Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Realtid Mätningar av membranprotein: Receptor interaktioner Använda Surface Plasmon Resonance (SPR)

Published: November 29, 2014 doi: 10.3791/51937

Summary

(Surface Plasmon Resonance, SPR) är en etikett-fri metod för att detektera biomolekylära interaktioner i realtid. Häri ett protokoll för ett membranprotein: är receptorinteraktion experiment beskrivs, medan de diskuterar för- och nackdelar med tekniken.

Introduction

Protein-proteininteraktioner (PPI); bildning och dissociation av proteinkomplex, är nyckelhändelser i många biologiska processer (t.ex. replikering, transkription, translation, signalering, cell-cell kommunikation). Semi-kvantitativa studier av PPI utförs ofta med hjälp av rullgardins eller immunfällningsförsök. Men dessa (och liknande) tekniker begränsad i intervallet tillhörighet som kan mätas (lågt mikromolära och högre affinitet) på grund av de tvättsteg som är förbundna med sådana tekniker. Sådana "end-point" tekniker kan inte identifiera gående eller låg affinitet interaktioner som ofta stora biologiska konsekvenser. Dessutom är den tidsmässiga upplösningen av sådana metoder ytterst begränsad, oftast storleksordningar lägre än de satser som reaktionen. SPR vinner dessa brister på grund av dess ökad känslighet och överlägsen temporal upplösning 1,2. SPR är en etikett-fri metod, och som sådanmolekylär interaktion kan mätas (så länge som de massändringar kan detekteras). Förutom PPI, har det i stor utsträckning använts för att karakterisera protein-ligand, protein-läkemedel (eller liten molekyl), protein-DNA och protein-RNA-interaktioner 3-5. Resultat registreras och ritas i realtid, vilket möjliggör snabb ändrade experimentella betingelser och flexibel experimentell design.

Den fysikaliska principen bakom SPR baserade instrument är användningen av ett optiskt system som mäter en förändring av brytningsindex på sensorytan vid massförändringar 2. En av de interagerande partners (härefter ligand) immobiliseras på en polymermatris chip och den andra molekylen (härefter analyt) bringas att strömma över ytan. Analyt bindning till liganden förändrar massan på spånytan. Denna massändring är direkt och proportionellt relaterat till förändringar i brytningsindex för ytan. Resultaten plottas i realtid ochpresenteras som responsenheter (RU) som en funktion av tiden. En sådan kurva benämns en Sensogram (t.ex. Figur 1). Sedan SPR följer den fullständiga tidsförloppet för interaktion, är pre-jämvikts kinetiska hastighetskonstanter härrör, förutom till jämvikt affiniteter. Enligt nedan, pre-jämvikts beteende ett givet system rymmer mycket information, och ger ett mycket annorlunda perspektiv än enbart jämvikt. När systemet är kalibrerat, experiment är mycket snabb och kräver endast små mängder protein material (mikrogram till nanogram belopp). Samla fullständig kinetisk information om ett givet system kan åstadkommas i dagar. Den höga känslighet SPR ger mätningar som inte är möjliga att använda någon annan teknik 6. Detta är dock hög känslighet en "tveeggat svärd", eftersom det kan vara en stor källa för falskt positiva data. Varje faktor som påverkar det reflekterande index registreras och plottas på Sensogrammet. Som sådan, apenliga kontroller måste användas för att eliminera falskt positiva, och stöd från kompletterande metoder är mycket rekommenderas.

Figur 1 illustrerar framskridandet av en SPR experimentet med hjälp av NTA-belagda sensorchipet. Sensogrammet i panel A visar injektion av nickeljoner över NTA matrisen (unsubtracted data), och paneler BD visa data efter avdrag signalen kommer från den negativa kontrollcellen. Röda och blå pilar visar insprutnings början och slut, respektive. Immobilisering av liganden på chipet gradvis förändrar massan tills injektionen är avslutad. Den stabila platå observeras efter avslutande av ligandens injektion speglar stabil association av liganden till ytan (Figur 1B, cykel 2). När en stabil baslinje uppnås en buffert injiceras under liganden och referenscellen (Figur 1B, cykel 3) .Detta injektion fungerar som en "tom kontroll", och kommer att varasubtraheras under analysen. Vid injektion, är mindre ändringar registreras, vilket återspeglar ett flöde av massa genom chipet. Sedan i en separat cykel (Figur 1B, cykel 4), är analyten injiceras; gradvis ökning av RU representerar analyten associering till liganden. De bindningsställen blir gradvis ockuperade dess att jämvikt uppnås. Så snart injektion slutar, en nedgång i RU speglar komplexets dissociation. Från sådana sensograms pre-jämvikts och jämviktskonstanter kan härledas (se senare). Figur 1 visar en transient växelverkan mellan liganden och analyten. När interaktionen är mer stabil, är nedgången i RU-nivå långsammare, vilket återspeglar en lägre k d.

