Summary
Nous décrivons ici un protocole que les couples deux techniques de protéomique, à savoir 2 dimensions électrophorèse (2DE) et la spectrométrie de masse (MS), d'identifier exprimés de manière différentielle / protéines modifiées post-traductionnelles entre deux ou plusieurs groupes d'échantillons primaires. Cette approche, avec des expériences fonctionnelles, permet l'identification et la caractérisation de marqueurs / cibles thérapeutiques pronostiques.
Abstract
L'identification des molécules impliquées dans l'initiation et la progression de la tumeur est essentielle à la compréhension de la biologie de la maladie et, en conséquence, pour la prise en charge clinique des patients. Dans le présent travail, nous allons décrire une approche protéomique optimisé pour l'identification des molécules impliquées dans la progression de la leucémie lymphoïde chronique (LLC). Dans le détail, les lysats de cellules leucémiques sont résolus par électrophorèse en 2 dimensions (2DE) et visualisées sous forme de "taches" sur les gels de 2DE. Analyse comparative des cartes protéomiques permet l'identification de protéines exprimées de façon différentielle (en termes d'abondance et de modifications post-traductionnelles) qui sont cueillies, isolé et identifié par spectrométrie de masse (MS). La fonction biologique des candidats identifiés peut être testée par des dosages différents (c.-à-migration, l'adhésion et la polymérisation de l'actine F), que nous avons optimisé pour les cellules leucémiques primaires.
Introduction
La leucémie lymphoïde chronique (LLC), la leucémie de l'adulte le plus fréquent dans les pays occidentaux, découle de l'accumulation de CD5 + lymphocytes B néoplasiques monoclonaux et est cliniquement très hétérogène. Il peut être présent sous une forme pré-leucémique, définie comme une lymphocytose monoclonal cellules B (MBL) 1,2,3. Dans d'autres cas, la maladie peut apparaître soit avec une évolutivité clinique, qui peut rester stable pendant des années avant d'avoir besoin de traitement, ou comme une maladie progressive avec chemorefractory mauvais pronostic malgré le traitement. Enfin, elle peut évoluer en un lymphome de haut grade fréquemment mortelle (syndrome RS de Richter) 2,3,4. Les patients sont généralement classés en deux sous-ensembles principaux: bon et mauvais pronostic, basé sur un ensemble de facteurs pronostiques qui fournit des informations complémentaires sur les prédicteurs de l'issue de la maladie et de la survie. L'hétérogénéité clinique reflète probablement l'hétérogénéité biologique. Un certain nombre de facteurs génétiques, microenvironnement et CEIl a été démontré facteurs llular de concourir à la pathogenèse de la maladie mais pas de mécanismes fédérateurs ont été trouvés 5. Dans le détail, plusieurs études ont démontré que les différences dans l'évolution clinique de la maladie peuvent s'expliquer en partie par la présence (ou l'absence) de certains marqueurs biologiques qui ont une valeur pronostique de 6,7,8. Ces données ont démontré qu'une meilleure compréhension de la biologie de la maladie pourrait fournir des indices supplémentaires pour la prise en charge clinique de la pathologie, par l'identification de deux marqueurs pronostiques et cibles thérapeutiques.
L'objectif du présent document est de montrer comment une combinaison de différentes techniques de protéomique peut être utilisé pour l'identification de protéines impliquées dans la LLC apparition et la progression. Notre approche démontre qu'il est possible de rejoindre protéomique ensemble de base et les données cliniques 5.
Dans le présent flux de travail, les cellules leucémiques primaires chez certains patients(Bon vs mauvais pronostic) sont isolés et les lysats cellulaires sont ensuite utilisés pour obtenir des cartes protéomiques. 2DE permet la caractérisation du profil protéomique d'une population de cellules, y compris des modifications post-traductionnelles, donnant ainsi des informations indirectes sur l'activité biologique de chaque protéine. Des lysats de cellules entières sont réglées par un premier passage de dimension sur la base du point isoélectrique, suivie d'une seconde dimension sur un gel de polyacrylamide qui permet de résoudre les protéines en fonction de leur poids moléculaire. Analyse comparative des cartes protéomiques permet l'identification de protéines différentiellement exprimés (à la fois en termes d'abondance et de modifications post-traductionnelles) comme des taches sur le gel qui peuvent être coupés et analysés par spectrométrie de masse. Le rôle de chaque candidat peut alors être exploité par différents tests.
