o 90 mm BaCl 2 come portatori di carica, tamponata con HEPES pH 7,6, osmolarità 270 mOsm) nella pipetta di patch con una siringa.
- Inserire la pipetta di patch nel supporto pipetta e la posizione sopra il bagno utilizzando un manipolatore MP225 motorizzato. Abbassare delicatamente la pipetta di patch nel bagno e la posizione contro la faccia di un terminale presinaptico fluorescente identificato.
- Anticipo la pipetta di patch lentamente fino di contatto con la membrana. A questo punto, ottenere una tenuta gigaohm da aspirazione delicata bocca attraverso un tubo collegato al titolare pipetta.
- Per ottenere i bassissimi livelli di rumore di fondo necessarie per la registrazione di singolo canale Ca 2 + correnti, utilizzare un Axopatch 200B con un headstage raffreddata per le registrazioni. Dati campione a 20-50 kHz e filtro con un filtro di Bessel 5 kHz. Eseguire l'acquisizione di dati tramite un Axograph X.
- Utilizzare un protocollo standard di passo, in incrementi di 10 mV come stimolo. Incorporare un pre-impulso nel protocollo, che precede il protocollo passo, al fine di garantire l'attivazione massima di canali del Ca 2 +. Incorporare un 10 mV perdita passo verso il protocollo step per la post-analisi sottrazione delle correnti di fuga.
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Representative Results
Questo produce protocollo dissociazione sani e funzionali isolate assoni reticulospinal privi di postsinaptico proiezioni figura 2f, ma che tuttavia conservano terminali presinaptici funzionali capaci di vescicole sinaptiche evocate eso-ed endocitosi Figura 4c e 4d Figura. Sezioni delle regioni isolate degli assoni reticulospinal possano essere chiaramente identificati al microscopio ottico per essere chiari di altri processi neuronali che consentono l'accesso illimitato al reticulospinal membrana dell'assone Figura 2f. Gli assoni mantengono l'integrità strutturale dopo la dissociazione. Isolati assoni sono patchati nella configurazione cellula intera e riempite con Alexa Fluor 488 idrazide. Il colorante uniformemente distribuita all'interno l'assone e nessuna perdita colorante è stato osservato dalla 4a assone figura.
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Figura 4. registrazioni rappresentativi provenienti da un isolato assone reticulospinal. (A) isolato assone reticulospinal riempito con Alexa Fluor 488 hydrazide con una pipetta di patch in configurazione cellula intera. Posizione pipetta è indicata con una freccia bianca. (B) i. Potenziale d'azione Rappresentante sparato in un isolato assone reticulospinal. ii. Potenziale d'azione Rappresentante sparato in un assone reticulospinal nel midollo spinale intatto. Freccia nera indica il punto di tempo di stimolazione. (C) e (d) Due immagini di un assone reticulospinal isolato mostrando etichettatura puntata di terminali presinaptici con FM 1-43 e la destinazione di un terminale presinaptico individuo con la patch pipetta per la registrazione di patch cell-attached. Le frecce verdi indicano i singoli terminali presinaptici, mentre la freccia bianca indica la pipetta di patch. (E) Morto isolato assone reticulospinal mostrando indiscrincorporazione iminate di FM 1-43 in tutta l'assone. 4f. Esempio rappresentativo che mostra la registrazione cella-attached di Ca 2 + correnti (10 mM [Ca 2 +] esterno nella soluzione di registrazione nella pipetta di patch) dalla membrana di rilascio viso presinaptica dimostrando l'apertura di più canali Ca 2 +. Linea Solid segnato 0 indica stato di chiusura di canale, mentre le linee tratteggiate indicano i picchi gaussiani per le aperture dei canali.
Assoni acutamente dissociate conservano proprietà elettriche. Potenziale di membrana a riposo (RMP) può essere misurata impalare l'assone dissociato con un microelettrodo o patch l'assone in configurazione cellula intera in modalità morsetto corrente. RMP simili sono registrati in entrambi i metodi, con una media di -57,94 ± 1,63 mV (n = 17 assoni). Inoltre, dissociate assoni possono essere stimolate per sparare potenziali d'azione Figura 4b, con il corso forma e il tempo del potenziale d'azione è paragonabilead uno sparato in un assone Reticolospinale nel midollo spinale intatto.
