Summary
Oberflächenplasmonresonanz (SPR) ist eine markierungsfreie Verfahren zur Detektion biomolekularer Wechselwirkungen in Echtzeit. Hierin wird ein Protokoll für ein Membranprotein: Rezeptor-Interaktion Experiment beschrieben, bei der Diskussion der Vor- und Nachteile der Technik.
Introduction
Protein-Protein-Interaktionen (PPI); die Bildung und Dissoziation von Proteinkomplexen, sind Schlüsselereignisse in vielen biologischen Prozessen (zum Beispiel der Replikation, Transkription, Translation, Signalisierung, Zell-Zell-Kommunikation). Semi-quantitative Studien der PPI sind oft unter Verwendung von Pull-Down-oder Immunpräzipitation Experimente. Jedoch sind diese (und ähnliche) Techniken im Bereich von Affinitäten, die gemessen werden kann (niedrigen mikromolaren und höhere Affinität) durch die Waschschritte, die bei einem solchen Verfahren sind beschränkt. Solche "Endpunkt" Techniken nicht identifizieren kann vorübergehend oder geringe Affinität Wechselwirkungen, die häufig von großem biologischen Konsequenzen sind. Zusätzlich wird die zeitliche Auflösung solcher Ansätze äußerst beschränkt, üblicherweise um Größenordnungen langsamer als die Raten der Reaktion. SPR überwindet diese Mängel durch seine erhöhte Sensibilität und überlegene Zeitauflösung 1,2. SPR ist eine markierungsfreie Methode, und als solchemolekulare Wechselwirkung gemessen werden kann (solange die Massenänderung festgestellt werden kann). Neben PPI wurde extensiv verwendet, um Protein-Ligand, Protein-Arzneistoff (oder kleines Molekül), Protein-DNA und Protein-RNA-Interaktionen 3-5 charakterisieren. Die Ergebnisse werden aufgezeichnet und in Echtzeit, was eine schnelle Abänderung der Versuchsbedingungen und Versuchs flexible Bauweise ermöglicht.
Das physikalische Prinzip hinter SPR basierte Instrumente besteht in der Verwendung eines optischen Systems, das eine Änderung des Brechungsindex misst auf der Sensoroberfläche auf Masse ändert 2. Einer der Wechselwirkungspartner (hiernach Liganden) auf einer Polymermatrix-Chip und das zweite Molekül (nachstehend Analyt) wird über der Oberfläche floß immobilisiert. Analyt-Bindung an den Liganden verändert die Masse auf der Chipoberfläche. Diese Massenänderung ist direkt und proportional zu Änderungen des Brechungsindex der Oberfläche bezogen. Die Ergebnisse werden in Echtzeit aufgezeichnet undals Reaktionseinheiten (RU) als eine Funktion der Zeit dargestellt. Eine solche Handlung ist eine Sensogramm bezeichnet (zB Abbildung 1). Da SPR folgt die komplette zeitliche Verlauf der Wechselwirkung werden Vorgleichgewicht Geschwindigkeitskonstanten abgeleitet sind, zusätzlich zu den Affinitäten Gleichgewicht. Wie unten beschrieben, die Vor-Gleichgewichtsverhalten eines Systems hält viele Informationen und bietet eine ganz andere Perspektive als Gleichgewicht allein. Nachdem das System kalibriert ist, sind Versuche sehr schnell und benötigen nur geringe Mengen an Proteinmaterial (Mikrogramm Mengen Nanogramm). Sammeln des kompletten kinetischen Daten von einem gegebenen System kann in Tagen erreicht. Die hohe Empfindlichkeit von SPR-Messungen liefert, die nicht durch ein anderes Verfahren 6 sind möglich. Ist diese hohe Empfindlichkeit jedoch ein "zweischneidiges Schwert", da es eine der Hauptquellen für falsch positive Daten sein. Jeder Faktor, der den Brechungsindex beeinflusst wird aufgezeichnet und auf der Sensogramm. Als solche apsprechende Kontrollen müssen genutzt werden, um falsch-positive zu beseitigen, und die Unterstützung von komplementären Ansätzen wird dringend empfohlen.
Abbildung 1 zeigt den Verlauf einer SPR-Experiment unter Verwendung einer NTA-beschichteten Sensorchip. Die Sensogramm in Tafel A zeigt die Injektion von der Nickelionen über die NTA-Matrix (unsubtrahierter Daten) und Platten BD die Daten anzeigen nach Abzug des aus der negativen Kontrollzell abgeleiteten Signals. Rote und blaue Pfeile zeigen Einspritzbeginn und das Ende auf. Immobilisieren des Liganden auf den Chip schrittweise verändert, bis die Masse Einspritzung beendet. Das nach Beendigung der Einspritzung von Ligand beobachtet stabiles Plateau spiegelt die stabile Assoziation des Liganden an der Oberfläche (1B, Zyklus 2). Sobald eine stabile Basislinie erreicht ist ein Puffer gegenüber dem Liganden und der Referenzzelle (1B, Zyklus 3) .Dieses Injektion dient als "Blindkontrolle" eingespritzt, und werdenwährend der Analyse abgezogen. Nach der Injektion werden kleinere Änderungen aufgezeichnet, was eine Strömung von Masse durch den Chip. Dann in einem separaten Kreislauf (Abbildung 1B, Zyklus 4), der Analyt eingespritzt wird; Die schrittweise Erhöhung der RU stellt Verband des Analyten an den Liganden. Die Bindungsstellen allmählich besetzt, bis ein Gleichgewicht erreicht wird. Sobald Einspritzung endet, ein Rückgang der EVU spiegelt Dissoziation des Komplexes. Aus solchen Sensogramme Pre-Gleichgewicht und Gleichgewicht Geschwindigkeitskonstanten abgeleitet werden können (siehe unten). Abbildung 1 zeigt eine transiente Interaktion zwischen dem Liganden und Analyten. Wenn die Interaktion ist stabiler, ist der Rückgang der EVU-Ebene langsamer, was auf einen geringeren k d.
