Summary
이 프로토콜의 목표는 마우스의 전두엽 피질 매개인지 적 유연성을 평가하는 작업 (AST)를 이동 주의력 세트로 행동 분석을 수행하는 것입니다.
Introduction
작업 (AST)를 이동 주의력 세트 전 1, 2 십 년간 쥐의 관심과인지 적 유연성의 척도로 개발되었다. AST는 인간과 인간이 아닌 영장류 3,4에서인지 기능 장애를 식별하는 데 사용되는 캠브리지 신경 심리 테스트 자동화 배터리 (CANTAB)의 extradimensional / intradimensional 구성 요소를 모델로. 간단한 규칙을 배울 수있는 능력은 그대로 유지하면서, 학습 적자 (규칙, 신경 장애 (즉, 정신 분열증, 강박 장애, 우울증)의 다양한 고통받는 환자에서 발견되는 신경 퇴행성 질환을 변경 한 응답을 수정하려면 즉, 파킨슨 병) 및 사전 전두엽 피질 (5)에 병변이있는 환자. 더 일반적으로, 이러한 환자는인지 적 유연성 적자를 갖는 것으로 설명되어 있습니다. 유사 적자는 비 - 인간 영장류 및 설치류 병변 t 모두에 도시 된전두엽 피질 O를 1,6-8를 유도하고있다. 이러한 적자는인지 적 유연성의 상태 또는 주의력 세트를 이동하는 장애인의 능력을 나타냅니다.
피사체의 규칙 세트는 무관 큐들에서 중요한 차별화하기 위해 복잡한 자극에 적용될 수 있다는 것을 알게 될 때 주의력 세트가 형성된다. 예를 들어, AST에, 동물 매체와 음식 보상을 페어링하여, 관련없는 큐 (즉, 냄새)주의를 지불하고 관련 큐 (즉, 파고 매체)에 대응하고 무시하는 방법을 배웁니다. 중간 냄새 변경을 파고의 종류,하지만, 보통과 보상 사이의 쌍 협회가 남아있는 곳이 협회는 후속 작업으로 강화된다. 이 강화 된 규칙은인지 세트를 형성한다. 반전과 여분의 차원 변화 :인지 적 유연성의 AST 프로토콜 측정 측면 내에서 두 단계. 반전 단계, 하나 dimensio 내에서 이전에 부정적인 자극에서N (이 예에서 매체) 이전 스테이지로부터 긍정적 인 자극을 무시하는 동물 도전 지금 긍정적이다. 펠트 파고 매체가 이전 단계에서 긍정적 자극이고 예를 들어, 이제 용지 반전에 해당하는, 음 자극했다. 이는 주의력 세트를 유지해야한다는 점에서 유연성이 동물의 도전 (즉, 매체가 관련 치수) 규칙을 변경하면 치수 내 자극과 보상 쌍에 대해 학습한다. 주의력 세트의 형성은 부적합 사이즈 (이 예에서는 냄새) 사이즈에 적합하게 추가 차원 시프트 스테이지에 도전한다. 이전에 학습 법칙을 이용하여 지속적으로 나타낸 바와 같이 선택 보속 응답은, 어느 단계에서인지 유연성 부족을 반영한다.
인간이 아닌 영장류와 설치류 모두에서 병변 연구 PERF 할 수있는 능력에 기인 할 수있다 전두엽 피질의 특정 지역을 보여 주었다AST 1,9의 특정 단계를 ORM. 안와 전두엽 피질 (OFC)에 병변은 전두엽 피질 (PFC)의 하위 영역은, AST 8 학습 반전에 적자를 유도하는 것으로 나타났다. 또한, 여분의 차원 변위를 특정 어려움 내측 전두엽 피질 (MPFC) 팀의 병변.
AST를 사용하여 수많은 연구 래트 및 인간이 아닌 영장류에서 수행되었지만, 비교적 소수 마우스에서인지 기능의 척도로 AST를 이용했다. 생쥐에서 유전자 조작의 용이성과, 다양한 질환을 연구 적응 및 마우스에서이 행동 측정 검증에 전두엽 기능을 측정하는 중요한 필요성 감안할 PFC 부전과 관련된 질환에 대한 연구에 중요한 추가이다. 여기에 설명 된 프로토콜은 마우스에서 어플리케이션에 최적화되어 Birrell 브라운 (1)에 의한 절차의 변형 마우스보고 특정 많이 반영이고이전에 2,6,10-13보고 된 C 적응.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
참고 :이 연구에 사용 된 동물은 최적의 결과에 대한 4 세 6 개월 사이의 남성 C57BL / 6J 마우스입니다. 마우스 편리 활성 (어두운) 단계에서이를 테스트하기 위해 후진 등주기에 유지됩니다. 동작은 하우징으로부터 분리 된 방에서 수행되는 경우, 마우스는 시험장에 다음 운송 적응 적어도 1 시간을 허용한다. 행동 검사는 육안 검사 세션을 모니터링하는 것이 여전히 실험자 적절한 조명시키면서 가능한 한 작은 쥐의 정상적인 활동에 방해를 최소화 적색광 조건 하에서 수행된다.
참고 : 여기에 기술 된 실험 절차의 모든 측면은 실험 동물의 관리 및 사용, 8 판 (NRC)에 대한 가이드에 있던 수행 하였다 텍사스 건강 과학 대학의 기관 동물 케어 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다 샌 안토니오에서 센터.
