Summary
سطح مأكل مثل الطحين الرنين (SPR) هو وسيلة خالية من التسمية للكشف عن التفاعلات الحيوية الجزيئية في الوقت الحقيقي. هنا، على بروتوكول لبروتين الغشاء: وصفت التجربة تفاعل مستقبلات، أثناء مناقشة إيجابيات وسلبيات هذه التقنية.
Introduction
تفاعلات البروتين البروتين (PPI)؛ تشكيل والتفكك المجمعات البروتين، هي الأحداث الرئيسية في العديد من العمليات البيولوجية (على سبيل المثال، والنسخ، والنسخ والترجمة والإشارات والاتصالات خلية خلية). وغالبا ما تجرى دراسات شبه الكمية للPPI باستخدام التجارب المناعية هطول الأمطار المنسدلة أو. ومع ذلك، فإن هذه (وما شابهها) التقنيات محدودة في حدود الانتماءات التي يمكن قياسها (منخفض مكرومولي وأعلى النسب) وذلك بسبب خطوات الغسيل التي هي ملازمة لمثل هذه التقنيات. هذه التقنيات "نقطة النهاية" لا يمكن تحديد التفاعلات تقارب عابرة أو المنخفضة التي غالبا ما تكون من العواقب البيولوجية كبيرة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن القرار الزماني لهذه النهج محدودة جدا، وعادة أوامر من حجم أبطأ من معدلات التفاعل. SPR يتغلب على هذه العيوب نتيجة لحالة من الحساسية وقراره الصدغي العلوي 1،2. SPR هي طريقة خالية من التسمية، وعلى هذا النحوويمكن قياس التفاعل الجزيئي (طالما أن يتم الكشف عن التغييرات الكتلة). بالإضافة إلى مؤشر أسعار المنتجين، وقد تم استخدامه على نطاق واسع لوصف البروتين يجند والبروتين المخدرات (أو جزيء صغير)،-DNA والبروتين، وتفاعلات البروتين RNA 3-5. وتسجل النتائج وتآمر في الوقت الحقيقي، والذي تمكن من تعديل السريع للظروف تجريبية والتصميم التجريبي مرونة.
مبدأ المادية وراء أدوات SPR مقرها هو الاستفادة من النظام البصري الذي يقيس تغيير معامل الانكسار على سطح استشعار على تغيير كتلة 2. ويجمد أحد الشركاء التفاعل (الآخرة يجند) على شريحة البوليمر المصفوفة والجزيء الثاني (الآخرة الحليلة) وتدفقت على السطح. الحليلة ملزمة ليجند يغير كتلة على سطح رقاقة. ويرتبط هذا كتلة التغيير مباشرة وبشكل متناسب مع التغيرات في معامل الانكسار من السطح. يتم رسم النتائج في الوقت الحقيقي، وكما عرضت وحدة استجابة (RU) بوصفها وظيفة من الزمن. ويطلق على مثل هذه المؤامرة على sensogram (على سبيل المثال، الشكل 1). منذ SPR يتبع دوام كامل للتفاعل، وتستمد قبل التوازن الثوابت معدل الحركية، بالإضافة إلى التوازن الانتماءات. كما هو مفصل أدناه، سلوك ما قبل توازن نظام معين يحمل الكثير من المعلومات، ويوفر وجهة نظر مختلفة جدا من التوازن وحدها. مرة واحدة يتم معايرة النظام، والتجارب سريعة جدا وتتطلب كميات صغيرة فقط من مادة البروتين (ميكروجرام لنانوغرام كميات). جمع المعلومات الحركية الكاملة لنظام معين لا يمكن أن يتحقق في غضون أيام. حساسية عالية من SPR تتيح القياسات التي لا يمكن استخدام أي تقنية أخرى (6). ومع ذلك، هذه الحساسية العالية هو "سيف ذو حدين" لأنه يمكن أن تكون مصدرا رئيسيا للبيانات إيجابية كاذبة. يتم تسجيل أي عامل يؤثر على مؤشر يعكس وتآمر على sensogram. على هذا النحو، ا ف بيجب استخدام الضوابط مالئمة للقضاء على ايجابيات كاذبة، وينصح للغاية بدعم من نهج تكميلية.
ويوضح الشكل (1) تطور تجربة البرنامج الخاصة باستخدام رقاقة الاستشعار NTA المغلفة. وsensogram في لوحة ويظهر حقن أيونات النيكل على مصفوفة NTA (بيانات unsubtracted)، والألواح BD عرض البيانات بعد طرح إشارة المشتقة من خلية مراقبة سلبية. الأحمر والأسهم الزرقاء تظهر حقن بداية ونهاية، على التوالي. الشلل في يجند على رقاقة يغير تدريجيا كتلة حتى يتم إنهاء الحقن. الهضبة مستقرة لوحظ بعد انتهاء الحقن يجند لتعكس جمعية مستقرة من يجند إلى السطح (الشكل 1B، دورة 2). مرة واحدة يتم التوصل إلى خط الأساس مستقر يتم حقن منطقة عازلة على يجند والخلية المرجعية (1B الشكل، دورة 3) يخدم حقن .هذا ك "السيطرة على بياض"، وسيكونتطرح أثناء التحليل. على حقن، يتم تسجيل التغييرات الطفيفة، مما يعكس تدفق كتلة من خلال رقاقة. ثم في دورة منفصلة (1B الشكل، ودورة 4)، يتم حقن الحليلة. الزيادة التدريجية في RU تمثل جمعية الحليلة ليجند. مواقع الربط تصبح احتلت تدريجيا حتى يتم التوصل إلى التوازن. حالما ينتهي الحقن، وانخفاض البرازيلية يعكس تفارق المجمع. من مثل sensograms قبل التوازن، والتوازن الثوابت معدل يمكن أن تستمد (انظر لاحقا). الشكل 1 يصور التفاعل عابرة بين يجند وتحليلها. عندما يكون التفاعل أكثر استقرارا، وانخفاض في مستوى RU أبطأ، ما يعكس انخفاض ك د.