Hier beschreiben wir eine SPR-Experiment am Charakterisieren der Wechselwirkung zwischen einem Membrantransporter (solubilisiertem) und seine funktionellen Partner seinen zugehörigen Substrat-Bindungsprotein 6,7 gerichtet. Die gewählte model-System ist ein ATP-Bindungs-Cassette (ABC) Transporter, ModBC-A von Archeaglobus fulgidus. Dieses System wurde für die sehr gut reproduzierbare Ergebnisse "on / off" Raten ausgewählt, hohem Signal-Rausch-Verhältnis und klassisch. Darüber hinaus sind Homologen ABC-Transporter zur Verfügung als wichtige negative Kontrollen dienen. Der Transporter, ModBC (Ligand A) von der Membran mit Reinigungsmittel, gereinigt und auf den Chip immobilisiert extrahiert. Seine löslichen Interaktionspartner, ModA ist der Analyt. Als Negativkontrolle Ligand wird eine andere ABC-Transporter RbsBC verwendet ("Ligand B").
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Protocol
1. Proteinproben und Buffer Vorbereitung
- Probenvorbereitung: Reinigung der Proteine von Interesse und sicherzustellen, dass alle Aggregate entfernt werden, durch Injizieren des Proteins vor dem Experiment auf eine Gelfiltrationssäule oder durch Ultrazentrifugation (üblicherweise 10 Minuten bei 100.000 xg genügt).
HINWEIS: Obwohl wünschenswert, hochreinen Proteinpräparate sind kein Muss. SPR wurde erfolgreich mit weniger-als-perfekte Reinigungen und sogar mit Gesamtextrakt 8,9 verwendet. - Buffer Zubereitung:
- Bereiten des Puffers des Experiments (als "Laufpuffer" oder RB). Für das hier beschriebene Protokoll verwendet 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl und 0,05% (w / v) DDM (n-Dodecyl β-D-maltosid). Denken Sie daran, dass die Wahl der Pufferzusammensetzung kann leicht nach dem untersuchten System geändert werden.
- Filter alle Puffer und Proteinproben mit 0,22 um-Filter. Vergewissern Sie sich vorher, dass die Filter Protein-kompatibel. Im allgemeinen enthalten kurzem vermarktet SPR Plattformen einen Inline-de-gasser; wenn dies nicht der Fall ist, de-Gas die Puffer vor der Verwendung.
- Dialyse über Nacht in verdünnter oder die Proben vor dem RB-Puffer zu Fehlanpassungen zu vermeiden. Dialyse (oder jede andere Methode der Pufferaustausch) empfiehlt sich insbesondere bei der Verwendung von Chemikalien von hoher Viskosität (zum Beispiel Saccharose, Glycerin, DMSO). Vor dem Anschluss des RB-Flasche zum Pumpeneinlaß beiseite stellen 10 ml des RB in einem separaten Röhrchen.
- Konzentrierten Ligand Lager in RB auf eine Endkonzentration von ~ 20 & mgr; g / ml. Als Faustregel gilt, für eine stabile Liganden Immobilisierung nutzen niedrigen Ligandenkonzentrationen mit mehr Injektionen bei niedrigen Strömungs, im Gegensatz zu hohen Konzentrationen, hohe Strömungs und kürzere Injektionen.
- Verdünne den Analyten in der RB auf die gewünschte Konzentration. In der Regel testen die Konzentrationsbereich für ein System von unbekannten Affinität von 10 um bis 10 nM in zehnfacher Verdünnung. Beginnen Sie immermit den niedrigeren Konzentrationen ersten.
2. Sensor Chip
- Chip-Auswahl: Mit einem Nitrilotriessigsäure (NTA) gekoppelt Chip geeignet für die Aufnahme von Proteinen mit einem Oligo-Histidin-Tag.
- Chip-Nutzung:
- Bei Verwendung einer neuen Chip, nehmen Sie den Chip aus dem Mantel, spülen Sie vorsichtig mit doppelt destilliertem Wasser (DDW), trocknen sorgfältig verbleibenden Flüssigkeiten mit empfindlichen Scheibenwischer, und sicherstellen, dass die Goldschichtoberfläche nicht zu berühren. Setzen Sie den Chip in die Scheide in der richtigen Ausrichtung (die Einfügung ist glatt, wenn der Chip richtig platziert ist).
