Summary
Résonance plasmonique de surface (SPR) est une méthode sans étiquette pour la détection des interactions biomoléculaires en temps réel. Ici, un protocole pour une protéine de la membrane: expérience de l'interaction du récepteur est décrite, tout en discutant les avantages et les inconvénients de la technique.
Introduction
Les interactions protéine-protéine (PPI); la formation et la dissociation des complexes de protéines, sont des événements clés dans de nombreux processus biologiques (par exemple, la replication, la transcription, la traduction, la signalisation, la communication cellule-cellule). Études semi-quantitative de PPI sont souvent effectuées à l'aide déroulant ou expériences immuno-précipitation. Cependant, ces techniques (et similaires) sont limités dans la gamme des affinités qui peut être mesurée (à faible et une plus grande affinité micromolaire) en raison des étapes de lavage qui sont inhérents à ces techniques. Ces techniques "point final" ne peuvent pas identifier les interactions d'affinité transitoires ou basses qui sont souvent de grandes conséquences biologiques. En outre, la résolution temporelle de ces approches est extrêmement limitée, généralement ordres de grandeur plus lent que les taux de la réaction. SPR surmonte ces lacunes en raison de sa sensibilité accrue et une résolution temporelle supérieure 1,2. SPR est un procédé sans étiquette, et en tant que telinteraction moléculaire peut être mesurée (à condition que les changements de masse peuvent être détectées). En plus de l'IPP, il a été largement utilisée pour caractériser la protéine-ligand, protéine-médicament (ou une petite molécule), la protéine-ADN et les interactions protéine-ARN 3-5. Les résultats sont enregistrés et tracés en temps réel, ce qui permet la modification rapide des conditions expérimentales et la conception expérimentale flexible.
Le principe physique derrière instruments basés SPR est l'utilisation d'un système optique qui mesure un changement de l'indice de réfraction sur la surface du capteur change masse sur deux. L'un des partenaires d'interaction de ligands (ci-après) est immobilisée sur une puce à matrice de polymère et la deuxième molécule (ci-après analyte) est coulé sur la surface. Analyte liaison au ligand modifie la masse sur la surface de la puce. Ce changement de masse est directement liée et proportionnellement à l'évolution de l'indice de réfraction de la surface. Les résultats sont tracés en temps réel etprésenté sous forme d'unités de réponse (RU) en fonction du temps. Un tel complot est appelé sensogramme (par exemple, la figure 1). Depuis SPR suit le cours du temps complet de l'interaction, de pré-équilibre constantes cinétiques sont dérivés, en plus de l'équilibre affinités. Comme détaillé ci-dessous, le comportement d'un système donné pré-équilibre détient beaucoup d'informations, et offre une perspective très différente de l'équilibre seul. Une fois que le système est étalonné, des expériences sont très rapides et ne ont besoin que de petites quantités de matière protéique (microgramme à des quantités nanogramme). La collecte de l'information cinétique complète d'un système donné peut être réalisé en quelques jours. La grande sensibilité de SPR offre mesures qui ne sont pas possible en utilisant toute autre technique 6. Cependant, cette sensibilité élevée est une «arme à double tranchant» car il peut être une source importante pour les données faussement positifs. Tout facteur qui affecte l'indice de réflexion est enregistrée et tracée sur l'sensogramme. En tant que tel, apcontrôles propriées doivent être utilisés pour éliminer les faux positifs, et le soutien des approches complémentaires est fortement conseillé.
La figure 1 illustre la progression d'une expérience SPR utilisant une puce de capteur revêtue de NTA. Le Sensogramme dans le panneau A montre l'injection des ions nickel sur la matrice NTA (données non soustraites), et des panneaux BD afficher les données après la soustraction du signal dérivé à partir de la cellule témoin négatif. Flèches rouges et bleus montrent début d'injection et à la fin, respectivement. Immobilisation du ligand sur la puce modifie progressivement la masse jusqu'à ce que l'injection est terminée. Le plateau stable observée après la fin de l'injection de ligand reflète l'association stable du ligand à la surface (figure 1B, le cycle 2). Une fois une ligne de base stable soit atteint, un tampon est injecté sur le ligand et la cellule de référence (figure 1B, cycle 3) .Cet injection sert de «contrôle à blanc", et serasoustrait lors de l'analyse. Lors de l'injection, des changements mineurs sont enregistrés, ce qui reflète un flux de masse à travers la puce. Ensuite, dans un cycle séparé (figure 1B, le cycle 4), l'analyte est injectée; l'augmentation progressive de RU représente l'association de l'analyte au ligand. Les sites de liaison deviennent progressivement occupées jusqu'à ce qu'un équilibre soit atteint. Dès que se termine l'injection, une diminution de EF reflète la dissociation du complexe. De tels sensograms constantes de vitesse pré-équilibre et d'équilibre peuvent être dérivées (voir plus loin). La figure 1 représente une interaction transitoire entre le ligand et l'analyte. Lorsque l'interaction est plus stable, la baisse du niveau RU est plus lent, reflétant une plus faible k d.