Häri beskriver vi en SPR experiment som syftar till att karakterisera interaktionen mellan en membrantransportör (detergent solubiliserat) och dess funktionella partner, dess besläktade substratbindande protein 6,7. Den valda model-systemet är ett ATP-bindande kassett (ABC) transportör, ModBC-A i Archeaglobus fulgidus. Detta system valdes för sin mycket reproducerbara resultat, högt signalbrusförhållande, och klassisk "on / off" priser. Dessutom homologer ABC transportörer finns att tjäna som viktiga negativa kontroller. Transportören, ModBC (ligand A) extraheras från membranet med användning av tvättmedel, renas och immobiliseras på chipet. Dess lösligt samverkande partner, Moda, är analyten. Som en negativ kontroll-ligand, är en annan ABC-transport RbsBC används ("ligand B").

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Protein Prov och Buffer Förberedelse

  1. Provberedning: rena proteiner av intresse och se till att alla aggregat tas bort, genom att injicera proteinet före experimentet på en gel-filtreringskolonn eller genom ultracentrifugering (vanligtvis 10 minuter vid 100.000 xg räcker).
    OBS: Även om önskvärda, mycket rena proteinpreparat är inte ett måste. SPR har framgångsrikt använts med mindre-än-perfekt reningar och även med total extrakt 8,9.
  2. Buffert preparatet:
    1. Förbered buffert av experimentet (benämnd "kömingsbuffert", eller RB). För beskrev protokollet här, använd 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl och 0,05% (vikt / volym) DDM (n-dodecyl β-D-maltosid). Tänk på att valet av buffertkomposition kan lätt modifieras enligt det studerade systemet.
    2. Filtrera alla buffertar och proteinprover med 0,22 um filter. Kontrollera i förväg att filtren är protein-kompatibla. I allmänhet nyligen salu SPR plattformar innehåller en in-line de-Gasser; om detta inte är fallet, de-gas buffertarna före användning.
    3. Dialysera över natten eller utspädd proverna mot RB att undvika buffert felpassningar. Dialys (eller någon annan metod för buffertbyte) är särskilt lämpligt vid användning av kemikalier med hög viskositet (t.ex. sackaros, glycerol, DMSO). Innan du ansluter RB flaskan till pumpinloppet hålla undan 10 ml av RB i ett separat rör.
  3. Späd den koncentrerade liganden lager i RB till en slutlig koncentration av ~ 20 mikrogram / ml. Som en tumregel, för stabil ligand immobilisering, använda låga ligandkoncentrationer med längre injektioner vid lågt flöde, i motsats till höga koncentrationer, högt flöde och kortare injektioner.
  4. Späd analyten in i RB till den önskade koncentrationen. Vanligtvis testa olika koncentrationer för ett system med okända affinitet från 10 ^ M till 10 nM i tiofaldiga utspädningar. Börja alltidmed de lägre koncentrationerna första.

2. Sensor Chip

  1. Chip urval: Använd en nitriltriättiksyra (NTA) kopplat chip lämplig för att fånga proteiner med en oligo-histidintag.
  2. Chip Användning:
    1. När du använder ett nytt chip, ta chipet ut ur skidan, skölj försiktigt med dubbeldestillerat vatten (DDW), torka försiktigt resterande vätskor använder känsliga vindrutetorkare, och se till att inte vidröra guldlagret ytan. Placera chipet tillbaka i skidan i korrekt orientering (insättningen är slät när chipet är korrekt placerad).
    2. Vid återanvändning ett chip, ta ut den lagrade chip från bufferten, skölj noggrant med DDW och torka försiktigt enligt ovan, och placera i dess ursprungliga mantel.
      OBS: ansamling av ospecifik skräpmaterial på chipet kan påverka dess "livskraft". Detta kan övervakas genom att jämföra RU före ligand immobilisering och poststrippning. Även om många mätningar kan varagörs genom att använda samma NiNTA chip, är frågan om dess livslängd inte en "entydig" och varierar stort mellan olika marker.
  3. Chip dockning: Öppna sensorchip dörren och placera chip i skidan. När du använder ett nytt chip, att mata chipet serienummer hålla användnings rekord. Stäng dörren och tryck "docka chip".