- Bei Wiederverwendung einen Chip, nehmen Sie die gespeicherten Chip aus dem Puffer, gründlich mit DDW und trocken leise, wie oben angegeben, und legen Sie in die ursprüngliche Hülle.
HINWEIS: Die Akkumulation unspezifischer Junk Materials auf dem Chip kann seine Lebensfähigkeit beeinträchtigen. Dies kann durch den Vergleich der EVU vor der Liganden Immobilisierung und nach Abstreifen überwacht werden. Obwohl viele Messungen könnengetan mit der gleichen NiNTA Chip, die Frage der seine Langlebigkeit ist kein 'eindeutig' und variiert stark zwischen verschiedenen Chips.
- Chip-Docking: Öffnen Sie den Sensorchip Tür und setzen Sie den Chip in der Scheide. Bei Verwendung einer neuen Chip, um die Seriennummer Eingang des Chips Verwendungsdatensatz zu halten. Schließen Sie die Tür und drücken Sie "Dock-Chip".
3. Temperatureinstellungen
- Gesetzt den Chip Zelltemperatur auf 25 ° C (oder der bevorzugten Experiment Temperatur).
- Optional: Legen Sie die Proben Raum auf 7 ° C, um die Proteine während des gesamten Experiments stabil zu halten.
4. Lösungen für die Be-und Abisolieren
Bereiten Sie die folgenden Lösungen zum Laden und Abziehen: 0,5 mM NiCl 2 in RB, 350 mM EDTA in RB (das Waschmittel zu EDTA-Lösung bis zu einer Endkonzentration wie in RB), 0,25% SDS in H 2 O und 100 mM HCl in H 2 O. Bei der Verwendung von Mikrozentrifugen Badewannees und nicht bezeichnet Rohre SPR, vergessen Sie nicht, schneiden Sie die Kappen der Rohre.
5. Minister die SPR Instrument mit RB
6. Starten Sie einen neuen Run
- Die Durchflussrate, die während des Experiments verwendet werden. Um die hier beschriebenen Ergebnisse zu erzielen setzen die Strömung auf 50 ml / min.
HINWEIS: Dieser Parameter kann während des Experiments geändert werden. - Definieren Sie die Fließwege und Bezugs Subtraktion. Um die hier beschriebenen setzen die Pfade Fc = 1 und Fc = 2, Subtraktion Fc = 2-1 Ergebnisse zu erzielen.
HINWEIS: Das Programm wird in Echtzeit angezeigt werden die Subtraktion der beiden Messzellen. Beachten Sie, dass dieser Parameter nicht während des Experiments geändert werden. - Wählen Sie den geeigneten Probenträger (kann das Probenvolumen Verbrauch beeinflussen).
- Speichern Sie die Ergebnisdatei.
7. Experiment Cycles
Jeder Versuch wird von Zyklen besteht, halten eine klare Aufzeichnung der Injektionen in ea getanch-Zyklus, und trennen Sie die Liganden 'Laden, leere Injektion des Puffers und den Analyten Injektion in verschiedenen Zyklen.
- Zyklus 1: Chip Vorbereitung und Nickelbeladung
- Stellen Sie sicher, der Fluss und Wegen eingestellt werden gemäß Schritt 6.1 und 6.2.
- Injizieren Sie 350 mM EDTA für 1 min abzuwaschen Reste.
- Stellen Strom bis 10 ml / min.
- Injizieren 0,5 mM NiCl 2 für 2 min.
HINWEIS: Nun ist die Chip Harz durch Nickelionen beschichtet.
- Zyklus 2: Liganden Immobilisierung
- Set Flow bis 15 ml / min, Flusspfad Fc = 2.
- Injizieren Ligand A bis zum Erreichen RU Werte 10-20fache seines Molekulargewichts sind. Legen Sie zum Beispiel einen Liganden von 50 kDa bis 500-1.000 EVU. Halten Sie eine Aufzeichnung des RU-Wert erreicht.
- Set Flow bis 15 ml / min, Flusspfad Fc = 1.
- Injizieren Ligand B (Kontrolle) bis zu der gleichen RU Wert wie der Ligand A. Überwachen Sie die Subtraktion Sensogramm (Fc = 2-1) Online, um die Kontrolle derInjektionslänge.
- Set Strom auf 50 ml / min, Flusspfad Fc = 1 und Fc = 2, waschen Sie das System für 5-20 Minuten, bis die Grundlinie (Fc = 2-1) stabilisiert.
- Zyklus 3: Leer Injektion. Diese Injektion wird für leere Subtraktion dienen somit alle Komponenten, die mit dem Analyten injiziert werden, mit Ausnahme des Analyten selbst.
HINWEIS: Injektionslänge kann in Abhängigkeit von der Zeit bis zum Gleichgewichtszustand (Signal Plateaus) erreichen dauert variieren.- Set Flow bis 15 ml / min, Flusspfad Fc = 1 und Fc = 2, Fc = 2-1 Subtraktion.
- Legen Sie die 'warten' Befehl für 30 Sekunden (im Folgenden als "warten" genannt) (eine stabile Basislinie haben).