- 세라믹 ramekins 작성 (비 다공성을 1.5 "깊이 X 2.5 '직경), 내부 림 (약 1 매체를 파고와"바닥에서); 필터 종이 라운드 반으로 잘라 ramekin에 뒷면 안쪽에 테이프 (그림 1A)
- 적응, 교육 및 테스트 단계에 대한 약 20 mg의 조각으로, 허니 너트 또는 설탕 코팅 종류 - 가볍게 달게 건조 아침 시리얼 (식품 보상을) 브레이크.
- 주의력 세트 작업을 이동 (AST) 챔버 (그림 1B) 확인 : 기차를 적응 및 개별 실에서 각 마우스를 테스트를; 최소 8 챔버의 생산을 권장합니다.
- 12 "× 8"X 7 "의 AST 챔버를 구축; 70 % 에탄올로 청소가 용이 불투명 한 흰색 아크릴로 만든 벽과 시작 게이트. 단두대 스타일, 이동식 출발 게이트 대기실 (5 "× 8") 및 테스트 영역 (7 "× 8")에 챔버를 분리한다.
- 클리어 5 포함(221); 균등하게 테스트 영역의 양측을 분리 X7 "이동식 파티션; 세 컷 ¼ "직경 구멍 파티션의 하부에 이격 한 액세스를 허용하도록 스니핑"분할 (도 1C)의 정면에서 "간격 1.
2. 절차 개요 (그림 2)
- AST 이전에, 집 마우스 개별적 그들을 적어도 일주일 후진 등 사이클 조정할 수 있습니다.
- 적응, 기차와 개별 테스트 챔버의 각 동물을 테스트합니다. 테스트의 마지막 날을 마무리 한 후 하나의 마우스와 70 % 에탄올로 청소 각 챔버를 할당합니다. 이것은 "홈 케이지"또는 "자기"와 같은 챔버 냄새를 만들어 테스트하는 동안 스트레스를 최소화됩니다.
- 향기가 발산 할 수 있도록 이일 테스트에 앞서 테스트 냄비 향기; 마우스는 매우 강한 냄새가 냄비에 발굴되지 않습니다. 25 G 바늘과 주사기를 사용하여 약 0.1 ml에 추가필터 종이의 상단에 에센셜 오일.
3. 취급 (일 ~ 8)
- 음식 제한의 첫 날 이전에 팔일을 시작 쥐를 처리합니다. 이 테스트 중에 처리와 관련된 스트레스를 줄일 수 있습니다.
- 무게 및 취급의 기록 체중 매일. 하루에 각 마우스 2 ~ 3 분을 처리합니다.
- 여러 실험자 쥐의 집합을 테스트에 참여하는 경우, 각각의 실험은 실험자와 친숙 함을 높이고 스트레스와 불안은 훈련이나 시험 일에 경험 줄이기 위해 처리 프로세스에 참여하고 있는지 확인합니다.
- 시험 기간에 걸쳐 처리 및 기록 가중치를 계속합니다.
4. 식품 제한 (일 9-12)
- 사일 전에 적응의 시작부터, 제한된 다이어트에 장소 마우스는 자유 먹이 체중 80 ~ 85 %로 마우스를 유지합니다. 하루에 마우스 당 식품의 1g을 제공합니다. 체중 이하로 떨어지면그들은 적절한 범위로 돌아올 때까지 지정된 범위는 하루 2g을 제공합니다.
- 마우스 테스트 냄비에 적응 할 수 있도록하기 위해 각 가정 케이지의 앞면에서 2 ramekins를 놓습니다. 이들은 음식 보상 파고 마우스를 양성하는 데 동일한 지점이다.
- 4 일 동안 매일 ramekins 음식의 2g과 음식 보상 (각 시리얼의 절반 조각)의 1 개를 추가합니다.
- 동작은 음식 제한의 1 일째부터 시작하여 마우스를 수납하는 하나 이상의 분리 된 방에서 수행되어야하는 경우, 하루에 적어도 1 시간 동안 테스트 실로 전송 생쥐 종래 하우징 실로 복귀 것은 허용하도록 행 그것들은 검사실에 적응.
- 음식 제한의 마지막 날, 적응을 시작하기 전에, 홈 케이지 침구를 변경합니다. 케이지 침구 테스트 교육 및 시험 (절대적으로 필요한 경우가 아니라면) 동안 스트레스 또는 불안 경험을 줄이기 위해 완료 될 때까지 다시 변경되지 않습니다.
- 유지시험이 끝날 때까지 음식에 제한 쥐. 일 13 ~ 17 일, (음식 펠릿의 일반적으로 <1g) 소비 식품 보상의 양의 추정에 기초 적응, 교육, 또는 테스트 후 쥐의 음식을 제공합니다.
5. 적응도 (일 13 ~ 14)
- 2 일전 훈련의 시작부터, 붉은 빛에서 어둠주기 동안 적응을 수행합니다.
- 챔버 내의 홈 케이지에서 더러운 침구 소량의 확산, 이것은 친숙한 "홈 케이지"또는 테스팅 챔버를 "자기"냄새를 도입하여 새로운 환경에있는의 스트레스를 감소시킬 것이다 (동일한 챔버 것 교육 및 시험)의 기간 동안 하나의 마우스에 사용됩니다.
- 챔버의 대기 지역에있는 물이 깨끗한 ramekin에 배치; 그들은 물에 대한 액세스 권한이없는 경우 마우스는 먹지 않는 경향이있다.
- ~ 20 (식품 보상과 시험 영역에 음식 제한에 사용 된 두 ramekins 배치각 MG 시리얼 조각).