هنا، نحن تصف تجربة البرنامج الخاصة التي تهدف إلى تحديد خصائص التفاعل بين نقل الغشاء (المنظفات تذوب) وشريك وظيفية لها، ركيزة لها وما شابه ذلك البروتين 6،7 ملزمة. وزارة الدفاع المختارنظام ايل هو ATP كاسيت ملزمة (ABC) نقل، ModBC-A من Archeaglobus fulgidus. وقد تم اختيار هذا النظام لنتائجها استنساخه للغاية، إشارة إلى ارتفاع نسبة الضوضاء، والكلاسيكية "تشغيل / إيقاف" أسعار الفائدة. بالإضافة إلى ذلك، تتوفر لخدمة ضوابط السلبية أهمية عن النقل المتماثلات ABC. الناقل، يتم استخراج ModBC (يجند A) من الغشاء باستخدام المنظفات وتنقيته وثبتوا على رقاقة. من ذوبان شريك التفاعل، مودا، هو الحليلة. كعنصر تحكم يجند سلبي، يتم استخدام مختلف RbsBC نقل ABC ("يجند B").
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. عينة البروتين وإعداد العازلة
- نموذج إعداد: تنقية البروتينات من الفائدة وتأكد من إزالة جميع الركام، عن طريق حقن البروتين قبل التجربة على عمود هلام الترشيح أو عن طريق تنبيذ فائق (عادة 10 دقيقة في 100،000 x ج كافية).
ملاحظة: على الرغم من المرغوب فيه، والأعمال التحضيرية البروتين النقي للغاية ليست لا بد منه. تم SPR استخدمت بنجاح مع التنقيات أقل من الكمال، وحتى مع إجمالي استخراج 8،9. - إعداد العازلة:
- إعداد المخزن المؤقت للتجربة (وهو ما يسمى "تشغيل عازلة"، أو RB). لبروتوكول الموصوفة هنا، استخدم 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 7.5، 150 مم كلوريد الصوديوم و 0.05٪ (ث / ت) DDM (ن-دوديسيل β-D-مالتوزيد). نضع في اعتبارنا أن اختيار تركيبة عازلة يمكن تعديلها بسهولة وفقا لنظام دراستها.
- تصفية جميع المخازن وعينات البروتين باستخدام مرشحات 0.22 ميكرون. تأكد مقدما أن المرشحات بروتينمتوافقة. بشكل عام، ومنصات SPR تسويقها مؤخرا تحتوي على دي جاسر في الخط؛ إذا لم تكن هذه هي الحالة، الغاز دي المخازن المؤقتة السابقة للاستخدام.
- Dialyze بين عشية وضحاها أو تمييع عينات ضد RB لتجنب عدم التطابق العازلة. غسيل الكلى (أو أي طريقة أخرى لصرف عازلة) ينصح وخاصة عند استخدام المواد الكيميائية من اللزوجة العالية (على سبيل المثال، والسكروز، الجلسرين، DMSO). قبل توصيل زجاجة RB إلى مدخل المضخة تبقي جانبا 10 مل من RB في أنبوب منفصل.
- تمييع الأسهم يجند المركز إلى RB إلى تركيز النهائي من ~ 20 ميكروغرام / مل. وكقاعدة عامة من الإبهام، لمستقر تجميد يجند، واستخدام تركيزات منخفضة يجند مع حقن أطول في التدفق المنخفض، بدلا من تركيزات عالية، وتدفق عالية وحقن أقصر.
- تمييع الحليلة في RB إلى التركيز المطلوب. عادة، اختبار مجموعة من تركيزات لنظام تقارب غير معروف من 10 ميكرومتر إلى 10 نانومتر في التخفيفات عشرة أضعاف. تبدأ دائمامع انخفاض تركيزات أولا.
2. رقاقة الاستشعار
- اختيار رقاقة: استخدام nitrilotriacetic الحمضيه (NTA) رقاقة بالإضافة مناسبة لالتقاط البروتينات مع علامة، بنسبة ضئيلة الحامض الاميني.
- استخدام رقاقة:
- عند استخدام شريحة جديدة، واتخاذ رقاقة الخروج من غمد، وشطف بلطف بالماء المقطر مزدوج (DDW)، تجف من السوائل المتبقية بعناية باستخدام ممسحات الحساسة، والتأكد من عدم لمس سطح طبقة الذهب. وضع رقاقة مرة أخرى إلى غمده في الاتجاه الصحيح (والإدراج على نحو سلس عندما يتم وضع رقاقة بشكل صحيح).
- عندما إعادة استخدام شريحة، واخراج رقاقة تخزينها من المخزن المؤقت، وشطف جيدا مع أحواض دبي الجافة العالمية والجافة بلطف كما ذكر أعلاه، ومكان في غمد الأصلي.