Nous décrivons ici une expérience SPR visant à caractériser l'interaction entre un transporteur membranaire (détergent solubilisé) et son partenaire fonctionnelle, son substrat apparenté protéines 6,7 contraignant. Le mod choisiel est un système ATP binding cassette (ABC) transporteur, ModBC-A de Archeaglobus fulgidus. Ce système a été choisi pour ses résultats hautement reproductibles, haute rapport signal sur bruit, et classique "on / off" taux. En outre, les transporteurs ABC homologues sont disponibles pour servir de témoins négatifs importants. Le transporteur, ModBC (ligand A) est extrait de la membrane avec un détergent, purifiée et immobilisée sur la puce. Son partenaire d'interaction soluble, moda, est l'analyte. Comme un ligand témoin négatif, un transporteur ABC différente RbsBC est utilisé ("ligand B").
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Protocol
1. protéine échantillon et le tampon Préparation
- Préparation de l'échantillon: purifier les protéines d'intérêt et se assurer que tous les agrégats sont éliminés, par injection de la protéine avant l'expérience sur une colonne de filtration sur gel ou par ultracentrifugation (habituellement 10 minutes à 100 000 xg est suffisante).
NOTE: Bien que souhaitables préparations de protéines, très pures ne sont pas un must. SPR a été utilisé avec succès par purifications moins-que-parfait et même avec 8,9 extrait total. - Buffer préparation:
- Préparer le tampon de l'expérience (appelé "tampon en cours", ou RB). Pour le protocole décrit ici, en utilisant du Tris-HCl 50 mM pH 7,5, NaCl 150 mM et 0,05% (p / v) DDM (β-D-maltoside de n-dodécyle). Gardez à l'esprit que le choix de la composition du tampon peut être facilement modifiée en fonction du système étudié.
- Filtrer tous les tampons et les échantillons de protéines en utilisant des filtres de 0,22 um. Assurez-vous à l'avance que les filtres sont protéinocompatible. En général, les plates-formes SPR récemment commercialisés contiennent un de-Gasser en ligne; si ce ne est pas le cas, de gaz les tampons avant de l'utiliser.
- Dialyser nuit ou diluer les échantillons contre le RB à éviter les décalages de tampons. Dialyse (ou toute autre méthode d'échange de tampon) est particulièrement recommandé lors de l'utilisation de produits chimiques de haute viscosité (par exemple, le saccharose, le glycérol, le DMSO). Avant de raccorder la bouteille de RB à l'entrée de la pompe garder de côté 10 ml de la RB dans un tube séparé.
- Diluer le ligand mère concentrée dans RB à une concentration finale de ~ 20 pg / ml. En règle générale, pour l'immobilisation stable ligand, utiliser de faibles concentrations de ligands avec plus injections à faible débit, par opposition à des concentrations élevées, haut débit et des injections plus courtes.
- Diluer l'analyte dans le RB à la concentration désirée. Typiquement, tester la gamme de concentrations pour un système d'affinité inconnue de 10 pM à 10 nM dans des dilutions de dix fois. Toujours commenceravec les concentrations plus faibles en premier.
2. Sensor Chip
- sélection de puce: Utilisez un acide nitrilotriacétique (NTA) couplé à puce adaptée pour capturer des protéines avec une étiquette de oligo-histidine.
- l'utilisation de la puce:
- Lorsque vous utilisez une nouvelle puce, prendre la puce à partir de la gaine, rincer doucement avec de l'eau bidistillée (DDW), sécher soigneusement liquides restants utilisant essuie délicates, et assurez-vous de ne pas toucher la surface de la couche d'or. Placez la puce dans son fourreau dans le bon sens (l'insertion est lisse lorsque la puce est correctement placé).
- Lors de la réutilisation d'une puce, prendre la puce stockées dans la mémoire tampon, rincer abondamment à l'DDW et sécher délicatement comme indiqué ci-dessus, et la placer dans son fourreau d'origine.
