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Biology

Geração de Published: October 31, 2014 doi: 10.3791/51934
Automatic Translation
1
1Department of Biological Sciences, Center for Applied Chemical Biology, Youngstown State University

Summary

Enterobacter sp. YSU cresce em meio de sais mínimos de glucose. Auxotrofos são geradas através da transformação com um transposome qual se insere aleatoriamente no genoma do hospedeiro. Os mutantes são encontrados pela réplica de placas a partir de meio complexo para meio mínimo. Genes interrompidos são identificados por socorro e seqüenciamento genético.

Abstract

Bactérias prototróficas crescer em M-9 sais de meio mínimo suplementado com glucose (meio M-9), que é usado como uma fonte de carbono e energia. Auxotrofos pode ser gerado usando um transposome. A disponível comercialmente, Tn 5 transposome -derived utilizado neste protocolo consiste de um segmento linear de DNA contendo uma origem de replicação R6K γ, um gene de resistência à canamicina e dois sequência termina mosaico, que servem como sítios de ligação de transposase. O transposome, fornecida como um complexo de proteína de ADN / transposase, é introduzida por electroporação na estirpe prototrófica, Enterobacter sp. YSU, e incorpora-se aleatoriamente no genoma deste hospedeiro. Os transformantes são plaqueadas em réplica Luria-Bertani placas de agar contendo canamicina (LB-kan) e em placas de agar M-9 médias contendo canamicina (M-9-kan). Os transformantes que crescem em placas de LB-kan mas não em placas de M-9-kan são considerados auxotrofos. Genómico purificadoADN a partir de um auxotrofo é parcialmente digerido, ligados e transformados em uma pir + Escherichia coli (E. coli) estirpe. A origem de replicação R6Kγ permite que o plasmídeo se replique em pir + E. estirpes de E. coli, e o marcador de resistência à canamicina para selecção permite plasmídeo. Cada transformante possui um novo plasmídeo contendo o transposão ladeada pela região cromossómica interrompida. Seqüenciamento Sanger eo Básico Local Alignment Search Tool (BLAST) sugerem uma identidade putativo do gene interrompido. Existem três vantagens de se utilizar esta estratégia mutagênese transposome. Em primeiro lugar, que não se baseia na expressão de um gene de transposase pelo hospedeiro. Em segundo lugar, o transposome é introduzido no hospedeiro-alvo por electroporação, em vez de por conjugação ou por transdução e, por conseguinte, é mais eficiente. Em terceiro lugar, a origem de replicação R6Kγ faz com que seja fácil de identificar o g mutadoeno que é parcialmente recuperada num plasmídeo recombinante. Esta técnica pode ser utilizada para investigar os genes envolvidos em outras características de Enterobacter sp. YSU ou de uma variedade mais ampla de estirpes bacterianas.

Introduction

Bactérias prototróficas crescer em M-9 sais de meio mínimo contendo glucose (meio M-9), a conversão de glicose através centrais vias de metabolismo de carbono para gerar precursores, tais como aminoácidos, ácidos nucleicos e vitaminas, para a biossíntese 1. M-9 meio contém cloreto de amónio como uma fonte de azoto, de sódio e fosfato de potássio como tampão e fonte de fósforo, sulfato de magnésio como fonte de enxofre e de glucose como fonte de carbono e energia. Luria-Bertani (LB) é rica em aminoácidos a partir de triptona e em vitaminas e factores de crescimento a partir de extracto de levedura. Ele suporta o crescimento de auxotrofos que não podem sintetizar aminoácidos, vitaminas e outros factores de crescimento necessários para o crescimento em meio M-9. Assim, prototrofos vai crescer em LB e meio M-9, ao passo que os auxotrofos vai crescer em meio LB, mas não em meio M-9. Com a introdução de mutações em uma população de bactérias e prototrófica identificação de genes mutantes que causam fenótipos auxotróficas, é possible para se obter uma melhor compreensão do metabolismo de uma estirpe bacteriana.

Mutagénese de transposões pode ser utilizado para identificar muitos dos genes necessários para o crescimento em glicose em meio M-9. Os transposões inserir-se aleatoriamente no genoma do hospedeiro 2. Ao detectar transformantes transposões em placas de agar LB e plaqueamento de réplicas em placas de agar de meio M-9, é possível para o rastreio de auxotrofos. Genes interrompidos são identificados por meio de resgate gene. Este estudo utiliza um Tn comercialmente disponível 5 -derived transposome que é fornecido como uma solução de um segmento de DNA transposon linear misturado com proteína transposase. O segmento de DNA não possui um gene de transposase, mas contém um gene de resistência a canamicina, uma origem de replicação R6K γ e dois motivos de mosaico que são sequências de ADN para a transposase de ligação em cada extremidade do segmento de 3,4. Uma vez que a proteína transposase é adicionado directamente ao ADN, o segmento de ADN sozinhoé definida como o transposão, e o complexo de proteína de ADN / transposase é definida como a transposome. O transposome é transformada por electroporação 5 num hospedeiro sensível a canamicina (Figura 1A). As colónias que crescem em placas de agar LB contendo canamicina (LB-kan) têm inserções de transposões (Figura 1B), e de réplica banhado transformantes que não conseguem crescer em M-9 placas de agar com meio contendo canamicina (M-9-kan) são auxotróficos (Figire 1C). O ADN genómico de um mutante é purificado e parcialmente digerido com a base de 4-endonuclease de restrição de corte, BFU CI (Figura 1D). O DNA ligado é transformado numa estirpe de Escherichia coli (E. coli) que contém o gene pir (Figura 1E). Este gene permite que o novo plasmídeo contendo o transposão e região flanqueadora cromossómico do hospedeiro para se replicar em E. coli 6. O gene de resistência à canamicina serve como quantoelectable marcador para o novo plasmídeo. Por último, a sequenciação utilizando iniciadores complementares a cada uma das extremidades do transposão e Básico Local Alignment Search Tool (BLAST) 7,8 análise da sequência resultante são utilizados para determinar a identidade dos genes interrompidos.