Cette approche, limitée à CLL dans le manuscrit actuel, peut être facilement étendue à d'autres maladies / échantillons, fournissant ainsi des informations sur la proteomic / les différences biologiques entre les deux groupes (c.-à-pathologiques vs normale, stimulés vs, de type sauvage non stimulées vs knockdown).
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Protocol
REMARQUE: Tous les échantillons de tissus ont été obtenus avec l'approbation du comité d'éthique de l'hôpital San Raffaele (Milan, Italie).
1. échantillons de tissus humains et de cellules purification (Figure 1)
REMARQUE: les lymphocytes leucémiques ont été obtenues à partir du sang périphérique (PB) de patients atteints de LLC, diagnostiqués selon Mulligan et al 9.
1.1) cellules leucémiques séparation de PB
- Recueillir PB en collecte de sang tubes Vacutainer avec héparine de sodium.
- Transférer le sang dans un tube de 15 ml et ajouter des cellules B humaines enrichissement cocktail à 50 ul / ml de sang entier. Bien mélanger et incuber 20 min à température ambiante.
- Diluer l'échantillon avec un volume égal de PBS + 2% de FBS, mélanger le sang avec douceur et précaution superposition sur le Ficoll, veillant à ne pas briser l'interface. Utilisez au moins une partie de Ficoll à 2 parties de l'échantillon dilué (soit 4 ml de Ficoll + 10 ml de sang dans un 15 ml tube).
- Centrifuger à 400 xg, à température ambiante (20 ° C) pendant 20 min sans frein. Les cellules mononucléaires seront à l'interface.
- Aspirer soigneusement l'interface pour récupérer les cellules et les placer dans un nouveau tube. Laver les cellules une fois avec du PBS et on centrifuge à 300 x g, 4 ° C dans l'obscurité pendant 5 minutes. Le culot sera en bas.
- Jeter le surnageant. Reprendre le culot dans le surnageant restant en tapotant le tube d'avant en arrière avec les doigts. On dilue le culot avec 10 ml de milieu RPMI complet (RPMI 1640 supplémenté avec 10% de sérum de veau foetal et 15 mg / ml de gentamicine) et compter les cellules à l'aide de la méthode d'exclusion au bleu Trypan.
1.2) L'évaluation de la pureté
REMARQUE: Pureté de toutes les préparations doit toujours être supérieure à 99%.
- Incuber 100 pi de suspension cellulaire purifiée avec les anticorps suivants (disponibles dans le commerce; voir le tableau des matériaux): CD3 FITC (5 pi / test), CD14 PE (5 pi / essai), CD19 DPE (6 pi / essai), CD16-CD56 PC5 (2 pi / essai), CD5 PC7 (4 pi / essai), pendant 20 min à 4 ° C dans un Tube FACS.
- Laver l'échantillon avec 4 ml de PBS (centrifugeuse pendant 5 min à 300 g) et vérifier la pureté par flux cytometry.Check dans le complot du% de cellules leucémiques (> 99%) qui co-expriment CD19 et CD5 sur leur surface comme représenté sur la figure 1 (6). Veiller à ce que les préparatifs sont pratiquement dépourvues de NK, lymphocytes T et les monocytes en cochant la% de CD3, CD14 et CD16-56 dans le complot, qui devrait être proche de zéro.
1.3) Les échantillons de stockage
- Pour les études protéomiques, collecter 25 x 10 6 cellules dans un tube de 1,5 ml, les cellules de centrifugation à 300 g pendant 10 min, jeter le surnageant et lyophiliser boulettes pendant 4 heures. Conserver à -80 ° C jusqu'à utilisation.
- Pour les essais de validation, remettre les cellules en RPMI complet (quantité dépend de l'analyse en outre que c'estchoisi) et passez à l'étape 4.
2 électrophorèse bidimensionnelle (2-DE) (figure 2)
2.1) isoélectrofocalisation (IEF)
- Solubiliser les cellules CLL pastilles avec un volume final de 380 ul de 2-DE tampon (344 ul d'une solution RBthio (9 M d'urée, Tris 10 mM, 4% de CHAPS), 30 pl de 65 mm de DTT, 6 ul de 2% IPG ampholine tampon pH 7.4).