- Injizieren Sie 15 Sek RB.
HINWEIS: Die Dauer der Einspritzung zwischen verschiedenen Systemen variieren, abhängig von ihrer Vorgleichgewicht kinetischen Konstanten (meist k a). - Warten 120-600 sec, um die Dissoziationsphase aufzuzeichnen.
HINWEIS: Die Länge dieser Schritt ist je nach der
- Zyklus 4: Analyt Injektion
- Copy / die genauen Bedingungen in der Referenzeinspritz (Zyklus 3), so dass diese zwei Injektionen kann später abgezogen werden verwendet, einfügen. Ändern Sie die Position der Steckplätze im Rack von dem Halten der Kontroll-Lösung, eine, die den Analyten-Lösung hält. Wählen Sie eine Konzentration, die über dem erwarteten K D leicht ist. Wenn keine Vorkenntnisse vorhanden ist, wählen Sie 1 uM als guter Ausgangspunkt.
- Zyklus 5: Pufferinjektion
- Taktgeber 3.
- Zyklus 6: Analyt Injektion
- Taktgeber 4.
- Zyklus 7: Chip abzustreifen
- Stellen Strom auf 50 ml / min. </ Li>
- Injizieren 350 mM EDTA für 1 min. Wiederholen Sie diesen Schritt noch zweimal. Verwenden Sie nicht eine einzige Injektion von 3 min, da dies die Chip beschädigen.
- Injizieren von 0,25% SDS für 1 min. Wiederholen Sie diesen Schritt noch zweimal. Verwenden Sie nicht eine einzige Injektion von 3 min, da dies die Chip beschädigen.
- Falls der Ausgangspegel nicht erreicht ist, zu injizieren 100 mM HCl für 1 min als zusätzliches Stripping-Schritt.
- Legen Sie die "End-Run" Befehl, den Standby-Modus schaltet.
- Chip-Speicher
- Docken Sie den Sensorchip und nehmen Sie es aus dem Gerät.
- Nehmen Sie den Sensor heraus aus der Scheide, berühren nicht die Oberfläche gründlich mit DDW, und in einen 50-ml-Röhrchen mit RB. Lagerung bei 4 ° C.
8. Datenanalyse mit Ausgewiesene Auswertesoftware
- Führen Sie folgende Schritte, um die von SPR vor Ableitung der kinetischen Parameter erhalten Rohdaten verarbeiten.
- Mit der Auswertesoftware, offendie Ergebnisdatei, wählen Zyklen 3-6 Fc = 2-1 (Referenz abgezogen Daten).
- Achsenverschiebung:
- Display-Zyklen 3-6.
- Null der Y-Achsen-Wert von der Grundlinie (der ersten 30 sec Wartezeit bei jedem Zyklus), um alle vier Kurven.
- Richten Sie die X-Achse der vier Kurven. Wählen ausgeprägten Funktionen (zB Spikes von Injektions Start oder das Ende), um perfekt richten Sie die vier Kurven entlang der X-Achse. Stellen Sie die Zeit des Beginns der Analyt (oder Steuerspeicher) auf Null gesetzt.
- Referenz Subtraktion
- Subtrahieren Sie die Hintergrundantwort durch Subtraktion Kurve der Zyklus 3 von Kurve der Zyklus 4 und Kurve des Zyklus 5 von Kurve Zyklus 6. Verwenden Sie die Kurve Subtraktion, die in der Y-Achse zu finden ist verschiebt Menü.
HINWEIS: Es ist wichtig, diesen Schritt, da es keine nicht-spezifischen Komponenten (die nicht mit dem Analyten), die die Oberfläche Brechungsindex beeinflusst haben könnten annulliert durchzuführen.- Speichern Sie die abgezogen Kurven in ter Blatt des Projekts unter einem anderen Namen.
- Beziehen sich auf diese Kurven als "doppelt abgezogen Kurven": die erste Subtraktion ist 2-1 Subtraktion beider Einspritzungen durchgeführt wird, und das zweite ist die Subtraktion einer Kurve von einem anderen.
HINWEIS: Eine solche Doppel Referenzierung ist der Goldstandard in der SPR-Experimente. - Überlagern die Kurven subtrahiert, indem Achsenverschiebung, wie vorstehend erläutert.
- Subtrahieren Sie die Hintergrundantwort durch Subtraktion Kurve der Zyklus 3 von Kurve der Zyklus 4 und Kurve des Zyklus 5 von Kurve Zyklus 6. Verwenden Sie die Kurve Subtraktion, die in der Y-Achse zu finden ist verschiebt Menü.
- Bestimmung der Kinetik-Konstanten und Modellanpassung
- Die Durchführung einer kinetischen Experiment
- Spritzen Sie eine Reihe von 6-7 Analytkonzentrationen, um eine zuverlässige Daten zur kinetischen Konstanten Bestimmung haben. Wählen Analytkonzentrationen von 10-fach über den 10-fach unter der geschätzten K D, in 2-3-fach-Verdünnungen. Fügen Sie die "Null" Konzentration, später für Doppelreferenz Subtraktion verwendet (siehe oben). Führen Injektionen in dreifacher Ausführung und in zufälliger Reihenfolge.