3. Temperaturinställningar

  1. Skjut spåncelltemperaturen till 25 ° C (eller den föredragna experimentet temperatur).
  2. Tillval: ställ in prover utrymmet till 7 ° C för att hålla proteinerna stabil under hela experimentet.

4. Lösningar för Lastning och Stripping

Bered följande lösningar för lastning och stripp: 0,5 mM NiCl2 i RB, 350 mM EDTA i RB (lägg tvättmedel till EDTA-lösning till en slutkoncentration som i RB), 0,25% SDS i H2O, och 100 mM HCl i H 2 O. Vid användning av mikrocentrifug tubes och inte SPR utsedda tuber, glöm inte att skära av locken på rören.

5. Prime SPR Instrument med RB

6. Starta en ny körning

  1. Ställ in flödeshastigheten som kommer att användas under experimentet. För att erhålla de resultat som beskrivs här ställa flödet till 50 ul / min.
    OBS: Denna parameter kan ändras under experimentet.
  2. Definiera flödesvägarna och referens subtraktion. För att erhålla de resultat som beskrivs här anges banorna Fc = 1 och Fc = 2, subtraktion Fc = 2-1.
    OBS: Programmet kommer att visas i realtid subtraktion av två uppmätta celler. Tänk på att denna parameter inte kan ändras under experimentet.
  3. Välj lämplig provstället (den kan påverka prowolymen förbrukning).
  4. Spara resultat filen.

7. Experiment Cykler

Varje experiment består av cykler, hålla en klar dokumentation av injektionerna görs i ealm cykel, och separera ligander "lastning, buffertens tom injektion, och analyten injektion i olika cykler.

  1. Cykel 1: Chip förberedelse och nickel lastning
    1. Kontrollera flödet och stigar är inställda enligt steg 6,1 och 6,2.
    2. Injicera 350 mM EDTA i 1 min för att tvätta bort resterna.
    3. Ställ flöde till 10 l / min.
    4. Injicera 0,5 mM NiCl2 för 2 min.
      OBS: Nu chipet hartset beläggs genom nickeljoner.
  2. Cykel 2: Ligander immobilisering
    1. Inställda flödet till 15 l / min, flödesväg Fc = 2.
    2. Injicera ligand A tills når RU värden som är 10-20 gånger sin molekylvikt. Till exempel, ladda en ligand på 50 kDa till 500-1000 RU. Håll reda på RU värdet uppnåtts.
    3. Inställda flödet till 15 l / min, flödesväg Fc = 1.
    4. Injicera ligand B (kontroll) upp till samma RU värde som ligand A. Övervaka subtraktion Sensogram (Fc = 2-1) på nätet för att hjälpa till att kontrollerainjektionslängd.
    5. Inställda flödet till 50 l / min, flödesväg Fc = 1 och Fc = 2, tvätta systemet för 5-20 min tills baslinjen (Fc = 2-1) stabiliseras.
  3. Cykel 3: Blank injektion. Denna injektion kommer att tjäna för tomt subtraktion, därför inkludera alla komponenter som kommer att injiceras med analyten, förutom analyten själv.
    OBS: Injektions längd kan variera beroende på den tid det tar att nå jämvikt (signal platåer).
    1. Inställda flödet till 15 l / min, flödesväg Fc = 1 och Fc = 2, Fc = 2-1 subtraktion.
    2. Sätt i "vänta" kommandot (kallad nedan som "vänta") under 30 sek (för att få en stabil baslinje).
    3. Injicera 15 sek RB.
      OBS: varaktighet injektion varierar mellan olika system, beroende på deras pre-jämvikts kinetiska konstanter (mestadels k a).
    4. Vänta 120-600 sek för att spela in dissociationen fasen.
      OBS: Längden på detta steg varierar beroende på d: Den långsammare dissociation ju längre detta steg behöver vara. För mycket långsamma dissociation komplex (k d <10 -4 sek -1), vänta 10-15 min och sedan fortsätta till ytan regenerering (se senare).
  4. Cykel 4: Analyt injektion
    1. Kopiera / klistra in de exakta villkoren som används i referens injektionen (cykel 3) så dessa två injektioner kan senare subtraheras. Ändra placering av slitsen i stället från en hålla manöverlösningen till ett som håller analytlösningen. Välj en koncentration som är något över den förväntade K D. Om inga förkunskaper är tillgänglig, välj en iM som en bra utgångspunkt.
  5. Cykel 5: Buffert injektion
    1. Upprepa cykeln 3.
  6. Cykel 6: Analyt injektion
    1. Upprepa cykeln fyra.
  7. Cykel 7: Chip strippa
    1. Ställ flöde till 50 l / min. </ Li>
    2. Injicera 350 mM EDTA i 1 min. Upprepa detta steg två gånger. Använd inte en enda injektion av 3 min eftersom det kan skada chipet.
    3. Injicera 0,25% SDS under 1 min. Upprepa detta steg två gånger. Använd inte en enda injektion av 3 min eftersom det kan skada chipet.
    4. Om baslinjen nivå inte uppnås, injicera 100 mM HCI i 1 min som extra avdrlvningssteget.
    5. Sätt i "end run" kommando som växlar till standbyläge.
  8. Chip lagring
    1. Docka av sensorchip och ta ut den ur instrumentet.
    2. Ta sensorn ut ur skidan, undvik att röra ytan, skölj med DDW, och lägg i en 50 ml rör innehållande RB. Förvaras vid 4 ° C.

