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Biology

膜蛋白的实时测量:受体相互作用使用表面等离子体共振(SPR)

Published: November 29, 2014 doi: 10.3791/51937

Summary

表面等离子共振(SPR)是一种无标记检测方法,实时生物分子相互作用。在这里,协议的膜蛋白:受体相互作用实验说明,在讨论该技术的优点和缺点。

Introduction

蛋白质 - 蛋白质相互作用(PPI);的形成和蛋白复合物的解离,在许多生物过程( 复制,转录,翻译,信号传导,细胞-细胞通讯)的重要事件。通常执行使用下拉或免疫沉淀实验PPI的半定量研究。但是,这些(以及类似)的技术在相关度的可以测量的范围内(低微摩尔和更高的亲和力)由于在洗涤步骤所固有的这些技术的限制。这种“终点”技术不能识别往往是巨大的生物后果短暂的或低亲和力的互动。此外,这种方法的时间分辨率是非常有限的,通常要比反应的速率较慢的订单。 SPR克服了这些缺点,由于其高度的灵敏度和优异的时间分辨率1,2。 SPR是一种无标记方法,因此分子间相互作用可以测量(只要该质量变化,可以检测出)。除了​​PPI,它已被广泛地用于表征蛋白质-配体,蛋白质-药物(或小分子),蛋白质-DNA和蛋白质-RNA相互作用3-5。结果记录并绘制在实际的时间,这使得实验条件和灵活的实验设计的快速修改。

后面的SPR基于票据的物理原理是测量在传感器表面上的折射率的改变时的质量变化2的光学系统的利用率。之一的相互作用伙伴(以下称配体)被固定到聚合物基质芯片和第二分子(以下称分析物)被流过的表面上。分析物结合至该配体改变在芯片表面的质量。这种质量变化是直接按比例变化有关的表面的折射率。该结果绘于实时和呈现为响应单位(RU),为时间的函数。这样的情节被称为sensogram( 例如图1)。由于SPR如下的相互作用的完整的时间过程中,预平衡动力学速率常数推导,除了平衡亲和力。如下面详细描述的,一个给定的系统的预均衡行为持有多的信息,并且提供了一个非常不同的角度比单独的平衡。一旦系统被校准,实验是非常快的,并且只需要少量的蛋白材料(微克至纳克量)。收集一个给定的系统的完整动力学信息可以在几天来实现。 SPR的高灵敏度的测量能提供使用的任何其它技术6那是不可能的。然而,这种高灵敏度是一个'双刃剑',因为它可以为误报数据的主要来源。影响的反射率的任何因素被记录并绘制在sensogram。因此,APpropriate控制必须用来消除误报,并补充办法支持高度建议。

图1示出使用NTA被覆传感器芯片的SPR实验的进展。在面板A中的sensogram示出了喷射的镍离子在NTA基质(未消减数据),并减去从所述阴性对照细胞产生的信号后面板的BD显示数据。红色和蓝色的箭头表示注射的开始和结束,分别。配位体上的芯片固定逐渐改变质量,直到喷射终止。终止配体的注射后观察到的稳定的高原反映配体与所述表面( 图1B,周期2)的稳定的缔合。一旦一个稳定的基线实现的缓冲器注射在配位体和所述参考单元( 图1B,周期3)。这注射作为'空白对照“,并且将在分析过程中减去。在注射后,小的变化被记录,反映了质量通过芯片的流动。然后在一个单独的循环( 图1B,周期4)中,分析物被注入;在RU的逐步增加代表分析物的关联配体。所述结合位点变得逐渐占据直至达到平衡。只要注射结束后,在个RU的下降反映了复杂的解离。从这样的传感图的预均衡和平衡速率常数可以衍生(见后面)。 图1示出了配体和分析物之间的瞬时相互作用。当该相互作用是更稳定的,在RU水平的下降是比较慢,这反映了较低的kð。