NOTE: L'accumulation de matériaux de récupération non spécifique sur la puce peut affecter sa «viabilité». Ceci peut être contrôlé en comparant les EF avant et après l'immobilisation du ligand de décapage. Bien que de nombreuses mesures peuvent êtrefait en utilisant la même puce NiNTA, la question de sa longévité ne est pas une «claire» et varie considérablement entre les différentes puces.
- Chip accueil: Ouvrez la porte de la puce de capteur et placer la puce dans son fourreau. Lorsque vous utilisez une nouvelle puce, le numéro de série de la puce entrée de garder une trace d'utilisation. Fermez la porte et appuyez sur «puce de quai».
3. Réglages de température
- Régler la température de cellule de la puce à 25 ° C (ou la température de l'expérience de préférence).
- Facultatif: régler le compartiment échantillons à 7 ° C pour garder les protéines stable tout au long de l'expérience.
4. Solutions pour le chargement et à dénuder
Préparer les solutions suivantes de chargement et de stripage: mM NiCl 0,5 2 dans RB mM, EDTA 350 RB (ajouter un détergent à la solution d'EDTA à une concentration finale en RB), 0,25% de SDS à H 2 O et HCl 100 mM dans H 2 O. Lors de l'utilisation de micro-centrifugeuse baignoirees et non SPR tubes désignés, ne oubliez pas de couper les bouchons des tubes.
5. Premier l'instrument SPR avec RB
6. Commencer un nouveau Run
- Réglez le débit qui sera utilisé pendant l'expérience. Pour obtenir les résultats décrits ici régler le débit à 50 pl / min.
NOTE: Ce paramètre peut être modifiée au cours de l'expérience. - Définir les chemins d'écoulement et la soustraction de référence. Pour obtenir les résultats décrits ici définir les chemins Fc et Fc = 1 = 2, la soustraction Fc = 2-1.
NOTE: Le programme affiche en temps réel la soustraction de deux cellules mesurées. Gardez à l'esprit que ce paramètre ne peut être modifiée pendant l'expérience. - Sélectionner le rack d'échantillons approprié (qui peut influer sur la consommation de volume de l'échantillon).
- Enregistrez le fichier de résultats.
7. Expérience Cycles
Chaque expérience est composé de cycles, garder une trace claire des injections faites dans eacycle de ch, et séparer loading les ligands, injection vierge de la mémoire tampon, et l'injection d'analyte dans différents cycles.
- Cycle 1: préparation de Chip et le nickel chargement
- Assurez-vous que le flux et les chemins sont fixés selon l'étape 6.1 et 6.2.
- Injecter 350 mM d'EDTA pendant 1 min à lavent restes.
- Régler le débit à 10 pl / min.
- Injecter 0,5 mM NiCl 2 pendant 2 min.
NOTE: Maintenant la résine à puce est recouverte par des ions de nickel.
- Cycle 2: l'immobilisation des ligands
- Réglez le débit à 15 pl / min, chemin d'écoulement Fc = 2.
- Injecter ligand A jusqu'à atteindre des valeurs RU qui sont de 10 à 20 fois de son poids moléculaire. Par exemple, charger un ligand de 50 kDa à 500-1000 EF. Gardez une trace de la valeur RU atteint.
- Réglez le débit à 15 pl / min, chemin d'écoulement Fc = 1.
- Injecter ligand B (contrôle) jusqu'à la même valeur que celle de RU ligand A. surveiller les sensogramme de soustraction (Fc = 2-1) en ligne pour aider à contrôler lalongueur d'injection.
- Réglez le débit à 50 pl / min, chemin d'écoulement Fc = 1 et Fc = 2, laver le système de 5-20 min jusqu'à ce que la ligne de base (Fc = 2-1) se stabilise.
- Cycle 3: injection Blank. Cette injection servira pour la soustraction vide, donc inclure tous les composants qui seront injectés avec l'analyte, sauf l'analyte lui-même.
REMARQUE: longueur d'injection peut varier en fonction du temps nécessaire pour atteindre l'équilibre (signal de plateaux).- Réglez le débit à 15 pl / min, chemin d'écoulement Fc = 1 et Fc = 2, Fc = 2-1 soustraction.
- Insérez la commande «wait» (appelée ci-après «wait ') pendant 30 secondes (pour avoir une ligne de base stable).
- Injecter 15 sec RB.