Esta estratégia de mutagênese transposome oferece três vantagens 3. Em primeiro lugar, uma vez que a proteína de transposase está ligado directamente ao transposão, a inserção não depende da expressão do gene de transposase dentro do hospedeiro. Uma vez que o transposão incorpora-se no genoma do hospedeiro, a transposase é degradada, impedindo o movimento adicional do transposão. No entanto, o movimento adicional não pode ser evitado se o host possui um Tn 5 elemento transposicional endógena. Em segundo lugar, a introdução de transposome por electroporação torna possível utilizá-lo em uma ampla variedade de hospedeiros. Também elimina a necessidade de introduzir o transposão por conjugação bacteriana ou por viinfecção ral. Ambos os processos requerem a susceptibilidade do hospedeiro. Em terceiro lugar, a inclusão do gene de resistência à canamicina e a origem de replicação R6K γ na transposome faz com que seja mais fácil para identificar o gene interrompido. Regiões de transposões-interrompido pode ser armazenado e sequenciados como plasmídeos, eliminando a necessidade de se utilizar a reacção em cadeia inversa da polimerase (PCR) para a identificação de genes.

O protocolo apresentado neste vídeo descreve cada passo para transposon mutagênese de Enterobacter sp. YSU 9 usando um transposome a partir da sua introdução nas células bacterianas para a identificação do gene putativo la interrompido. Além de protocolos previamente publicados 3,4,10, métodos detalhados para usar réplica de placas para rastrear auxotrofos são apresentados. Esta técnica de mutagénese podem ser usados ​​para a investigação de outros fenótipos, tais como antibióticos e resistências de metal, em diferentes tipos de bactérias, para identifying o número mínimo de genes necessários para o crescimento sob condições de cultura definidas em estudos de biologia sintética, ou para o ensino de um componente de um laboratório de genética ou curso de fisiologia microbiana.

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Protocol

1. Eletroporação de células competentes 5,11

  1. Dilui-se uma S / N cultura LB de Enterobacter sp. YSU 1/20 em 50 ml de meio LB fresco e crescer com agitação a 120 rpm e 30 ° C para uma DO (600 nm) entre 0,4 e 0,6. Opcionalmente, crescer outras estirpes de bactérias na sua temperatura de crescimento ideal.
  2. Relaxar as células em gelo durante 5 min e centrifuga-se a 4 ° C e 7000 x g durante 5 min.
  3. Descartar o sobrenadante, ressuspender as células em 50 ml de água gelada estéril e centrifugar a 4 ° C e 7000 x g durante 5 min. Repita este passo.
  4. Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em um volume de água gelada igual ao volume de sedimento celular. Para armazenamento a longo prazo, lavar as células com 10 ml de gelado a 10% (v / v) de glicerol, ressuspender o sedimento em um volume igual de gelado a 10% (v / v) de glicerol, armazenar a -80 ° C, e descongelar em gelo antes da electroporação.
  5. Adicionar 0,5 mL da transposome a 40 ul decélulas. A solução transposome disponível comercialmente é fornecido a uma concentração de ADN de 0,33 ug / ul. Embora seja recomendado 0,33 g, 0,165 ug de DNA é suficiente.
  6. Coloque a mistura de células / transposome numa gelada, 0,2 mm, de cuvete de electroporação e toque na mistura para o fundo da cubeta. Chocar as células a 25 mF, 200 Ω, e 2,5 kV. Para garantir que as células permanecem refrigerados, armazenar as tinas de eletroporação em um freezer -20 ° C antes do uso.
  7. Imediatamente, adicione 960 mL de caldo de super filtro esterilizados ideal com catabólito repressão (SOC) médio. Misture por pipetagem cima e para baixo e transferir as células para um estéril de 1,5 ml tubo de microcentrífuga.
    NOTA: As células começam a morrer após o choque, mas o sal no meio SOC lhes permite recuperar. Para economizar, não é necessário adicionar transposome ou para chocar as células de controlo negativo. Basta adicionar 960 ul de meio SOC estéril a ele.
  8. Incubar as células a 30 ° C fou 45-60 min com agitação a 120 rpm. Isso proporciona um tempo para o transposome para recombinar-se com o genoma do hospedeiro e para as células para expressar resistência à canamicina.
  9. Espalhe 100 ul de células numa placa de agar LB-kan e incubar a placa de O / N a 30 ° C. Armazenar a mistura de transformação remanescente no frigorífico a 4 ° C. Espalhe valores adicionais em uma data mais tarde para duas semanas após a eletroporação inicial, se necessário.

