Summary
表面プラズモン共鳴（SPR）は、リアルタイムでの生体分子相互作用を検出するためのラベルフリー法である。ここで、膜タンパク質のためのプロトコル：技術の長所と短所を議論しながら、受容体相互作用の実験は、記載されている。
Introduction
タンパク質 - タンパク質相互作用（PPI）タンパク質複合体の形成および解離は、多くの生物学的プロセスにおいて重要な事象（ 例えば 、複製、転写、翻訳、シグナル伝達、細胞間コミュニケーション）である。 PPIの半定量的研究は、多くの場合、プルダウンまたは免疫沈降実験を用いて行われる。しかしながら、これらの（および類似の）技術により、このような技術に固有の洗浄工程に（低マイクロモルより高い親和性）を測定することができる親和性の範囲が限られている。このような「エンドポイント」技術は、多くの場合、大きな生物学的結果のある一過性または低親和性相互作用を同定することはできない。さらに、このようなアプローチの時間分解能は、反応の速度より通常数桁遅い極めて限られている。 SPRは、その高まり感度と優れた時間分解能1,2に、これらの欠点を克服する。 SPRは、ラベルフリーの方法であり、等（質量変化を検出することができる限り、）分子相互作用を測定することができる。 PPIに加えて、広範囲のタンパク質-リガンド、タンパク質-薬物（または小分子）、タンパク質、DNA、およびタンパク質-RNA相互作用3-5を特徴付けるために使用されている。結果は、実験条件と柔軟な実験設計の迅速な変更を可能にする、リアルタイムで記録し、プロットした。
SPRベースの計測器の背後にある物理的原理は、2を変更質量にセンサ表面に屈折率の変化を測定する光学系の利用である。相互作用パートナー（以下、リガンド）の一つは、ポリマーマトリックスチップと第二の分子（以下、分析物）の表面上に流している上に固定されている。リガンドに結合する分析物は、チップ表面上の質量を変化させる。この質量変化は、直接的に比例して表面の屈折率の変化に関連している。結果をリアルタイムでプロットし、時間の関数として応答単位（RU）として提示する。このようなプロットは、センサーグラムと呼ばれる（ 例えば 、 図1）。 SPRは、相互作用の完全な時間経過をたどるので、予め平衡反応速度定数は親和性を平衡に加えて、導出される。以下に詳述されるように、与えられたシステムのプレ平衡挙動は、多くの情報を保持しており、単独の均衡よりも非常に異なる視点を提供します。システムが校正されると、実験は非常に高速であり、タンパク質材料（金額ナノグラムするマイクログラム）を少量しか必要とします。与えられたシステムの完全な運動情報を収集する日で達成することができる。 SPRの高感度は、他の技法6を使用して可能でない測定値が得られる。しかし、この高感度は、偽陽性のデータのための主要な源とすることができるので、「両刃の剣」である。反射率に影響を与える要因を記録し、センサーグラム上にプロットされている。そのような、APとしてpropriateコントロールは、偽陽性を排除するために使用されなければならない、と補完的なアプローチからの支援を強くお勧めします。
図1は NTAでコーティングされたセンサーチップを用いたSPR実験の進行を示している。パネルAのセンソグラムはNTAマトリックス（非サブトラクションデータ）上のニッケルイオンの注入を示し、パネルはBDは、陰性対照細胞由来の信号を減算した後にデータを表示する。赤と青の矢印は、注入の開始と終了を示す。注入が終了するまで、チップ上へのリガンドの固定化は徐々に質量を変化させる。リガンドの噴射の終了後に観察され、安定した高原は、表面へのリガンド（ 図1B、サイクル2）の安定な会合を反映している。安定なベースラインが達成されると、バッファは、リガンド上に注入し、基準セル（ 図1B、サイクル3）。この注射は、「ブランクコントロール」として機能しているであろう分析中に差し引か。注射の際、多少の変更は、チップを通して質量の流れを反映して、記録されている。その後、独立したサイクル（ 図1B、サイクル4）で、分析物を注入されます。 RUの緩やかな増加は、リガンドへの検体の関連を表します。平衡に達するまで、結合部位は、徐々に占有になる。とすぐに注入が終了すると、RUはの低下が複雑なの解離を反映している。予備平衡平衡速度定数を導出することができるようなセンサーグラムから（後述）。 図1は、リガンドとアナライトとの間の過渡的な相互作用を示している。相互作用がより安定しているとき、RUレベルの減少はより低いk dを反映遅い。