ملاحظة: تراكم المواد غير المرغوب فيه غير محددة على رقاقة يمكن أن تؤثر في 'جدوى'. هذا يمكن رصدها من خلال مقارنة روس قبل تجميد يجند وبعد تجريد. على الرغم من العديد من القياسات يمكن أن يكونيتم ذلك باستخدام نفس NiNTA رقاقة، قضية طول العمر ليست "واضحة المعالم" وتختلف اختلافا كبيرا بين رقائق مختلفة.
- رقاقة لرسو السفن: فتح الباب رقاقة الاستشعار ووضع رقاقة في غمده. عند استخدام شريحة جديدة، والرقم التسلسلي إدخال رقاقة للحفاظ على سجل الاستخدام. أغلق الباب واضغط على "رقاقة قفص الاتهام".
3. ضبط درجة الحرارة
- ضبط درجة الحرارة خلية رقاقة إلى 25 درجة مئوية (أو درجة حرارة التجربة المفضلة).
- اختياري: تعيين مقصورة عينات إلى 7 ° C للحفاظ على البروتينات مستقرة في كافة مراحل التجربة.
4. حلول لتحميل وتجريد
إعداد الحلول التالية لتحميل وتجريد: 0.5 ملي NiCl 2 في RB، 350 ملي EDTA في RB (إضافة المنظفات لحل EDTA إلى التركيز النهائي كما هو الحال في RB)، 0.25٪ SDS في H 2 O، و 100 ملم حمض الهيدروكلوريك في H 2 O. عند استخدام الحوض الصغير الطرد المركزيوفاق وليس SPR أنابيب المعينة، لا تنسى أن قطع قبعات من الأنابيب.
5. رئيس الصك SPR مع RB
6. بدء تشغيل جديد
- ضبط معدل تدفق التي سيتم استخدامها أثناء التجربة. للحصول على النتائج الموضحة هنا ضبط تدفق إلى 50 ميكرولتر / دقيقة.
ملاحظة: يمكن تعديل هذه المعلمة أثناء التجربة. - تحديد مسارات تدفق والطرح المرجعية. للحصول على النتائج الموضحة هنا تعيين مسارات التيسير = 1 و FC = 2 والطرح التيسير = 2-1.
ملاحظة: سيقوم البرنامج عرض في الوقت الحقيقي الطرح خليتين قياسها. نضع في اعتبارنا أن هذه المعلمة لا يمكن تغييرها أثناء التجربة. - اختيار العينة رف مناسب (أنها يمكن أن تؤثر على استهلاك حجم العينة).
- حفظ الملف النتائج.
7. دورات تجربة
ويتكون كل تجربة من دورات، الاحتفاظ بسجل واضح لحقن به في EAدورة الفصل، والفصل بين تحميل وبروابط، حقن فارغة في المخزن المؤقت، وحقن تحليلها في دورات مختلفة.
- دورة 1: إعداد رقاقة والنيكل تحميل
- تأكد من ضبط تدفق والمسارات وفقا للخطوة 6.1 و 6.2.
- ضخ 350 ملي EDTA لمدة 1 دقيقة ليغسل بقايا الطعام.
- ضبط تدفق إلى 10 ميكرولتر / دقيقة.
- ضخ 0.5 ملي NiCl 2 لمدة 2 دقيقة.
ملاحظة: الآن وهي مغلفة الراتنج رقاقة من أيونات النيكل.
- دورة 2: بروابط تجميد
- تدفق مجموعة إلى 15 ميكرولتر / دقيقة، ومسار تدفق التيسير = 2.
- حقن يجند وحتى الوصول إلى القيم RU التي هي 10-20 أضعاف وزنه الجزيئي. على سبيل المثال، تحميل ليجند من 50 كيلو دالتون إلى 500-1،000 البرازيلية. الاحتفاظ بسجل من قيمة RU تحقيقها.
- تدفق مجموعة إلى 15 ميكرولتر / دقيقة، ومسار تدفق التيسير = 1.
- حقن يجند ب (مراقبة) ما يصل إلى نفس القيمة RU كما ان من يجند A. مراقبة sensogram الطرح (FC = 2-1) على الخط لمساعدة في السيطرة علىطول الحقن.
- تدفق مجموعة إلى 50 ميكرولتر / دقيقة، ومسار تدفق التيسير = 1 و FC = 2، وغسل نظام 5-20 دقائق حتى خط الأساس (FC = 2-1) تستقر.
- دورة 3: حقن فارغ. هذا وسوف حقن مناصبهم لالطرح فارغة، وبالتالي تشمل كافة المكونات التي سيتم حقنها مع الحليلة، باستثناء الحليلة نفسها.
ملاحظة: طول حقن يمكن أن تختلف اعتمادا على الوقت الذي يستغرقه للوصول إلى التوازن (إشارة الهضاب).- تدفق مجموعة إلى 15 ميكرولتر / دقيقة، ومسار تدفق التيسير = 1 و FC = 2، التيسير = 2-1 الطرح.
- إدراج الأمر "الانتظار" (يشار إليها فيما يلي باسم 'الانتظار') لمدة 30 ثانية (أن يكون لها خط الأساس مستقر).
- ضخ 15 ثانية RB.
ملاحظة: إن مدة الحقن تختلف بين أنظمة مختلفة، اعتمادا على ما قبل التوازن الثوابت الحركية الخاصة بهم (ومعظمهم من ك أ). - الانتظار 120-600 ثانية لتسجيل مرحلة التفكك.