8. Dataanalys Använda utsedda Utvärderings Software

  1. Utför följande steg för att bearbeta rådata som erhållits genom SPR innan härledning av de kinetiska parametrarna.
    1. Använda utvärderingsprogramvaran, öppenresultaten fil väljer cykler 3-6 Fc = 2-1 (referens subtraheras data).
    2. Axis shift:
      1. Visa cykler 3-6.
      2. Noll Y-axelvärdet för baslinjen (den initiala 30 sek väntetiden i varje cykel) på alla fyra kurvor.
    3. Rikta in X- axeln i de fyra kurvorna. Välj uttalade funktioner (t.ex. spikar av injektions början eller slut) för att helt rikta in de fyra kurvorna längs X-axeln. Ställ in tiden för starten av analyten (eller kontrollbuffert) till noll.
  2. Referens subtraktion
    1. Subtrahera bakgrundsresponsen genom att subtrahera kurvan för cykel 3 från kurvan för cykel 4 och kurvan för cykeln 5 från kurvan av cykeln 6. Använd kurvan subtraktion operation som kan hittas i Y-axeln skiftar menyn.
      OBS: Det är viktigt att utföra detta steg eftersom det upphäver eventuella ospecifika komponenter (utan samband med analyten) som kan ha påverkat ytan brytningsindex.
      1. Spara subtraherade kurvor i tHan projektets ark under ett annat namn.
    2. Se dessa kurvor som "dubbelt subtraheras kurvor": den första subtraktion är 2-1 subtraktion utföras på båda injektioner, och den andra är subtraktion av en kurva från en annan.
      OBS: Denna dubbla referenser är den högsta standarden inom SPR experiment.
    3. Överlägg de subtraherade kurvorna genom att utföra axelförskjutning som förklarats tidigare.
  3. Fastställande av kinetiska konstanter och modell montering
    1. Genomföra en kinetisk experiment
      1. Injicera en serie av 6-7 analytkoncentrationer för att få en tillförlitlig data för kinetiska konstantbestämning. Välj analytkoncentrationer från 10-faldig ovan till 10-faldigt under den uppskattade Kd, i 2-3-faldiga spädningar. Inkludera "noll" koncentration, användes senare för dubbel referens subtraktion (se ovan). Genomföra injektioner i tre exemplar och i slumpmässig ordning.
      2. Riktaoch subtrahera alla kurvor med avseende på Y-axeln och X-axeln innan modellanpassning.
    2. Modellanpassning
      1. Välj ett lämpligt analysprogram.
        OBS: De flesta tillgängliga passande program erbjuder flera modeller som kan tillämpas för montering och bestämning av kinetiska konstanter.
      2. Applicera den enklaste modellen (Langmuir) under antagande av en reversibel 1: 1 interaktionen mellan analyten och liganden för montering. Såvida övertygande data finns tillgängliga från andra experimentella metoder för att det finns en mer komplex interaktion, använd alltid den enkla Langmuir modellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I det system som beskrivs häri, är en NiNTA chip som används för att immobilisera den His-märkt membrantransportör 6,7. Att vara en homo-dimer, är varje transportör dubbelt märkt, förbättra dess bindning till NiNTA chipet. Efter nickel lastning, ligand A (transportören intresse) immobiliseras på Fc = 2, upp till ~ 3500 RU (protokollcykel 2, figur 2A svart etikett). Sedan, med hjälp av samma flöde och insprutningstiden, ligand B (kontroll ligand) injiceras på Fc = 1, till en början når bara upp till en ~ 3000 RU. För att se till att liknande protein belopp immobiliserade på båda flödesceller; ligand B ytterligare laddad, med hjälp av kortare injektion, medan noggrant övervaka lastning upp till 3.500 RU. Den "trappor" formen representerar gradvis ökning i massa på Fc = 1 vid varje injektion (Figur 2A grå etikett). En on-line övervakning av Fc = 2-1 hjälper styra lika liganden lastning. Figur 2B visar Fc = 2-1 subtraktion, dvs subtrahera det maximala RU värdet i Fc = 2, från steg stegvisa i RU värdet i Fc = 1. Det är viktigt att variera varaktigheten av de ligander "injektioner för att uppnå lika laddning av de undersökta och kontrollligander. Däremot när injicera analyten, varaktighet injektionen måste hållas konstant för alla koncentrationer som används. Figur 3A och 3B visar svaren uppmätta genom att injicera en "tom analyt" (dvs, RB endast utelämnar analyt) i cykler 3 och 5, och de analytinjektioner (i cykler 4 och 6). Observera att båda sensograms representerar Fc = 2-1 subtraktion. I var och en av de cykler (3-6) ett identiskt analyt injektion (tom eller en viss koncentration) appliceras på de två flödesceller immobiliserade med olika ligander. De två upprepningar lagra mycket väl, vilket visar den höga reproducerbarhet SPR. Ett svar är inspelad i båda fallen; ~ 3 RU för blind kontra ~ 40 RU för analyten. Dessa värden representerar ett signalbrusförhållande på ~ 13. För att få de dubbel refererade sensograms, representerande endast den specifika bindande svar, är den tomma injektionen nu subtraheras från analyt injektionen (~ 37 RU, figur 3C). Sensogrammet inspelade avslöjar det karakteristiska mönstret hos en transient växelverkan. Vid injektion föreningen fasen kännetecknas av en snabb ökning av mängden ligand-bunden analyt, når steady state efter ~ 7 sekunder. Steady-state bibehålls så länge som analyten injiceras. När injektionen avslutas, tvättas cellerna med RB utlöser dissociationen fasen. Komplexet snabbt dissocierar, och som analyt tvättas bort från liganden de SPR-signal återvänder till baslinjen.