REMARQUE: La durée de l'injection varie entre les différents systèmes, en fonction de leurs constantes cinétiques pré-équilibre (principalement le k A). - Attendez 120-600 sec pour enregistrer la phase de dissociation.
NOTE: La longueur de cette étape varie selon le
- Cycle 4: injection Analyte
- Copiez / collez les conditions exactes utilisées dans le injection de référence (cycle 3) de sorte que ces deux injections peuvent être soustraites tard. Modifier l'emplacement de la fente dans le rack par celui qui détient la solution de contrôle à celui qui détient la solution d'analyte. Choisissez une concentration qui est légèrement supérieur à la K attendue D. Si aucune connaissance préalable ne est disponible, choisissez une uM comme un bon point de départ.
- Cycle 5: injection Buffer
- Répétez le cycle 3.
- Cycle 6: injection Analyte
- Répétez le cycle 4.
- Cycle 7: Chip dépouiller
- Régler le débit à 50 pl / min. </ Li>
- Injecter 350 mM d'EDTA pendant 1 min. Répétez cette étape deux fois plus. Ne pas utiliser une seule injection de 3 min car cela pourrait endommager la puce.
- Injecter 0,25% de SDS pendant 1 min. Répétez cette étape deux fois plus. Ne pas utiliser une seule injection de 3 min car cela pourrait endommager la puce.
- Si le niveau de base ne est pas atteint, injecter HCl 100 mM pendant 1 min comme étape d'extraction supplémentaire.
- Insérez la commande 'de fin de course »qui passe en mode veille.
- stockage à puce
- Détacher la puce du capteur et de le sortir de l'instrument.
- Prenez le capteur hors de son fourreau, évitez de toucher la surface, rincer à DDW, et le placer dans un tube de 50 ml contenant RB. Conserver à 4 ° C.
8. Analyse des données en utilisant le logiciel désigné évaluation
- Effectuez les étapes suivantes pour traiter les données brutes obtenues par SPR avant calcul des paramètres cinétiques.
- Utilisation du logiciel d'évaluation, ouvertle fichier de résultats, sélectionnez cycles 3-6 Fc = 2-1 (référence soustrait des données).
- Axe changement:
- Afficher cycles 3-6.
- Zéro, la valeur de l'axe Y de la ligne de base (initial des temps d'attente de 30 secondes dans chaque cycle) à l'ensemble des quatre courbes.
- Aligner l'axe des x de quatre courbes. Choisissez caractéristiques prononcées (par exemple, les pics de début d'injection ou d'arrivée) d'aligner parfaitement les quatre courbes le long de l'axe-X. Réglez l'heure du début de l'analyte (tampon ou de contrôle) à zéro.
- Référence soustraction
- Soustraire la réponse de fond en soustrayant la courbe du cycle 3 de la courbe du cycle de 4 et la courbe de cycle de 5 de la courbe du cycle de 6. Utilisez l'opération de soustraction courbe qui peut être trouvé dans l'axe Y se déplace menu.
NOTE: Il est important d'effectuer cette étape qu'il annule tous les composants non spécifiques (sans rapport avec l'analyte) qui ont pu influencer l'indice de réfraction de surface.- Enregistrer les courbes soustraits à til Fiche de projet sous un nom différent.
- Reportez-vous à ces courbes que "courbes doublement soustraite»: la première soustraction est la soustraction 2-1 effectuée sur deux injections, et la seconde est la soustraction d'une courbe d'un autre.
NOTE: Cette double-référencement est l'étalon-or dans les expériences SPR. - Superposer les courbes soustraits en effectuant axe changement comme expliqué précédemment.
- Soustraire la réponse de fond en soustrayant la courbe du cycle 3 de la courbe du cycle de 4 et la courbe de cycle de 5 de la courbe du cycle de 6. Utilisez l'opération de soustraction courbe qui peut être trouvé dans l'axe Y se déplace menu.
- Détermination de la cinétique constantes et ajustement du modèle
- Mener une expérience cinétique
- Injecter une série de 6-7 concentrations d'analyte d'avoir un système fiable de données pour la détermination constantes cinétiques. Choisissez concentrations analyte de 10 fois supérieure à 10 fois inférieure au montant estimatif K D, dans des dilutions 2-3-fold. Inclure la concentration "zéro", utilisé plus tard pour le double soustraction de référence (voir ci-dessus). Mener injections en triple et dans un ordre aléatoire.
- Aligneret soustraire toutes les courbes par rapport à l'axe Y et l'axe X avant de l'ajustement du modèle.