ملاحظة: طول هذه الخطوة يختلف وفقا ل
- دورة 4: حقن الحليلة
- نسخ / لصق الظروف المحددة المستخدمة في الحقن المرجعية (دورة 3) لذلك هذه الحقن اثنين يمكن أن تطرح في وقت لاحق. تغيير مكان فتحة في رف واحد من عقد الحل سيطرة لأحد أن يحمل الحل تحليلها. اختيار تركيز هذا هو أعلى قليلا من K D المتوقع. إذا لم يكن هناك معرفة سابقة هي المتاحة، اختر 1 ميكرومتر كنقطة انطلاق جيدة.
- دورة 5: حقن العازلة
- كرر دورة 3.
- دورة 6: حقن الحليلة
- كرر دورة 4.
- دورة 7: تشيب تجريدها
- ضبط تدفق إلى 50 ميكرولتر / دقيقة. </ لى>
- ضخ 350 ملي EDTA لمدة 1 دقيقة. كرر هذه الخطوة مرتين أخريين. لا تستخدم حقنة واحدة من 3 دقائق لأن ذلك قد يؤدي إلى تلف رقاقة.
- ضخ 0.25٪ SDS لمدة 1 دقيقة. كرر هذه الخطوة مرتين أخريين. لا تستخدم حقنة واحدة من 3 دقائق لأن ذلك قد يؤدي إلى تلف رقاقة.
- إذا لم يتم التوصل إلى مستوى خط الأساس، وضخ 100 ملم حمض الهيدروكلوريك لمدة 1 دقيقة كخطوة تجريد إضافية.
- إدراج الأمر "نهاية المدى" أن بالتبديل إلى وضع الاستعداد.
- تخزين رقاقة
- إرساء رقاقة الاستشعار وإخراجها من الصك.
- خذ استشعار الخروج من غمده، وتجنب لمس السطح، وشطف مع أحواض دبي الجافة العالمية، ومكان في أنبوب 50 مل تحتوي على RB. تخزينها في 4 ° C.
8. تحليل البيانات باستخدام مخصصة للبرامج التقييم
- نفذ الخطوات التالية لمعالجة البيانات الخام التي تحصل عليها SPR قبل اشتقاق المعلمات الحركية.
- باستخدام برنامج التقييم، مفتوحةملف النتائج، حدد دورات 3-6 التيسير = 2-1 (المرجع تطرح البيانات).
- محور التحول:
- دورات عرض 3-6.
- الصفر قيمة Y-محور خط الأساس (30 ثانية وقت الانتظار الأولي في كل دورة) لجميع المنحنيات الأربعة.
- محاذاة محور X- من المنحنيات الأربعة. اختيار الميزات وضوحا (على سبيل المثال، والمسامير من بداية الحقن أو النهاية) لمحاذاة تماما منحنيات أربعة على طول محور X. ضبط الوقت من بداية الحليلة (أو عازلة السيطرة) إلى الصفر.
- إشارة الطرح
- طرح استجابة الخلفية من خلال طرح منحنى دورة 3 من منحنى دورة 4 ومنحنى دورة 5 من منحنى دورة 6. استخدام العملية منحنى الطرح التي يمكن العثور عليها في المحور Y القائمة التحولات.
ملاحظة: من المهم لتنفيذ هذه الخطوة لأنه يلغي أي مكونات غير محددة (لا علاقة لها الحليلة) التي ربما تكون قد أثرت على مؤشر الانكسار السطح.- حفظ منحنيات تطرح في تيكان ورقة المشروع تحت اسم مختلف.
- الرجوع إلى هذه المنحنيات باسم "منحنيات طرح مضاعف": الطرح الأول هو الطرح 2-1 أجريت على كل من الحقن، والثاني هو الطرح من منحنى واحد من آخر.
ملاحظة: هذا المراجع مزدوج هو معيار الذهب في التجارب SPR. - تراكب منحنيات تطرح عن طريق إجراء تحول محور كما هو موضح من قبل.
- طرح استجابة الخلفية من خلال طرح منحنى دورة 3 من منحنى دورة 4 ومنحنى دورة 5 من منحنى دورة 6. استخدام العملية منحنى الطرح التي يمكن العثور عليها في المحور Y القائمة التحولات.
- تحديد حركية الثوابت ونموذج المناسب
- إجراء التجربة الحركية
- حقن سلسلة من 6-7 تركيزات حليلة أن يكون موثوقة من البيانات لتحديد الثوابت الحركية. اختر تركيزات تحليلها من 10 أضعاف فوق إلى 10 أضعاف أقل من المقدر K D، في التخفيفات 2-3 أضعاف. تشمل "الصفر" التركيز، واستخدامها لاحقا لمضاعفة الطرح المرجعية (انظر أعلاه). إجراء الحقن في يثلث وبترتيب عشوائي.
- محاذاةوطرح كل المنحنيات فيما يتعلق Y-محور ومحور X-قبل محاولة النموذج المناسب.
- تركيب نموذج
- تحديد برنامج تحليل مناسب.
ملاحظة: معظم برامج تركيب المتاحة تقدم العديد من النماذج التي يمكن تطبيقها لتركيب وتحديد الثوابت الحركية. - تطبيق أبسط نموذج (انجميور) بافتراض عكسها 1: 1 التفاعل بين الحليلة ويجند للتركيب. ما لم إقناع البيانات يتوفر من وسائل تجريبية أخرى عن وجود تفاعل أكثر تعقيدا، ودائما استخدام نموذج انجميور بسيط.
- تحديد برنامج تحليل مناسب.