- Ausrichtenund subtrahieren Sie alle Kurven in Bezug auf die Y-Achse und X-Achse, bevor Modellanpassung.
- Modellanpassung
- Wählen Sie einen geeigneten Analyseprogramm.
HINWEIS: Die meisten verfügbaren passend Programme bieten mehrere Modelle, die für die Montage und die Bestimmung der kinetischen Konstanten angewendet werden können. - Anwenden das einfachste Modell (Langmuir) unter der Annahme einer reversiblen 1: 1-Wechselwirkung zwischen dem Analyten und den Liganden für den Einbau. Es sei denn, überzeugende Daten aus anderen experimentellen Methoden für die Existenz einer komplexen Interaktion, immer den einfachen Langmuir-Modell.
- Wählen Sie einen geeigneten Analyseprogramm.
- Die Durchführung einer kinetischen Experiment
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Representative Results
In dem hier beschriebenen System wird eine NiNTA Chip verwendet, um die His-markierte Membrantransporter 6,7 immobilisieren. Wobei ein Homodimer ist jedes Transporters doppelt markiert, die Verbesserung seiner Bindung zum NiNTA-Chip. Nach Nickelbeladung, Liganden A (der Transporter von Interesse) auf Fc = 2 immobilisiert, bis ~ 3500 RU (Protokoll Zyklus 2, 2A black label). Dann werden mit dem gleichen Strömungs und Einspritzdauer, Ligand B (Kontrollliganden) an Fc = 1 eingespritzt wird, zunächst bis auf nur bis zu ~ 3000 RU. Um sicherzustellen, dass ähnliche Proteinmengen sind auf beiden Flusszellen immobilisiert; Ligand B weiter geladen, mit kürzeren Einspritzung, während die sorgfältige Überwachung der Belastung bis zu 3.500 EVU. Die Form 'Treppe' die allmähliche Zunahme der Masse an Fc = 1 bei jeder Injektion (2A grau Label). Eine Online-Überwachung von Fc = 1.2 unterstützt die Steuerung der Gleich Ligand Lade. 2B zeigt die Fc = 2-1 Subtraktion, dh Subtraktion der maximale RU-Wert in Fc = 2, von den stufenweisen Schritten in der RU-Wert im Fc = 1. Es ist wichtig, die Dauer der Liganden 'Injektionen variieren, um die gleichmäßige Beladung der untersuchten und Steuerliganden zu erreichen. Im Gegensatz dazu, wenn das Einspritzen des Analyten, die Dauer der Einspritzung muß für alle Konzentrationen konstant in den Zyklen 3 gehalten werden. 3A und 3B zeigen die Antworten, die durch Einspritzen eines "leeren Analyt" gemessen (dh, RB Weglassen nur des Analyten) und 5, und die Analyt-Injektionen (in den Zyklen 4 und 6). Beachten Sie, dass beide Sensogramme stellen die Fc = 2-1 Subtraktion. In jedem der Zyklen (3-6) eine identische Analyten Injektion (blank oder eine gegebene Konzentration) auf die zwei Strömungszellen angelegt, mit unterschiedlichen Liganden immobilisiert. Die zwei Wiederholungen zu überlagern sehr gut, was die hohe Reproduzierbarkeit der SPR. Eine Antwort wird in beiden Fällen aufgezeichnet; ~ 3 HE für den Rohling gegen ~ 40 RU für den Analyten. Diese Werte stehen für ein Signal-Rausch-Verhältnis von ~ 13. Um die Doppel referenziert Sensogramme, was nur die spezifischen Bindungsreaktion zu erhalten, wird der Zuschnitt Injektions nun vom Analyten Injektion (~ 37 RU, 3C) subtrahiert. Das aufgezeichnete Sensogramm zeigt das charakteristische Muster eines transienten Interaktion. Nach der Injektion wird die Assoziationsphase durch einen raschen Anstieg in der Menge des Liganden-gebundenen Analyten, dadurch gekennzeichnet, Erreichen stationärer Zustand nach ca. 7 Sekunden. Der stationäre Zustand wird so lange wie der Analyt injiziert gehalten. Wenn der Einspritz beendet wird, werden die Zellen mit RB Auslösen der Dissoziationsphase gewaschen. Der Komplex schnell distanziert und als Analyt wird von der Liganden die SPR-Signal kehrt zum Ausgangs gewaschen.
Um quantitative Daten (Pre-Gleichgewicht und Gleichgewichtskonstanten) zu gewinnen, wird ein Bereich von Analytkonzentrationen in Duplikaten oder dreifacher Ausführung (siehe 8.3.1 in Protokoll) injiziert.