这里,我们描述一个SPR实验旨在表征膜转运(洗涤剂溶解)和它的功能性配偶体之间的相互作用,其同源底物结合蛋白6,7。所选择的MOD埃尔系统是一个ATP结合盒(ABC)转运,Archeaglobus fulgidus的ModBC-A。这个系统被选定为它的高度可重复性的结果,高信噪比,和古典'开/关'速率。此外,同源物ABC转运可作为重要的阴性对照。转运,ModBC(配位体A)中,从使用的洗涤剂,纯化和固定到芯片上的膜萃取。其可溶性互动的合作伙伴,MODA,是分析物。作为阴性对照配体,不同的ABC转运RbsBC被使用(“配体B”)。

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Protocol

1.蛋白质样品和缓冲液准备

  1. 样品制备:纯化目的蛋白,并确保所有聚集体被除去,通过注入实验前的蛋白上的凝胶过滤柱或通过超速离心(通常为10分钟,在100000×g离心就足够了)。
    注:虽然可取,高纯度蛋白制剂不是必须的。 SPR已成功地用于与低于完美纯化,甚至与总提取物8,9。
  2. 缓冲液配制:
    1. 制备实验的缓冲液(称为“运行缓冲液”,或包)。对于这里描述的协议中,使用的50mM的Tris-HCl pH为7.5,150mM的NaCl和0.05%(重量/体积)DDM(正十二烷基β-D-麦芽糖苷)。请记住,缓冲组合物的选择可根据所研究的系统可以容易地进行修改。
    2. 过滤器全部采用0.22微米的过滤器缓冲区和蛋白质样品。确保提前的过滤器是蛋白质兼容。在一般情况下,最近市场上销售的SPR平台包含一个在线脱放气;如果不是这种情况下,解气体之前的缓冲器来使用。
    3. 夜间透析或稀释样品对RB避免缓冲区不匹配。使用高粘度的化学物质时,透析(或缓冲液交换的任何其他方法)是特别可取的( 例如 ,蔗糖,甘油,DMSO)。之前对RB瓶连接至泵入口保持预留的10ml RB的在一个单独的管中。
  3. 稀释浓缩的配位体的库存到的RB对的〜20微克/毫升的最终浓度。作为一个经验法则,对于稳定的配体的固定化,使用低浓度的配体具有更长的注射在低流量,相对于高浓度,高流量和较短的注射。
  4. 稀释分析物进入RB至所需浓度。典型地,测试浓度范围为未知亲和力的系统从10微米至10nM的10倍稀释。总是开始与较低浓度的第一。

2.传感器芯片

  1. 芯片选择:使用次氮基三乙酸(NTA)适于捕获蛋白质与寡组氨酸标签偶联芯片。
  2. 芯片的使用:
    1. 当使用新的芯片,把芯片从鞘,用双蒸水(DDW)轻轻地冲洗,擦干仔细剩余液体用细腻的雨刷器,并确保不要触摸金层的表面。将芯片回其护套以正确的方向(插入是顺畅当芯片被正确放置)。
    2. 当重复使用芯片,取出从缓冲区存储芯片,具有DDW干彻底冲洗轻轻如上所述,并放入原来的护套。
      注:非特异性的垃圾材料的芯片上的累积会影响它的“活力”。这可以通过事先对配体的固定化和后剥离比较的RU进行监测。虽然许多测量可使用相同的芯片NiNTA完成,其长寿的问题不是一个“明确的”,变化很大不同芯片之间。
  3. 芯片对接:打开传感器芯片的门,并把它套芯片。当使用新的芯片,输入在芯片的序列号,以保持使用记录。关好门,然后按'码头芯片“。