- Appliquer les échantillons de protéines (1 mg) à 18 bandes IPG (pH 4-7) et effectuer IEF suivant le protocole standard telle que décrite par Conti et al. 10
- Equilibrer les bandes dans 2 ml de tampon d'équilibration (EB: tampon 50 mM pH 8.8 contenant du Tris-HCl 6 M d'urée, 30% de glycerol, 2% de SDS), additionné de 2% de frais de DTT pendant 15 minutes à température ambiante. Jeter EB + TNT et ajouter 2 ml de EB complétés avec 2,5% Iodoacetamide. Incuber pendant 15 min à température ambiante sur un agitateur oscillant.
2.2) SDS-PAGE
- Sécher les plaques sur un papier sans toucher le gel pour éliminerl'excès de EB. Chargez chaque bande sur le dessus d'un gel de 9-16% de SDS-PAGE gradient. Ajouter une petite quantité d'électrophorèse SDS-tampon (Tris 25 mM, glycine 192 mM, SDS 0,1% p / v) sur le dessus du gel, pour faciliter le chargement de la bande.
- Sceller le gel par addition de ~ 5 ml de solution d'agar (0,8%) afin d'éviter de flotter la bande, puis l'assemblage de l'unité d'électrophorèse et remplir avec du tampon SDS-électrophorèse. Effectuer la course à 60 mA / gel pendant 4 heures à 4 ° C.
- Retirer le gel de l'unité d'électrophorèse et le placer dans la boîte de bonne coloration.
2.3) coloration à l'argent pour préparative de gel
| FIXER | 50% methanol 12% d'acide acétique 0,05% de formol | 2 heures (ou toute la nuit) * |
| TAMPON DE LAVAGE | 35% Ehanol | 20 min (répéter l'étape trois fois) |
| SENSIBILISATION | 0,02% de thiosulfate de sodium | 2 min |
| WASH | H 2 O | 5 min (répéter l'étape trois fois) |
| NITRATE D'ARGENT | 0,2% de nitrate d'argent 0,076% formol | 20 min |
| WASH | H 2 O | 1 min (répéter l'étape deux fois) |
| DÉVELOPPEUR | 6% de carbonate de sodium 0,0004% de thiosulfate de sodium 0,05% de formol | Jusqu'à ce que la coloration est suffisante |
| Arrêtez | 50% de méthanol | 30 min |
| * 2 heures est le temps minimum nécessaire pour fixation de la protéine |
Tableau 1.
REMARQUE: les taches de protéines peuvent être visualisées par coloration des gels avec MS compatible coloration à l'argent 11. Toutes les solutions nécessairespour coloration à l'argent sont énumérées dans le tableau 1.
- Préparer environ 200 ml de chaque solution / gel et procéder comme indiqué dans le tableau 1. Ajouter délicatement chaque solution à la boîte de coloration contenant le gel. Effectuer toutes les incubations sur une plate-forme à bascule.
- Après la coloration, enlever la solution d'arrêt et laisser le gel dans une solution de 1% d'acide acétique jusqu'à ce que l'acquisition.
2.4) Gel d'acquisition et d'analyse
- Acquérir des images à haute résolution à l'aide d'un densitomètre dans les 3 jours à partir de la coloration.
- Analyser les modèles de protéines 2-D en utilisant un logiciel de 2-DE gels.
REMARQUE: Le logiciel permet une comparaison d'image rapide et fiable.- Créez un projet en choisissant "créer un nouveau projet" dans le menu contextuel. Créez un dossier et importer les gels en choisissant "images de gel d'importation" avec .tif, png. ou .gel prolongation.
- Une fois que les gels sont importés et ajoutés à la workspace, effectuer une détection d'angle automatique en sélectionnant les gels pour la détection de place et en choisissant "edit> place> détecter" dans le menu.
- Ensuite, effectuer une soustraction de fond en sélectionnant dans le menu "fond soustraction". Remarque: Après cela, il est possible de comparer plusieurs gels et de détecter des différences ou des similitudes par l'analyse quantitative et / ou qualitative.
3 Identification des protéines par MALDI-TOF MS (Figure 3)
3.1) La digestion des protéines
- Rincer le gel avec des taches d'eau et d'accise d'intérêt à partir de gels soit par manuel (coupant avec un scalpel propre) ou par excision automatisée.
- Laver les particules de gel avec de l'eau (100-150 pi), tourner vers le bas (30 sec à 400 xg) et enlever le liquide.