Abbildung 1 Darstellung der Schritte eines SPR-Experiment unter Verwendung einer Ni-NTA-Sensorchip. (A (B - D) Illustration des Fc = 2-1 Sensogramm während einer SPR-Experiment aufgezeichnet. Im Zyklus 2 wie His-markierten Liganden wird auf die Ni-geladene Oberfläche injiziert wird, sammelt sich allmählich Masse. Die Einspritzung wird beendet, wenn sie zu einem endgültigen RU-Wert im Bereich zwischen 1000-5000 RU (je des Liganden MW). Eine Basislinie wird gebildet, was die stabile Bindung des Liganden an den Chip. Im Zyklus 3 wird ein Rohling vorgeformt Injektion, Injizieren der Komponenten der Analytprobe ausschließlich nur des Analyten. In diesem Injektion oft eine geringe Reaktion wird aufgezeichnet (1-5 EVU). Im Zyklus 4 wird der Analyt mit dem gleichen Regime wie der Rohling eingespritzt. Die zunehmende RUs während der Massenänderung auf der Oberfläche, das heißt, die Bindung des Analyten an den Liganden. Das Signal schnell ansteigt und dann Plateaus als thE-System ein Gleichgewicht erreicht. Wenn der Einspritzenden dissoziiert der Analyt aus dem Liganden, was zu einer Abnahme in dem Signal und zurück auf das Ausgangsniveau.
Abbildung 2. On line Überwachung der Ligand Belastungen. (A) unsubtrahierter Kurven der Ligand Belastung. Die interessierenden Liganden (Ligand "A") eingelegt ist, um die Durchflusszelle 2 (Fc = 2, schwarz) bis zum Erreichen der gewünschten RU Niveau (~ 3.500 RU in diesem Beispiel). Dann wird die negative Kontrollliganden (Ligand "B") stufenweise geladen auf Flusszelle 1 (Fc = 1, grau), bis eine identische RU Pegel erreicht. (B) Die zwei Injektionen in (A) durchgeführt, in Echtzeit als Fc = 2-1 Subtraktion überwacht. Diese Überwachung ermöglicht identische Belastung der Liganden von Interesse und Kontrolle.
Abbildung 3. Doppel Referenzierung. (A) Duplikate eines 2-1 Subtraktion (dh Fc = 2-1) des Rohlings Injektion. (B) Wie unter (A) wird nur Analyt eingespritzt. (C) Schluß Sensogramme nach Subtraktion des Hintergrundsignals in (A) gezeigt, aus der gemessenen Antwort in (B). Diese Kurven werden als "Doppelblendeten" oder "Doppel referenziert" bezeichnet. Duplikate von sequentiellen Zyklen.
. Abbildung 4. Bestimmung der Geschwindigkeitskonstanten durch Injektionen mehrerer Analyt-Konzentrationen (in Doppelbestimmung) Die schwarzen Linien sind die Anfälle, die unter Verwendung eines einfachen 1 wurden: 1 Langmuir-Interaktionsmodell.
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Discussion
SPR ist ein hochempfindliches Verfahren, um molekulare Wechselwirkungen zu untersuchen, und ist oft der einzige Ansatz, der Echtzeit-Überwachung von vorübergehenden (noch wichtiger) Wechselwirkungen liefert. Ein Beispiel ist die vorübergehende Wechselwirkung hierin dargestellt, die nicht durch ein anderes Verfahren (Pull-down-Assays, Liposomen Sedimentation Assays 6) festgestellt werden konnte. Darüber hinaus, während andere Verfahren sind begrenzt, um Messungen Gleichgewicht (ob quantitativ oder qualitativ) ist SPR eines der wenigen Verfahren, die auch zur Messung der Vorgleichgewicht Kinetik.
Seine erhöhte Sensibilität ist auch seine Vorbehalt. Falsch-positive Sensogramme leicht erfasst. Es wird daher empfohlen, um die Existenz der Wechselwirkung mit anderen Methoden, bevor SPR-Messungen zu schaffen. Vorkenntnisse der Eigenschaften des Systems (grobe Einschätzung der K D, stabil gegen transiente Interaktion) ist sehr hilfreich bei der Einrichtung von SPR Experiments und Bewertung der funktionellen Relevanz der erhaltenen Messwerte. Ein wichtiger Punkt im Auge zu behalten, bevor SPR-Messungen ist die Qualität der Proteinproben. SPR ist hochempfindlich zu Aggregaten und diese müssen von sowohl dem Liganden und dem Analyten Zubereitungen (mittels Gelfiltrationschromatographie oder Ultrazentrifugation wenn möglich) entfernt werden. Eine weitere Quelle für Rauschen und falsche Signale vom Puffer-Fehlpaarungen zwischen RB und dem Puffer des Analyten stammen. Dies kann durch Dialysieren des Analyten gegen die RB, oder durch Verwendung eines stark konzentrierten Zubereitung des Analyten, die viele Falten verdünnt (~ 100-1000-fach) in den RB gelöst werden. Falsch positive Daten können auch aus nicht-spezifische Wechselwirkungen des Analyten mit den Chip-Matrix