3.温度设置

  1. 将芯片的细胞的温度至25℃(或优选的实验温度)。
  2. 可选:设置样品仓至7℃,保持蛋白质整个实验过程中保持稳定。

4.解决方案加载和脱模

准备用于装载和剥离了以下解决方案:为0.5mM的NiCl 2中的RB,350毫摩尔EDTA中的RB(添加洗涤剂至EDTA溶液至终浓度为以RB),0.25%SDS中的H 2 O,和100mM的HCl H中2 O.当使用微型离心机桶ES,而不是SPR指定管,不要忘了切断管帽。

5.总理的SPR仪器与RB

6.启动一个新的运行

  1. 设置将在实验过程中所使用的流速。以获得这里描述的结果设定流量至50μl/分钟。
    注:此参数可在实验过程中进行修改。
  2. 限定流动通道和参考减法。以获得这里描述设置的路径的Fc = 1和Fc = 2,减法FC = 2-1的结果。
    注:该方案将在实时显示两个测量单元的减法。请记住,这个参数不能在实验过程中改变。
  3. 选择合适的样架(它可以影响样品量消耗)。
  4. 保存结果文件。

7.试验周期

每个实验由周期,保持EA做了注射清晰记录CH周期,并分离配位体'装载,该缓冲区的空白注射,并且该分析物注射到不同的周期。

  1. 周期1:芯片的制备和镍负载
    1. 确保流动路径设置根据步骤6.1和6.2。
    2. 注入350毫摩尔EDTA 1分钟洗去剩菜。
    3. 流量设置为10微升/分钟。
    4. 注入0.5毫的NiCl 2 2分钟。
      注:现在,芯片的树脂是由镍离子涂覆。
  2. 周期2:固定的配体
    1. 组流动到15微升/分钟,流动路径的Fc = 2。
    2. 注入配体,直到达到RU值是10-20倍,其分子量。例如,装载的50kDa的配体,以500-1000个RU。不断实现RU值的记录。
    3. 组流动到15微升/分钟,流动路径的Fc = 1。
    4. 注入配体B(对照)达到相同的RU值作为配位体A的监视减法sensogram(FC = 2-1)上线,以帮助控制注射长度。
    5. 集流至50μl/分钟,流动路径的Fc = 1和Fc = 2,洗系统5-20分钟,直到基线(FC = 2-1)稳定。
  3. 周期3:空白注射。该注射将作为空白的减法,因此,包括将与所述分析物被注入,除分析物本身的所有组件。
    注意:注射长度可根据需要达到平衡(信号高原)的时间而变化。
    1. 组流动到15微升/分钟,流动路径的Fc = 1和Fc = 2,FC = 2-1减法。
    2. 将“等待”命令(以下简称为“等待”),30秒(有一个稳定的基线)。
    3. 注入15秒RB。
      注:注射的持续时间将不同的系统之间变化,这取决于他们的预平衡动力学常数(主要是K A)。
    4. 等待120-600秒,记录的解离相。
      注意:该步骤的长度根据不同D:解离的时间越长这个步骤需要的慢。对于很慢解离性复合物( 杀敌 <10 -4-1),等待10-15分钟,然后进行表面再生(见后)。
  4. 周期4:分析物注射液
    1. 复制/粘贴到基准喷射(周期3),以便这两个注射以后可以减去使用的确切条件。在从一个持有对照溶液,以一个保持分析物溶液机架改变槽的位置。选择一个浓度稍预期杀敌以上。如果没有先验知识是可用的,选择1μM作为一个很好的起点。
  5. 周期5:缓冲区注入
    1. 重复循环3。
  6. 周期6:分析物注射液
    1. 重复循环4。
  7. 周期7:芯片剥离
    1. 流量设置为50微升/分钟。</ li>
    2. 注入350毫摩尔EDTA,1分钟。重复此步骤两次。不要使用3分钟的单次注射,因为这可能会损坏芯片。
    3. 注入0.25%SDS中1分钟。重复此步骤两次。不要使用3分钟的单次注射,因为这可能会损坏芯片。
    4. 如果基线水平未达到,注入100毫盐酸,持续1分钟作为附加汽提步骤。
    5. 插入'端运行“命令,切换到待机模式。
  8. 存储芯片
    1. 移除传感器芯片,并把它从仪器中。
    2. 就拿传感器从它的外皮,避免接触到表面,冲洗DDW,并将其放置在50毫升的试管含有RB。保存在4℃。