2. Gridding de transformantes

  1. Fita de uma grade para a tampa de um vazio de 100 x 15 mm placa de petri. Copie uma grade de "Um Curso de curta duração em Genética bacteriana" 12.
  2. Desenhar uma linha na parte inferior de uma placa de agar LB-kan. Usar um pequeno pedaço de fita adesiva para o ancorar a tampa em grade de modo que a grade é visível através do ágar. Certifique-se de que a linha na parte inferior da placa está alinhada com o topo, centro da grade. Ancorando a placa com fita impede de correr, permitindo até mesmo gridding. A linha facilita a identificação colônia após réplica de placas.
  3. Escolha um único transformante com um palito estéril e detectá-lo no centro de uma praça no grid. Basta tocar a colônia eo local. Não cavar o palito no agar. Para evitar a contaminação da chapa, lidar com o palito apenas em uma extremidade.
  4. Manchar outro transformante em um quadrado adjacente como no passo 2.3. Quando o prato está cheio, ele incubar O / N a 30 ° C. Esta é a placa mestre.

3. réplica de placas para determinar a auxotrofo Fenótipo 12

  1. Para cada placa que foi reticulada, fazer uma pilha de três placas de agar fresco numeradas de um a três: um para LB-kan, dois para M-9-kan e três para LB-kan. Secar as placas de cabeça para baixo, S / N, a 37 ° C antes da utilização.
  2. Desenhar uma linha no topo de cada placa como no passo 2.2.
  3. Limpe a ferramenta réplica de placas com 70% de etanol, coloque um quadrado de veludo estéril em cima do forro réplica paraol e apertar o quadrado de veludo para baixo. As mãos estão cheias de micróbios mesmo depois de lavá-las. Evitar a introdução de contaminantes micróbios pela manipulação da praça de veludo pelas bordas.
  4. Alinhar a linha na placa principal com uma linha traçada sobre o grampo e colocar a placa na parte superior do quadrado veludo. Aplique uma leve pressão para transferir as bactérias da placa até a praça de veludo. Tenha cuidado para não manchar as bactérias. Remova a placa mestre da praça de veludo.
  5. Alinhe a linha desenhada na placa o número um com a linha no suporte e coloque-o em cima da praça de veludo. Aplique uma leve pressão para transferir as bactérias a partir da praça de veludo para a chapa. Retire a placa de número um.
  6. Descarte a praça de veludo para um copo de água e coloque um pano limpo, quadrado veludo estéril na ferramenta réplica de placas como no passo 3.3. Este passo evita o excesso de inoculação, que provoca o crescimento avanço e resultados falsos positivos.
  7. Alinhe alinha na placa o número um com a linha do grampo e coloque-o em cima da nova praça de veludo. Aplique uma leve pressão para transferir as bactérias da placa número um para a praça de veludo. Retire a placa de número um.
  8. Alinhe a linha desenhada na placa de número dois com a linha no suporte e coloque-o em cima da praça de veludo. Aplique uma leve pressão para transferir as bactérias a partir da praça de veludo para placa de número dois. Retire a placa de número dois.
  9. Repita o passo 3.8 para três número da placa. A terceira placa é um controlo para a transferência completa da placa mestra para as outras duas placas. Descarte a praça de veludo para um copo de água. Para reutilizar as praças de veludo, autoclave o copo contendo os quadrados de veludo contaminados, lave-as, seque-as, enrole-os em papel alumínio e re-autoclave-los.
  10. Incubar as placas a 30 ° CO / N. As colónias que crescem em ambas as placas de agar LB-kan mas não conseguem crescer em placas de M-9-kan são considerados (auxotrofos
  11. Streak fora auxotrofos de placa número um em um prato fresco agar LB-kan, e incubar a placa a 30 ° CO / N.
  12. Streak fora para isolamento três colônias da placa raia na etapa 3.11 em uma placa LB-kan fresco. Incubar a placa a 30 ° CO / N. Isto assegura que o mutante é bem isolado. Divida o prato em três partes e raia a cada colônia em uma seção.
  13. Colônias spot das colônias estrias derivados de passo 3,12 em uma placa de LB-kan fresco para formar uma grade como nos passos 2,1-2,4. Cada mutante está sendo re-testadas em triplicata.
  14. Replicar placa novamente como nos passos 3,1-3,10 para confirmar o fenótipo auxotrofo.