oder mit der Negativkontrolle führen. Diese Interaktionen sind von geringer Affinität, so dass manchmal kann mit niedrigen Analytkonzentrationen vermieden werden. Zusätzlich Einbeziehung minder BSA und / oder Detergenskonzentration (0,1 mg / ml und / oder 0,05-0,1% (W / v), jeweils) zu dem RB und dem injizierten Analytprobe kann unspezifische Wechselwirkungen zu verringern. Ändern des Inhalts in der negativen Kontrollzellen (unterschiedliche negative Kontrolle) ist ein weiterer Ansatz für die Behandlung von nicht-spezifischen Bindung Probleme. Alternativ unter Verwendung einer anderen Art von Chip kann auch Auswirkungen auf die Qualität der Daten. Verschiedene Arten von Sensor-Chips sind im Handel erhältlich, die auf unterschiedlichen Chemien. In der am häufigsten verwendeten Sensorchip (CM-5 Chip) carboxymethylierte Dextran kovalent an einer Goldoberfläche befestigt ist. Proteine können kovalent an die Sensoroberfläche mit einer Vielzahl von sehr einfachen Oberflächenchemie (meist Amin- oder Thiol-Kopplung) gekoppelt werden. Doch in unseren Händen, bei der Arbeit mit Membranproteinen kovalente Immobilisierung führt oft Artefakte und ist somit nicht die Methode der Wahl. Im Rahmen der Untersuchung ein Membranprotein, ist es bemerkenswert, dass es kommerzielle Chips, mit lipophilen Molekülen beschichtet sind. Diese ermöglichen die immoblisation von Membranproteinen auf eine native-ähnliche Umgebung. Ähnliche Sensorchips kann auch "im Haus" vorbereitet werden. Eine Beschreibung der anderen Kupplungsmethoden sehen 10,11. Das hier beschriebene Protokoll basiert auf der Verwendung von Ni-NTA-Chip für die Immobilisierung eines His-markierten, an solubilisiertem transporter bezogen (der Analyt nicht His-markiert, um Analyt-Bindung an die Chipoberfläche zu vermeiden). Unserer Erfahrung nach 6,12, sind kinetischen Konstanten aus Versuchen mit Ni-NTA-Chips durchgeführt abgeleitet in guter Übereinstimmung mit den in nativ-ähnlichen Umgebungen bestimmt. Obwohl Ni-NTA-Chips relativ teuer sind, ist ihr Hauptvorteil, dass sie der Liganden gestrippt werden und wiederverwendet werden. Hunderte von Messungen pro Chip durchgeführt werden. Außerdem ist die Orientierung des Liganden auf dem Chip durch die Position des His-Tag bestimmt, und ist somit ziemlich homogen.
Nachdem eine Wechselwirkung wurde erfolgreich von SPR, eine Reihe von Kontrollen und repe zeichnetenats werden benötigt, um die Gültigkeit des SPR-Signals zu verifizieren. Überprüfung der folgenden Parameter können helfen, die SRP-Daten zu validieren:
1. Spezifität des SPR-Signals: Aufgrund der hohen Empfindlichkeit der SPR, von besonderer Bedeutung ist die Verwendung von entsprechenden Negativkontrollen. Nicht-spezifische Wechselwirkung SRP aufgezeichnet kann aufgrund der Adsorption eines Analyten auf die Matrix sein. Daher ist es eine leere Durchflußzelle oft nicht die beste Wahl, da eine Durchflusszelle mit Protein (der Ligand) geladen ist nicht chemisch äquivalent zu einer leeren Durchflusszelle. Eine bessere Option besteht darin, eine inaktive mutierte Variante des Liganden, eines, das bekannt ist, nicht an den Analyten binden verwenden. Alternativ kann man eine ähnlich mutiert Analyten zu verwenden. Wenn solche Mutanten sind nicht verfügbar ein homologes Protein (aber unterschiedlicher Bindungsspezifität) verwendet werden 12. Beispiele für gute negative Kontrollen sind eine homologe Ligand (wie hier beschrieben) oder eine Punktmutation in einer der Wechselwirkungspartner, der bekannt istAbschaffung des Vereins. Ein anderes empfohlenes negativen Kontroll Veränderung einer posttranslationalen Modifikation (zB Phosphorylierung, Methylierung, Thiol Ableitung), die wesentlich für die Wechselwirkung ist. Beispielsweise de-Phosphorylierung einer Tyrosin, die für die SH2-Domäne-Wechselwirkung ist. Andere negative Kontrollen können System spezifisch sein. Bei der Verwendung von SPR kann die Bedeutung des Einsatzes von strengen Negativkontrollen nicht überbewertet werden.
2. Reproduzierbarkeit des SPR-Signals: SPR ist ein äußerst reproduzierbaren Verfahren. Wenn gleich Ligand Mengen werden auf dem Biosensorchip geladen und gleicher Konzentration des Analyten injiziert die Wiederholungen sollte perfekt ausrichten (siehe Abbildung 3).