8.数据分析利用指定的评估软件

  1. 执行以下步骤来处理动力学参数的推导之前通过SPR获得的原始数据。
    1. 使用评估软件,开放结果文件,选择周期3-6 FC = 2-1(参考减去数据)。
    2. 轴位移:
      1. 显示周期3-6。
      2. 零基线(在每个循环中的初始30秒的等待时间),以所有四个曲线的Y轴值。
    3. 对准四条曲线的X轴。选择突出特征( 例如 ,注射开始或结束的尖峰)到完美地对齐沿X轴的四条曲线。置的分析物(或对照缓冲液)开始到零的时间。
  2. 参考减法
    1. 减去通过从周期6的曲线中减去周期3的曲线由周期4和周期5的曲线的曲线使用,可以在Y轴中找到曲线减去操作移动菜单背景的响应。
      注:它执行此步骤,因为它撤销本任何非特异性组分(无关的分析物),可能影响了表面折射率是重要的。
      1. 保存在T减去的曲线他根据不同的名称项目表。
    2. 参阅这些曲线为“双减去曲线”:第一减法是在两个注射进行的2-1减法,和第二个是从另一个曲线的减法。
      注意:这种双重引用是SPR实验的金标准。
    3. 通过像以前一样进行解释的光轴偏移的叠加减去曲线。
  3. 动力学常数和模型拟合的决心
    1. 在进行运动试验
      1. 注入一系列6-7的分析物浓度,以获得可靠的对动力学常数测定的数据。上述由选择的分析物浓度的10倍至10倍低于估计杀敌 ,在2-3倍稀释。包括“零”的浓度,以后用于双参考减法(见上文)。一式三份,并在随机的顺序进行注射。
      2. 对齐和减去所有曲线相对于所述Y轴和X轴尝试模型拟合之前。
    2. 模型拟合
      1. 选择合适的分析程序。
        注意:大多数提供装修方案提供可应用于拟合和决心动力学常数的几种模式。
      2. 应用的最简单的模型(朗缪尔)假设一个可逆1:分析物和配体之间的接头1的相互作用。除非有说服力的数据是从其他的实验方法进行更复杂的相互作用的存在,总是用简单的Langmuir模型。

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Representative Results

在本文所描述的系统中,一个NiNTA芯片被用来固定所述His-标记的膜转运6,7。作为同型二聚体,各转运被双重标记,提高其结合到NiNTA芯片。继镍负载,配体A(感兴趣的转运)被固定在FC = 2,多达〜3500 RU(协议周期2, 图2A黑色标签)。然后,用同样的流量和喷射持续时间,配体B(对照配体)被注射到的Fc = 1,最初仅达到多达〜3000 RU。确保相似的蛋白质的量被固定在这两个流动细胞;配体B进一步加载,使用更短的注入,同时密切监测负荷可达3500个RU。在'楼梯'形状代表每次注射( 图2A灰色标签)在逐渐增加,质量上的Fc = 1。一上线监测的Fc = 2-1有助于控制等于配装图2B展示了FC = 2 -1减法, ,减去在FC = 1的RU值中的Fc = 2最大RU值,从阶梯状递增。它以改变配位体'喷射的持续时间,以实现所研究和控制配位体的相等的加载是重要的。与此相反,注射的分析物时,所述喷射的持续时间必须保持恒定的所有浓度下使用。 图3A3B表明由注入“空白分析物”测得的响应( 即,RB省略仅分析物)在周期3和5,和分析物注射(在周期4和6)。注意,这两种传感图表示在Fc = 2-1减法。在每个周期(3-6)相同的分析物注射(空白或给定浓度)被施加到两个流动的细胞,固定化的具有不同配体。这两个重复叠加得很好,证明SPR的高重复性。的响应被记录在这两种情况下, 〜3 RU的空白与4〜0 RU用于分析物。这些值表示一个信号,以〜13的信噪比。要获得双参考传感图,表示只特异性结合反应,坯注射现在减去从分析物注射(〜37 RU, 图3C)。记录在sensogram揭示了一个短暂的相互作用的特征的图案。在注射后,该协会相的特征在于在配位体结合的分析物的量快速增加,〜在7秒之后达到稳定状态。在稳定状态下保持,只要分析物注入。当注射结束时,细胞用RB触发的解离相。复杂的快速解离,并作为分析物被洗掉由配位体的SPR信号返回至基线。