- إجراء التجربة الحركية
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في النظام الموصوفة هنا، يتم استخدام رقاقة NiNTA لشل حركة نقل غشاء صاحب الموسومة 6،7. كونه وطي-ديمر، هي المعلمة كل نقل مضاعف، وتحسين لها صفة الإلزام للرقاقة NiNTA. التالية النيكل التحميل، يجند ألف (نقل من الفائدة) وثبتوا على التيسير = 2، وتصل إلى ~ 3،500 RU (دورة بروتوكول 2، الشكل 2A التسمية السوداء). ثم، وذلك باستخدام نفس تدفق ومدة الحقن، ويجند B (يجند السيطرة) يتم حقن على التيسير = 1، حيث بلغت في البداية فقط ما يصل الى ~ 3،000 RU. للتأكد من أن كميات البروتين مماثلة وثبتوا على كل من الخلايا التدفق؛ يجند B يتم تحميل أبعد من ذلك، باستخدام حقن أقصر، في حين رصد دقيق لتحميل ما يصل إلى 3،500 البرازيلية. شكل "الدرج" يمثل زيادة تدريجية في الكتلة على التيسير = 1 على كل حقنة (الشكل 2A التسمية الرمادية). للرصد على الانترنت من التيسير = 2-1 يساعد على السيطرة على قدم المساواة يجند التحميل. الشكل 2B يدل على التيسير = 2-1 الطرح، أي طرح قيمة RU القصوى في التيسير = 2، من زيادات تدريجية في قيمة RU في التيسير = 1. من المهم أن تختلف مدة الحقن يغاندس "لتحقيق المساواة للتحميل بروابط التحقيق فيها والسيطرة عليها. في المقابل، عندما حقن الحليلة، يجب أن تبقى مدة الحقن المستمر لجميع التركيزات المستخدمة. 3A الشكل وتظهر 3B الردود قياسها عن طريق حقن "الحليلة فارغة" (أي، RB الاستغناء فقط الحليلة) في دورات و3 5، وحقن الحليلة (في دورات 4 و 6). لاحظ أن كلا sensograms تمثل التيسير = 2-1 الطرح. في كل دورة من دورات (3-6) حقنة تحليلها متطابقة (فارغة أو تركيز معين) يتم تطبيقها على تدفق الخلايا اثنين، وثبتوا مع بروابط مختلفة. يكرر اثنين يطغى بشكل جيد للغاية، مما يدل على استنساخ عالية من SPR. يتم تسجيل رد في كل الحالات؛ ~ 3 RU لالفراغ مقابل 4 ~0 RU لتحليلها. هذه القيم تمثل إشارة إلى نسبة الضوضاء من ~ 13. للحصول على sensograms نقرا مزدوجا المشار إليها، ويمثل استجابة ملزمة معينة فقط، يتم طرح حقن فارغة الآن من حقن الحليلة (~ 37 RU، الشكل 3C). وsensogram سجلت يكشف عن نمط مميز من التفاعل عابر. على الحقن، وتتميز المرحلة جمعية من الزيادة السريعة في كمية محددة يجند تحليلها، ليصل إلى حالة مستقرة بعد ~ 7 ثوان. يتم الحفاظ على حالة الاستقرار طالما يتم حقن الحليلة. عند إنهاء حقن، يتم غسلها الخلايا مع RB التسبب في مرحلة التفكك. مجمع تنأى بسرعة، وكما الحليلة يتم غسل بعيدا عن يجند العوائد إشارة SPR الى الاساس.
للحصول على البيانات الكمية (ما قبل التوازن وثوابت التوازن)، يتم حقن مجموعة من تركيزات تحليلها في مكررة أو يثلث (انظر 8.3.1 في البروتوكول).
الشكل 1. توضيحات من الخطوات من تجربة البرنامج الخاصة باستخدام رقاقة الاستشعار ني NTA. (A (B - D) توضيحات من التيسير = 2-1 sensogram سجلت خلال تجربة البرنامج الخاصة. في دورة 2 كما يجند له الموسومة يتم حقن على سطح ني المشحونة، كتلة يتراكم تدريجيا. يتم إنهاء حقن عند الوصول إلى القيمة النهائية RU تتراوح ما بين 1،000-5،000 RU (اعتمادا على MW يجند ل). يتم تشكيل خط الأساس، مما يعكس الربط مستقرة من يجند إلى الرقاقة. في دورة 3، بريفورميد حقنة فارغة، حقن مكونات العينة المراد تحليلها باستثناء فقط الحليلة. في هذه الحقن في كثير من الأحيان يتم تسجيل استجابة منخفضة (1-5 RUS). في دورة 4 يتم حقن الحليلة باستخدام النظام نفس حقن فارغة. روس زيادة تعكس التغيير الشامل على السطح، أي الربط الحليلة ليجند. إشارة يزيد بسرعة ثم الهضاب كما النظام البريد يصل إلى التوازن. عندما ينتهي الحقن، والحليلة تنأى من يجند، مما أدى إلى انخفاض في إشارة والعودة إلى مستويات خط الأساس.
الشكل 2. مراقبة خط التحميل يجند. (A) منحنيات Unsubtracted من يجند التحميل. يتم تحميل يجند الفائدة (يجند "A") في التدفق الخلوي 2 (FC = 2، أسود) حتى تصل إلى مستوى RU المطلوب (~ 3،500 RU في هذا المثال). ثم، سيطرة يجند سلبي (يجند "B") هي محملة خطوة حكيمة على تدفق خلية 1 (FC = 1، الرمادي) حتى مستوى RU متطابقة يتم التوصل إليه. (B) والحقن اثنين أجريت في (A) رصدها في الوقت الحقيقي باعتبارها التيسير = 2-1 الطرح. هذا الرصد يسهل تحميل متطابقة من بروابط المصالح والسيطرة.