- Ajustement du modèle
- Sélectionnez un programme d'analyse approprié.
REMARQUE: La plupart des programmes ajustés disponibles offrent plusieurs modèles qui peuvent être appliquées pour le montage et la détermination des constantes cinétiques. - Appliquer le modèle le plus simple (Langmuir) en supposant une réversible 1: une interaction entre l'analyte et le ligand pour le montage. Sauf convaincre les données sont disponibles à partir d'autres méthodes expérimentales pour l'existence d'une interaction plus complexe, toujours utiliser le modèle de Langmuir simple.
- Sélectionnez un programme d'analyse approprié.
- Mener une expérience cinétique
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Representative Results
Dans le système décrit ici, une puce NiNTA est utilisée pour immobiliser le transporteur membranaire marquée par His 6,7. Être un homo-dimère, chaque transporteur est doublement marqué, l'amélioration de sa liaison à la puce NiNTA. Après le chargement de nickel, ligand A (le transporteur d'intérêt) est immobilisé sur Fc = 2, jusqu'à ~ 3500 RU (cycle de protocole 2, Figure 2A label noir). Puis, en utilisant le même débit et la durée d'injection, le ligand B (le ligand de contrôle) est injecté sur Fc = 1, pour atteindre un premier temps uniquement jusqu'à un ~ 3000 RU. Pour vous assurer que les montants de protéines similaires sont immobilisés sur les deux cellules d'écoulement; ligand B est en outre chargé, en utilisant une injection plus courte, tout en surveillant attentivement le chargement jusqu'à 3500 EF. La forme «escaliers» représente l'augmentation progressive de la masse sur Fc = 1 lors de chaque injection (figure 2A étiquette grise). Une surveillance en ligne de Fc = 2-1 aide contrôler le ligand chargement égale. Figure 2B démontre l'Fc = 2-Une soustraction, ce est à dire, en soustrayant la valeur maximale RU Fc = 2, des augmentations graduelles de la valeur EF Fc = 1. Il est important de faire varier la durée des injections de ligands pour atteindre une charge égale des ligands étudiés et de contrôle. En revanche, lorsque l'injection de la substance à analyser, la durée de l'injection doit être maintenue constante pour toutes les concentrations utilisées. Figure 3A et 3B montrent les réponses mesurées par injection d'un "analyte blanc» (c.-à-RB omettant uniquement la substance à analyser) dans des cycles 3 et 5, et les injections d'analyte (dans les cycles 4 et 6). Notez que les deux sensograms représentent le Fc = 2-1 soustraction. Dans chacun des cycles (3-6) une injection d'analyte identique (vierge ou une concentration donnée) est appliquée sur les deux cellules d'écoulement, avec différents ligands immobilisés. Les deux répétitions superposent très bien, ce qui démontre la forte reproductibilité de SPR. Une réponse est enregistrée dans les deux cas; ~ 3 RU pour le blanc par rapport ~ 40 RU pour l'analyte. Ces valeurs représentent un rapport signal sur bruit de 13 ~. Pour obtenir les sensograms doubles-référencé, ne représentant que la réponse de liaison spécifique, l'injection vierge est maintenant soustraite de l'injection d'analyte (~ 37 RU, figure 3C). Le sensogramme enregistrée révèle le motif caractéristique d'une interaction transitoire. Lors de l'injection, la phase d'association est caractérisée par une augmentation rapide de la quantité d'analyte lié au ligand, atteignant l'état d'équilibre après environ sept secondes. L'état d'équilibre est maintenue aussi longtemps que l'analyte est injectée. Lorsque l'injection se termine, les cellules sont lavées avec du RB déclenchement de la phase de dissociation. Le complexe se dissocie rapidement, et que l'analyte est emporté du ligand au retour du signal SPR à base.
Pour obtenir des données quantitatives (pré-équilibre et les constantes d'équilibre), une gamme de concentrations d'analyte est injectée en double ou en triple (voir 8.3.1 dans le protocole).