为了获得定量数据(预平衡和平衡常数),各种分析物浓度注入一式两份或一式三份(见8.3.1协议)。 (K D)的用于图4中所示的ModBC-A相互作用是〜3×10 -6 M,具有适度快K A(〜10 4 M -1-1)和快速杀敌 ( 〜0.1秒-1)。

图1
图1.的使用Ni-NTA传感器芯片的SPR实验的步骤。(一 (B - D)示意图FC = 2-1 sensogram的SPR实验期间记录的。在周期2作为带有His标记的配体注射在镍表面带电,质量逐渐积累。到达最终RU值1,000-5,000 RU之间的范围内(取决于该配体的MW)时注射结束。基线形成,这反映了配体与芯片的稳定结合。在周期3中,空白注射预成形,注射的分析物的样品不含仅分析物的组件。在该注射通常是一个低响应被记录(1-5个RU)。在周期4中的分析物使用相同的机制为空白喷射中喷射。日益增加的RU反映的表面上, ,分析物与配体的结合的质量变化。信号急剧增大,然后高原作为第评估系统达到平衡。当注射结束时,该分析物从所述配体解离,从而导致该信号中的降低,并返回到基线水平。

图2
图2.在配体负载的在线监测。(A)配装的未消减曲线。的兴趣(配位体“A”)的配位体被装载到流动池2(FC = 2,黑色),直到达到所期望的RU级(〜3500 RU在这个例子中)。然后,阴性对照配体(配位体的“B”)是分步进行装载到流动池1(FC = 1,灰色),直到一个相同RU级为止。 (B)在(A)进行两次注射实时为FC = 2-1减法监控。本次监测有利于利益和控制的配体相同的负荷。

“图3”SRC 图3.双击引用。(A)2-1减法重复( FC = 2-1)空白注射。 (B)作为在(A)中,仅分析物注入。 (C)的 (A)所示,从在(B)中所测量的响应中的背景应答的减法后的最终传感图。这些曲线被称为“双冲切”或“双引用”。重复是连续循环。

图4
图由多个分析物浓度注射(一式两份)4.测定动力学速率常数的黑线是用一个简单的1计算的千篇一律:1朗缪尔交互模型。

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Discussion

SPR是一种研究分子相互作用高度敏感的方法,并且经常是,它提供了短暂的(但重要)的相互作用的实时监测的唯一方法。一个例子是瞬时相互作用本文中所呈现,不能由任何其他方法(下拉测定法,脂质体沉淀测定法6)来检测。此外,虽然其他方法被限制为平衡测量(不论数量或质量),SPR是衡量也预平衡动力学的唯一技术之一。