Fusione della vescicola e riciclaggio persistono negli assoni dissociati. Cluster riciclo delle vescicole possono essere etichettati con il colorante styryl FM 1-43 durante l'alta potassio (KCl 30 mM) stimolazione 19. Alla liquidazione colorante, etichettatura puntata distinta di terminali presinaptici può essere osservato Figura 4c e 4d Figura, con una distribuzione simile a assoni reticulospinal nel intatta midollo spinale 13. FM 1-43 colorazione fornisce una chiara distinzione tra assoni sani e non sani come gli assoni non sani mostrano indiscriminato ingresso colorante FM in tutto il 4e assone figura. La capacità di identificare chiaramente i singoli terminali presinaptici ci permette di orientarli con una pipetta di patch per la registrazione Figura 4c e 4d Figura. Utilizzando questa capacità, abbiamo registrato Ca 2 + correnti direttamente dal rilascio viso membrane di singolo terminali presinaptici figura 4f.
La preparazione assone reticulospinal acutamente isolato offre anche vantaggi rispetto al midollo spinale intatto per immunoistochimica dei terminali presinaptici singoli. La mancanza di qualsiasi sfondo autofluorescenza e l'assenza di colorazione su strutture post-sinaptici o glia consente l'identificazione univoca di etichettatura degli anticorpi nei terminali presinaptici identificati (Figura 5b, i). Accoppiato con un marcatore presinaptico come Alexa-488 falloidina coniugato (figura 5a, ii) e (Figura 5b, ii), che etichette actina presinaptica 20, la localizzazione di etichettatura immunoistochimica per terminali presinaptici possa essere chiaramente dimostrato (figura 5a, iii). Questo approccio è stato utilizzato in combinazione con microscopia confocale ad effettuare la caratterizzazione immunoistochimica dei diversi sottotipi VGCC mostrano terede localizzazione specifica ai terminali presinaptici figura 5a.
Figura 5 Immunostaining di un isolato assone reticulospinal. (A) caratterizzazione immunoistochimica di R-type (CaV2.3) dei canali del calcio a singoli terminali presinaptici. i. Un anticorpo primario policlonale è stato utilizzato per etichettare un epitopo nel loop intracellulare tra i domini II e III del canale del calcio di tipo R-(host - coniglio). Anticorpo secondario era 633 IgG anti-coniglio di capra coniugato idrazide Alexa Fluor. ii. Terminali presinaptici identificate da Alexa Fluor 488 falloidina etichettatura di actina presinaptica. iii. Colocalizzazione tra l'etichettatura R-tipo di anticorpo (rosso) e Alexa-488 falloidina (verde) mostrato in una sovrapposizione risultante dalla fusione. (B) i. La preincubazione anti-R di tipo anticorpo canale del calcio conantigene di controllo non produce alcuna etichettatura specifica dei canali del calcio. ii. Alexa Fluor 488 falloidina etichettatura dei terminali presinaptici per lo stesso assone mostrando etichettatura puntata discreta.