Figure 1. Illustration des étapes d'une expérience SPR utilisant une puce de capteur Ni-NTA. (A (B - D) Illustration de la Fc = 2-1 sensogramme enregistrée lors d'une expérience SPR. Au cycle 2 comme ligand marquée par his est injecté sur la surface Ni-chargée, la masse se accumule progressivement. L'injection est terminée lorsque atteindre une valeur finale comprise entre 1.000-5.000 RU RU (selon MW du ligand). Le niveau de référence est formée, en raison de la liaison du ligand stable à la puce. Au cycle 3, une injection en blanc est préformée, l'injection des composants de l'échantillon d'analyte excluant seulement l'analyte. Dans cette injection souvent une réponse faible est enregistré (1-5 EF). Au cycle 4 de l'analyte est injecté à l'aide du même régime que l'injection vide. Les EF augmentation reflète la variation de la masse sur la surface, à savoir la liaison de l'analyte sur le ligand. Le signal augmente rapidement puis plateaux que eSystème de courrier atteigne l'équilibre. Lorsque l'injection se termine, se dissocie l'analyte du ligand, ce qui entraîne une diminution du signal et revenir à des niveaux de base.
Figure 2. Le suivi de la ligne de chargements de ligands. (A) courbes non soustraites de ligand chargement. Le ligand d'intérêt (ligand "A") est chargé de se écouler cellule 2 (Fc = 2, noir) jusqu'à atteindre le niveau souhaité RU (~ 3500 RU dans cet exemple). Ensuite, le ligand de contrôle négatif (ligand "B") est progressive chargé sur une cellule d'écoulement (Fc = 1, gris) jusqu'à un niveau identique RU est atteint. (B) Les deux injections effectuées dans (A) suivi en temps réel comme un Fc = 2-1 soustraction. Cette surveillance facilite le chargement identique de ligands d'intérêt et de contrôle.
Figure 3. Double référencement. (A) les doublons d'une soustraction 2-1 (c.-à-Fc = 2-1) de l'injection vide. (B) comme dans (A), seul analyte est injectée. (C) sensograms finales après soustraction de la réponse de fond représenté en (A) à partir de la réponse mesurée dans (B). Ces courbes sont appelés «double masqué» ou «double référencé". Les doublons sont des cycles séquentiels.
. Figure 4. Détermination des constantes cinétiques par des injections de concentrations d'analytes multiples (en double) Les lignes noires sont les crises qui ont été calculées en utilisant un simple 1: 1 Langmuir modèle d'interaction.
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Discussion
SPR est une méthode très sensible pour étudier les interactions moléculaires, et est souvent la seule approche qui permet la surveillance en temps réel des interactions transitoires (mais importantes). Un exemple est l'interaction transitoire présentée ici, qui ne pouvait pas être détecté par toute autre méthode (dosages déroulants, liposomes sédimentation essais 6). De plus, tandis que d'autres procédés sont limités à l'équilibre des mesures (que ce soit quantitative ou qualitative), SPR est l'une des seules des techniques qui mesurent également la cinétique de pré-équilibre.
Sa sensibilité accrue est aussi sa mise en garde. Sensograms faux-positifs sont facilement enregistrées. Il est donc recommandé d'établir l'existence de l'interaction avec d'autres méthodes avant de tenter mesures de SPR. La connaissance préalable des caractéristiques du système (d'évaluation grossière de la K D, stable par rapport interaction transitoire) est très utile pour la mise en place SPR experiments et évaluer la pertinence fonctionnelle des mesures obtenues. Une question importante à garder à l'esprit avant de commencer mesures de SPR est la qualité des échantillons de protéines. SPR est très sensible aux agrégats et ceux-ci doit être enlevée à la fois du ligand et les préparations de substance à analyser (par Chromatographie par filtration sur gel ou ultracentrifugation si possible). Une autre source de faux signaux de bruit et peut découler de l'inadéquation de tampon entre le RB et le tampon de l'analyte. Cela peut être résolu en dialysant contre la substance à analyser le RB, ou en utilisant une préparation très concentrée de la substance à analyser que l'on dilue de nombreux plis (~ 100-1000 fois) dans le RB. Données faussement positifs peuvent aussi résulter d'interactions non spécifiques de l'analyte avec la matrice de la puce ou au contrôle négatif. Ces interactions sont de faible affinité, de sorte que parfois, peuvent être évités en utilisant de faibles concentrations d'analyte. En outre, l'inclusion de BSA à faible et / ou les concentrations de détergent (0,1 mg / ml et / ou 0,05-0,1% (P / v), respectivement) de la RB et de l'échantillon d'analyte injecté peut réduire les interactions non spécifiques. Modification du contenu de la cellule de contrôle négatif (différente de contrôle négatif) est une autre approche pour traiter des questions de liaison non spécifiques. Alternativement, en utilisant un autre type de puce peut également affecter la qualité des données. Différents types de puces de capteur sont disponibles