ここで、我々は、その同族基質タンパク質6,7結合膜輸送（洗剤が可溶化）とその機能的パートナーとの相互作用を特徴づけることを目的としSPR実験について説明します。選ばれたMODエル·システムは、ATP結合カセット（ABC）トランスポーター、ArcheaglobusのフルギダスのModBC-Aである。このシステムは、信号対雑音比、および古典的な「オン/オフ」速度にその再現性の高い結果が、高信号のために選択した。さらに、同族体ABCトランスポーターが重要な負の対照として役立つために利用可能である。トランスポーター、ModBC（配位子A）がチップ上に精製し、固定化され、界面活性剤を用いて膜から抽出される。その可溶性相互作用パートナー、MODAは、分析対象である。陰性対照リガンドとして、別のABCトランスポーターRbsBCは（「リガンドB」）が使用されている。
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Protocol
1.タンパク質サンプルおよびバッファの準備
- サンプル調製：目的のタンパク質を精製し、ゲルろ過カラムにまたは超遠心分離により、実験前にタンパク質を注入することにより、すべての集計が削除されていることを確認し（100,000 XGが十分で通常10分で）。
注：望ましいが、高純度のタンパク質調製物は必須ではありません。 SPRが正常より少なくより完璧な精製であっても全抽出物の8,9で使用されてきた。 - バッファーの調製：
- （「バッファを実行している」と呼ばれる、またはRB）実験のバッファを準備します。プロトコルは、ここで説明のために、50mMのトリス塩酸pH7.5で、150mMのNaClおよび0.05％（w / v）のDDM（n-ドデシルβ-D-マルトシド）を使用する。緩衝液組成の選択が容易に研究し、システムに応じて変更することができることに留意してください。
- 0.22μmのフィルターを使用してすべてのバッファとタンパク質サンプルをフィルタリングします。フィルタは、タンパク質であることを事前に確認してください互換性。一般に、最近市販SPRプラットフォームは、インライン脱ガッサーを含む。そうでない場合には、脱ガスバッファ使用前。
- 一晩透析またはバッファの不一致を回避するために、RBに対してサンプルを希釈。高粘度（ 例えば 、スクロース、グリセロール、DMSO）の化学物質を使用した場合、透析（または緩衝液交換の他の方法）が特に推奨される。ポンプ入口にRBボトルを接続する前に別のチューブに置いRBの10ミリリットルを保つ。
- 〜を20μg/ mlの最終濃度になるようにRBに濃縮リガンドストックを希釈する。経験則として、安定したリガンド固定化のために、高濃度の、高流量と短い注射とは対照的に、低流量でより長い注射で低リガンド濃度を使用しています。
- 所望の濃度にRBに検体を希釈する。一般的に、10倍希釈で10 nMの10μMから未知の親和性のシステムのための濃度の範囲をテストします。常に開始最初のより低い濃度で。
2.センサーチップ
- チップ選択：三酢酸（NTA）、オリゴヒスチジンタグを有するタンパク質を捕捉するのに適した結合されたチップを使用してください。
- チップの使用状況：
- 新しいチップを使用する場合は、シースからチップを取り出して再蒸留水（DDW）で軽くすすいで、繊細なワイパーを使って慎重に残りの液体を乾燥し、金層の表面に触れないように注意してください。 （チップが適切に配置されたときに挿入がスムーズです）正しい方向に戻す鞘にチップを置きます。
- チップを再利用する場合、バッファから格納されたチップを取り出し、上記のように優しくDDWとドライで十分に洗い流し、そして、元の鞘に入れる。
注：チップ上の非特異的なジャンク材料の蓄積は、その「可能性」を影響を与えることができます。これは、リガンド固定ポストストリッピングする前のRUを比較することによってモニターすることができる。多くの測定が可能ですが同じのNiNTAチップを使用して行わ、その長寿の問題は、「明確な」ものではなく、異なるチップ間で大きく異なる。
- チップドッキング：センサチップのドアを開いて、その鞘にチップを置く。新しいチップを使用する場合は、入力チップのシリアル番号が使用記録を維持する。ドアを押して「ドックチップ」を閉じます。
3.温度設定
- 25°C（または好適な実験温度）チップ電池温度を設定する。
- オプション：実験を通して安定した蛋白質を保つために7℃までのサンプルコンパートメントを設定します。
ロードとストリップ4.ソリューション
H 2 O中RB（RBのように最終濃度にEDTA溶液に洗剤を追加）でRBさ0.5mmのNiCl 2、350 mMのEDTA、0.25％SDS、及びHで100 mMの塩酸：ロードおよびストリッピングのために、以下のソリューションを準備2 O.マイクロ遠心機用浴槽を使用している場合ESとしない指定されたチューブをSPR、チューブのキャップを遮断することを忘れないでください。
5. RBと首相SPR計測器
6.新しいファイル名を指定して実行を開始します
- 実験中に使用される流量を設定する。ここに記載された結果を得るために50μL/分への流れを設定する。