الشكل 3. المراجع مزدوج. (A) التكرارات من 2-1 الطرح (أي التيسير = 2-1) من حقن فارغة. (B) كما في (A)، يتم حقن تحليلها فقط. (C) sensograms النهائي بعد الطرح للاستجابة الخلفية هو مبين في (A) من رد محسوب في (B). ويشار إلى هذه المنحنيات على أنها "ضعف مموها" أو "المشار إليها ضعف". التكرارات هي دورات متتابعة.
. الشكل 4. تحديد الثوابت معدل الحركية عن طريق الحقن من تركيزات تحليلها متعددة (في التكرارات) والخطوط السوداء هي نوبات التي تم حسابها باستخدام بسيط 1: 1 انجميور نموذج التفاعل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
SPR هو وسيلة حساسة للغاية لدراسة التفاعلات الجزيئية، وغالبا ما يكون النهج الوحيد الذي يوفر رصد في الوقت الحقيقي من عابر (بعد مهمة) التفاعلات. ومن الأمثلة على ذلك التفاعل عابرة المقدمة في هذه الوثيقة، التي لا يمكن الكشف عنها بواسطة أي وسيلة أخرى (المقايسات المنسدلة، الجسيمات الشحمية الترسيب المقايسات 6). وعلاوة على ذلك، في حين أساليب أخرى تقتصر على التوازن القياسات (سواء الكمية أو النوعية)، SPR هي واحدة من تقنيات الوحيدة التي تقيس أيضا حركية قبل التوازن.
في حالة من الحساسية هي أيضا التحذير به. وتسجل sensograms إيجابية كاذبة بسهولة. لذا فمن المستحسن أن إثبات وجود التفاعل باستخدام أساليب أخرى قبل محاولة القياسات SPR. معرفة مسبقة من خصائص النظام (تقييم تقريبي للK D، مستقرة مقابل التفاعل عابرة) هي مفيدة جدا في إنشاء SPR experimeاليلة وتقييم أهميتها الوظيفية من القياسات التي تم الحصول عليها. قضية مهمة أن نأخذ في الاعتبار قبل البدء القياسات SPR هي نوعية العينات البروتين. SPR حساس للغاية لوحدات العمل وهذه يجب إزالتها من كل من يجند والاستعدادات الحليلة (عن طريق الترشيح هلام اللوني أو تنبيذ فائق عندما يكون ذلك ممكنا). مصدر آخر من الضوضاء وإشارات خاطئة قد تنبع من عدم التطابق عازلة بين RB وعازلة للالحليلة. ويمكن حل هذه من قبل dialyzing الحليلة ضد RB، أو باستخدام إعداد عالية التركيز من الحليلة الذي المخفف العديد من طيات (~ 100-1،000 أضعاف) في RB. يمكن للبيانات إيجابية كاذبة أيضا ينتج من التفاعلات غير محددة من الحليلة مع مصفوفة رقاقة أو مع سيطرة سلبية. هذه التفاعلات هي منخفضة تقارب، حتى في بعض الأحيان يمكن تجنبها عن طريق استخدام تركيزات منخفضة تحليلها. وبالإضافة إلى ذلك، إدراج منخفض BSA و / أو تركيزات المنظفات (0.1 ملغ / مل و / أو 0.05-0.1٪ (ث ت /)، على التوالي) إلى RB والعينة المراد تحليلها حقن يمكن أن تقلل التفاعلات غير محددة. تغيير المحتوى في الخلية السيطرة السلبية (مراقبة سلبية مختلفة) هو نهج آخر للتعامل مع القضايا ملزمة غير محددة. بدلا من ذلك، وذلك باستخدام نوع آخر من رقاقة يمكن أن تؤثر أيضا على جودة البيانات. هي أنواع مختلفة من رقائق استشعار المتاحة تجاريا، على أساس كيمياء مختلفة. في الشريحة الأكثر استخداما الاستشعار (رقاقة CM-5) carboxymethylated ديكستران يرد تساهميا على سطح الذهب. البروتينات يمكن أن يقترن تساهمي إلى السطح استشعار باستخدام مجموعة متنوعة من كيمياء سطح بسيطة جدا (معظم الأمينات أو اقتران ثيول شيوعا). ومع ذلك، في أيدينا، عند العمل مع بروتينات الغشاء تجميد التساهمية غالبا ما ينتج التحف وبالتالي لا طريقة الاختيار. في سياق دراسة بروتين الغشاء، ومن الجدير بالذكر أن هناك رقائق التجارية التي يتم المغلفة مع جزيئات محبة للدهون. هذه تمكين IMMOBilization للبروتينات غشاء على بيئة تشبه مواطن. ويمكن أيضا رقائق استشعار مماثلة تكون على استعداد في المكان ". للحصول على وصف أساليب اقتران أخرى نرى 10،11. ويستند بروتوكول الموصوفة هنا على استخدام ني NTA رقاقة اللازمة لتجميد لصاحب الموسومة، والمنظفات نقل يذوب (الحليلة ليس صاحب الموسومة لتجنب الحليلة ملزمة لسطح رقاقة). في تجربتنا 6،12، والثوابت الحركية المستمدة من التجارب التي أجريت مع رقائق ني NTA هي في اتفاق جيد مع تلك المحددة في بيئات مثل مواطن. وعلى الرغم من رقائق ني NTA غالية الثمن نسبيا، والميزة الرئيسية التي هي أنها يمكن تجريده من يجند وإعادة استخدامها. يمكن القيام به مئات القياسات في رقاقة. وعلاوة على ذلك، يتم تحديد التوجه يجند على رقاقة من موقف للعلامة له وبالتالي فهو متجانس تماما.