- Ajouter un volume égal (en fonction du volume de gel) de CH 3 CN pour les morceaux de gel et attendre pendant 10-15 min jusqu'à ce que les morceaux de gel se rétrécir. Sécher les particules de gel ina centrifugeuse sous vide.
- Ajouter 75 à 100 ul de 10 mM de dithioérythritol dilué dans 50 mM de NH 4 HCO 3 et incuber pendant 30 min à 56 ° C (étape de réduction). Réduction de nouveau les morceaux de gel avec CH 3 CN comme décrit à l'étape 3.1.3.
- Procéder à alkylation en ajoutant 75-100 ul d'une solution à 55 mM Iodoacetamide dilué dans 50 mM NH 4 HCO 3 et incuber pendant 20 min à température ambiante dans l'obscurité.
- Réduction de la taille des morceaux de gel une fois avec CH 3 CN en utilisant un volume suffisant pour recouvrir les morceaux de gel comme décrit dans l'étape 3.1.3. Sec dans une centrifugeuse sous vide.
- Réhydrater les particules dans un tampon contenant 25 mM de NH 4 HCO 3, 5 mM de CaCl2, et 12,5 ng / ul de trypsine à 4 ° C pendant 20 min. Utilisez un volume suffisant de tampon pour couvrir les morceaux de gel. Eliminer le surnageant de non absorbé par les morceaux de gel et ajouter mM NH 25 4 HCO 3, 5 mM de CaCl2 sans trypsine à cover le gel.
- Laisser les échantillons à 37 ° C au moins 3 heures (le délai minimum requis pour le peptide digestion) pour la nuit.
3.2) Spectrométrie de masse analyse (technique de gouttelettes séchées)
- Coin 1 ul aliquote de chaque échantillon sur une plaque MALDI en acier inoxydable et mélanger avec 1 pi d'α-cyano-4-hydroxycinnamique comme matrice, préparées dans 50% de CH 3 CN et 0,1% de TFA.
- Obtenir des spectres de masse sur un spectromètre de masse MALDI-TOF. Accumuler environ 200 spectres par endroit, en ajustant l'intensité du laser pour éviter la saturation du signal ou pour augmenter le signal. spectres de processus via le logiciel Data Explorer comme décrit ci-dessous:
- Importez le fichier dat et effectuer la correction de base en choisissant "processus> correction de base". Calibrer masses en utilisant les produits d'autolyse de la trypsine et les sommets de la matrice en choisissant "processus> étalonnage de masse> étalonnage manuel; sélectionnez pics proches de m / z 855,1 et 2163,1 by faisant glisser à gauche et sélectionner les masses de référence correspondant, puis cliquez sur «complot» et «s'applique calibrage" dans la fenêtre de calibrage manuel.
- Régler le seuil de détection de crête ("pic> détection de crête"), dupliquer la trace active ("affichage> dupliquer trace active"), sélectionnez la nouvelle trace et effectuer la deisotoping ("pic> deisotoping"). Utilisation de la macro "getpeaklist", générer une liste de masses à être utilisé pour l'identification. Si nécessaire, supprimer manuellement les signaux de bruit cueillis comme des pics pour nettoyer la liste et obtenir une meilleure identification.
- Identifier les protéines par la recherche d'une base de données de protéines non-redondant complet utilisant profonde et Mascot les moteurs de recherche 12.
- Utilisez les paramètres suivants dans toutes les recherches: on a manqué clivage par peptide, l'oxydation de la méthionine comme modification dans une variable, la cystéine carbamidomethylation que la modification fixe et une initial masse tolérance de 50 ppm.
4. cytosquelette des tests d'activité (Figure 4)
REMARQUE: Remettre en suspension les cellules purifiées à l'étape 1 dans du milieu RPMI complet (10 6 cellules / 200 ul).
4.1) Migration dosage. Cet essai permet la quantification de la capacité de migration des cellules analysées (lymphocytes). Utiliser une chambre Transwell de 6,5 mm de diamètre et 5,0 pm de taille de pores et effectuer les essais en triple exemplaire. Optimiser la taille des pores et le temps de migration (étape 4.1.3) dans le cas de différents types de cellules.
- Préparer la chambre inférieure en ajoutant 600 ul de RPMI complet avec ou sans stimuli spécifiques (SDF-1) pour mesurer la migration spontanée et induite par l'respectivement.
- Mettre la chambre supérieure et à laisser le système s'équilibrer pendant 30 minutes à 37 ° C dans l'incubateur.