其高度的敏感性也是它的警告。假阳性传感图很容易记录。因此,建议以建立使用尝试SPR测定之前的其他方法的相互作用的存在。该系统的特点先验知识( K 的D粗略的评估,稳定与瞬态交互)是建立SPR experime非常有帮助NTS和评估获得的测量的功能相关。一个重要的问题要记住之前启动SPR测量是蛋白质样品的质量。 SPR是对聚集体高度敏感和这些必须同时从配体和分析物制剂(通过凝胶过滤色谱或超速离心可能时)被除去。噪声和假信号的另一个来源可能来自该RB和分析物的缓冲器之间的缓冲失配。这可以通过透析分析物对的RB,或通过使用一种高度浓缩该稀释许多倍的分析物(〜100-1,000倍)到RB的制剂来解决。假阳性的数据也可能是由于与芯片的基质或与阴性对照分析物的非特异性相互作用。这些相互作​​用是低亲和力的,所以有时可避免使用低分析物浓度。另外,夹杂物低BSA和/或洗涤剂浓度(0.1毫克/毫升和/或0.05的-0.1%(重量/体积),分别地)的RB和所注入的样品的分析物可减少非特异性相互作用。改变所述阴性对照细胞(不同阴性对照)的含量为处理非特异性结合的问题的另一种方法。或者,使用另一种类型的芯片也可以影响数据的质量。是各种传感器芯片市售,基于不同的化学组成。在最常用的传感器芯片(在CM-5芯片)羧甲基化的葡聚糖共价连接到金表面。蛋白质可以使用​​各种非常简单的表面化学性质(最常用的胺或硫醇偶联)共价偶联到传感器表面。然而,在我们手中,与膜蛋白共价固定的工作时,往往会产生伪影,因此不是首选的方法。在研究的膜蛋白的背景下,值得注意的是,有一些涂有亲脂性分子的商业芯片。这使immob膜蛋白的ilization到母语般的环境。类似的传感器芯片,也可以'在家里'做好准备。对于其他耦合方法的描述见10,11。本文所描述的协议是基于使用的Ni-NTA芯片为一His标记,洗涤剂增溶的转运的固定(该分析物是不带His标签的,以避免分析物结合到芯片表面)。根据我们的经验6,12,从与镍NTA芯片进行实验得出的动力学常数与那些在本地般的环境决定的吻合。虽然的Ni-NTA芯片是相对昂贵的,其主要优点是配位体,它们可以被剥离并重新使用。数以百计的测量可以每块芯片来完成。此外,该芯片上的配体的取向是由他的标签的位置来确定,因此是相当均匀的。

一旦相互作用已被成功记录,通过SPR,一系列的控制和REPEATS需要验证的SPR信号的有效性。以下参数验证可能有助于验证数据SRP:

1.特异性的SPR信号的:由于SPR的高灵敏度,使用适当的阴性对照是特别重要的。记录SRP非特异性相互作用可能是由于分析物与基质的吸附。因此,一个空的流动池通常不是最佳的选择,因为装载了蛋白(配体)的流动池不是化学等效于一个空流动池。一个更好的选择是使用该配体的无活性突变体变型中,一个是已知不结合分析物。可替代地,可以使用一个类似的突变分析物。如果这样的突变体是不可用同源蛋白质(但不同的结合特异性的)可用于12。良好的阴性对照实例是同源配体(如这里描述的),或者在已知的相互作用伙伴之一的点突变取消关联。另一推荐的阴性对照是改变一个翻译后修饰( 例如 ,磷酸化,甲基化,硫醇推导)所必需的相互作用的。例如,去磷酸化酪氨酸即对于SH2结构域相互作用至关重要的。其他阴性对照可能是特定的系统。当使用SPR,采用严格的负控制的重要性怎么强调也不过分。

2.重复性的SPR信号:SPR是一个非常可重复的方法。当相等的配体量被装载到生物传感器芯片和分析物的浓度等于被喷射出的重复应完美地对齐( 见图3)。

3.再生系统:在用慢解离速率(K D)的相互作用,所述分析物必须从配位体,同时保留1a的功能和结构完整性剥离tter。如果解离和/或再生的不完备的,SPR信号将逐渐在被分析物的后续注射衰减。典型的再生条件,可以进行测试是高浓度的Mg 2+(高达2μM),酸性或碱性条件( 例如,10毫甘氨酸pH值2.5,10mM的氢氧化钠),高盐(最多4 M氯化钠),或高洗涤剂浓度( 例如 ,1%,DDM)。然而,这些试剂(和其他)的再生效果是高度系统特定,从而再生条件必须进行测试。在一些情况下,相互作用是如此的稳定,并强烈,再生是从未完成,如在大肠杆菌的情况下大肠杆菌维生素B 12的运输系统(BtuCD-F)7。在这种情况下,唯一的选择是剥离从生物传感器芯片的配位体和重新加载的新一批为每次注射。的情况下,从该配体分析物的解离速度快且完成表面再生是不必要(见协议和图2-3)。