4. Gene Resgate

  1. Cresça um 3 ml O / N a cultura de um mutante isolado de colónias a partir do passo 3.13 em meio LB-kan líquido a 30 ° C. Purifica-se o ADN genómico a partir de 1 ml de cultura utilizando um kit de purificação de ADN genómico disponíveis comercialmente.
  2. Configurar uma mistura de 0,025 LBFU CI endonuclease de restrição e 14 uL de 1 ug de ADN genómico ul / em uma reacção de 20 ul em gelo. Desde BFU CI corta o transposão em doze locais diferentes, pode ser mais eficiente a utilização de endonuclease de restrição, Bfa I ou Hae III, que corta o transposão em dois e três locais diferentes, respectivamente.
  3. Incubar a reacção a 37 ° C durante 25 minutos e depois a 80 ° C durante 20 minutos para inactivar a enzima. Analise 3 ul de DNA parcialmente digerido num gel de agarose a 0,8% (Figura 3). Uma bem-sucedida de digestão resultados parciais em um esfregaço de acima de 10 kb para a parte inferior do gel.
  4. Ligadura de 15 ul de ADN genómico digerido parcialmente usando 800 unidades de DNA ligase de T4 numa reacção de 500 ul. Incubar a reacção de O / N a 4 ° C. O grande volume de reacção maximiza a ligação de fragmentos individuais para si e minimiza as interacções entre dois ou mais fragmentos de ADN.
  5. Precipitate o DNA ligado por adição de 50 ul de acetato de sódio 3M, pH 5,5, e 1 ml de etanol a 95% e incubando-se a -20 ° C durante 20 min.
  6. Microcentrífuga o DNA a 4 ° C e 13.500 xg durante 10 min, lavar o sedimento com etanol a 70%, secá-lo num concentrador centrífugo de vácuo, e ressuspender-lo em 10 ul de água livre de nuclease. Alternativamente, o ADN pode ser seca ao ar à temperatura ambiente durante 15 min.
  7. Use 4 ul de DNA para transformar E. ressuspensas coli pir ECD100D tensão ou ECD100D pir116 por eletroporação como na seção 1. A origem de replicação γ R6K requer uma estirpe bacteriana com um gene pir replicar 6. Os resultados da estirpe pir em baixas plasmídeos de cópia, e a estirpe pir116 contém um gene mutante pir que resulta em plasmídeos de elevado número de cópias. Cada transformante contém um novo plasmídeo com o transposão e uma região do cromossoma interrompido (Figura 1E).
  8. InoculComeram 5 ml de meio LB-kan com uma única colónia, que crescem O / N com agitação a 120 rpm e 37 ° C, e purifica-se DNA de plasmídeo a partir de toda a cultura D / N usando um kit comercial.
  9. Digerir 14 ul do plasmídeo usando a endonuclease de restrição Xho I. Certifique-se o volume final da reacção é de 20 uL. Este enzima reconhece um local no meio do transposão na extremidade 5 'do gene de resistência à canamicina. Analise 10 ul do plasmídeo não digerido e digerido num gel de agarose a 0,8% (Figura 3). O plasmídeo consiste no DNA do hospedeiro transposão 2 kb de flanqueamento mais.

Sequenciamento 5. DNA

  1. Sequenciar o plasmídeo utilizando um kit disponível comercialmente sequenciação, os iniciadores que são homólogas a cada uma das extremidades do transposão, e um sistema de análise de sequenciação capilar. Alternativamente, o plasmídeo pode ser enviado para uma instituição fora para o seqüenciamento.
  2. Use o padrão de peso molecular (escada 1 kb) emo gel para estimar o tamanho do plasmídeo. Em seguida, estimar o número de nanogramas (ng) de plasmídeo que é exigido por 50 fmol.
  3. Medir a concentração do ADN do plasmídeo utilizando um espectrofotómetro a comprimentos de onda de 260 nm (A 260) e 280 nm (A280). Assegurar o comprimento do percurso da luz através da cuvete é de 1 cm. Determinar a concentração multiplicando-se a absorvância a 260 nm por 50 ng / ul. DNA de plasmídeo alta qualidade terá um A 260 / A 280 rácio entre 1,8 e 2,0.
  4. O volume de ADN necessário para cada reacção de sequenciação é o número de ng necessária para 50 fmol dividida pela concentração do plasmídeo. Misturar o volume do plasmídeo requerido com água para levar o volume total até 10 ml.
  5. Aquece-se a mistura de ADN de plasmídeo / água a 96 ° C durante 1 min e em seguida arrefecer-lo para a TA.
  6. Adicionar 8 ul de mistura principal a partir do kit de sequenciação e 2 ul de 1,6 uM de um dos iniciadores de sequenciação.
  7. Folbaixo o protocolo do kit de sequenciamento para o programa do termociclador e limpeza reação.
  8. Analise cada amostra, utilizando um sistema de análise de DNA capilar.
  9. Use um pacote de software disponível no mercado para ver a seqüência de DNA. Busca para a sequência ", 5'-GAGACAG-3 '", que é o último 7 pb do transposão (Figura 4). A sequência antes da extremidade 5 'deste segmento de 7 pb pertence ao transposão. A sequência após a extremidade 3 'deste segmento de 7 pb pertence ao gene interrompido.
  10. Determinar a possível função do gene interrompido usando o Básico Local Alignment Search Tool (BLAST) 7,8. Use o seguinte link: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&BLAST_PROGRAMS=megaBlast&PAGE_TYPE=BlastSearch . Cole a sequência da interrupçãogene ed na caixa de consulta, selecione "outros" sob o banco de dados e clique em "BLAST" na parte inferior da página. Quando o resultado aparece, role a página para ver os resultados do alinhamento (Figura 5).

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Representative Results

Transformação de Enterobacter sp. YSU por electroporação com o genoma transposome iniciado inserção aleatória no genoma do hospedeiro (Figura 1A; B). A eletroporação sucesso rendeu vários milhares de transformantes que cresceram em placas LB-kan. Para obter 300-400, colônias por placa bem espaçados, a quantidade de transformação mistura propagação em cada placa de ágar LB-kan foi otimizado. Cada transformante continha pelo menos uma inserção transposon, mas não estava claro se um gene importante para o crescimento em M-9 meio foi interrompida sem triagem por réplica de placas. Os transformantes foram transferidos para placas LB-kan frescos em grades de 88 e réplica semeados em meio M-9. Nota, para garantir que o transposão é mantida nos transformantes, a secção de protocolos recomenda a adição de canamicina para as placas de meio M-9. O meio M-9 não foi suplementado com canamicina neste caso, mas foi ainda possível obter auxotrofos sem ele. Em (Figura 1C). Os outros 86 colónias não tem uma interrupção em um gene que é necessária para o crescimento em M-9 de meio mínimo.