- Semences 10 6 cellules / 200 pi dans la chambre haute (nombre total de cellules) et incuberla plaque pendant 4 heures à 37 ° C dans l'incubateur.
- Retirer la chambre haute, recueillir les médias dans la chambre inférieure et laver la chambre basse une fois avec 1 ml de PBS. Recueillir le PBS dans le tube.
- Centrifugeuse 5 minutes à 300 g, éliminer le surnageant et remettre en suspension dans 500 ul de PBS.
- Par cytométrie en flux, compter le nombre de cellules ayant migré après 1 min de l'acquisition. Dans le cas d'une population cellulaire isolée, il n'est pas nécessaire d'ajouter un anticorps de surface. Vérifiez le nombre de cellules dans un complot point bidimensionnel considérant les disperse secondaires des cellules et le nombre d'événements visualisés en 1 min, ce qui est le nombre à utiliser pour le calcul.
- Calculer l'indice de migration (MI) que:
4.2) test d'adhérence. Ce test permet de mesurer la capacité d'adhérence des cellules. Effectuer les essais en triple exemplaire.
- Pré-manteau 96 wells plaque (-fond plat) avec 50 ul / puits soit de 2% de BSA-PBS (comme arrière-plan) ou 1 ug d'ICAM-1 dilué dans du PBS pendant une nuit à 4 ° C.
- Laver la plaque deux fois avec du PBS et de bloquer les sites non spécifiques par addition de 2% de BSA-PBS (100 pl / puits) pendant 1 heure à 37 ° C.
- Dans les cellules attendant de remettre les à 5 x 10 6 / ml dans RPMI complet, les étiqueter avec tracker cellule 1 mM CMFDA-vert et incuber 30 min à 37 ° C.
- Ajouter 1 x 10 6 cellules / puits dans les puits pré-enduits après avoir écarté la solution de blocage (étape 4.2.2) et incuber 1 h à 37 ° C.
- Quantifier l'adhérence à l'aide d'un lecteur ELISA (excitation filtre: 485 nM, filtre d'émission: 535 nm). Effectuer une première mesure sur l'apport total (INPUT).
- Laver la plaque doucement avec 2% de BSA-PBS (200 pl / puits) 4 fois (x). Effectuer une lecture de la plaque après chaque étape de lavage (adhérence de x).
- Après soustraction de fond pour chaque mesure, calculer ADHES spécifiquesion (ADHESION):
4.3) essai de polymérisation. Il s'agit d'un test colorimétrique qui quantifie la polymérisation de l'actine F. Effectuer les essais en triple exemplaire.
- Remettre en suspension 1x10 ^ 6 cellules dans 100 pl d'préchauffé RPMI complet et ajouter le stimulus spécifique (c.-à-α-IgM 20 pg / ml) pendant 10 min.
- Arrêter la réaction avec 400 pl de 4% de paraformaldéhyde et de fixer les cellules pendant 10 min à température ambiante.
- Laver 3 fois avec du PBS (centrifugation à 300 xg pendant 5 min, 4 ° C).
- Jeter le surnageant et perméabiliser les cellules avec du PBS-saponine 0,2% (200 ul) sur de la glace pendant 2 min.
- Laver 3 fois avec du PBS-saponine 0,1% (centrifugeuse à 100 g pendant 5 min, 4 ° C), jeter le surnageant et remettre en suspension dans 100 ul de PBS-saponine 0,1%.
- Colorer avec phalloïdine-AlexaFluor 488 (3 pg / ml) pendant 30 min à la salle tEMPÉRATURE dans l'obscurité.
- Laver 3 fois avec du PBS-0.1% saponine. Jeter le surnageant et remettre en suspension dans 300 ul de PBS.
- Quantifier la quantité de F-actine par cytométrie de flux, calcul de l'intensité Floraison moyenne (MFI) de la phalloïdine. Analyser les données générées dans une parcelle de dimension unique afin de produire un histogramme basé sur l'intensité de fluorescence, la valeur de MFI est indiqué dans le rapport de graphique.
- Mesurer la polymérisation d'actine (Δ F-actine) comme:
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Representative Results
Nous avons isolé les cellules leucémiques primaires B forment PB de patients atteints de LLC et nous avons analysé les cartes protéomiques. Les échantillons (n = 104) ont été regroupées en deux sous-ensembles principaux sur la base des caractéristiques cliniques de chaque patient (mauvais pronostic vs bon pronostic) et l'analyse comparative des gels 2DE a été réalisée.