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Discussion
Il nostro protocollo dissociazione è significativa cedendo isolati assoni reticulospinal privi di postsinaptico proiezioni figura 2f, ma che tuttavia mantengono funzionale presinaptica terminali Figura 4c e 4d Figura. L'assenza di processi di post-sinaptici che si oppongono al terminale presinaptico registrazione consente l'accesso diretto alla membrana di rilascio presinaptico faccia a terminali presinaptici singoli, in precedenza non possibile in sinapsi centrali e realizzato con successo in soli due terminali presinaptici caliceale tipo; calice-tipo sinapsi delle pulcino ganglio ciliare 7-10 e ratto calici 11,12. I singoli terminali presinaptici, che a livello elettrone micrografico hanno dimostrato di presentare semplici, singole zone attive 21, possono essere identificati dal riciclaggio etichettatura grappoli di vescicole con FM 1-43 e mirati per la registrazione Figura 4c e 4d Figura. Ca
La chiave per ottenere isolate assoni reticulospinal con terminali presinaptici funzionale si trova in una serie di criticoAL passi sequenziali. Tissue impedendo dissociazione acuta degli assoni giganti situati principalmente nella regione dorso-mediale del midollo spinale Figura 1a doveva essere rimosso prima di una vibrante affettatrice tessuto Figura 2a. Ciò rende più facile dissociare meccanicamente midollo spinale utilizzando la forza minore possibile. Il taglio della colonna dorsale richiede la rimozione completa della meninge primitiva dorsale poiché qualsiasi residuo meninge primitiva dorsale ostacolerebbe l'azione di taglio della lama. Troviamo che lasciando la meninge primitiva ventrale sul midollo spinale al momento del taglio aiuta a mantenere la forma del midollo spinale e aiuta a meglio affettatura. Sostenere tensione nel midollo spinale durante il processo di taglio impedisce qualsiasi movimento laterale o di limitare del tessuto sotto la lama che danneggerebbe gli assoni. 1 centimetro pezzi lunghi del midollo spinale offre una buona lunghezza per affettare come il tessuto può essere allungato e immobilizzato mantenendo la tensione wentre affettare. Un altro fattore critico per controllare la profondità della fetta; troppo poco profondo una fetta impedisce buona separazione del midollo spinale, mentre troppo profondi danni una fetta gli assoni reticulospinal. Una buona fetta di profondità è quella in cui la colonna dorsale viene rimossa lasciando visibilmente colonna reticulospinal ventrale integro. La profondità della fetta deve essere misurato durante il processo di affettatura dato c'è variazione di spessore del midollo spinale tra animali. La rimozione della colonna dorsale è meglio effettuata nella sezione centrale del midollo spinale pezzo Figura 2b in quanto consente la unsliced rostrale e caudale finisce per servire come maniglie per afferrare il tessuto durante il processo di dissociazione Figura 2e.
Dopo la rimozione della colonna dorsale, trattando i pezzi del midollo spinale a fette con una miscela di collagenasi (Collagenase tipo IA da Clostridium histolyticum) e proteasi (proteasi tipo XIV da Streptomyces griseus) enzimi (1 mg / ml in soluzione di Ringer) aiuta a digerire il tessuto connettivo e facilita una dissociazione dolce. A 30-45 min digestione a RT è ideale per la dissociazione. Completa dissociazione enzimatica della lampreda midollo spinale è stata precedentemente effettuata con trattamenti sequenziali di collagenasi (2 mg / ml, 30 min) e la proteasi (2 mg / ml, 45 min) per isolare i neuroni spinali 17. Trattamenti sequenziali rispetto al trattamento con un cocktail di proteasi e collagenasi non danno i risultati migliori nel dissociare assoni reticulospinal. Abbiamo anche sperimentato con diverse concentrazioni di enzimi dissociazione. Concentrazioni enzimatiche superiori a 2 mg / ml o tempi di digestione più lunghi di 45 min portato nel midollo spinale perdere la sua consistenza e dissociazioni poveri. Le concentrazioni più elevate di enzimi e periodi di trattamento prolungati potrebbero aiutare nella completa dissociazione del midollo spinale quando sono richiesti i rendimenti dei neuroni più piccoli. Assoni reticulospinal, al contrario, hanno una stru estesocture e trattamenti superiori a 45 min erano controproducenti. Mantenendo una certa tensione nel midollo spinale Aided dissociazioni migliori.
Il prossimo passo importante è quello di tagliare le vie laterali dei pezzi del midollo spinale enzimi trattati nel punto centrale della regione fette di isolare la forza dissociazione finale per la regione che comprende assoni reticulospinal. I tagli dovrebbero estendersi dal bordo laterale della materia grigia corno ventrale della colonna centrale ventro-mediale di assoni reticulospinal lasciandoli intatti Figura 2d. Il taglio dei tratti laterali fornisce un punto focale in cui la separazione del midollo spinale costretto avverrà durante dissociazione meccanica e facilita una agevole separazione del tessuto. Tensione sostenuta nel midollo spinale è richiesto durante il processo di taglio e può essere raggiunto da stretching e appuntare le estremità caudale e rostrale del pezzo del midollo spinale. Questo impedisce la deformazione del tessuto sotto la lama di bisturie conseguente danneggiamento degli assoni.