För att få kvantitativa data (pre-jämvikts och jämviktskonstanter), är ett område av analytkoncentrationer injiceras i dubbletter eller tripletter (se 8.3.1 i protokollet). (Kd) för ModBC-En interaktion som visas i figur 4 är ~ 3 x 10 -6 M, med en måttligt snabb Ka (~ 10 4 M -1 sek -1) och snabb Kd ( ~ 0.1 sek -1).

Figur 1
Figur 1. Illustration av stegen i en SPR experiment med användning av en Ni-NTA-sensorchip. (A (B - D) Illustration av Fc = 2-1 Sensogram inspelad under en SPR experiment. I cykel 2 som hans-märkta liganden injiceras över Ni-laddad yta, massa gradvis ackumuleras. Injektion avslutas när nå en slutlig RU värde på mellan 1,000-5,000 RU (beroende på liganden s MW). En baslinje bildas, vilket återspeglar den stabila bindningen av liganden till chipet. I cykel 3, är en tom injektion förformad, injicera komponenterna i analytprov med undantag endast analyten. I denna injektion ofta en låg respons registreras (1-5 RU). I cykel 4 analyten injiceras med samma regim som den tomma injektionen. Den ökande RU reflekterar massaförändringen på ytan, dvs bindningen av analyten till liganden. Signalen ökar snabbt och sedan platåer som the-systemet når jämvikt. När injektionen slutar dissocierar analyten från liganden, vilket resulterar i en minskning av signalen och återgå till baslinjenivåer.

Figur 2
Figur 2. På rad övervakning av ligand belastningar. (A) Unsubtracted kurvor av ligand belastning. Den liganden av intresse (ligand "A") laddas flöda cell 2 (Fc = 2, svart) fram till att nå önskad RU-nivå (~ 3500 RU i detta exempel). Sedan är den negativa kontrollen liganden (ligand "B") stegvis lastas på flödescell 1 (Fe = 1, grå) tills en identisk RU nivån har nåtts. (B) De två injektioner utförs i (A) övervakas i realtid som en Fc = 2-1 subtraktion. Denna övervakning underlättar identisk lastning av ligander av intresse och kontroll.

"Bild Figur 3. Dubbel referenser. (A) dubbletter av en 2-1 subtraktion (dvs Fc = 01/02) av ämnet injektion. (B) Som i (A), endast analyt injiceras. (C) Slut sensograms efter subtraktion av bakgrundsresponsen som visas i (A) från det uppmätta svaret i (B). Dessa kurvor kallas "double blanked" eller "dubbel refererade". Duplikat är av sekventiella cykler.