مرة واحدة وقد سجلت التفاعل بنجاح من قبل SPR، سلسلة من الضوابط وrepeوهناك حاجة إلى ATS للتحقق من صحة إشارة SPR. التحقق من المعلمات التالية قد تساعد على التحقق من صحة البيانات SRP:
1. خصوصية للإشارة SPR: نظرا لحساسية عالية من SPR، واستخدام ضوابط السلبية المناسبة له أهمية خاصة. تفاعل غير محدد سجلتها SRP يمكن أن يكون نتيجة لامتزاز لتحليلها لالمصفوفة. ولذلك، خلية تدفق الفارغة غالبا ما تكون غير الخيار الأفضل منذ خلية تدفق محملة البروتين (يجند) لا تعادل خلية تدفق فارغة كيميائيا. الخيار الأفضل هو استخدام البديل متحولة غير نشط ليجند، واحدة أن لا يعرف لربط الحليلة. بدلا من ذلك، يمكن للمرء استخدام تحليلها تحور بالمثل. إذا كانت هذه المسوخ لا تتوفر بروتين مثلي (ولكن من خصوصية ملزمة مختلفة) يمكن استخدام 12. أمثلة الضوابط السلبية الجيدة هي ليجند مثلي (كما هو موضح هنا)، أو طفرة نقطة في واحدة من شركاء التفاعل ما هو معروف لإلغاء الاشتراك في الجمعيات. أوصى آخر السيطرة السلبية هي تغيير لتعديل ما بعد متعدية (على سبيل المثال، الفسفرة، مثيلة، ثيول الاشتقاق) التي لا غنى عنها للتفاعل. على سبيل المثال، وإزالة الفسفرة من التيروزين التي لا غنى عنها لSH2 التفاعل المجال. ضوابط سلبية أخرى قد يكون نظام محدد. عند استخدام SPR، وأهمية استخدام ضوابط السلبية صارمة لا يمكن المبالغة.
2. القدرة على التكاثر للإشارة SPR: SPR هو أسلوب استنساخه للغاية. عندما يتم تحميل مبالغ يجند متساوية على رقاقة جهاز الاستشعار البيولوجي ويتم حقن تركيزات متساوية من الحليلة ينبغي أن يكرر تتفق تماما (انظر الشكل 3).
3. تجديد النظام: في التفاعل مع معدل التفكك البطيء (ك د)، لا بد من تجريد الحليلة من يجند مع الحفاظ على سلامة الوظيفية والهيكلية لللاtter. إذا التفكك و / أو تجديد غير مكتملة، فإن إشارة SPR الاضمحلال تدريجيا على حقن لاحقة من الحليلة. شروط تجديد النموذجية التي يمكن اختبارها هي تركيزات عالية من المغنيسيوم 2+ (تصل إلى 2 M)، الظروف الحمضية أو الأساسية (على سبيل المثال، 10 ملي جليكاين درجة الحموضة 2.5، 10 ملي هيدروكسيد الصوديوم)، والملح عالية (تصل إلى 4 M كلوريد الصوديوم)، أو تركيز المنظفات عالية (على سبيل المثال، 1٪ DDM). ومع ذلك، فإن فعالية تجديد هذه الكواشف (وغيرها) هي غاية نظام معين، وبالتالي يجب أن يتم اختبار الظروف regenerations. في بعض الحالات، والتفاعل حتى مستقر وقوي على أن تجديد أبدا كاملة، كما في حالة من E. القولونية فيتامين ب 12 نظام النقل (BtuCD-F) 7. في ظل هذه الظروف، فإن الخيار الوحيد هو لتجريد يجند من رقاقة الاستشعار البيولوجي وإعادة تحميل دفعة جديدة لكل الحقن. في الحالات التي يكون فيها تفكك الحليلة من يجند سريع وكامل تجديد سطح غير ضروري(انظر البروتوكول وأرقام 2-3).
وتنقيته 4. البروتينات غشاء دائما في وجود المنظفات، والتي يمكن أن تؤثر على SPR حساسية وردود الفعل أسعار الفائدة. ومع ذلك، في تجربتنا مع BtuCD، فإن معدلات قياس متشابهة جدا. يحتاج المرء دائما للحصول على أدلة تدعم استخدام نهج مجانية مثل حجم الاستبعاد اللوني (SEC)، المقايسات المنسدلة، الحويصلية الترسيب الفحص، الخ على سبيل المثال وقد تبين وجود علاقة بين SPR وغيرها من التقنيات لميثيونين، وفيتامين ب 12، ونظامين موليبدات 6،12.
تقرير خاطئ من الثوابت معدل الحركية غالبا ما تنشأ أثناء عملية تركيب. وكقاعدة عامة من الإبهام، وتطبيق دائما بسيط انجميور 1: 1 نموذج التفاعل لإجراء التجارب الحركية التحليل. نماذج أكثر تعقيدا افتراضات إضافية من التغييرات متعلق بتكوين، حليلة الثنائي التكافؤ، أو عينة عدم التجانس. وينبغي أن تكون هذه الافتراضاتتتم فقط إذا كانت مدعومة بأدلة من المناهج التجريبية الأخرى. لاحظ أن تطبيق هذه النماذج سوف النتيجة الأكثر احتمالا في القيم تشي 2 أفضل المناسب والسفلى، ولكن هذا لا ينبغي أن ينظر إليه على أنه شهادة لموثوقيتها. درجات أعلى من الحرية التي تتيحها نماذج أكثر تعقيدا وعادة ما تكون مسؤولة عن أفضل المناسب، بدلا من أهميتها الميكانيكية.