3. Regeneration des Systems: in Wechselwirkung mit einer langsamen Dissoziationsrate (k d), der Analyt muß von dem Liganden gestrippt werden und gleichzeitig die funktionelle und strukturelle Integrität des latter. Wenn Dissoziation und / oder Regeneration sind unvollständig, wird die SPR-Signal schrittweise auf nachfolgenden Injektionen des Analyten zerfallen. Typische Regenerationsbedingungen, die getestet werden können, sind hohe Konzentrationen von Mg 2+ (bis zu 2 M), sauren oder basischen Bedingungen (zum Beispiel 10 mM Glycin, pH 2,5, 10 mM NaOH), Hochsalz (bis zu 4 M NaCl) oder hohe Reinigungsmittelkonzentration (zB 1% DDM). Jedoch wird die regenerierende Wirksamkeit dieser Reagenzien (und andere) ist sehr systemspezifisch und somit Regenerationen Bedingungen geprüft werden. In einigen Fällen ist die Wechselwirkung so stark und stabil, dass eine Regeneration ist nicht vollständig, wie in dem Fall des E. coli Vitamin B 12 Transportsystem (BtuCD-F) 7. Unter solchen Bedingungen ist die einzige Möglichkeit, den Liganden von dem Biosensorchip abzustreifen und Nachladen einer frischen Charge für jede Injektion. In Fällen, in denen die Dissoziation des Analyten von dem Liganden ist eine schnelle und vollständige Oberfläche Regenerierung unnötig(Siehe Protokoll und Zahlen 2-3).
4. Membranproteine werden immer in Gegenwart eines Detergens, die die SPR Empfindlichkeit und Reaktionsgeschwindigkeit beeinflussen kann gereinigt. Aber nach unserer Erfahrung mit BtuCD, sind die gemessenen Raten sehr ähnlich. Man muss immer Belege mit kostenlosen Ansätze wie Grßenausschlußchromatographie (SEC) zu erhalten, Pull-down-Assays, Liposom Sedimentation Assay usw. Zum Beispiel kann eine Korrelation zwischen den SPR und andere Techniken für das Methionin gezeigt worden, Vitamin B 12, und zwei Molybdat Systeme 6,12.
Fehlerhafte Bestimmung der Geschwindigkeitskonstanten ergibt sich oft während der Anpassung. 1 Interaktionsmodell für die Analyse kinetischer Experimente: Als Faustregel gilt, immer die einfachen Langmuir 1 anzuwenden. Die komplexeren Modelle machen zusätzliche Annahmen von Konformationsänderungen, bivalente Analyten oder Probe Heterogenität. Diese Annahmen solltennur dann, wenn durch Beweise aus anderen experimentellen Ansätzen unterstützt. Beachten Sie, dass die Anwendung dieser Modelle werden höchstwahrscheinlich besser pass und unteren Chi 2-Werte, aber dies sollte nicht als ein Zeugnis für ihre Zuverlässigkeit zu sehen. Die höheren Freiheitsgrade durch die komplexere Modelle erzielt werden, sind in der Regel für den besseren Sitz verantwortlich, anstatt ihre mechanistische Relevanz.
Einer der Vorteile der SPR ist ihre hohe chemische Kompatibilität, insbesondere im Hinblick auf Detergentien, die zur Solubilisierung und Reinigung von Membranproteinen. Saccharose und Glycerin (und andere viskose Lösungen), die oft während des Reinigungsprozesses von Membranproteinen hinzugefügt werden, verfügen jedoch dramatische Auswirkungen auf die RU. Es wird daher empfohlen, diese zu vermeiden, falls möglich, oder zumindest deren Konzentration senken. Bei der Verwendung von viskosen Lösungen, die Vermeidung von Pufferübereinstimmung ist unerlässlich. Hinzufügen von Lipiden eine Waschmittel RB enthält, kann die Bindung zu verstärken Zeichenal um nicht weniger als das Zehnfache. Jedoch ist eine solche Bemühung teuer (für die meisten Lipide) und neigt dazu, die Lebensdauer der Biosensor-Chips zu verkürzen.
Die Tipps und Problembehandlung oben aufgeführten kann helfen, bei der Kalibrierung eines neuen Systems. Jedoch kann ein bestimmtes System erfordert häufig spezifische Optimierungen (zB Auswahl der Reiniger, Salz, pH-Wert), um optimale Ergebnisse zu erzielen.
SPR ist seit langem als ein leistungsfähiges und einzigartigen Ansatz zur molekularen Wechselwirkungen messen anerkannt. In den letzten Jahren die Verfügbarkeit verschiedener SPR-Plattformen und deren Preisverfall hat SPR zugänglicher gemacht. Es wird schnell zum Goldstandard Ansatz zur Protein-Protein-Wechselwirkungen, Zielprotein-Wechselwirkungen mit anderen Arzneimitteln und bei der Entdeckung Blei niedermolekularen Inhibitoren zu untersuchen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biacore T200 | GE Healthcare | 28-9750-01 | |
| Sensor Chip NTA | GE Healthcare | 14100532 | |
| BIAevaluation | GE Healthcare | ||
| Biacore T200 Software | GE Healthcare | ||
| Nickel chloride | Sigma | N6136 | |
| Sodium tungstate dihydrate | Sigma | T2629 | |
| Sodium Chloride | Bio-Lab LTD. | 19030591 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Ethyldiamine-tetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma | E5134 | |
| n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside (DDM) | Affymetrix | D310 | |
| Sodium dodecyl sulfate solution | Sigma | 05030 | |
| Kimwipes KIMTECH | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Hydrochloric acid | GADOT | 7647-01-0 | |
| Nylon (NY) Membrane Filter | Sartorius | 25007--47------N | |
| ModBC ABC transporter | Lewinson lab | ||
| RbsBC ABC transporter | Lewinson lab | ||
| ModA Substrate Binding Protein | Lewinson lab |
References
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