Il passo finale nella dissociazione sta applicando tensione meccanica e stretching delicatamente il tessuto lungo il rostro-caudale asse Figura 2e con pinze per afferrare il tessuto. Questa operazione viene eseguita su vetrini rivestiti di poli-lisina per consentire l'adesione degli assoni separati per la registrazione successiva. Al fine di ottenere una maggiore aderenza per i lunghi assoni reticulospinal estesi, abbiamo utilizzato un peso molecolare elevato (> 300.000) poli-D-lisina bromidrato, che fornisce maggior numero di punti di fissaggio, per rivestire i coprioggetti e inserti capsula di Petri. La superficie rivestita di poli-lisina offre aderenza sufficiente per il midollo spinale termina e gli assoni reticulospinal acutamente isolati. Pinze rivestite in teflon sono tenuti ad afferrare il midollo spinale, perché si attacca saldamente a pinza in acciaio inox regolari impediscono dissociazioni. Il tessuto deve essere allungato lentamente e tirando delicatamente gli assoni dalla spcavo inale. Il modo migliore per ottenere gli assoni a stabilirsi è quello di mantenere il midollo spinale termina lungo il vetrino di vetro in qualsiasi momento durante il processo di dissociazione, mantenendo una pressione al ribasso sul midollo spinale rostrale e caudale termina con le pinze.
Gli assoni sono meglio classificati come parzialmente isolata dal qualche porzione dell'assone rimane dentro al minimo un'estremità della fine del midollo spinale seconda dell'entità della dissociazione. Isolamenti possono essere effettuate da separare meccanicamente le due estremità del midollo spinale fino agli assoni completamente separate da un'estremità del midollo spinale. In questo caso, una porzione di assone rimane all'interno dell'estremità del midollo spinale da cui emerge mentre la restante parte è isolato dal midollo spinale interno. L'estremità terminale aperto degli assoni sigilla da un processo a membrana richiusura seconda della salute del assone. Isolamenti possono anche essere effettuate in modo tale che gli assoni emergono dal midollo spinale, but la caudale e le estremità rostrale del midollo spinale rimanere connessi tramite isolate assoni reticulospinal Figura 2e. A questo punto, rilasciando delicatamente la pressione permette gli assoni in tensione per rilassarsi e LOOP OUT cedendo regioni isolate di assoni privi di proiezioni postsinaptici. Entrambe le tecniche di dissociazione producono assoni funzionali. La temperatura fisiologica per la lampreda è 10 ° C e quindi la preparazione è permesso di recuperare a 10 ° C per 1 ora per consentire gli assoni di recuperare dalla dissociazione acuta. Per le registrazioni elettrofisiologiche, la dissociazione è stata effettuata su un vetrino coprioggetto rivestiti poli-lisina inserito in una figura camera personalizzato 3. Midolli spinali Lamprey sono stati generalmente mantenuta a 10 ± 2 ° C mediante perfusione soluzione di Ringer, preraffreddato a 10 ° C passando un dispositivo di raffreddamento termoelettrico. Eccezionalmente è richiesto a basso rumore di fondo per la risoluzione di singolo canale Ca Alta K + (KCl 30 mM) è utilizzato per depolarizzare assoni (paragrafo 4.1), in modo che la tintura FM è incorporato nelvescicole sinaptiche durante eso-endocitosi. E 'difficile trattenere l'inserimento di un microelettrodo in assoni isolate per periodi prolungati, come la minima deriva in posizione assone provoca l'elettrodo di recedere dal assone. Questo rende difficile per stimolare gli assoni per un periodo prolungato uso di un microelettrodo. Il grande diametro dell'assone (20-50 micron) rende difficile stimolare utilizzando un elettrodo di stimolazione tungsteno. Quindi alto K + è stato utilizzato per depolarizzare gli assoni. I terminali presinaptici nelle assoni reticulospinal hanno un diametro di 1-2 micron. Ca 2 + correnti sono localizzati per la membrana di rilascio volto a terminali presinaptici ed è quindi fondamentale per indirizzare con precisione il terminale presinaptico. Quindi, un requisito fondamentale per raggiungere queste registrazioni è in grado di manipolare il movimento della posizione delle patch pipetta in micron incrementi. Ca 2 + correnti al momento del rilascio presinaptico membrane viso sono state dimostrativeed in sinapsi caliceale di essere estremamente piccola in ampiezza, meno di 0,5 pA. Registrazioni