注：このパラメータは、実験中に変更することができます。 - 流路及び基準減算を定義します。ここに記載された結果を得るためにFcが= 1およびFc = 2、減算のFc = 2-1のパスを設定する。
注：このプログラムは、リアルタイムで測定された2つのセルの減算が表示されます。このパラメータは実験中に変更できないことに注意してください。 - 適切な検体ラックを選択し（これは試料容量の消費に影響を与えることができる）。
- 結果ファイルを保存します。
7.実験サイクル
各実験は、EAで行わ注射の明確な記録を保持し、サイクルで構成されているCHサイクル、およびリガンド」のローディング、バッファのブランク注入、および異なるサイクルへの分析物の注入を分離する。
- サイクル1：チップの準備とニッケルのロード
- フローとパスがステップ6.1および6.2に応じて設定されていることを確認。
- 残り物を洗い流すために1分間350 mMのEDTAを注入。
- 10μL/ minに設定の流れ。
- 2分間0.5 mMののNiCl 2を注入。
注：ここでチップ樹脂ニッケルイオンによってコーティングされている。
- サイクル2：固定化リガンド
- 15μL/分、流路のFc = 2に設定の流れ。
- その分子量の10〜20倍であるRU値に到達するまで配位子Aを注入。例えば、500〜1,000のRUに50kDaの体のリガンドをロードします。達成RU値の記録を保管してください。
- 15μlの/分、流路のFc = 1に設定流量。
- 制御しやすくするためにオンライン減算センソグラム（FC = 2-1）を監視するリガンドAのと同じRU値までリガンドB（コントロール）を注入注射の長さ。
- を50μl/分で、流路のFc = 1およびFc = 2に設定されたフローは、ベースラインになるまで5〜20分間システムを洗浄（のFc = 2-1）が安定する。
- サイクル3：ブランク注入。この注入は、分析物自体を除いて、検体と注入されるすべてのコンポーネントが含まれ、したがって、空白の減算に役立つ。
注：注入長さは、平衡（シグナルプラトー）に到達するのに要する時間に応じて変えることができる。- 15μlの/分、流路のFc = 1およびFc = 2は、Fc = 2-1減算に設定流量。
- 30秒間（「待つ」と以後呼ぶ）「待つ」コマンドを挿入します（安定したベースラインを持っている）。
- 15秒RBを注入。
注：注射の継続時間は、それらの前平衡反応速度定数（主にk個のA）に応じて、異なるシステム間で異なります。 - 解離相を記録するために120から600秒待ってください。
注：このステップの長さは、に応じて変化する
- サイクル4：検体注入
- コピー/基準噴射（サイクル3）で使用される正確な条件ので、これら2回の注射を後で減算することができる貼り付けます。検体溶液を保持しているものに制御ソリューションを保持して1からラック内のスロットの場所を変更します。少し期待されるK Dの上にある濃度を選択してください。事前の知識が使用できない場合は、出発点として1μMを選択する。
- サイクル5：バッファインジェクション
- 繰り返しサイクル3。
- サイクル6：検体注入
- 繰り返しサイクル4。
- サイクル7：チップは取り除く
- 50μL/ minに設定の流れ。</ LI>
- 1分間350 mMのEDTAを注入。このステップをさらに2回繰り返します。これは、チップに損傷を与える可能性がある3分の単回注射を使用しないでください。
- 1分間の0.25％SDSを注入。このステップをさらに2回繰り返します。これは、チップに損傷を与える可能性がある3分の単回注射を使用しないでください。
- ベースラインレベルに達していない場合は、追加のストリッピング工程として1分間の100mMのHClを注入する。
- スタンバイモードに切り替わり '末端の実行」コマンドを挿入します。
- チップ収納
- センサチップのドッキングを解除すると、機器の外にそれを取る。
- DDWで洗い流し、表面に触れないように、その鞘からセンサーを取り出し、とRBを含む50 mlチューブ内の場所。 4℃で保存。
指定評価版ソフトウェアを使用して、8データ分析
- 動力学的パラメータの導出前にSPRによって得られた生データを処理するために、次の手順を実行します。
- 評価ソフトウェアを使用して、オープン結果ファイルを選択しサイクル3-6のFc = 2-1（参照は、データを減算）。
- 軸シフト：
- 表示サイクル3-6。
- ゼロすべての4つの曲線のベースライン（各サイクルの最初の30秒の待ち時間）のY軸値。
- 4つの曲線のX軸の位置を合わせます。顕著な特徴を選択してください（ 例えば 、噴射開始または仕上げのスパイクは）完全にX軸に沿って4つの曲線を整列させる。ゼロに分析物（または対照緩衝液）の開始時刻を設定します。