dans le commerce, sur la base de différentes compositions chimiques. Dans puce les plus couramment utilisés de capteur (la puce CM-5) carboxyméthylé dextrane est lié de manière covalente à une surface d'or. Les protéines peuvent être couplés de manière covalente à la surface du capteur en utilisant une variété de compositions chimiques de surface très simples (le plus souvent amine ou thiol couplage). Cependant, dans nos mains, quand on travaille avec des protéines membranaires immobilisation covalente donne souvent des artefacts et ne est donc pas la méthode de choix. Dans le cadre de l'étude d'une protéine de la membrane, il est à noter qu'il existe des puces commerciales qui sont revêtus avec des molécules lipophiles. Ceux-ci permettent l'immobilization de protéines de la membrane sur un environnement natif analogue. Capteurs similaires puces peuvent également être préparés «en interne». Pour une description des autres méthodes de couplage voir 10,11. Le protocole décrit ici est basé sur l'utilisation de la puce Ni-NTA pour l'immobilisation d'un His, détergent transporteur solubilisé (l'analyte ne est pas marquée par His à éviter la liaison à la surface de la puce analyte). Dans notre expérience 6,12, constantes cinétiques issues d'expériences menées avec des puces Ni-NTA sont en bon accord avec celles déterminées dans des environnements de type natif. Bien puces Ni-NTA sont relativement coûteux, leur principal avantage est qu'ils peuvent être dépouillés de ligand et réutilisés. Des centaines de mesures peuvent être effectuées par puce. En outre, l'orientation du ligand sur la puce est déterminée par la position de l'étiquette His et ne est donc tout à fait homogène.
Une fois qu'une interaction a été enregistrée avec succès par SPR, une série de contrôles et repeats sont nécessaires pour vérifier la validité du signal SPR. Vérification des paramètres suivants peut aider à valider les données SRP:
1. Spécificité du signal SPR: en raison de la grande sensibilité de SPR, l'utilisation des contrôles négatifs appropriés revêt une importance particulière. Interaction non spécifique enregistrée par SRP peut être due à l'adsorption d'un analyte à la matrice. Par conséquent, une cellule de flux vide ne est souvent pas la meilleure option depuis une cellule d'écoulement chargé avec des protéines (le ligand) ne est pas chimiquement équivalent à une cellule d'écoulement vide. Une meilleure solution consiste à utiliser une variante mutante inactive du ligand, qui est connue pour ne pas se lier à l'analyte. Alternativement, on peut utiliser un analyte muté de façon similaire. Si ces mutants ne sont pas disponibles pour une protéine homologue (mais différent de spécificité de liaison) peut être utilisé 12. Des exemples de bons contrôles négatifs sont un ligand homologue (comme décrit ici), ou une mutation ponctuelle dans l'un des partenaires d'interaction qui est connu pourabolir l'association. Un autre a recommandé contrôle négatif est la modification d'une modification post-traductionnelle (par exemple, la phosphorylation, la méthylation, thiol dérivation) qui est essentielle à l'interaction. Par exemple, de phosphorylation d'une tyrosine qui est essentiel pour l'interaction domaine SH2. Autres contrôles négatifs peuvent être système spécifique. Lors de l'utilisation SPR, l'importance d'utiliser des contrôles négatifs strictes ne peut être surestimée.
2. La reproductibilité du signal SPR: SPR est une méthode extrêmement reproductible. Lorsque des montants égaux de ligands sont chargés sur la puce de biocapteur et des concentrations égales de l'analyte sont injectés les répétitions devraient aligner parfaitement (voir Figure 3).
3. La régénération du système: en interaction avec une vitesse de dissociation lente (k d), la substance à analyser doit être éliminé du ligand, tout en préservant l'intégrité fonctionnelle et structurale de la latter. Si la dissociation et / ou la régénération sont incomplètes, le signal SPR va progressivement décroître sur les injections ultérieures de l'analyte. Conditions de régénération typiques qui peuvent être testés sont des concentrations élevées de Mg 2+ (jusqu'à 2 m), des conditions acides ou basiques (par exemple, 10 mM de glycine pH 2,5, NaOH 10 mM), riche en sel (jusqu'à 4 M de NaCl), ou forte concentration de détergent (par exemple, 1% DDM). Cependant, l'efficacité de régénération de ces réactifs (et autres) est donc régénérations conditions doivent être testés hautement spécifique système. Dans certains cas, l'interaction est si stable et forte que la régénération ne est jamais complète, comme dans le cas du E. coli système de transport de la vitamine B 12 (BtuCD-F) 7. Dans ces conditions, la seule option est de dépouiller le ligand de la puce de biocapteur et rechargez un nouveau lot pour chaque injection. Dans les cas où la dissociation de l'analyte du ligand est la régénération de la surface est rapide et complet inutile(Voir le protocole et les figures 2-3).