Figur 4
. Figur 4. Fastställande av kinetiska konstanter genom injektioner av multipla analytkoncentrationer (i dubbletter) De svarta linjerna är de passar som beräknades med hjälp av en enkel 1: 1 Langmuir interaktionsmodell.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

SPR är en mycket känslig metod för att studera molekylära interaktioner, och är ofta den enda metod som ger realtidsövervakning av transienta (men viktiga) interaktioner. Ett exempel är den övergående samverkan som presenteras häri, som inte kunde upptäckas genom någon annan metod (pull-down-analyser, liposomer sedimente 6 analyser). Dessutom medan andra metoder är begränsade till jämvikt mätningar (oavsett om kvantitativ eller kvalitativ), är SPR en av de enda tekniker som mäter även pre-jämvikts kinetik.

Dess ökad känslighet är också dess varning. Falskt positiva sensograms lätt registreras. Det rekommenderas därför att fastställa förekomsten av samspelet med andra metoder innan du försöker SPR mätningar. Förkunskaper i systemets egenskaper (grov bedömning av K D, stabil kontra gående samverkan) är till stor hjälp med att inrätta SPR experiments och utvärdera den funktionella betydelsen av de erhållna mätningarna. En viktig fråga att tänka på innan du börjar SPR mätningar är kvaliteten på proteinprover. SPR är mycket känslig för aggregat och dessa måste tas bort från både liganden och analyten preparat (genom gelfiltreringskromatografi eller ultracentrifuge om möjligt). En annan källa till brus och falska signaler kan bero på buffert obalanser mellan RB och bufferten av analyten. Detta kan lösas genom att dialysera analyten mot RB, eller genom att använda en högkoncentrerad beredning av analyten som späds många veck (~ 100-1000-faldigt) in i RB. Falskt positiva data kan också vara resultatet av icke-specifika interaktioner av analyten med chipets matrisen eller med den negativa kontrollen. Dessa interaktioner är av låg affinitet, så ibland kan undvikas genom användning av låga analytkoncentrationer. Dessutom inkludering av låg BSA och / eller tvättmedelskoncentrationer (0,1 mg / ml och / eller 0,05-0,1% (Vikt / vol), respektive) till RB och till den injicerade analytprovet kan minska icke-specifika interaktioner. Ändra innehållet i den negativa kontrollcellen (annan negativ kontroll) är en annan strategi för att hantera icke-specifika bindnings frågor. Alternativt, med användning av en annan typ av chip kan också påverka kvaliteten på data. Olika typer av sensorchip är kommersiellt tillgängliga, baserade på olika kemier. I den mest vanligen använda sensorchip (CM-5 chipset) karboximetylerad dextran är kovalent fäst till en guldyta. Proteiner kan kopplas kovalent till sensorytan genom att använda en variation av mycket enkla ytan kemier (vanligast amin eller tiol koppling). Men i våra händer, när man arbetar med membranproteiner kovalent immobilisering ofta ger artefakter och är alltså inte metoden för val. I samband med studiet av ett membranprotein, är det anmärkningsvärt att det finns kommersiella marker som är belagda med lipofila molekyler. Dessa gör det möjligt immobsering av membranproteiner på en infödd-liknande miljö. Liknande sensorchips kan också framställas "in house". För en beskrivning av andra kopplingsmetoder ser 10,11. Protokollet som beskrivs häri är baserad på användning av Ni-NTA-chip för immobilisering av ett His-märkt, detergent solubiliserat transportör (analyten inte är His-märkt att undvika analyt som binder till spånytan). I vår erfarenhet 6,12, kinetiska konstant härrör från försök utförda med Ni-NTA marker är i god överensstämmelse med dem som fastställs i native-liknande miljöer. Även Ni-NTA-chips är relativt dyra, är deras främsta fördelen att de kan skalas av ligand och återanvändas. Hundratals mätningar kan göras per chip. Dessutom är liganden orientering på chipet bestäms av läget för hans-taggen och är därmed ganska homogen.