- 参考減算
- サイクル4サイクル6. Y軸のシフトメニューで見つけることができカーブ減算操作の曲線からサイクル5のカーブの曲線からサイクル3の曲線を減算することによってバックグラウンド応答を引く。
注：それは、表面の屈折率に影響を与えた可能性（分析物に関係のない）非特異的要素をannulsとして、この手順を実行することが重要です。- トンで減算曲線を保存彼は別の名前の下に、プロジェクトのシート。
- 「二重に差し引か曲線」として、これらの曲線を参照してください。第1の減算は両方の注射で行わ2-1引き算であり、第二は、別の1の曲線の引き算である。
注：このような二重参照は、SPR実験でのゴールドスタンダードです。 - 前に説明したように軸シフトを行うことにより、減算、曲線オーバーレイ。
- サイクル4サイクル6. Y軸のシフトメニューで見つけることができカーブ減算操作の曲線からサイクル5のカーブの曲線からサイクル3の曲線を減算することによってバックグラウンド応答を引く。
- 動力学定数の決定とモデルフィッティング
- 速度実験を実施
- 反応速度定数の決定のためのデータの信頼性を持っている6-7の検体濃度の一連の注入。 2-3倍希釈で、推定K Dの下に10倍に上記の10倍から分析物の濃度を選択してください。 （上記参照）、後に二重の基準減算に使用される「ゼロ」濃度を、含める。三重でランダムな順序で注射を実施する。
- 整列するモデルフィッティングを試みる前に、Y軸、X軸に対してすべての曲線を減算する。
- モデルフィッティング
- 適切な解析プログラムを選択します。
注：ほとんどの利用可能なフィッティングのプログラムは、フィッティングと反応速度定数の決定のためにも適用することができるいくつかのモデルを提供します。 - 分析対象とフィッティングのためのリガンドとの間の1相互作用：リバーシブル1を想定した最も単純なモデル（ラングミュア）を適用します。説得力のあるデータをより複雑な相互作用の存在を他の実験方法から利用可能である場合を除き、常に単純なラングミュアモデルを使用します。
- 適切な解析プログラムを選択します。
- 速度実験を実施
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Representative Results
本明細書に記載のシステムにおいて、のNiNTAチップは、Hisタグ、膜輸送体6,7を固定するために使用される。ホモ二量体であること、各トランスポーターは、二重のはのNiNTAチップへの結合を改善し、タグ付けされている。ニッケルロード以下、リガンドA（関心のトランスポーター）〜3500 RU（プロトコルサイクル2、 図2A黒ラベル）までは、Fc = 2上に固定されている。その後、同じ流量と噴射時間、配位子B（制御リガンド）を使用することは最初は最大〜3000 RUに達するは、Fc = 1に注入される。類似したタンパク質の量は、両方のフローセルに固定されていることを確認すること。リガンドBは、さらに慎重に3500のRUへの読み込みを監視しながら、短い注入を使用して、ロードされます。 「階段」形状は、各注射（ 図2Aグレーラベル）の際に= 1 Fc上の質量が徐々に増加を表す。 Fcのオンラインモニタリング= 2-1等しいリガンド負荷を制御するのに役立ちます。 図2Bは、FC = 2 -を示している1減算、 すなわち 、Fcを= 1におけるRU値で段階的増分からのFc = 2の最大RU値を減算する。これは、調査し、制御リガンドの等しい負荷を達成するために、リガンド」噴射の持続時間を変化させることが重要である。検体を注入する際は対照的に、注入の持続時間は、使用される全ての濃度は一定に保たれなければならない。 図3は、サイクル3（ すなわち、RBのみ検体を省略）「ブランク検体」を注入することによって測定された応答を示し、 5、及びアナライトの注射（サイクル4および6）。両方のセンサーグラムは、FC = 2-1減算を表すことに注意してください。サイクル（3-6）と同一の検体注入（ブランクまたは与えられた濃度）のそれぞれにおいて、2つのフローセル上に適用される種々のリガンドを固定化した。 2リピートはSPRの高い再現性を実証し、非常によく重ね合わせる。応答は、両方の場合に記録される。 〜4対のブランクのために〜3 RU検体のための0 RU。これらの値は、〜13の信号対雑音比を表す。唯一の特異的な結合応答を表す二重参照さセンサーグラムを、取得するには、ブランク注入は、現在の検体注入（〜37 RU、 図3C）から差し引かれる。記録されたセンソグラムは、過渡相互作用の特徴的なパターンを明らかにする。注射の際に、結合相は、3~7秒後に定常状態に達し、リガンドに結合した分析物の量の急速な増加によって特徴付けられる。定常状態であれば、検体が注入されるように維持される。注入が終了すると、細胞は、RBは、解離相をトリガで洗浄する。複合体は、急速に解離し、検体として離れたリガンドからベースラインまでのSPR信号リターンを洗浄する。
定量的データ（プレ平衡平衡定数）を得るために、分析対象物濃度の範囲は、重複または三連（プロトコル8.3.1を参照）に注入される。
のNi-NTAセンサーチップを用いたSPR実験のステップの図1のイラスト。（A （B - D）SPR実験中に記録されたFc = 2-1センサーグラムのイラスト。彼のタグ付きリガンドとしてサイクル2中のNi-に帯電した表面上に注入され、質量が徐々に蓄積する。 （リガンドのMWに応じて）1,000~5,000 RUの範囲の最終的なRU値に達したときに噴射が終了される。ベースラインは、チップへのリガンドの安定な結合を反映して形成されている。サイクル3では、ブランク注入は、検体を除く検体試料の成分を注入すること、予め形成されている。この注射では、多くの場合、低応答は（1-5のRU）が記録される。サイクル4において、分析物は、ブランク注入と同じ方式を用いて注入される。増加RUは、表面上の質量変化、 すなわち 、リガンドへの分析物の結合を反映している。信号が急激に増加し、その後第としてプラトー電子システムは、平衡に達する。注入が終了すると、分析物はシグナルの低下をもたらす、リガンドから解離し、ベースラインレベルに戻る。
リガンド負荷のライン監視の図2.。（A）リガンドの負荷の非サブトラクションカーブ。関心（配位子「A」）のリガンドは、所望のRUレベル（〜3500 RUこの例では）に到達するまで（黒のFc = 2）セル2を流れるようにロードされる。同一のRUレベルが到達されるまで、陰性対照リガンド（配位子「B」）が段階的フローセル1（のFc = 1、灰色）にロードする。 （B）（A）で行う2回の注射は、Fc = 2-1減算としてリアルタイムで監視。この監視は関心や制御のリガンドの同一のロードを容易にします。
図3.二重参照。ブランク注入の2-1減算（ すなわち 、Fcを= 2-1）の（A）重複。 （B）（A）のように、唯一の検体が注入される。 （C）（B）において測定された応答から（A）に示したバックグラウンド応答を差し引いた後の最終的なセンサーグラム。これらの曲線は、「二重ブランク」または「二重参照」と呼ばれる。重複はシーケンシャルサイクルである。
1ラングミュア相互作用モデル： 図（重複）の複数の分析物濃度の注射により反応速度定数の決定4.黒い線は、単純な1を用いて計算したフィットである。
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Discussion
SPRは、分子相互作用を研究するための高感度な方法であり、多くの場合、一過性の（まだ重要な）相互作用のリアルタイム監視を提供する唯一のアプローチである。例は、他の方法（プルダウンアッセイ、リポソーム沈降アッセイ6）によって検出することができなかった、本明細書に提示過渡相互作用である。他の方法（定量的または定性的のいずれか）の測定値を平衡に制限されながらさらに、SPRはまた、プレ平衡動力学を測定するだけの技術の一つである。
その高められた感度は、その警告である。偽陽性のセンサグラムを容易に記録されている。したがって、SPR測定を行う前に、他の方法を使用して相互作用の存在を確立することをお勧めします。システムの特性の予備知識（一過性の相互作用対安定したK Dの大まかな評価は、）SPR experimeの設定で非常に便利ですNTS及び得られた測定値の機能的関連性を評価する。 SPR測定を開始する前に、心に留めておくべき重要な問題は、タンパク質サンプルの品質です。 SPRは骨材に非常に敏感であり、これらは、リガンドと（ゲルろ過クロマトグラフィーまたは超遠心分離可能による）分析物の製剤の両方から削除する必要があります。ノイズ、偽信号のもう1つの原因は、RBと検体のバッファとの間のバッファの不一致から生じることができる。これは、RBに対して分析物を透析することによって、またはRBに多数倍に希釈された検体（〜100〜1,000倍）の高濃度の製剤を使用することによって解決することができる。偽陽性データは、チップのマトリックスまたは陰性対照と検体との非特異的相互作用から生じ得る。これらの相互作用は、低親和性であるので、時には低い分析物濃度を使用することによって回避することができる。加えて、低BSAおよび/または界面活性剤の濃度（0.1 mg / mlの、および/または0.05を包含）は、それぞれ、（w / v）のRBへと注入された検体試料に0.1％の非特異的な相互作用を減少させることができる。ネガティブ対照細胞（別の陰性対照）の内容を変更すると、非特異的結合の問題に対処するための別のアプローチである。代替的に、チップの他のタイプを使用した場合も、データの品質に影響を与えることができる。センサーチップの種々の異なる化学反応に基づいて、市販されている。最も一般的に使用されるセンサーチップ（CM-5チップ）、カルボキシメチルデキストランに共有結合した金表面に結合される。タンパク質は、共有結合的に、非常に単純な表面化学（最も一般的にはアミン又はチオール結合）のさまざまな方法を使ってセンサー表面に結合することができる。しかし、我々の手で、膜タンパク質の共有結合固定化を操作する場合は、多くの場合、アーチファクトをもたらし、したがって、最適な方法ではない。膜タンパク質の研究の文脈では、親油性分子でコーティングされている商用チップがあることは注目に値する。これらはimmobを有効にネイティブのような環境への膜タンパク質のilization。同様のセンサチップは、また、「家で」製造することができる。他のカップリング方法の説明については、10,11を参照してください。本明細書中に記載されたプロトコルはHisタグ、界面活性剤、可溶化ポーター（検体をチップ表面に結合する分析物を避けるために、Hisタグ化されていない）を固定化するためのNi-NTAチップの使用に基づいている。我々の経験6,12は、Ni-NTAチップが行った実験から得られた速度定数は、天然様の環境で決定されたものとよく一致している。のNi-NTAチップは比較的高価であるが、それらの主な利点は、それらがリガンドを取り除いて再使用することができることである。測定値の何百ものチップごとに行うことができます。また、チップ上のリガンドの配向はhisタグの位置によって決定され、従って、非常に均質である。
相互作用は、正常にSPR、一連の制御とREPEによって記録された後ATSは、SPR信号の妥当性を検証するために必要とされる。以下のパラメータの検証は、SRPデータを検証するために支援することができる。
SPRシグナルの特異性は、1：SPRの高い感度のために、適切な陰性対照の使用は、特に重要である。 SRPによって記録された非特異的な相互作用は、マトリックスへの検体の吸着に起因し得る。タンパク質（リガンド）を装填したフローセルは、化学的に空のフローセルと等価ではないので、したがって、空のフローセルは、多くの場合、最善の選択肢ではない。より良いオプションは、リガンドの不活性突然変異体、分析物を結合しないことが知られているものを使用することである。あるいは、同様に変異した検体を使用することができます。このような変異体が利用可能でない場合、相同タンパク質は（しかし、異なる結合特異性）12を使用することができる。良好なネガティブコントロールの例は、同種リガンド（ここで説明したように）、またはに知られている相互作用パートナーのいずれかの点突然変異である関連付けを廃止する。別の陰性対照推奨相互作用に不可欠な翻訳後修飾（ 例えば 、リン酸化、メチル化、チオール派生）の変化である。例えば、SH2ドメインの相互作用に必須であるチロシンの脱リン酸化。他の陰性対照は、システム特異的であってもよい。 SPRを使用する場合、厳密な陰性対照を使用することの重要性を誇張することはできません。
SPRシグナルの2再現性：SPRは非常に再現性のある方法である。同じリガンド量をバイオセンサーチップ上にロードされ、分析物の濃度に等しい反復は完全に整列するべきで注入される（ 図3参照）。
システムの3再生：ラの機能的および構造的完全性を維持しながら、遅い解離速度（k d）のとの相互作用に、分析物がリガンドから取り除かれなければならないtter。解離および/または再生が不完全である場合には、SPRシグナルは徐々に分析物のその後の注射の際に減衰する。 （2 Mまで）の典型的な再生を試験することができる条件は、Mg 2+の高い濃度で、酸性または塩基性条件（ 例えば、10mMのグリシンpH2.5の、10mMのNaOH）で、高塩（4 MのNaClまで）、または高洗剤濃度（ 例えば 、1％DDM）。しかし、これらの試薬（およびその他）の再生効果が高度にシステム固有であるため、再生の条件がテストされなければならない。いくつかの場合において、相互作用は、再生がEの場合のように、決して完全であるので、安定した強い大腸菌ビタミンB 12輸送システム（BtuCD-F）7。このような条件下では、唯一のオプションは、バイオセンサーチップからのリガンドを除去し、各注射のための新鮮なバッチをリロードすることです。リガンドからの分析物の解離があるケースでは、迅速かつ完全な表面再生が不要である（プロトコルと図2-3を参照）。
前記膜タンパク質は常にSPR感度と反応速度に影響を与えることができる界面活性剤の存在下で精製される。しかし、BtuCDの経験では、測定された速度は非常に似ています。一つは、常に、SPR及び他の技術との間の相関は、メチオニンのために示されている例などのサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）、プルダウンアッセイ、リポソーム沈降アッセイ、無料のアプローチを使用して証拠、ビタミンB 12を支持取得する必要があるそして2モリブデンシステム6,12。
反応速度定数の誤判定がしばしばフィッティングプロセス中に生じる。分析速度実験のために1相互作用モデル：経験則として、常にシンプルなラングミュア1を適用します。より複雑なモデルが立体構造変化、二価分析物、またはサンプル異質の追加の仮定を行う。これらの仮定はあるべき他の実験的アプローチからの証拠によってサポートされている場合のみ行わ。より良いフィッティングと下限カイ2値の意志可能性が最も高い結果、これらのモデルを適用することに注意しますが、これは彼らの信頼性のための証言として見るべきではない。より複雑なモデルによって与えられるより高い自由度ではなく、そのメカニズムの関連性よりも、通常、より良いフィットする責任があります。
SPRの利点の一つは、特に膜タンパク質を可溶化し、精製するために使用される界面活性剤に対するその広範な化学的適合性、である。しかし、多くの場合、膜タンパク質の精製プロセスの間に添加されるスクロース及びグリセロール（および他の粘性溶液）をRUに劇的な効果を有する。したがって、可能な場合は、これらを回避するため、あるいは少なくともその濃度を低減することを推奨します。粘性溶液を使用する場合は、バッファの不整合を回避することが不可欠となる。 RBを含む洗剤に脂質を追加すると、結合記号を増幅することができる限り10倍によるAl。しかし、このような努力は（ほとんど脂質の場合）、高価であり、バイオセンサーチップの寿命を短くする傾向がある。
新しいシステムを較正しながら、上記のヒントとトラブルシューティングが役立つことがあります。しかし、与えられたシステムは、多くの場合、最適な結果を達成するために特定の微調整（界面活性剤、塩、pHを、例えば 、選択）を必要とする。
SPRは、長い分子相互作用を測定するための強力でユニークなアプローチとして認識されている。近年、様々なSPRプラットフォームとその価格下落の可用性は、SPRは、より親しみやすいました。これは、急速に、かつリード小分子阻害剤を発見するタンパク質 - タンパク質相互作用は、標的タンパク質 - 薬物相互作用を研究するための金標準的なアプローチとなってきている。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biacore T200 | GE Healthcare | 28-9750-01 | |
| Sensor Chip NTA | GE Healthcare | 14100532 | |
| BIAevaluation | GE Healthcare | ||
| Biacore T200 Software | GE Healthcare | ||
| Nickel chloride | Sigma | N6136 | |
| Sodium tungstate dihydrate | Sigma | T2629 | |
| Sodium Chloride | Bio-Lab LTD. | 19030591 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Ethyldiamine-tetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma | E5134 | |
| n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside (DDM) | Affymetrix | D310 | |
| Sodium dodecyl sulfate solution | Sigma | 05030 | |
| Kimwipes KIMTECH | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Hydrochloric acid | GADOT | 7647-01-0 | |
| Nylon (NY) Membrane Filter | Sartorius | 25007--47------N | |
| ModBC ABC transporter | Lewinson lab | ||
| RbsBC ABC transporter | Lewinson lab | ||
| ModA Substrate Binding Protein | Lewinson lab |
References
- Rich, R. L., Myszka, D. G. Advances in surface plasmon resonance biosensor analysis. Current Opinion in Biotechnology. 11, 54-61 (2000).
- Rich, R. L., Myszka, D. G. H. igher-throughput label-free, real-time molecular interaction analysis. Analytical Biochemistry. 361, 1-6 (2007).
- Helmerhorst, E., Chandler, D. J., Nussio, M., Mamotte, C. D. Real-time and label-free bio-sensing of molecular interactions by surface plasmon resonance: a laboratory medicine perspective. The Clinical Biochemist Reviews. 33, 161 (2012).
- Kyo, M., et al. Evaluation of MafG interaction with Maf recognition element arrays by surface plasmon resonance imaging technique. Genes to Cells. 9, 153-164 (2004).
- Katsamba, P. S., Park, S., Laird-Offringa, I. A. Kinetic studies of RNA–protein interactions using surface plasmon resonance. Methods. 26, 95-104 (2002).
- Vigonsky, E., Ovcharenko, E., Lewinson, O. Two molybdate/tungstate ABC transporters that interact very differently with their substrate binding proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 110, 5440-5445 (2013).
- Lewinson, O., Lee, A. T., Locher, K. P., Rees, D. C. A distinct mechanism for the ABC transporter BtuCD-BtuF revealed by the dynamics of complex formation. Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 332-338 (2010).
- Kyo, M., Usui-Aoki, K., Koga, H. Label-Free Detection of Proteins in Crude Cell Lysate with Antibody Arrays by a Surface Plasmon Resonance Imaging Technique. Analytical Chemistry. 77, 7115-7121 (2005).
- Mori, T., et al. Evaluation of protein kinase activities of cell lysates using peptide microarrays based on surface plasmon resonance imaging. Analytical Biochemistry. 375, 223-231 (2008).
- Mol, N., Fischer, M. E. Surface Plasmon Resonance Vol. 627 Methods in Molecular Biology. Mol, N. J., Fischer, M. J. E. 1, Humana Press. 1-14 (2010).
- Van Der Merwe, P. A. Surface plasmon resonance. Protein– ligand interactions: hydrodynamics and calorimetry. , Oxford University Press. Oxford. 137-170 (2001).
- Lewinson, O., Lee, A. T., Locher, K. P., Rees, D. C. A distinct mechanism for the ABC transporter BtuCD-BtuF revealed by the dynamics of complex formation. Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 332-338 (2010).