واحدة من مزايا SPR هو توافقه الكيميائية واسع، وخاصة فيما يتعلق المنظفات التي تستخدم لإذابة وتنقية البروتينات الغشاء. ومع ذلك، والسكروز والجلسرين (والحلول لزجة أخرى) التي غالبا ما تضاف أثناء عملية تنقية البروتينات الغشاء يكون لها آثار دراماتيكية على RU. لذا فمن المستحسن تجنب هذه إذا أمكن، أو على الأقل تقليل تركيزها. عند استخدام الحلول لزجة، وتجنب عازلة عدم تطابق يصبح من الضروري. يمكن إضافة الدهون إلى المنظفات التي تحتوي على RB تضخيم علامة ملزمةآل بنسبة تصل إلى عشرة أضعاف. ومع ذلك، فإن مثل هذا المسعى هو الثمن (بالنسبة لمعظم الدهون)، ويميل إلى تقصير العمر الافتراضي للرقائق جهاز الاستشعار البيولوجي.
نصائح وحلول للمشاكل المذكورة أعلاه قد يساعد في حين معايرة نظام جديد. ومع ذلك، فإن نظام معين وغالبا ما يتطلب التغيير والتبديل محددة (على سبيل المثال، واختيار المنظفات، والملح، ودرجة الحموضة) لتحقيق أفضل النتائج.
المعروف منذ فترة طويلة SPR كنهج قوية وفريدة من نوعها لقياس التفاعلات الجزيئية. في السنوات الأخيرة جعلت توافر مختلف منصات SPR وانخفاض أسعارها SPR أكثر ودود. فإنه سرعان ما أصبحت نهج موحد الذهب لدراسة التفاعلات البروتين البروتين، الهدف البروتين المخدرات التفاعلات، وفي اكتشاف مثبطات جزيء صغير الرصاص.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biacore T200 | GE Healthcare | 28-9750-01 | |
| Sensor Chip NTA | GE Healthcare | 14100532 | |
| BIAevaluation | GE Healthcare | ||
| Biacore T200 Software | GE Healthcare | ||
| Nickel chloride | Sigma | N6136 | |
| Sodium tungstate dihydrate | Sigma | T2629 | |
| Sodium Chloride | Bio-Lab LTD. | 19030591 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Ethyldiamine-tetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma | E5134 | |
| n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside (DDM) | Affymetrix | D310 | |
| Sodium dodecyl sulfate solution | Sigma | 05030 | |
| Kimwipes KIMTECH | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Hydrochloric acid | GADOT | 7647-01-0 | |
| Nylon (NY) Membrane Filter | Sartorius | 25007--47------N | |
| ModBC ABC transporter | Lewinson lab | ||
| RbsBC ABC transporter | Lewinson lab | ||
| ModA Substrate Binding Protein | Lewinson lab |
References
- Rich, R. L., Myszka, D. G. Advances in surface plasmon resonance biosensor analysis. Current Opinion in Biotechnology. 11, 54-61 (2000).
- Rich, R. L., Myszka, D. G. H. igher-throughput label-free, real-time molecular interaction analysis. Analytical Biochemistry. 361, 1-6 (2007).
- Helmerhorst, E., Chandler, D. J., Nussio, M., Mamotte, C. D. Real-time and label-free bio-sensing of molecular interactions by surface plasmon resonance: a laboratory medicine perspective. The Clinical Biochemist Reviews. 33, 161 (2012).
- Kyo, M., et al. Evaluation of MafG interaction with Maf recognition element arrays by surface plasmon resonance imaging technique. Genes to Cells. 9, 153-164 (2004).
- Katsamba, P. S., Park, S., Laird-Offringa, I. A. Kinetic studies of RNA–protein interactions using surface plasmon resonance. Methods. 26, 95-104 (2002).
- Vigonsky, E., Ovcharenko, E., Lewinson, O. Two molybdate/tungstate ABC transporters that interact very differently with their substrate binding proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 110, 5440-5445 (2013).
- Lewinson, O., Lee, A. T., Locher, K. P., Rees, D. C. A distinct mechanism for the ABC transporter BtuCD-BtuF revealed by the dynamics of complex formation. Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 332-338 (2010).
- Kyo, M., Usui-Aoki, K., Koga, H. Label-Free Detection of Proteins in Crude Cell Lysate with Antibody Arrays by a Surface Plasmon Resonance Imaging Technique. Analytical Chemistry. 77, 7115-7121 (2005).
- Mori, T., et al. Evaluation of protein kinase activities of cell lysates using peptide microarrays based on surface plasmon resonance imaging. Analytical Biochemistry. 375, 223-231 (2008).
- Mol, N., Fischer, M. E. Surface Plasmon Resonance Vol. 627 Methods in Molecular Biology. Mol, N. J., Fischer, M. J. E. 1, Humana Press. 1-14 (2010).
- Van Der Merwe, P. A. Surface plasmon resonance. Protein– ligand interactions: hydrodynamics and calorimetry. , Oxford University Press. Oxford. 137-170 (2001).
- Lewinson, O., Lee, A. T., Locher, K. P., Rees, D. C. A distinct mechanism for the ABC transporter BtuCD-BtuF revealed by the dynamics of complex formation. Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 332-338 (2010).