- 대기실에서 마우스를 놓고; 시작 게이트를 제거하고 마우스가 1 시간 동안 챔버를 탐험 할 수 있습니다.
- 지속적으로 시험 영역과 자주 냄비를 탐구하는 쥐를 장려하기 위해 빈 ramekins에 음식 보상 (~ 20 mg의 시리얼 조각)를 추가합니다.
- 실험자의 존재는 테스트 기간 동안 추가 스트레스가되지 않도록 마우스가 적응 기간 동안 실험을 볼 수 있는지 확인합니다.
6. 훈련 (15 일)
- 대기실에서 마우스를 놓습니다.
- 각 시험 영역으로, 음식 보상 (~ 20 mg의 시리얼 조각)를 포함, 빈 ramekins를 놓고 시작 게이트를 들어 올립니다. 마우스 3 분은 모두 식품 보상을 검색 할 수 있습니다. 이 단계를 여러 번 반복합니다.
- 점차적으로 이후의 시험에서 냄비에 톱밥 / 마우스 케이지 침구를 추가합니다. 트라이 종료하기 전에 각각의 냄비에서 음식 보상을 검색하는 3 분 마우스를 허용알. 마우스가 각각의 냄비에서 음식 보상을 검색하면, 다음 재판을 진행합니다. 마우스가 음식 보상이 부분적으로 덮여되면 파고에 시도를하지 않을 경우, 힌트는, (즉, 음식 보상의 영역에 시리얼 먼지를 뿌려 음식 보상의 영역에 걸쳐 톱밥에서 들여 쓰기를 만들어 제공의 일부를 발견 할 수있다 음식 보상).
- 식품 보상이 완전히 덮여 마우스가 안정적으로 음식 보상을 찾기 위해 전체 냄비에 발굴 할 수있는 능력을 보여줍니다 때까지 각 시험 후 톱밥 / 침구를 계속 추가.
- 마우스가 안정적으로 훈련의 시작 2 시간 내에 전체 냄비에 음식 보상을 찾을 수있는 능력을 입증하지 않은 경우, 훈련 이틀째를 계속합니다. 음식 제한에 마우스를 유지하고이 절차 다음날를 반복합니다.
- 마우스는, 두 개의 연속 일 후에 음식 보상 파고 나머지 실험에서 제외하고, 같은 주석을 실패하면 특급에서 "파고 실패"erimental 기록.
7. 테스트 (일 16 ~ 17)
- 첫날에, 간단한 차별 (SD), 복합 차별 (CD), 반전 (R1), 인트라 차원 이동 (IDS)을 테스트합니다.
- (, 옵션 R2), 여분의 차원 이동 (EDS) 둘째 날, 내 차원 시프트 2 (IDS2), 내부 차원 이동 3 (IDS3), 반전 2를 테스트합니다.
- 쌍 매체와 냄새는 표 1에 도시.
- 시험 당일에 처리하는 시점에서, 쥐에게 인해 굶주림에 테스트하는 동안 초점의 부족을 피하기 위해 하나의 음식 보상을 제공합니다. 시험 당일이 끝날 때까지이 시점에서 올바른 선택에 대한 보상을 제외한 모든 음식을 제공하지 않습니다.
- 집게를 (냄비 사이의 향기의 확산을 제한)를 사용하여 테스트의 시작에서 올바른 선택을 나타내는 냄비에 음식 보상의 조각을 배치합니다. 음식 보상 완전히 매체 (도 3 참조)에 의해 커버되어야한다. 시리얼 먼지 O를 뿌려, 음식 보상에서 향기 큐를 피하려면무대의 시작 VER 모든 냄비.
- 시작 게이트가 닫힌 대기실에 마우스를 놓습니다. 테스트 챔버의 양쪽에있는 냄비를 놓습니다. 스타트 게이트는 제거되고 타이머가 시작되면 시험이 시작된다. 선택을해야 시험 당 각 마우스 3 분을 허용합니다. 마우스를 각 시험에 대한 선택을 할 때까지 (올바른 또는 잘못된) 선택과 시간을 기록한다.
참고 : "선택"이 중 하나를 냄비에 발굴하기위한 시도로 표시됩니다. 마우스가 미디어를 변위는 음식 보상을 밝히기 위해서 미디어의 음식 보상 또는 난민 충분한을 찾기 위해 작성하는 공간에서 충분히 코를 찌르고 경우 발굴은 선택 사항으로 기록됩니다. 마우스를 3 분 내에 선택을하지 않은 경우, 이것은 선택의 여지 (잘못된)로서 기록된다. - 선택은 하나 냄비 만들어되면, 테스트 챔버에서 선택되지 않은 냄비를 제거합니다. 올바른 선택이 이루어진 경우, 마우스가 다시 마우스를 배치하기 전에 음식 보상을 완료 할 수 있도록대기실. 잘못된 선택이 이루어지면, 마우스가 대기실에 마우스를 반환하기 전에 그 선택에 대한 음식 보상이 없다는 것을 보여주기 위해 냄비를 탐험 할 수 있습니다.
- 각 시험의 끝에, 다시 대기 영역에 마우스를 위치시키고 시작 게이트를 대체.
- 마우스가 연속적으로 AST의 다음 단계로 이동 8 올바른 재판의 기준을 충족하는지 확인합니다. 마우스 (50) 내에서 연속적으로 시행 8 정답을 획득하지 못하면, 그 단계를 실패하고 테스트를 완료하기에 이동할 수 없다. 6 개의 연속 선택의 여지 (선택없이 3 분)는 참여 실패하지 않으며 다음 단계로 이동하는 마우스를 금지한다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
이 테스트의 전형적인 따라 조치가 기준 (8 올바른 연속 선택)을 만족하는 단계에 따라 임상 시험의 수입니다. 그림 4a는 AST를 사용하여 치료 C57BL / 6J의 각 단계에서 기준을 충족하는 시험의 평균 수를 보여줍니다. 생쥐 관련된 큐 사이즈 (냄새 또는 미디어)에 주의력 세트 형태로 연속 intradimensional 교대 기준을 만족하는 시험의 감소에 의해 지시하기 때문에 성능이 향상되며, 반전 단과 extradimensional 시프트 충족하기 위해 추가 실험을 필요 기준. 우리가 냄새가 관련성이 있는지 여부를 기준에 시험 수의 증가에 간단한 차별 단계에서 약간의 차이를 관찰 반영 것처럼 두 개의 관련 치수 (즉, 미디어 또는 냄새)에 각각 시작 동물의 수를 상쇄하는 것이 중요하다 큐 (그림 4B). 시련은 SD 단계에서 기준에 도달하는 경우 일 사이에 유의 한 차이가 있습니다전자 두 관련 큐 크기 (즉, 미디어는 그림 (b)에서와 관련이 더 나은 성능), 다음 단계 동안 각 마우스의 성능 데이터는 단순한 차별 단계에서의 성능에 정상화 될 수있다. 도 4c에 도시 된 바와 같이,이 정규화 단계는 초기에 관련된 큐를 학습과 관련된 변동을 감소시키고 후속 IDS 단계에 개선 된 성능의 가시화를 향상시킨다. ~ 20 마우스의 그룹 크기 정규화없이 원시 데이터의 분석을 허용하기에 충분하다하더라도. 중요한 시험에서 상당한 증가를 나타내는 이전에 시프트 intradimentional extradimentional 시프트 동안 상대적인 기준을 만족하는 것은 검사 타당도 (도 4d 및도 4e)의 제어 중요한 척도이다. ED 시프트 단계에 앞서, 마우스는 보상을 찾기 위해 하나의 관련 큐 차원 (냄새 또는 미디어)에 관심을 배웁니다. NE에 스위치관련 큐 차원 와트, 즉 ID / ED 변화의 결과, 기준에 도달하기 위해 더 많은 실험이 필요한 경우, 이전에 관련이 있었다. 흥미롭게도, 원시 데이터 내의 ID / ED 시프트 분석 IDS2 및 ED (도 4d) 사이의 기준에 도달하고, (<데이터 미기재, P 0.1) IDS3 및 ED 사이 증가 향해 추세 시험에서 상당한 증가를 보여 와 사이의 평균 시험 증가 ED (데이터는 미도시)와 비교 IDS2 IDS3의 기준에 도달한다. 데이터가 SD 단계 (그림 4E)에서 성능 표준화했다 흥미롭게도, 상당한 ID / ED의 변화는 ED에 비해 IDS2과 IDS3 둘 사이에 분명했다.
이는 대조군 마우스의 약 70~80% 전체 태스크 (20 ~ 30 % 드롭 아웃 율) 완료 할 것으로 예상된다. 대안 종속 대책, 작업의 각 단계에서 측정 한 (이 쥐 간 매우 가변적 인 것으로 밝혀 않았지만) 선택을 평균 대기 시간을 포함반전에 "설정 손실"에러 여분 차원 시프트 스테이지들의 오류 횟수의 총계 잘못된 선택이 이루어진 횟수가 세 개 이상의 연속 정답을 다음과 같이 Lapiz-Bluhm에 외. (14)에 의해 정의 된 바와 같다. "설정 손실"에러 수가 증가 보속 행위를 의미 할 수있다. 또한, 마우스는 일반적으로 30 분 미만 (도 5)에서 테스트의 각 단계를 완료하고, 각 단계에서 필요한 시간의 기간은 기준에 도달하는 시험의 함수이다.
여기 OFC 또는 마우스 mPFC에 신경 독성 병변 상세한 것과 유사한 패러다임을 이용하여 이전의 연구에서는이 시험의 사용을 검증하는 기능적 결손을 판별 각각 반전 여분 차원 시프트 단계에서의 성능을 손상시킬 것으로 나타났다 쥐와 인간이 아닌 영장류 studies11 동일 지역. 동안 상기 연구 V의 일련의 작업즉, 여기에 도시 양궁 약간, 그것은 그 단계에서 기준에 시행 횟수의 증가에 의해 반영된 바와 OFC 및 mPFC 병변 또는 결손은 또한, R1과 EDS에 손상된 성능을 초래할 것으로 예상된다. .