L'analyse a permis d'identifier des points exprimés de manière différentielle entre les deux sous-ensembles (en terme de présence / absence ou le décalage sur le gel, ce qui implique des changements dans les modifications post-traductionnelles, n ≈ 16). Nous excisé points sélectionnés dans les gels de 2DE et après avoir été réduite et alkylée, les protéines sont digérées par la trypsine et les peptides dans le surnageant résultant ont été repérés sur une plaque MALDI. Les spectres ont été acquis dans un MALDI-TOF Voyager DE. La liste des pics résultant a été soumis à MASCOT et profonde. Masses à l'intérieur d'une certaine tolérance de masse sont affectés à des séquences peptidiques de la base de données, et ensuite assemblées en une protéine, qui est considéréidentifié si elle dépasse un certain score de probabilité (figure 3). Par cette analyse, nous avons identifié principalement des protéines impliquées dans l'activité du cytosquelette et les processus métaboliques (données non publiées).
Parmi eux, nous nous sommes concentrés sur spécifique hématopoïétique lignée de cellules-protein-1 (HS1), dont la phosphorylation différentielle fortement associé à l'évolution clinique de la maladie (Figure 4). En particulier, nous avons constaté que les patients portant un seul endroit (n = 44, hyper-phosphorylée HS1) l'expérience d'un mauvais résultat clinique, alors que les patients avec 2 points (n = 60, hypo-phosphorylée HS1) ont un bon pronostic 13 (Figure 4 ). La présence de la protéine dans les taches HS1 est ensuite validé par le gel 2DE immunoblot avec un anticorps monoclonal contre HS1 13.
Comme on sait que HS1 est impliquée dans le remodelage du cytosquelette 14, nous avons procédé à des essais in vitro pour tester if l'état de phosphorylation HS1 pourrait affecter différemment l'activité du cytosquelette dans les deux sous-ensembles (bons vs mauvais pronostic) CLL. Nous avons constaté que les cellules de LLC portant HS1 comme un endroit ont une activité du cytosquelette déficience en termes de migration, l'adhésion et la polymérisation de l'actine, par rapport aux échantillons-HS1 hypo-phosphorylée, ce qui explique un comportement clinique différent 15 (Figure 5).
Figure 1:. Flux de travail de purification de cellules leucémiques de PB sang de patients atteints de LLC sont transférées dans un tube de 15 ml (1), Human enrichissement des cellules B cocktail est ajouté à l'échantillon (2) et on incube pendant 20 minutes. Le sang est ensuite diluée avec du PBS dans une proportion de 1: 1 et posé sur la partie supérieure du gradient de densité (3). Après centrifugation échantillon (4) permet la formation de l multiple Ayers: a) le plasma, b) les lymphocytes B, c) de Ficoll, d) des globules rouges et des cellules non désirées. Lymphocytes B purifiés (b) de la couche sont ensuite collectées (5), lavé et la pureté de la préparation cellulaire est analysé par cytométrie de flux (6). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2:. Flux de 2DE Le culot est solubilisé dans un tampon 2DE (1) et chargé sur la bande IPG pour le premier cycle de dimension (2-isoélectrofocalisation). Après équilibrage, la bande est chargée sur un gel de polyacrylamide à gradient de la seconde course de dimension (3-SDS-PAGE). Le gel est ensuite coloré pour visualiser les spots / protéines (4). Après l'acquisition d'images à haute résolution, des cartes protéomiques sont analysées (5). les / ftp_upload / 51942 / 51942fig2highres.jpg "target =" _blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Flux de production de l'analyse MS (1) les points d'intérêt sont excisés du gel 2D avec un scalpel et transférées dans un tube propre.. (2) Après avoir été réduite et alkylée, les protéines sont digérées par la trypsine, les peptides dans le surnageant résultant sont déposés sur une plaque MALDI (3). Les spectres sont acquis dans un MALDI-TOF Voyager DE. (4) La liste de pointe qui en résulte est soumis aux moteurs de mascotte et profonde recherche et recherché dans une base de données de protéines non-redondant complet. (5) des masses à l'intérieur d'une certaine tolérance de masse sont affectés à des séquences peptidiques de la base de données, puis assemblées en une protéine. target = "_blank"> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: HS1 état de phosphorylation en corrélation avec le pronostic de patients atteints de LLC (1) Le cercle identifie deux points étroits avec la même masse moléculaire (MM) de 79 kDa et différent point isoélectrique (pI) de 4,83 et 4,86 respectivement, ce qui a été identifié par. MS en tant que protéine HS1 (2). (2) Deux gels représentatifs d'un mauvais pronostic (carré rouge) et un patients atteints de LLC bon pronostic (carré vert). (3) Les courbes de Kaplan-Meier montrent survie cumulatif de patients atteints de LLC regroupés selon le modèle de la phosphorylation HS1 (1 place, n = 44, contre 2 points, n = 60). Les patients avec 2 place (points verts) ont une survie significativement plus longue (survie médiane non atteinte) que ceux avec seulement un (points rouges)./files/ftp_upload/51942/51942fig4highres.jpg "target =" _blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5: la phosphorylation de la fonctionnalité HS1 influences de l'état du cytosquelette dans des échantillons leucémiques primaires (1) Migration transwell sur des échantillons primaires en présence ou en absence de SDF-1.. Dans le graphique sont affichés les moyens de SEM le nombre de cellules acquises en 1 minute au cytomètre de flux (n = 7 de 1 point HS1 vs n = 12 de 2 place HS1). (2) l'adhérence spontanée a été mesurée après marquage des cellules et une heure d'incubation dans des plaques à 96 puits. Affichés sont les moyens SEM pour les échantillons primaires (n = 7 de 1 point HS1 vs n = 12 de 2 place HS1). (3) la capacité de polymérisation d'actine des échantillons primaires. Affichés sont les moyens SEM de la suite F-actine rapportent des cellules de LLC après stimulation par SDF-1 et coloration avec la phalloïdine marquée au FITC (n = 5 1 place HS1 vs n = 5 2 place HS1). IMF: intensité de fluorescence moyenne. L'histogramme représente à titre d'exemple de l'acquisition de l'échantillon. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Le but de ce manuscrit est de décrire un protocole optimisé pour l'identification de molécules impliquées dans la pathogenèse de la CLL, même si cette approche peut être étendue à d'autres maladies et / ou d'autres types d'échantillons de 16 à 18. En comparant les profils protéomiques de 2 sous-ensembles de patients atteints de LLC, de bons vs mauvais pronostic 19, nous avons démontré que ils diffèrent dans l'état de phosphorylation de HS1 et que son activation affecte la capacité des cellules leucémiques migration et l'adhérence.
En ce qui concerne d'autres procédés, l'avantage principal des techniques protéomiques présentés dans le manuscrit, gel 2DE et MS, est qu'ils fournissent une empreinte digitale complète du protéome de la cellule et, surtout, ils donnent des informations sur les modifications post-traductionnelles des protéines. Les protéines qui sont différentiellement phosphorylées ou glycosylées changent leur position sur le gel, et susceptible de changer leur activité dans les cellules.
ove_content "> De plus, nous avons décrit les protocoles pour l'évaluation de la migration et l'adhérence de cellules qui ont été utilisés pour tester la fonctionnalité du cytosquelette, ces protocoles sont encore mal décrits pour la croissance des cellules en suspension, car ils sont généralement utilisés dans des cellules adhérentes (par exemple la cicatrisation ). La principale limite de la technique 2DE et MS est la quantité de cellules / protéines (≈25 x 10 6 cellules par gel), tandis que pour les tests fonctionnels, il est de la viabilité des cellules. Le véritable défi est de travailler sur des cellules primaires , mais pour de nombreuses maladies, il n'est pas possible d'atteindre un nombre suffisant de cellules ou de cellules vivantes pour effectuer ces expériences, dans ce cas, s'il est disponible, il est possible d'utiliser des lignées cellulaires.L'étape la plus critique pour le protocole MS est de travailler dans des conditions de propreté (kératine gratuit) afin d'éviter la contamination et pour obtenir l'identification des protéines clair. Cytosquelette dosages sont généralement difficiles à reproduire (en particulier sur primacellules ry), donc il est suggéré de réaliser l'expérience en trois exemplaires.
Comme nous l'avons démontré, la combinaison des approches présentées dans ce manuscrit aide à l'identification de nouvelles voies impliquées dans des maladies différentes, offrant ainsi à la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques, comme nous l'avons démontré pour la protéine HS1 19.
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Acknowledgments
Nous remercions l'Unité des affections malignes lymphoïdes, Elisa dix Hacken, Lydia Scarfo, Massimo Alessio, Antonio Conti, Angela Bachi, et Angela Cattaneo.
Ce projet a été soutenu par: Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro AIRC (Investigator Grant et moléculaire Programme spécial Clinical Oncology - 5 pour mille # 9965)
CS et BA conçus l'étude, les expériences réalisées, ont analysé les données et rédigé le manuscrit. MTSB, UR, FBPR aidé à la rédaction du manuscrit. PG et FCC conçus les échantillons de l'étude ont fourni des patients et des données cliniques.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitril | MERCK | 61830025001730 | |
| Ammonium Bicarbonate | SIGMA | A6141-500G | |
| 1,4-Dithioerythritol | SIGMA | D9680-5G | |
| Iodoacetamide | SIGMA | I6125-25G | |
| Calcium chloride dihydrate | SIGMA | 223506-25G | |
| Trypsin, Sequencing Grade | ROCHE | 11418475001 | |
| α-cyano-4-hydroxycinnamic acid | SIGMA | C2020-10G | |
| Trifluoroacetic acid | SIGMA | T6580 | |
| ZipTipµ-C18 | MILLIPORE | ZTC18M096 | |
| RosetteSep Human B Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL | 15064 | |
| PBS | EUROCLONE | ECB4004L | |
| FBS | DOMINIQUE DUTSCHER | S1810 | |
| Lymphoprep | SENTINEL DIAGNOSTICS | 1114547 | |
| Trypan Blue | SIGMA | T8154 | |
| CD19 | BECKMAN COULTER | 082A07770 | ECD |
| CD5 | BECKMAN COULTER | 082A07754 | PC5 |
| CD3 | BECKMAN COULTER | 082A07746 | FITC |
| CD14 | BD | 345785 | PE |
| CD16 | BECKMAN COULTER | 082A07767 | PC5 |
| CD56 | BECKMAN COULTER | 082A07789 | PC5 |
| Ettan IPGphor 3 Isoelectric Focusing Unit | GE-Healthcare | 11-0033-64 | |
| Urea | SIGMA | U6504 | |
| Tris-Hcl Buffer | BIO-RAD | 161-0799 | |
| CHAPS | SIGMA | C2020-10G | |
| DTT | SIGMA | D9163-5G | |
| IPGstrips | GE-Healthcare | 17-1233-01 | Linear pH 4-7 18cm |
| IPGbuffer | GE-Healthcare | 17-6000-86 | pH 4-7 |
| Glycerol | SIGMA | G6279 | |
| PROTEAN II XL Cell | BIO-RAD | 165-3188 | |
| SDS | INVITROGEN | NP0001 | |
| Acrilamide | BIO-RAD | 161-0156 | |
| Agarosio | INVITROGEN | 16500 | |
| Methanol | SIGMA | 32213 | |
| Acetic Acid | VWR | 631000 | |
| Formalin | BIO-OPTICAL | 05-K01009 | |
| Ethanol | VWR | 9832500 | |
| Sodium Thiosulfate | FLUKA | 72049 | |
| Silver Nitrate | FLUKA | 85228 | |
| Molecular Dynamics Personal SI Laser Densitometer | Amersham Biosciences | ||
| ImageMaster 2D Platinum 5.0 | Amersham Biosciences | ||
| Sodium Carbonate | MERCK | A0250292 | |
| MALDI-TOF Voyager-DE STR | Applied Biosystems | ||
| Data Explorer software (version 3.2) | Applied Biosystems | ||
| transwell chambre 6.6 mm diameter | CORNING | 3421 | |
| RPMI | EUROCLONE | ECB2000L | WITH L-GLUTAMINE |
| Gentamicin | SIGMA | G1397 | |
| SDF-1 | PREPROTECH | 300-28A | |
| Flat-bottom 96-well plate | BECTON DICKINSON | 353072 | |
| BSA | SANTA CRUZ | 9048-46-8 | |
| ICAM-1 | R&D Systems | 720-IC | |
| CMFDA | Life Thechnology | C7025 | Green |
| IgM | SOUTHERNBIOTECH | 2020-02 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA | P6148 | |
| Saponine | SIGMA | S-7900 | |
| Phalloidin | Life Thechnology | A12379 | Alexa fluor 488 |
References
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