singolo canale di Ca 2 + correnti richiedono quindi estremamente bassi livelli di rumore di fondo. A basso rumore termico è stato realizzato con un amplificatore Axopatch 200B e un headstage raffreddato. Inoltre, contaminando le fonti di rumore devono essere sistematicamente individuati ed eliminati. Pipette Patch sono stati realizzati, dal vetro di alluminio per garantire silenziosità in quanto il vetro ha impurezze estremamente bassi e alta resistività. Le pipette sono stati creati in modo tale che il diametro della punta della pipetta è più grande del diametro del terminale presinaptico così che comprende completamente il terminale presinaptico, le cui dimensioni possono essere chiaramente osservate da FM 1-43 etichettatura. Ciò ha garantito la registrazione da tutta la membrana di rilascio il viso. Il rumore capacitivo è stata ridotta rivestendo la pipetta con PDMS più vicino alla punta più possibile. Le guarnizioni gigaohm a membrane terminali presinaptici non sono stabili a lungo periods e registrazioni in genere durano un massimo di 2 min. Questo rende le registrazioni estremamente difficile da ottenere poiché la bassa percentuale di successo richiede un gran numero di tentativi di ottenere registrazioni corrette. Soluzioni di registrazione devono essere progettati in modo che tutte le altre correnti noti nella membrana terminale presinaptico come tensione-gated Na + e canali K + e Ca 2 + K + -activated canali sono bloccati, permettendo la registrazione delle correnti di Ca 2 +. Ci sono alcune limitazioni all'utilizzo superficie adesiva poli-lisina con questa preparazione. Uno è l'incapacità di spostare la posizione fisica della camera contenente i preparati in quanto eventuali vibrazioni interrotto la preparazione. Un altro limite della superficie adesiva è stata scoperta durante gli esperimenti di immunoistochimica, come i pezzi di fine midollo spinale rostrale e caudale perdere aderenza quando incubati in 4% paraformaldeide. Abbiamo provato coa adesivo alternativaTings quali Cell-Tak e incontrato problemi simili. Al fine di risolvere questi problemi, abbiamo usato la colla liquida sutura per fissare le maniglie del midollo spinale. Le specifiche riguardanti l'utilizzo della colla sutura sono stati discussi in un precedente articolo Giove da Chen e Featherstone 22. I set di colla a un ritmo più lento in soluzioni senza ioni bivalenti e abbiamo approfittato di tale bene e svolte le dissociazioni in soluzione di Ringer senza Ca 2 + e Mg 2 +. Questo ci ha fornito ulteriore tempo per la manipolazione del tessuto durante il processo di dissociazione. Abbiamo adottato un approccio simile a Chen e Featherstone 22 mediante pipette di patch e di aspirazione bocca attraverso un tubo collegato alla pipetta di patch per applicare la colla sulla zona obiettivo specifico sulla superficie dissociazione prima di eseguire la dissociazione (paragrafo 5.2 Protocol). Le dissociazioni sono stati eseguiti come descritto in precedenza, con la sola differenza che il c midolloestremità ord state apposte durante il processo di dissociazione trascinando delicatamente la fine maniglia sopra la colla precedentemente posizionato (sezione Protocol 5.3). Una volta che la dissociazione è stata completata, lo ione bivalente libero soluzione di Ringer è stato scambiato per soluzione di Ringer contenente Ca 2 + e Mg 2 + ioni di perfusione e la preparazione è stato permesso di recuperare a 10 ° C per 20-30 minuti su una piastra di raffreddamento termoelettrico prima procedere alle successive fasi di immunoistochimica. L'implicazione fondamentale di questa tecnica è una precisa comprensione del Ca 2 + requisito per il rilascio del neurotrasmettitore, che non è stato completamente risolto, nonostante decenni di ricerca. Un aumento transitorio della presinaptico [Ca 2 +] è stato stabilito come cruciale per innescare il rilascio in tutti sinapsi. Tuttavia, il consenso manca ancora il numero di canali del Ca 2 + che contribuiscono al Ca 2 + dominio gating releaSE. Misura simultanea di Ca 2 + correnti e le misure di capacità a livello della membrana rilascio volto di singoli terminali presinaptici darebbe una risposta univoca a questa domanda. Inoltre, essa consentirebbe spiegazione della relazione temporale tra presinaptica Ca 2 + ingresso e fusione delle vescicole, che permette una misura precisa di ritardo sinaptico. L'accessibilità senza restrizioni per la membrana di rilascio volto a singoli terminali presinaptici offre la possibilità di applicare una serie di diversi approcci sperimentali per studiare i vari componenti del processo di rilascio di neurotrasmettitore. Esempi di tali metodi includono l'imaging singola vescicola utilizzando punti quantici per studiare la fusione delle vescicole sinaptiche. Eventi di fusione delle vescicole possono anche essere caratterizzati direttamente ai terminali presinaptici misurando i cambiamenti della membrana di capacità che stanno alla base di eventi di fusione delle vescicole.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm Syringe filter | EMD Millipore | SLGV004SL | |
| 22 x 60 mm Coverslips | Fisherbrand | 12545J | |
| Advasep-7 | Cydex Pharmaceuticals | ADV7 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12379 | |
| Alexa-633 conjugated goat anti-rabbit secondary antibody | Invitrogen/Life Technologies | A21070 | |
| Antifreeze | Prestone | ||
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B7660 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Bright field light source | Dolan-Jenner | Fiberlite 180 | |
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | C4901 | |
| Collagenase Type IA from Cloristridium Histolyticum | Sigma-Aldrich | C9891 | |
| Cover slip | Fisher-Scientific | 12-545-J | |
| Dextrose | Sigma-Aldrich | D9559 | |
| Digital CCD Camera | Hamamatsu | C8484-03G01 | |
| Dissection fine forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Dissection forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Dissection microscope | Leica Biosystems | Leica MZ 12 | |
| Dissection scissors | Fine Science Tools | 15025-10 | |
| Dissection scissors fine | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Dissection scissors ultra fine | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| FM 1-43 | Invitrogen/Life Technologies | T3163 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7523 | |
| High vacuum grease | Dow-Corning | ||
| Hydrochloric acid | Fisherbrand | SA-56-500 | |
| Immersion oil | Fisher-Scientific | M2000 | |
| Industrial grade nitrogen gas tank | Praxair | UN1066 | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Liquid suture glue | Braun Veterinary Cair Division | 8V0305 | The suture glue we used in our experiments was provided to us by another lab. It is no longer manufactured. We have sourced a Histoacryl Suture Glue for future use from Aesculap (Ts1050071FP) |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 154903 | |
| Non-fat dry milk | Cell Signaling Technology | 9999S | |
| P-87 Micropipette puller | Sutter Instruments | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Perfusion pump | Cole-Palmer | Masterflex C/L | |
| Petri dish 100 x 15 mm | Fisher-Scientific | 875712 | |
| Petri dish 35 x 10 mm | Fisher-scientific | 875712 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P1024 | MW > 300,000 |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5379 | |
| Primary antibodies R-type calcium channel | Alomone Labs | ACC-006 | |
| Protease Type XIV from Streptomyces Griseus | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| Scalpel blades | World Precision Instruments | 500240 | |
| Schot Duran Pressure Bottle | Fisher-Scientific | 09-841-006 | |
| Silicone tubing for glue application | Cole-Palmer | 07625-26 | |
| Slicing base plate | Leica Biosystems | 14046327404 | |
| Slicing chamber | Leica Biosystems | 14046230132 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium hydroxide | S8045 | ||
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S9763 | |
| Sodium tetraborate | Sigma-Aldrich | B3545 | |
| Sylgard 160 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | SYLGARD® 160 | To prepare, mix elastomer A and elastomer B 10:1 by weight |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | SYLGARD® 184 | To prepare, mix elastomer and curing agent 10:1 by weight |
| Teflon coated forceps | Fine Science Tools | 11626-11 | |
| Tricaine methanesulphonate | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Vibratome blades | World Precision Instruments | BLADES | |
| Xenon lamp | Nikon |
References
- Katz, B., Miledi, R. The timing of calcium action during neuromuscular transmission. Journal of Physiology. 189 (3), 535-544 (1967).