| 무대 | 관련된 | 예를 들면 | 관련된 | 예를 들면 | ||
| 간단한 차별 (SD) | 중 | 펠트 (+) | 용지 (-) | 냄새 | 육두구 (+) | 로즈마리 (-) |
| 복합 차별 (CD) | 중 | 펠트 (+) / 육두구 | 용지 (-) / 로즈마리 | 냄새 | 육두구 (+) / 펠트 | 로즈마리 (-) / 종이 |
| 펠트 (+) / 로즈마리 | 용지 (-) / 육두구 | 육두구 (+) / 종이 | 로즈마리 (-) / 펠트 | |||
| 반전 1 (R1) | 중 | 용지 (+) / 로즈마리 | 펠트 (-) / 육두구 | 냄새 | 로즈마리 (+) / 종이 | 육두구 (-) / 펠트 |
| 용지 (+) / 육두구 | 펠트 (-) / 로즈마리 | 로즈마리 (+) / 펠트 | 육두구 (-) / 종이 | |||
| Intradimensional 시프트 (IDS) | 중 | 기억할만한 | 장식 조각 (-) / 정향 | 냄새 </ TD> | 계피 (+) / 기억할만한 | 정향 (-) / 장식 조각 |
| (+) / 계피 | ||||||
| 기억할만한 (+) / 정향 | 장식 조각 (-) / 계피 | 계피 (+) / 장식 조각 | 정향 (-) / 기억할만한 | |||
| IDS2 | 중 | Pipecleaners | googly 눈 (-) / 생강 | 냄새 | 레드 백리향 (+) / Pipecleaners | 생강 (-) / googly 눈 |
| (+) / 레드 타임 | ||||||
| Pipecleaners (+) / 생강 | googly 눈 (-) / 레드 타임 | 레드 백리향 (+) / googly 눈 | 생강 (-) | |||
| IDS3 | 중 | 리본 (+) / 바닐라 | 금속 스트립 (-) / 레몬 | 냄새 | 바닐라 (+) / 리본 | 레몬 (-) / 금속 스트립 |
| 리본 (+) / 레몬 | 금속 스트립 (-) / 바닐라 | 바닐라 (+) / 금속 스트립 | 레몬 (-) / 리본 | |||
| R2 | 중 | 금속 스트립 (+) / 바닐라 | 리본 (-) / 레몬 | 냄새 | 레몬 (+) / 리본 | 바닐라 (-) / 금속 스트립 |
| 금속 스트립 (+) / 레몬 | 리본 (-) / 바닐라 | 레몬 (+) / 금속 LIC 스트립 | 바닐라 (-) / 리본 | |||
| Extradimensional 시프트 (EDS) | 냄새 | 시트로 넬라 (+) / 라피아 | 아니스 (-) / 폼 | 중 | 라피아 (+) / 시트로 넬라 | 폼 (-) / 아니스 |
| 시트로 넬라 (+) / 폼 | 아니스 (-) / 라피아 | 라피아 (+) / 아니스 | 폼 (-) / 시트로 넬라 | |||
이들 조합 표 1. 예 냄새 및 굴착 매체의 조합. 냄새 및 굴착 미디어는이 연구에서 확인되고있다. 이러한 특정 조합을 사용하여 얻은 대표 결과는도 2에 도시되어있다.
hres.jpg "/>
그림 1. AST 테스트 챔버. (A) 사진 및 ramekin에 여과지 배치의 예 치수. 마우스 및 (C) 파티션 내 구멍의 배치를 나타내는 테스팅 챔버의 3 차원 도면에 적합한 AST 테스트 챔버 (B) 사진.
그림 2. 매체를 파고. 물질 목록 (ii.-xi.)에서 상세한이 프로토콜에 사용되는 매체 쌍을 파고의 예. 냄비에 중간을 파고와 내부의 테두리에 약 채워진다.
테스트를 위해 3. 타임 라인을 그림.
AST 그림 4. C57BL / 6J 성능을 제공합니다. (A) 시험의 평균 수는 남성 C57BL / 6J 마우스의 AST의 기준을 충족합니다. 데이터는 ± SEM을 의미 나타냅니다 (N = 22 마우스 / 그룹), 무대의 주요 효과 P = 0.013. (B) 별개의 초기 관련 큐 크기의 SD 단계에서 기준에 도달하는 시험의 평균 수. 데이터는 ± SEM을 (N = 22 마우스 / 그룹)을 의미 나타냅니다, * P = SD 단계에서 각 마우스의 개인의 성과에 대한 백분율로 표시 0.01. (C) 정규화 된 데이터. 데이터는 (22 마우스 / 그룹 N =) 단계의 주요 효과 P = 0.06. 시험에서 (D) ID / ED 시프트가 IDS2과 ED 사이의 기준에 도달하기 위해 ± SEM을 의미 나타냅니다. 데이터는 ± SEM을 (N = 22 마우스 / 그룹)을 의미 나타냅니다, * P = IDS3과 ED 사이의 정규화 된 데이터 0.03. (E) ID / ED 이동. 데이터는 ± SEM (N = 22 마우스 / 그룹), * P = 0.012을 의미 나타냅니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
PFC에 의해 매개되는인지 적 유연성 적자 신경 학적 및 신경 정신병 학적 장애의 종류와 관련된 상당한 장애를 나타내고, 결과 이들 질환으로 고통받는 사람들의 삶의 질에 큰 영향을 미칠 수있다. 마우스에 사용되는 AST의 최적화는 대뇌 피질의 중재인지 기능 장애를 전두엽에 결합 질병의 유전 적 토대를 조사에 매우 중요합니다. 우리는 상술 한 방법은 특정인지 결핍,인지 유연성 신뢰성 척도 것을 발견하고, 밀접 래트 및 인간이 아닌 영장류에서이 작업을 사용하여 얻은 결과에 근사 하였다. 설명하는 방법은 쥐뿐만 아니라 우리의 기관에서 전문가의 조언 및 지침에 앞에서 설명한 프로토콜의 광범위한 설문 조사의 결과입니다.
쥐에서 유사한 작업을 사용하여 이전 보고서이기는하지만, 이러한 행동 조치의 적응성을 보여 주었다몇 가지주의 사항이 2,6,11. Colacicco는 외. 사일 기간 동안 시험 11 확산이 하루에 차별 테스트의 수를 제한했다. 이 연속 테스트 일에 이전에 배운 자극 쌍의 반복을 포함했다. 효과적이지만, 여기에 제시된 프로토콜 개발의 목적은 시험 기간의 지속 기간을 최소화하고 효율을 최대화하는 것이다. 여기, 우리는 2 일 기간에 시험을 제한하고 이전에 배운 자극 쌍의 반복을 제거한다. 이전 연구진은 쥐가 주의력 세트를 형성하고 그들이 노력이 응답을 유지하는 작은 "테스트 용이성의 창"을 전시과 훈련이 필요하다는 지적했다. 우리의 프로토콜은 초기에 관련 큐 차원 내에서 intradimensional 변화에 겸손과 훈련을 포함한다. 도 4c에서 정규화 된 데이터를 평가할 때, 특히 그것이 더 현저 결핍 두리을 나타낼 수 우리 프로토콜 시험 생쥐 나타나는(바로 앞의 단계를 기준으로) 두 번째 intradimensional 반전 겨. 이러한 관찰은 또한 생쥐 ID / ED 시프트를 나타내 같은 주의력 세트의 형성을 보장하기 위해과 훈련의 개념과 일치한다. 마우스는 2 시간의 평균 세션 길이를 포함 우리의 프로토콜 (그림 5)의 노력이 성과를 유지 이유에 하나의 가능성은, 때문에 후진 등 사이클의 활용을 할 수있다. 우리는 어두운 (깨어있는)주기의 처음 네 시간에 빨간 조명 아래에서 격리 된 전용 테스트 룸에서 동작을 테스트했다. 그러나,이 방법 원고의 범위 이외의 체계적인 테스트는 마우스 AST를 수행하기 위해 계속하는 기간에 기여하고, 후각 차별에 적자가 의심되는 경우, 사전 선별 대체로 테스트하기 전에 보장 될 수 있습니다 요인이 무엇인지를 결정해야 할 것입니다 냄새없는 방법들이보고되고있다.
또한,시초기 방법 개발, 우리는 (8~12주 세) 젊은 성인 마우스는 큰 변동 약간 오래된 4~6개월 된 마우스로 수행 것을 발견했다. 우리는 음식을 제한 프로토콜은 고전적인 신경 발달 의미에서, 더 성숙 마우스 및 동안 다르게 마우스의 성장에 영향을 추측하고, 마우스의 뇌가 완전히 육주에 의해 개발 된 것으로 간주되는 것이 가능하다 성인 성숙과 성인 초기에 청소년의 전환이 젊은 쥐에서 전두엽 피질 혼란의 AST 성능 내에서 시냅스 리모델링. 그러나 이러한 매혹적인 질문 탐험 남아있다.
마우스에서 AST 프로토콜의 다른 변형 득점되지 않습니다 각 단계의 시작 부분에 시험의 지정된 번호 (일반적으로 4)을 의미하는 "무료"시험을 포함하고, 동물은 보상이 검색 될 때까지 모두 냄비를 탐험 할 수있다. 여기에 설명 된 프로토콜은 "무료"시험에 포함되지 않습니다. 또, 세트의 requireme국세청은이이 동물이 진정으로 규칙을 배운 여부에 효과적인 지표 것을 발견했다 (이전 기준을 충족하기 위해 8/10 시련을 설명 대신 기준에 8 연속 올바른 시험) 기준보다 엄격한을 충족합니다. 가너 등. IDS 다음과 훈련의 기간 (즉, 추가로 50 시험에 대해 이전에 관련된 자극의 제시가) 크게 EDS 2 기준에 시련을 증가 것으로 나타났다. 여기서 우리는 Bissonette 등. 6 계약에 "지나치게 연습"과 관련 차원에 주의력 세트의 형성을 보장하기위한 노력의 일환으로, 여러 내부 차원의 변화를 포함한다. 또한, 가너 등. 약 1 시간 (또는 때 마우스가 더 이상 응답하지 않음) 2, 우리는 C57BL6 / J 마우스는 적절하고 신뢰성있게 제어 (약 2 시간 기간 내에 매일 그들에게 제시된 네 가지 단계를 통해 진행 것을 발견했다 반면에 제한된 테스트 세션마우스). 성능을 해석 할 때 실험군 간의 운동 능력의 전위차가 고려되어야 않는다. 우리는 시험 절차의 완료를 통해 처리의 개시로부터 각각의 동물을 17 일 시간과 노력을 투자 제한한다. 그것은 개별 실험자가 2 개 이하의 단일 실험자 적어도 6에 테스트를 완료 할 수 있도록 (이것은 개별 실험자 능력과 경험에 기초하여 수정 될 수있다)로 하루에 시험 생쥐의 수를 제한 할 것을 권장 주당 마우스. 운동 기능이 약간 손상되는 경우, 각각의 시험 길이의 올바른 응답이 아닌 응답 속도로, 키 종속 변수이며, 증가 될 수있다.
시각적 판정은 최근 설치류에서 사용하도록 적응 된 비인간 영장류인지 성능을 평가하기 위해 사용되었다는 것과 유사한 패러다임과 냄새 discriminatio 매체에 대한 대안으로 사용될 수있다N 작업은 여기에 설명. 후각 차별에 유의 한 차이가 쥐의 실험 그룹 사이에있는 경우에는이 방법이 필요할 수 있습니다. Brigman 등은. 마우스는 쉽게 ID와 ED 이동 패러다임 15 화합물 시각적 자극을 분별 것으로 나타났습니다. 더 나은이 자동화 된 방법은 인간과 인간이 아닌 영장류의 전두엽 피질의 기능 장애를 연구하기 위해 사용되는 테스트를 나타내고 있지만, 필요한 조작 적 챔버와 터치 스크린의 비용은 쥐에서이 자동화 된 테스트가 금지 될 수 있습니다 수행 할 수 있습니다.
이 문제는 각 마우스, 즉, 습관, 훈련으로 일관 가능한 수행 및 테스트가 각 동물에 대한 일의 같은 시간에 수행해야하는 것이 좋습니다. 동물이 반송 될 경우 또한, 실 동작 등에 의해 제어 할 수없는 트래픽 흐름, 악취 도입에 문제 공유 / 커뮤니티 공간의 활용, 실험을하는 동안 변경되지 않고 남아 있어야원격 동작 실에 수용 실 (여기의 경우와 같이)에서, 동일한 경로마다 취해 져야한다. 행동 객실은 실험과 동물 실험 절차를 수행하는 동안 방해되지 않습니다 영역에 있어야합니다. 여러 실험자 방에서 같은 방, 입구와 출구에서 작업을 수행하는 경우로 테스트하는 동안 동물의 스트레스 나 불안을 증가시킬 수있는 큰 소음 또는 혼란을 방지하기 위해 가능한 한 제한해야합니다. 또한, 실험자는 제거하고 가능한 한 적은 소음과 혼란을 만들 수 있도록로 챔버에서 시작 게이트뿐만 아니라 냄비를 교체에주의해야합니다. 래트에서의 실험은 AST 성능은 다양한 스트레스에 의해 중단 될 수 있다는 것을 증명하고있다.
냄비의 Scenting은 매주 수행하고 같은 날 각 주에 최소 2 일 전에 첫 번째 시험 당일에해야합니다. 이 냄비가 잘 배출에 향수하는 것이 좋습니다시험이 수행 될 영역의 외측 ilated 영역 (예를 들면 별도의 실험실, 복도, 흄 후드). 이 냄새의 교차 오염을 방지하는 데 도움이 될 것입니다 및 시험의 일부가 아닌 향기와 마우스를 헷갈 리지 않게됩니다. 또한, 사전에 테스트하는 동안, 차별에서 동물을 방해 할 수 있습니다 강한 냄새 (즉, 직전 테스트, 강한 향수 / 탈취제 등으로 껌이나 커피의 소비가) 상기 이유로 피해야한다. 실험자이 프로토콜에서 설명하는 것과는 다른 굴삭 매체를 사용하기를 원할 경우,이 매체는 여기 기술 된 것과 유사한 밀도 및 중량 (마우스가 충분히 파고 과도한 중량 / 밀도가 곤란하게하는) 것이 권장된다. 예를 들어, 우리는 쥐가 옆으로 밀어하기가 어려운 있기 때문에 작은 플라스틱 구슬이 적합하지 않은 것으로 나타났다. 또한, 모든 아주 강한 향기와 미디어 (예., 고무 스트립과 일부 비접촉식이 시험되는 냄새 감지하는 능력을 방해 할 수 있으므로 IC 재료)에는 적합하지 않다.
교육 및 개별 마우스의 테스트가 하나의 실험에 의해 수행되어야한다, 그러나 적응은만큼 그들은 처리에 참여 어떠한 실험하여 수행 할 수 있습니다. 모든 동물은 화분이 스테이지 사이 대기실에있는 시간의 양을 제한하도록 이동할 수 있어야 매일 수행 네 단계에 사용한다. 이는 각 작업에서 마우스의 관심을 유지하는 데 도움이됩니다. 시험이 시작되면 또한, (즉, 각각의 테스트 하루에 4 단계가 연속적으로 완료해야합니다) 테스트의 그 날의 작업이 완료 될 때까지 중단하지 않는 것이 중요합니다.
결론적으로, 여기에 설명 된 프로토콜은 설명을 포함 생쥐의 전두엽 피질에 의존하는인지 기능을 측정하는 AST의 유효 이용에 대한 자세한 방법 론적 지침을 제공합니다데이터 분석 및 잠재적주의의. 마우스 AST의 다양한 방법, 차 문헌 만의 독특한 절차 적 세부 사항과 함께 각각보고된다. 연구자들이 과학적인 레퍼토리로이 강력한 행동 분석을 통합하는 시도 모두 텍스트 기반 및 시각 정보의 독특한 결합은 특히 도움이 될 것입니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 연구는 번역 상 과학 선진화를위한 국가 센터에서 보조금 R01-MH090127, 정신 건강의 국립 연구소에서 P30-MH089868와 보너스 번호 UL1TR001120에 의해 지원되었다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 NIMH 또는 NCATS의 공식 견해를 대변하지 않습니다. 또한, 우리는 감사 초기 방법 개발을 유도에서 자신의 가치있는 전문 지식 박사 데이비드 Morilak을 인정하고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Testing Chamber | Fabricated in-house, specifications can be found in protocol | ||
| 3 oz. Ramekins | BIA Cordon Bleu | 900002S12 | Purchased on amazon.com |
| Essential Oils: | Fronteir Natural Products Co-Op | Purchased on http://www.frontiercoop.com/prodlist.php?ct=anpceoeo | |
| Clove Bud | 191114 | ||
| Red Thyme | 191140 | ||
| Lemon | 190810 | ||
| Cinnamon Leaf | 191111 | ||
| Rosemary | 191133 | ||
| Citronella Java | 191112 | ||
| Vanilla in jojoba oil | 191231 | ||
| Anise Seed | 191102 | ||
| Ginger | 191121 | ||
| Nutmeg | 191161 | ||
| Filter Paper, 9.0 cm diameter | VWR International | 28310-048 | Purchased on https://us.vwr.com/ |
| Digging Media | |||
| Raffia | Ashland 8 oz Raffia | Purchased on http://www.michaels.com/ Cut into 1/2" to 1" strips |
|
| Green Felt | Creatology Basic Felt Forest/Dark Green 36 in x 36 in | Purchased on http://www.michaels.com/ cut into 1 cm x 1 cm squares |
|
| Brown foam | Creatology Fun Foam 18 x 12 in sheets (light brown/tan) | Purchased on http://www.michaels.com/ cut into 1/2 cm x 2 cm rectangles |
|
| Crepe paper (yellow) | Celebrate It Paper Crinkle 4 oz yellow jumbo | Purchased on http://www.michaels.com/ Cut into 1/2" to 1" strips |
|
| Ribbon (turqoise) | Celebrate It Wide Ribbon 4 in x 10 yd 100% polyester | Purchased on http://www.michaels.com/ cut into 1 cm x 1 cm squares |
|
| Metallic | Celebrate It Metallic Crinkle Gold 2 oz | Purchased on http://www.michaels.com/ Cut into 1/2" to 1" strips |
|
| Googly Eyes, 4 mm | ME4144 | Purchased on http://factorydirectcraft.com/index.php | |
| Black Sequins, 3 mm | 8780BK | ||
| Pink Pom Poms, 1/4 inch | 1018221 | ||
| Pipe Cleaners, red | 108430 | ||
| Bedding material/sawdust | Obtained from in-house animal resources | ||
| Timer | Control Company | 5000 | Purchased on http://www.control3.com/5000p.htm |
| Lightly sweetened dry breakfast cereal loops | HEB | Honey nut toasted oats used in the protocol described, any lightly sweet coated breakfast cereal is recommended |
References
- Birrell, J. M., Brown, V. J. Medial frontal cortex mediates perceptual attentional set shifting in the rat. J Neurosci. 20 (11), 4320-4324 (2000).
- Garner, J. P., Thogerson, C. M., Wurbel, H., Murray, J. D., Mench, J. A. Animal neuropsychology: validation of the Intra-Dimensional Extra-Dimensional set shifting task for mice. Behav Brain Res. 173 (1), 53-61 (2006).
- Nagahara, A. H., Bernot, T., Tuszynski, M. H. Age-related cognitive deficits in rhesus monkeys mirror human deficits on an automated test battery. Neurobiol Aging. 31 (6), 1020-1031 (2010).
- Rock, P. L., Roiser, J. P., Riedel, W. J., Blackwell, S. Cognitive impairment in depression: a systematic review and meta-analysis. Psychol Med. , 1-12 (2013).
- Stuss, D. T., et al. Wisconsin Card Sorting Test performance in patients with focal frontal and posterior brain damage: effects of lesion location and test structure on separable cognitive processes. Neuropsychologia. 38 (4), 388-402 (2000).
- Bissonette, G. B., et al. Double dissociation of the effects of medial and orbital prefrontal cortical lesions on attentional and affective shifts in mice. J Neurosci. 28 (44), 11124-11130 (2008).
- Chase, E. A., Tait, D. S., Brown, V. J. Lesions of the orbital prefrontal cortex impair the formation of attentional set in rats. Eur J Neurosci. 36 (3), 2368-2375 (2012).
- McAlonan, K., Brown, V. J. Orbital prefrontal cortex mediates reversal learning and not attentional set shifting in the rat. Behav Brain Res. 146 (1-2), 97-103 (2003).
- Dias, R., Robbins, T. W., Roberts, A. C. Primate analogue of the Wisconsin Card Sorting Test: effects of excitotoxic lesions of the prefrontal cortex in the marmoset. Behav Neurosci. 110 (5), 872-886 (1996).
- Bissonette, G. B., Powell, E. M. Reversal learning and attentional set-shifting in mice. Neuropharmacology. 62 (3), 1168-1174 (2012).
- Colacicco, G., Welzl, H., Lipp, H. P., Wurbel, H. Attentional set-shifting in mice: modification of a rat paradigm, and evidence for strain-dependent variation. Behav Brain Res. 132 (1), 95-102 (2002).
- Kos, T., Nikiforuk, A., Rafa, D., Popik, P. The effects of NMDA receptor antagonists on attentional set-shifting task performance in mice. Psychopharmacology (Berl). 214 (4), 911-921 (2011).
- Tait, D. S., Chase, E. A., Brown, V. J. Attentional Set-Shifting in Rodents: a Review of Behavioural Methods and Pharmacological Results. Curr Pharm Des. , (2013).
- Lapiz-Bluhm, M. D., et al. Behavioural assays to model cognitive and affective dimensions of depression and anxiety in rats. J Neuroendocrinol. 20 (10), 1115-1137 (2008).
- Brigman, J. L., Bussey, T. J., Saksida, L. M., Rothblat, L. A. Discrimination of multidimensional visual stimuli by mice: intra- and extradimensional shifts. Behav Neurosci. 119 (3), 839-842 (2005).