4.膜蛋白总是纯化在洗涤剂的存在下,这可能会影响SPR的灵敏度和反应速度。然而,在我们与BtuCD经验,测得的速度是非常相似的。一个始终需要获得使用免费的方法,例如大小排阻层析(SEC)的支持证据,下拉测定法,脂质体沉淀测定法等。例如SPR和其它技术之间的相关性已被证实为蛋氨酸,维生素B 12,和两个钼酸系统6,12。

误判定的动力学速率常数的经常的嵌合过程中就产生了。作为一个经验法则,总是运用简单的朗缪尔1:1相互作用模型进行分析动力学实验。更复杂的模型做出的构象变化,二价分析物或样品异质额外的假设。这些假设应该是仅当通过从其它的实验方法的证据支持制成。需要注意的是将这些车型将最 ​​有可能导致更好的拟合和较低志2的值,但是这不应该被看作是一个见证了其可靠性。较高的自由度由更复杂的模型,得到通常负责的更好拟合,而不是他们的机械相关性。

之一的SPR的一个优点是它的广泛的化学相容性,特别是对于那些用于溶解和纯化膜蛋白的洗涤剂。然而,蔗糖和甘油(和其它粘性溶液),在膜蛋白的纯化过程中常常加入对RU戏剧性的效果。因此,建议如果可能的话,以避免这些,或至少降低其浓度。当使用粘性溶液,避免缓冲区不匹配就显得至关重要了。添加脂质含RB洗涤剂可以放大绑定标志人高达10倍。然而,这种努力是昂贵的(对大多数脂质)并趋于缩短生物传感器芯片的寿命。

上面列出的提示和故障排除可能有助于同时校准一个新的系统。然而,给定的系统通常需要特定的调整( 例如 ,所选择的洗涤剂,盐,pH值),以达到最佳的效果。

SPR一直被认为是一个强大而独特的方法来测量分子间的相互作用。近年来各种SPR平台及其价格下降的可用性取得了SPR更加平易近人。它正迅速成为学习,并在发现铅小分子抑制剂蛋白质 - 蛋白质相互作用,靶蛋白 - 药物相互作用的黄金标准的做法。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biacore T200 GE Healthcare 28-9750-01
Sensor Chip NTA  GE Healthcare 14100532
BIAevaluation GE Healthcare
Biacore T200 Software  GE Healthcare
Nickel chloride Sigma N6136
Sodium tungstate dihydrate Sigma T2629
Sodium Chloride  Bio-Lab LTD. 19030591
Trizma base Sigma T1503
Ethyldiamine-tetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) Sigma E5134
n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside (DDM) Affymetrix D310
Sodium dodecyl sulfate solution  Sigma 05030
Kimwipes KIMTECH Kimberly-Clark 34120
Hydrochloric acid GADOT 7647-01-0
Nylon (NY) Membrane Filter Sartorius 25007--47------N
ModBC ABC transporter Lewinson lab
RbsBC ABC transporter Lewinson lab
ModA Substrate Binding Protein Lewinson lab

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References

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膜蛋白的实时测量:受体相互作用使用表面等离子体共振(SPR)
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Livnat Levanon, N., Vigonsky, E.,More

Livnat Levanon, N., Vigonsky, E., Lewinson, O. Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR). J. Vis. Exp. (93), e51937, doi:10.3791/51937 (2014).

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