När en interaktion har framgångsrikt registrerats av SPR, en serie av kontroller och RepeATS behövs för att kontrollera giltigheten av SPR-signalen. Kontroll av följande parametrar kan hjälpa att validera SRP uppgifter:

1. Specifika uppgifter om det SPR signal: på grund av den höga känsligheten hos SPR, är av särskild betydelse att lämpliga negativa kontroller. Icke-specifik interaktion registreras av SRP kan bero på adsorptionen av en analyt till matrisen. Därför, är en tom flödescell ofta inte det bästa alternativet eftersom en flödescell laddat med protein (liganden) inte är kemiskt ekvivalent med en tom flödescell. Ett bättre alternativ är att använda en inaktiv mutant variant av liganden, en som är känd att inte binda analyten. Alternativt kan man använda en likaledes muterad analyt. Om sådana mutanter är inte tillgängligt ett homologt protein (men med olika bindningsspecificitet) kan användas 12. Exempel på bra negativa kontroller är en homolog ligand (såsom beskrivs här), eller en punktmutation i en av de interagerande partners som är kända föravskaffa föreningen. En annan rekommenderad negativ kontroll är förändring av en posttranslationell modifiering (t.ex., fosforylering, metylering, tiol härledning) som är nödvändig för interaktionen. Till exempel, de-fosforylering av en tyrosin som är väsentligt för domän interaktion SH2. Andra negativa kontroller kan vara systemspecifika. Vid användning av SPR, kan vikten av att använda strikta negativa kontroller inte överskattas.

2. Reproducerbarhet av SPR signal: SPR är en extremt reproducerbar metod. När lika ligand belopp lastas på biosensorchip och lika koncentrationer av analyten injiceras upprepning bör sluter (se figur 3).

3. Regenerering av systemet: i interaktioner med en långsam dissociation hastighet (k d), analyten måste strippad från liganden samtidigt bevara den funktionella och strukturella integritet latter. Om dissociation och / eller förnyelse är ofullständig kommer SPR signalen gradvis sönderfalla vid efterföljande injektioner av analyten. Typiska regenereringsförhållanden som kan testas är höga koncentrationer av Mg 2 + (upp till 2 m), sura eller basiska förhållanden (t ex 10 mM glycin pH 2,5, 10 mM NaOH), hög salthalt (upp till 4 M NaCl), eller hög koncentration rengöringsmedel (t.ex. 1% DDM). Dock är regenere effektiva dessa reagenser (och andra) mycket systemspecifika och därmed regenere villkor måste testas. I vissa fall är interaktionen så stabil och stark att regenerering är aldrig fullständig, såsom i fallet med E. coli vitamin B 12 transportsystem (BtuCD-F) 7. Under sådana förhållanden är det enda alternativet att strippa liganden från biosensorchip och ladda om ett nytt parti för varje injektion. I de fall där dissociation av analyten från liganden är snabb och fullständig yta regenerering är onödig(Se protokoll och Figurerna 2-3).

4. Membranproteiner alltid renas i närvaro av tvättmedel, vilket kan påverka SPR känslighet och reaktionshastigheter. Men i vår erfarenhet med BtuCD, de uppmätta priserna är mycket lika. Man måste alltid erhålla stödjande bevis använder gratis metoder som storlek (SEC), pull-down-analyser, liposomer sedimenteanalys, etc. Till exempel en korrelation mellan SPR och andra tekniker har visat för metionin, vitamin B 12, och två molybdat system 6,12.

Felaktig bestämning av kinetiska konstanter uppstår ofta under anpassningsprocessen. Som en tumregel, gäller alltid den enkla Langmuir 1: 1 interaktionsmodell för analys kinetiska experiment. De mer komplexa modeller göra ytterligare antaganden om konformationsförändringar, bivalent analyt eller prov heterogenitet. Dessa antaganden ska varagörs endast om det stöds av bevis från andra experimentella metoder. Observera att tillämpa dessa modeller kommer sannolikt leda till en bättre montering och lägre Chi 2 värden, men detta bör inte ses som ett vittnesbörd för sin tillförlitlighet. De högre frihetsgrad som ges av de mer komplexa modeller är vanligtvis ansvariga för bättre passform, snarare än deras mekanistiska relevans.

En av fördelarna med SPR är den breda kemisk kompatibilitet, speciellt med avseende på tvättmedel som används för att solubilisera och rena membranproteiner. Emellertid, sackaros och glycerol (och andra viskösa lösningar) som ofta tillsätts under reningsprocessen av membranproteiner har dramatiska effekter på RU. Det rekommenderas därför att undvika dessa om möjligt, eller åtminstone minska deras koncentration. Vid användning av viskösa lösningar, undvika mismatch buffert blir avgörande. Lägga lipider till ett rengöringsmedel innehållande RB kan förstärka bindningen tecknetal med så mycket som tio gånger. Dock är en sådan strävan dyrt (för de flesta lipider) och tenderar att förkorta livslängden på biosensorchips.