Algumas colônias pode ter sido contaminado com colônias adjacentes durante a réplica de placas. Para isolar um mutante como uma cultura pura, foi riscada da placa de LB-kan número um no Passo 3.1 numa placa de ágar LB-kan fresco e crescidas O / N a 30 ° C. Três colônias que cresceram foram riscadas-se para uma segunda placa LB-kan fresco e crescido O / N a 30 ° C. Em seguida, uma colônia que surgiu a partir de cada uma das três colônias foi flagrado em uma terceira fresco placa LB-kan. Réplica de placas de volta para uma M-9 medi mínimohum placa verificada em triplicado o fenótipo auxotrófico que foi observado na Figura 2. Dos 1.760 transformantes transposon exibidos em um curso de Fisiologia Microbiana 2013, 23 eram auxotrofos.

O gene interrompido a partir de um auxotrofo foi então identificados utilizando resgate do gene. Uma colónia auxotrófica a partir da segunda placa raia acima (Passo 3,13) foi cultivado O / N em meio LB-kan, e o ADN genómico foi purificado a partir da cultura usando um kit de purificação de ADN genómico. Electroforese em gel de agarose mostrou que o ADN purificado foi maior do que 10 kb de tamanho (Figura 3, pista 2). Para quebrar o ADN genómico em fragmentos menores que continham o transposão e flanqueando interrompidos regiões hospedeiras (Figura 1D), que foi parcialmente digerido com 0,025 unidades de UFB IC durante 25 min a 37 ° C. Esta restrição cortes de endonucleases em 5'-GATC-3 'locais que ocorrem aproximadamente a cada 200 a 500 pares de bases. Embora existamsão doze 5'-GATC-3 sítios 'dentro do transposão, um grande número de fragmentos contendo o transposão intacta e flanqueando genoma do hospedeiro ainda estará presente no DNA parcialmente digeridos. A pista 3 da Figura 3 mostra parcialmente ADN genómico digerido com uma mancha de ADN começando acima de 10 kb, todo o caminho para o fundo do gel para abaixo de 0,5 kb. Se a mancha de ADN começa inferior a 2 kb, o tamanho do transposão, em seguida, o ADN foi digerido demais. Será necessária para diminuir a quantidade de enzima adicionado, a 37 ° C tempo de incubação, ou ambos. Se não houver mancha e a faixa com o ADN digerido é do mesmo tamanho que o ADN com o ADN não digerido, então não ocorreu digestão. Será necessário aumentar a quantidade de enzima adicionado, o tempo de incubação de 37 ° C ou ambos. Em vez de usar BFU CI, pode ser possível usar as endonucleases de restrição Bfa I ou Hae III, que corta o transposão em dois e três sítios diferentesrespectivamente. A utilização de uma dessas enzimas podem aumentar a E. coli pir + transformação rendimento durante o resgate gene.

O ADN parcialmente digerido foi ligado numa reacção de 500 ul. Este aumento de volume minimizado interacções entre outros fragmentos de ADN e maximizada a probabilidade de que cada fragmento ligado com si própria para formar uma molécula circular. O DNA ligado foi precipitado e transformada por electroporação em E. coli pir116 ECD100D tensão. A mistura de transformação foi espalhada sobre placas de LB-kan. As colónias que cresceram continha um novo plasmídeo consistindo do transposão e uma região do gene hospedeiro interrompido (Figura 1E). O número de unidades formadoras de colónias variaram de 0 a 2000 por ml da mistura de transformação. Se a região cromossómica de flanqueamento codificava uma proteína que era tóxica para a E. coli hospedeira, a eficiência de transformação foi baixa ou apenas um pequeno segmento da chromoalguns foi associado com o novo plasmídeo. O DNA de plasmídeo foi purificado a partir de uma cultura que foi inoculado com uma única transformante e digerido com a endonuclease de restrição, Xho I, o qual reconhecido um único sítio no centro do transposão próximo da extremidade 5 'do gene de resistência à canamicina. A pista 4 na Figura 3 continha o plasmídeo não digerido e a pista 5 continham o plasmídeo digerido. Uma vez que o DNA de plasmídeo purificado tende a ser super-enrolado, que migraram a uma taxa mais rápida do que a mesma cadeia linear de ADN digerido. O tamanho correcta deste plasmídeo foi de 3 kb. Ele continha 2 kb do transposão, além de cerca de 1 kb do gene hospedeiro interrompida. Se o DNA do hospedeiro que flanqueia contém um ou mais locais de reconhecimento Xho I, duas ou mais bandas de plasmídeo vai ser observada na pista digerido com Xho I de ADN.

A Figura 4 mostra um resultado de sequenciação de um plasmídeo que foi isolado a partir de um auxotrofo. Depois de retirar o shoseqüência transposon rt em negrito, a sequência de DNA do hospedeiro foi submetido a Básico Local Alignment Search Tool (BLAST) 7,8 análise. Um dos resultados do BLAST sugeriu que a sequência interrompida é semelhante a um subsp Enterobacter cloacae. cloacae NCTC 9394 (emb | FP929040.1 |) gene para corismato mutase, que está envolvida na biossíntese de L-tirosina e L-fenilalanina (Figura 5) 13. Por vezes, durante a ligação do ADN genómico digerido parcialmente, o transposão linear ligates a um ou mais outros fragmentos BFU CI. Isto pode tornar o BLAST confusa resulta porque a identidade de um gene muda abruptamente. Por exemplo, os primeiros 41 pares de bases da outra auxotrofo corresponde a um gene para glutamato-5-semialdeído desidrogenase que está envolvida na biossíntese de prolina 1. Em seguida, os próximos 219 pares de bases corresponde a um gene de uma subunidade ribonucleósido-difosfato redutase, seguido de um segmento de par de base 62 para lípido-A-disacc quinase haride. O último segmento de 295 pares de bases corresponde a glutamato-5-semialdeído desidrogenase novamente. A presença de 5'-GATC-3 sítios 'para BFU CI sugeriu que dois fragmentos de ADN menores ligado no plasmídeo resgatado. Deste modo, a diluição do ADN parcialmente digerido para reacções de ligação não elimina completamente o fundo causado pela ligação de fragmentos mais pequenos. A partir destes resultados, concluiu-se que o transposome próprio inserido no gene de glutamato-5-semialdeído desidrogenase porque a sequência por este gene foi imediatamente adjacente ao transposão. Outras interrupções auxotrofos contida no gene para cistationa beta-liase envolvido na biossíntese de metionina; da histidinol-desidrogenase envolvido na biossíntese de histidina; para a fosfatase fosfosserina envolvido em serina, glicina, cisteína e biossíntese; e para reductoisomerase ácido ketol-envolvido em leucina, isoleucina e valina biossíntese 1.

nt "fo: manter-together.within-page =" always "> A Figura 1
Figura 1. A mutagénese Transposon. (A) As células bacterianas que contêm um gene que é necessária para o crescimento em M-9 sais de meio mínimo contendo glucose. O M-9 em caixa representa um gene auxotrófica. (B) A transposome é introduzida na estirpe bacteriana por electroporação, e a proteína transposase ligada a cada extremidade do mosaico (setas) insere aleatoriamente o transposão no cromossoma do hospedeiro 3,4. Apenas os transformantes contendo transposões vai crescer em placas de meio LB-kan. (C) Os transformantes são plaqueadas em réplica M-9 meio contendo glucose e em meio LB-kan. Os transformantes que não conseguem crescer (cruzado) em M-9 meio contendo glicose são auxotrofos. (D) O DNA genômico é purificado a partir das auxotrofos e é parcialmente digerido com o cutt 4-base deer, BFU CI, que reconhece o sítio de ADN, 5'-GATC-3 '. (E) O ADN parcialmente digerido é tratado com ADN-ligase de T4 e transformada por electroporação em E. coli estirpe pir ECD100D para formar um novo plasmídeo que contém o transposão e o gene cromossomal interrompido que é necessária para o crescimento em meio M-9. O gene pir permite fragmentos de ADN circular contendo a origem de replicação R6K γ no transposão para servir como uma origem de replicação no novo plasmídeo 6. O gene de resistência à canamicina serve como um marcador seleccionável para o novo plasmídeo. O plasmídeo é purificado, e uma seqüência pb ~ 500 do gene interrompido é determinado utilizando primers (setas) que são homólogas a cada extremidade do transposon. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.


Figura 2. réplica de placas. (A) Grelha de transformantes que foram transferidos para uma placa de ágar LB-kan. (B) Grelha de transformantes que os mesmos foram transferidos para um M-9 placa de meio. Auxotrofos cresceram nas placas de LB-kan, mas não sobre as placas de meio M-9. Estes são identificados pelos quadrados pretos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A Figura 3
Figura 3. 0,8% do gel de agarose Pista 1: 1. Escada kb. Pista 2: O DNA genómico não digerida. Pista 3: BFU C I parcialmente ADN genómico digerido. Pista 4: não digerida plasma resgatadoid. Pista 5: plasmídeo digerido com Xhol resgatado.

Figura 4
Figura 4. Sequência de DNA parcial de um plasmídeo. A sequência a negrito é parte do transposão e não foi submetida a análise BLAST. O restante da seqüência é um segmento dos genes resgatado do host.

A Figura 5
Figura 5. Análise BLAST 7,8. A partir da primeira base (de consulta), o gene interrompido parece codificar uma corismato mutase Enterobacter cloacae, a qual está envolvida na biossíntese de fenilalanina e tirosina.

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Discussion

Mutagênese Transposon usando um transposome é uma ferramenta eficiente para a geração de auxotrofos em Enterobacter sp. YSU e outros tipos de bactérias Gram negativas e Gram positivas 3,4. O processo foi iniciado pela introdução do Tn 5 transposome -derived no hospedeiro por electroporação. Para identificar as colónias com inserções, a estirpe não transformada alvo teve de ser sensíveis à canamicina, de modo a seleccionar para o marcador de resistência transportado pelo transposon. Alguns hospedeiros produzir endonucleases de restrição que degradam o DNA transposon antes que ele possa recombinar com o genoma do hospedeiro. A adição de um inibidor de endonuclease de restrição para a mistura electroporação pode minimizar a degradação e aumentar o rendimento de transformação 3. Durante a preparação de electroporação bactérias competentes, que era importante para remover o máximo possível de sal para evitar um arco eléctrico ou de faísca que mata as bactérias causado pela presença de sal. Mesmo na ausência deum arco elétrico, as células começaram a morrer rapidamente após chocar-los. Adicionando o sal contendo meio de cultura SOC imediatamente restaurado o equilíbrio osmótico, a morte celular minimizado e aumento da eficiência de transformação 5. Os transformantes resistentes à canamicina foram então manchada sobre uma placa de LB-kan fresco e plaqueadas em réplica a M-9 ágar de meio mínimo. Para evitar o excesso de inoculação que pode causar resultados falsos positivos que perder possíveis auxotrofos, praças de veludo foram trocados no passo 3.6 antes do resto das placas foram inoculadas. Então, durante réplica de placas, apenas bastante pressão foi aplicada para transferir as colônias sem causar manchas ou contaminação entre as colônias adjacentes.

Os genes mutados nos auxotróficos foram identificados por meio de resgate do gene. O DNA genômico de cada auxotrofo foi cortado usando uma digestão parcial com a base freqüente cortador UFB C I. digestões parciais usando Bfa I ou Hae III, que cortar o transposon com menos frequência, pode melhorar a eficiência de transformação transposon. É também possível utilizar uma digestão completa com outras endonucleases de restrição, 6-base e de 8-cortadores de base, que não possuem locais dentro do transposão. O DNA digerido foi então ligado e usado para transformar E. coli ECD100D tensão pir ou ECD100D pir116 6. Embora a E. coli estirpe pir116 foi transformada por electroporação na etapa 4.8, também é possível utilizar células quimicamente competentes. Neste caso, toda a transformação deve ser transmitida para se obter uma selecção de plasmídeos resgatados. O gene pir permite a transposão circularizado para replicar como um plasmídeo de baixo número de cópias, e o gene mutante pir116 lhe permite replicar como um plasmídeo de cópia elevada. Baixos rendimentos de transformação utilizando a estirpe pir116 pode ser devido à expressão de produtos de genes tóxicos a partir do hospedeiro original. A toxicidade pode ser reduzida utilizando o baixo número de cópias pir pode fazer sequenciamento mais desafiador.

Sequenciamento genômico 10 e PCR seqüenciamento 14 são métodos alternativos para resgatar gene. O método de sequenciação genómica sequências que flanqueiam as regiões cromossómicas directamente a partir de DNA genómico purificado. Esta estratégia é útil quando o genoma do organismo alvo já foi sequenciado. Uma vez que a região mutada foi identificado por sequenciação genómica e BLAST, toda a região pode ser amplificado por PCR e clonados para análise posterior. O método de PCR utiliza duas reacções de PCR e quatro iniciadores diferentes. Os primeiros pares de um iniciador de reacção homóloga transposão (iniciador 1) com um iniciador degenerado que contém uma curta de ADN, sequência de ligação (iniciador 2). A segunda reacção de PCR é uma reacção de PCR aninhada, emparelhando outro transposão iniciador homólogo (iniciador 3) com uma sequência ligante do iniciador homólogo (iniciador 4). O sítio de iniciação para o iniciador 3 élocalizado no lado 3 'do sítio de iniciação para o iniciador 1. Em seguida, a partir de amplicand segunda reacção de PCR é limpa e sequenciados. Este método de sequenciação de DNA automatizado amplifica directamente a partir das células mutantes, eliminando a necessidade de purificação de ADN e de ambos o plasmídeo de resgate genómico.

Em vez de identificar genes envolvidos na auxotrofia, mutagénese por transposões também podem ser usadas para estudar outros fenótipos facilmente ensaiados. Enterobacter sp. YSU é uma estirpe bacteriana resistente a multi-metal que é também de 100 ug / ml de ampicilina resistente (dados não publicados). A sua concentração inibitória mínima (MIC) para HgCl2 é de 70 ^ M, ZnCl2 é de 800 uM, AgNO 3 é de 80 uM e 2 é NAASO 14 mM 9. Após a introdução do transposome para esta estirpe e gridding transformantes em placas de LB-kan, as colónias em grade pode ser plaqueadas em réplica médias contendo metais em concentrações inferiores a MIC do presente bactericidaestirpe rial. O resgate e sequenciação de um gene interrompido a partir de um mutante com uma MIC reduzido pode revelar um gene que confere resistência a um destes metais.

Além da geração de mutantes, a transposome pode ser utilizado como um vector in vitro ou in vivo para identificar os genes função do ganho, tais como resistência a antibióticos ou metais. Para a estratégia in vitro, a partir de ADN genómico Enterobacter sp. YSU é digerido com uma endonuclease de restrição que reconhece locais fora do transposão. O DNA foi ligado e misturado com o transposome num tampão contendo Mg 2+. Após a recombinação entre o transposão e fragmentos genómicos aleatórios, E. coli estirpe pir ECD100D é transformada com o DNA e espalhadas em placas contendo ampicilina ou de um sal de metal. As colónias que crescem possuirá um novo plasmídeo que contém o transposão localizado junto ao gene de resistência do hospedeiro. Para o desenvolvimento in vivo rrategy, Enterobacter sp. YSU é transformada com o transposome. Em seguida, toda a reacção de transformação é crescido em LB-kan meio líquido para seleccionar para uma grande parte da população com inserções de transposões aleatórios. O ADN genómico é digerido com uma endonuclease de restrição que reconhece locais fora da transposome, ligados e transformados em E. coli estirpe pir ECD100D. Tal como no método in vitro, os transformantes são espalhadas em placas de ampicilina ou de metal. Novamente, o plasmídeo resultante irá consistir do transposão inserido perto de um gene de resistência. Estas duas estratégias só será bem sucedida se o gene de resistência alvo pode ser expresso e é activo na E. estirpe de E. coli.

Mutagénese de transposões pode ser usado para identificar o número mínimo de genes de uma estirpe bacteriana requer para 15,16 crescimento. Dois transposomes contendo locais loxP e diferentes marcadores de resistência a antibióticos são necessários para essa estratégia ina estirpe bacteriana com uma seqüência do genoma conhecido. Depois de os dois transposões integrar, expressa recombinase cre catalisa uma reacção de recombinação entre os dois sítios loxP, eliminando regiões cromossómicas entre as inserções de transposões. O conhecimento da sequência do genoma faz com que seja possível identificar quais os genes que são eliminados. A capacidade de crescer demonstra que os genes eliminados não são necessários para o crescimento. Esta técnica é um trabalho intensivo, e um genoma mínimo para o crescimento usando esta estratégia ainda não tenha sido concluída. No entanto, um estudo de mutagénese por transposões automatizada de Pseudomonas aeruginosa utilizando PCR, sequenciação estima-se que os genes foram 300-400 requerida para o crescimento desta bactéria em meio rico 14. Este estudo não usar o sistema recombinase loxP / cre.

Micróbios com genomas mínimos são úteis para a biologia sintética 17. A estirpe bacteriana com o mínimo de um genoma é especially útil para eliminar a produção de produtos secundários indesejados. Por exemplo, Clostridium acetobutylicum (C. acetobutylicum) é usado para produzir o biocombustível, butanol 18. Durante o seu crescimento, esta estirpe produz butanol no final da sua fase de crescimento exponencial, pouco antes de entrar na fase estacionária. Neste ponto, torna-se sensível ao butanol e outros produtos de fermentação e forma endospores dormentes que deixem de sintetizam produto. Desde transposomes têm sido usados ​​para estudar Clostridium perfringens 3, pode ser possível utilizar um sistema de transposome / loxP / cre recombinase semelhante para construir uma estirpe de C. acetobutylicum que carece dos genes para produtos de fermentação indesejáveis ​​e esporulação, mas contém genes para maior tolerância butanol. Esta estirpe iria aumentar o rendimento do produto com o mínimo de contaminantes.

Em resumo, este artigo vídeo diário fornece um ste completop por descrição passo dos procedimentos utilizados para criar auxotrofos por mutagênese transposon. Ele cobre a introdução do transposome por eletroporação, triagem de mutações por réplica de placas, resgatando genes mutados por técnicas de clonagem e identificação de genes interrompidos por seqüenciamento de DNA. Esta técnica pode ser usada para identificar a função dos genes desconhecidos ou, possivelmente, para construção de uma estirpe bacteriana que podem ser utilizados num processo industrial.

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Disclosures

O autor não tem nada a divulgar.

Acknowledgments

O autor gostaria de agradecer a todos da minha graduação Pesquisa Independente Estudantes e todos os meus alunos de pós-graduação em Fisiologia Microbiana que testaram as minhas ideias mutagênese transposon durante os semestres 2010-2014 primavera. Este trabalho foi financiado pelo Departamento de Ciências Biológicas da Universidade Estadual de Youngstown.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
EZ-Tn5 R6Kγori/KAN-2 Tnp Transposome Kit Epicentre (Illumina) TSM08KR
EC100D pir+ Electrocompetent E. coli Epicentre (Illumina) ECP09500 Capable of replicating plasmids with an R6Kγ replication origin at a low copy number
EC100D pir-116 Electrocompetent E. coli Epicentre (Illumina) EC6P095H Capable of replicating plasmids with an R6Kγ replication origin at a high copy number
5X M-9 Salts Thermo Fisher DF048517
Lennox LB Broth Thermo Fisher BP1427-2
Agar Amresco, Inc. J637-1KG Solid media contained 1.6% (w/v) agar
Kanamycin Sulfate  Amresco, Inc. 0408-25G When required, media contained 50 μg/ml kanamycin sulfate
D-Glucose Monohydrate Amresco, Inc. 0643-1KG
Yeast Extract Amresco, Inc. J850-500G
Tryptone Amresco, Inc. J859-500G
KCl Sigma-Aldrich P4504-500G
NaCl Amresco, Inc. X190-1KG
MgCl2 Fisher Scientific BP214-500
MgSO2 Fisher Scientific BP213-1
Super Optimal Broth with Catabolite Repression (SOC) medium 0.5% (w/v) yeast extract, 2% (w/v) tryptone, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM MgSO4 and 20 mM Glucose
BfuC I NEB R0636S Partial digestion of genomic DNA
Xho I NEB R0146S Plasmid digestion
T4 DNA Ligase NEB M0202S
Nuclease Free Water Amresco, Inc. E476-1L For dissolving precipitated DNA and restriction endonuclease reactions
GenomeLab DTCS - Quick Start Kit Beckman Coulter 608120 DNA sequencing
Wizard Genomic DNA Purification Kit Promega A1120A
Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System Promega A1460 Plasmid purification
Replica Plating Block Thermo Fisher 09-718-1
Velveteen Squares Thermo Fisher 09-718-2 Replica plating
PetriStickers Diversified Biotech PSTK-1100 Grid for replica plating
Petri Dishes Thermo Fisher FB0875712
Gene Pulser II BioRad Electroporation
Electroporation Cuvettes – 2 mm BioExpress E-5010-2
CentriVap DNA Vacuum Concentrator Labconco 7970010 Drying DNA
CEQ 2000XL DNA Analysis System Beckman Coulter DNA sequencing
Vector NTI Advance 11.5.0 Life Technologies 12605099 DNA sequence analysis

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References

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Microbiologia auxotrofo transposome transposon mutagênese réplica de placas meio mínimo glicose meio complexo,
Geração de<em&gt; Enterobacter</em&gt; Sp. YSU auxotrofos Usando Transposon Mutagênese
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Caguiat, J. J. Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis. J. Vis. Exp. (92), e51934, doi:10.3791/51934 (2014).

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