- Sabatini, B. L., Regehr, W. G. Timing of neurotransmission at fast synapses in the mammalian brain. Nature. 384 (6605), 170-172 (1996).
- Augustine, G. J., Adler, E. M., Charlton, M. P. The calcium signal for transmitter secretion from presynaptic nerve terminals. Annals of the New York Academy of Sciences. 635, 365-381 (1991).
- Zucker, R. S. Calcium and transmitter release. Journal of Physiology Paris. 87 (1), 25-36 (1993).
- Delaney, K. R., Shahrezaei, V. Uncaging Calcium in Neurons. Cold Spring Harbor protocols. (12), (2013).
- Paradiso, K., Wu, W., Wu, L. G. Methods for patch clamp capacitance recordings from the calyx. Journal of Visualized Experiments. (6), 244 (2007).
- Stanley, E. F. The calyx-type synapse of the chick ciliary ganglion as a model of fast cholinergic transmission. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 70, S73-S77 (1992).
- Church, P. J., Stanley, E. F. Single L type calcium channel conductance with physiological levels of calcium in chick ciliary ganglion neurons. The Journal of Physiology. 496 (Pt 1), 59-68 (1996).
- Stanley, E. F. Single calcium channels and acetylcholine release at a presynaptic nerve terminal. Neuron. 11 (6), 1007-1011 (1993).
- Weber, A. M., Wong, F. K., Tufford, A. R., Schlichter, L. C., Matveev, V., Stanley, E. F. N-type Ca(2+) channels carry the largest current implications for nanodomains and transmitter release. Nature Neuroscience. 13 (11), 1348-1350 (2010).
- He, L., Wu, X. S., Mohan, R., Wu, L. G. Two modes of fusion pore opening revealed by cell attached recordings at a synapse. Nature. 444 (7115), 102-105 (2006).
- Sheng, J., He, L., et al. Calcium channel number critically influences synaptic strength and plasticity at the active zone. Nature Neuroscience. 15 (7), 998-1006 (2012).
- Photowala, H., Freed, R., Alford, S. Location and function of vesicle clusters, active zones and Ca2+ channels in the lamprey presynaptic terminal. The Journal of Physiology. 569. 569 (Pt 1), 119-135 (2005).
- Rovainen, C. M. Synaptic interactions of reticulospinal neurons and nerve cells in the spinal cord of the sea lamprey. Journal of Comparative Neurology. 154 (2), 207-223 (1974).
- Takahashi, M., Freed, R., Blackmer, T., Alford, S. Calcium influx independent depression of transmitter release by 5 HT at lamprey spinal cord synapses. The Journal of Physiology. 532 (2), 323-336 (2001).
- Stanley, E. F., Goping, G. Characterization of a calcium current in a vertebrate cholinergic presynaptic nerve terminal. The Journal of Neuroscience. 11 (4), 985-993 (1991).
- El Manira, A., Bussières, N. Calcium channel subtypes in lamprey sensory and motor neurons. Journal of Neurophysiology. 78 (3), 1334-1340 (1997).
- Kay, A. R., Alfonso, A., et al. Imaging synaptic activity in intact brain and slices with FM1 43 in C elegans lamprey and rat. 24 (4), 809-817 (1999).
- Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255 (5041), 200-203 (1992).
- Bleckert, A., Photowala, H., Alford, S. Dual pools of actin at presynaptic terminals. Journal of Neurophysiology. 107 (12), 3479-3492 (2012).
- Gustafsson, J. S., Birinyi, A., Crum, J., Ellisman, M., Brodin, L., Shupliakov, O. Ultrastructural organization of lamprey reticulospinal synapses in three dimensions. The Journal of Comparative Neurology. 450 (2), 167-182 (2002).
- Broadie, K., Featherstone, D. E., Chen, K. Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo. Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).
- Rae, J. L., Levis, R. A. A method for exceptionally low noise single channel recordings. Pflügers Archiv European Journal of Physiology. 420 (5-6), 618-620 (1992).