4. Les protéines membranaires purifiées sont toujours en présence de détergent, ce qui peut affecter la sensibilité et la réaction des taux SPR. Cependant, dans notre expérience avec BtuCD, les taux mesurés sont très similaires. On a toujours besoin d'obtenir les éléments probants justifiant l'utilisation d'approches complémentaires telles que la chromatographie d'exclusion stérique (SEC), les dosages déroulants, liposome test de sédimentation, etc. Par exemple, une corrélation entre SPR et d'autres techniques a été démontré pour la méthionine, la vitamine B 12, et deux systèmes molybdate 6,12.
Détermination erronée des constantes cinétiques se pose souvent au cours du processus de montage. En règle générale, toujours appliquer l'Langmuir 1 simple: 1 modèle d'interaction pour l'analyse des expériences cinétiques. Les modèles plus complexes font des hypothèses supplémentaires de changements conformationnels, analyte bivalent, ou hétérogénéité de l'échantillon. Ces hypothèses doivent êtrefait que si elles sont soutenues par des preuves d'autres approches expérimentales. Notez que l'application de ces modèles sera très probablement comme conséquence Chi deux meilleures valeurs de montage et inférieures, mais cela ne devrait pas être considérée comme un témoignage pour leur fiabilité. Les degrés plus élevés de la liberté offertes par les modèles plus complexes sont généralement responsables pour le mieux approprié, plutôt que leur pertinence mécaniste.
L'un des avantages de la SPR est son large compatibilité chimique, en particulier en ce qui concerne les détergents qui sont utilisés pour solubiliser et purifier des protéines membranaires. Cependant, le saccharose et le glycérol (et d'autres solutions visqueuses) qui sont souvent ajouté pendant le procédé de purification de protéines membranaires ont des effets dramatiques sur l'EF. Il est donc recommandé d'éviter ces si possible, ou au moins réduire leur concentration. Lors de l'utilisation des solutions visqueuses, évitant décalage tampon devient essentiel. Ajout de lipides pour un détergent contenant RB peut amplifier le signe de liaisonal de pas moins de dix fois. Cependant, un tel effort est cher (pour la plupart des lipides) et a tendance à raccourcir la durée de vie des puces de biocapteur.
Les conseils et au dépannage énumérés ci-dessus peuvent vous aider lors de l'étalonnage d'un nouveau système. Cependant, un système donné nécessite souvent peaufinage spécifique (par exemple, le choix de détergent, sel, pH) pour obtenir des résultats optimaux.
SPR a longtemps été reconnu comme une approche unique et puissant pour mesurer les interactions moléculaires. Au cours des dernières années, la disponibilité des différentes plates-formes et leurs SPR baisse des prix a fait SPR plus accessible. Il devient rapidement l'approche standard d'or pour étudier les interactions protéine-protéine, interactions protéine-médicaments cibles, et à découvrir des inhibiteurs de petites molécules de plomb.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biacore T200 | GE Healthcare | 28-9750-01 | |
| Sensor Chip NTA | GE Healthcare | 14100532 | |
| BIAevaluation | GE Healthcare | ||
| Biacore T200 Software | GE Healthcare | ||
| Nickel chloride | Sigma | N6136 | |
| Sodium tungstate dihydrate | Sigma | T2629 | |
| Sodium Chloride | Bio-Lab LTD. | 19030591 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Ethyldiamine-tetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma | E5134 | |
| n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside (DDM) | Affymetrix | D310 | |
| Sodium dodecyl sulfate solution | Sigma | 05030 | |
| Kimwipes KIMTECH | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Hydrochloric acid | GADOT | 7647-01-0 | |
| Nylon (NY) Membrane Filter | Sartorius | 25007--47------N | |
| ModBC ABC transporter | Lewinson lab | ||
| RbsBC ABC transporter | Lewinson lab | ||
| ModA Substrate Binding Protein | Lewinson lab |
References
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- Rich, R. L., Myszka, D. G. H. igher-throughput label-free, real-time molecular interaction analysis. Analytical Biochemistry. 361, 1-6 (2007).
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