De tips och felsökning som anges ovan kan hjälpa till när kalibrering ett nytt system. Emellertid kräver ett givet system ofta specifika justeringar (t.ex. val av detergent, salt, pH) för att uppnå optimala resultat.

SPR har länge setts som en kraftfull och unik metod för att mäta molekylära interaktioner. Under senare år har tillgången på olika SPR plattformar och deras sjunkande priser har gjort SPR mer tillgänglig. Det har snabbt blivit den gyllene standarden tillvägagångssätt för att studera protein-proteininteraktioner, målprotein-läkemedelsinteraktioner, och i att upptäcka bly småmolekylinhibitorer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biacore T200 GE Healthcare 28-9750-01
Sensor Chip NTA  GE Healthcare 14100532
BIAevaluation GE Healthcare
Biacore T200 Software  GE Healthcare
Nickel chloride Sigma N6136
Sodium tungstate dihydrate Sigma T2629
Sodium Chloride  Bio-Lab LTD. 19030591
Trizma base Sigma T1503
Ethyldiamine-tetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) Sigma E5134
n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside (DDM) Affymetrix D310
Sodium dodecyl sulfate solution  Sigma 05030
Kimwipes KIMTECH Kimberly-Clark 34120
Hydrochloric acid GADOT 7647-01-0
Nylon (NY) Membrane Filter Sartorius 25007--47------N
ModBC ABC transporter Lewinson lab
RbsBC ABC transporter Lewinson lab
ModA Substrate Binding Protein Lewinson lab

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rich, R. L., Myszka, D. G. Advances in surface plasmon resonance biosensor analysis. Current Opinion in Biotechnology. 11, 54-61 (2000).
  2. Rich, R. L., Myszka, D. G. H. igher-throughput label-free, real-time molecular interaction analysis. Analytical Biochemistry. 361, 1-6 (2007).
  3. Helmerhorst, E., Chandler, D. J., Nussio, M., Mamotte, C. D. Real-time and label-free bio-sensing of molecular interactions by surface plasmon resonance: a laboratory medicine perspective. The Clinical Biochemist Reviews. 33, 161 (2012).
  4. Kyo, M., et al. Evaluation of MafG interaction with Maf recognition element arrays by surface plasmon resonance imaging technique. Genes to Cells. 9, 153-164 (2004).
  5. Katsamba, P. S., Park, S., Laird-Offringa, I. A. Kinetic studies of RNA–protein interactions using surface plasmon resonance. Methods. 26, 95-104 (2002).
  6. Vigonsky, E., Ovcharenko, E., Lewinson, O. Two molybdate/tungstate ABC transporters that interact very differently with their substrate binding proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 110, 5440-5445 (2013).
  7. Lewinson, O., Lee, A. T., Locher, K. P., Rees, D. C. A distinct mechanism for the ABC transporter BtuCD-BtuF revealed by the dynamics of complex formation. Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 332-338 (2010).
  8. Kyo, M., Usui-Aoki, K., Koga, H. Label-Free Detection of Proteins in Crude Cell Lysate with Antibody Arrays by a Surface Plasmon Resonance Imaging Technique. Analytical Chemistry. 77, 7115-7121 (2005).
  9. Mori, T., et al. Evaluation of protein kinase activities of cell lysates using peptide microarrays based on surface plasmon resonance imaging. Analytical Biochemistry. 375, 223-231 (2008).
  10. Mol, N., Fischer, M. E. Surface Plasmon Resonance Vol. 627 Methods in Molecular Biology. Mol, N. J., Fischer, M. J. E. 1, Humana Press. 1-14 (2010).
  11. Van Der Merwe, P. A. Surface plasmon resonance. Protein– ligand interactions: hydrodynamics and calorimetry. , Oxford University Press. Oxford. 137-170 (2001).
  12. Lewinson, O., Lee, A. T., Locher, K. P., Rees, D. C. A distinct mechanism for the ABC transporter BtuCD-BtuF revealed by the dynamics of complex formation. Nat. Struct. Mol. Biol. 17, 332-338 (2010).

Tags

Strukturbiologi ABC transportör substrat bindande protein biomolekylära interaktions kinetik etikett fritt interaktion protein-protein Ytplasmonresonans (SPR) Biacore
Realtid Mätningar av membranprotein: Receptor interaktioner Använda Surface Plasmon Resonance (SPR)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Livnat Levanon, N., Vigonsky, E.,More

Livnat Levanon, N., Vigonsky, E., Lewinson, O. Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR). J. Vis. Exp. (93), e51937, doi:10.3791/51937 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter