Summary
Цель этого протокола заключается в выполнении поведенческого анализа, таких как сосредоточения внимания множества переключения задач (AST) для оценки префронтальная кора-опосредованной когнитивной гибкости у мышей.
Introduction
К вниманию набор Перераспределение обязанностей (AST) была разработана в качестве меры внимания и когнитивной гибкости у крыс более десяти лет назад в 1,2 раза. АСТ смоделирован intradimensional / внепространственной компонента Кембриджского нейропсихологических тестов автоматизированной батарея (Кембриджский), который используется для идентификации когнитивную дисфункцию у человека и приматов 3,4. В то время как способность к обучению простых правил остается неизменным, дефицит обучения, чтобы изменить ответ, когда правила изменились найдены у пациентов, страдающих от различных нервно-психических расстройств (например, шизофрении, обсессивно-компульсивное расстройство, депрессия), нейродегенеративных расстройств (например, болезнь Паркинсона) и у пациентов с поражением на предварительно лобной коре 5. В целом, эти пациенты описаны как имеющие дефицит в когнитивной гибкости. Аналогичные дефициты были показаны в обоих приматов и грызунов когда через повреждения тО префронтальной коры были вызваны 1,6-8. Эти дефициты показывают состояние когнитивного негибкости или нарушение способности, чтобы сместить к вниманию набор.
К вниманию набор образуется, когда предметом узнает, что набор правил может быть применено к сложным стимулов для того, чтобы отличить информацию от второстепенной подсказки. Например, в AST, животные научиться обращать внимание и реагировать на соответствующей сигналу (например, рытье среды) и игнорировать ненужную кий (то есть, запах), соединяя пищевого вознаграждения со средой. Эта ассоциация затем усиливается в последующих задач, где тип копать средних и запах изменения, но в паре связь между средой и вознаграждения остается. Это укрепило правило формирует познавательный набор. Два этапа в протоколе АСТ измерения различных аспектов когнитивной гибкости: изменение и экстра-мерном смену. На этапе обращения, ранее отрицательных стимулов в течение одного dimensioн (средняя в данном примере) теперь положительным, что ставит под сомнение животное игнорировать положительные стимулы от предыдущей стадии. Например, если чувствовал, рытье среда была позитивные стимулы в предыдущем этапе и бумага были отрицательные стимулы, теперь наоборот. Это ставит гибкость животного в том, что он должен поддерживать сосредоточения внимания набор (т.е. среда соответствующую единицу измерения), а изменения правила уроки для стимула и награды пары в измерении. Формирование для повышенного внимания множества вызов на этапе экстра-мерном сдвига, когда не имеет значения размер (запах в данном примере) становится соответствующую единицу измерения. Персеверативного ответа, как показано в продолжение выбора с использованием ранее научились правило, на любом этапе отражает дефицит познавательной гибкости.
Поражений исследования в обеих приматов и грызунов показали отдельные области префронтальной коры можно отнести к способности перфорацияORM конкретные этапы АСТ 1,9. Поражения в орбитофронтальную коры (OFC), субрегион префронтальной коры (PFC), как было показано, чтобы вызвать дефицит в реверсивного обучения на АСТ 8. Кроме того, повреждения медиальной префронтальной коре (MPFC) приводят к специфических трудностей в выполнении особо сдвиг измерений.
В то время как многочисленные исследования с использованием AST были проведены на крыс и приматов, сравнительно мало использовали AST в качестве меры когнитивной функции у мышей. Учитывая легкость генетических манипуляций у мышей, и острая необходимость измерения префронтальной функции коры надпочечников при изучении различных расстройств, адаптации и утверждения этого поведения меру у мышей является важным дополнением к исследованиям заболеваний, связанных с PFC дисфункции. Протокол подробно здесь является модификацией процедуры по Birrell и Brown 1, который оптимизирован для применения у мышей и отражает многие из мыши-УдельныйС адаптации, которые были ранее сообщалось 2,6,10-13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Животные, используемые в настоящем исследовании, мужчина C57Bl / 6J между 4 и 6-месячного возраста для получения оптимальных результатов. Мышей содержали при световом цикле обратного для того, чтобы удобно проверить их в течение активного (темной) фазы. Если поведение выполняется в отдельной комнате из корпуса, мыши могут по меньшей мере, 1 ч, чтобы акклиматизироваться следующий транспорт к испытательной комнате. Поведенческая тестирование проводится в условиях красного света свести к минимуму нарушения в нормальной деятельности мышей как можно меньше в то же время позволяя экспериментатором, но достаточную освещенность визуально контролировать сессии тестирования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все аспекты экспериментальной методике, описанной здесь были проведены в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных, 8-е издание (СРН) и были утверждены Комитетом по уходу и использованию Институциональная животного в университете Техаса наук о здоровье Центр в Сан-Антонио.
- Заполните керамические ramekins (непористый; 1,5 "глубина х 2,5" диаметр), к внутреннему краю с рытья среды (примерно 1 "снизу); фильтровальной бумаги раундов разрезать пополам и приклеенный к внутренней задней ramekin (1А)
- Перерыв слегка подслащенный сухой хлебный злак завтрака (пищевой наградой) - Мед орех или сахара покрытием сортов, в примерно 20 мг пьес для акклиматизации, обучения и тестирования этапов.
- Сделайте к вниманию набор Перераспределение обязанностей (AST) камера (рис 1B): Акклиматизироваться поезд и проверить каждой мыши в отдельных камерах; Рекомендуем производство, по крайней мере 8 камер.
- Построить 12 "х 8" х 7 "АСТ камеры; Стены и стартовые ворота, сделанные из непрозрачного белого акрила, который легко очистить с 70% этанола. Гильотинного типа, съемный стартовые ворота отделяет камеру в зоне ожидания (5 "х 8") и полигона (7 "х 8").
- Включите Ясно 5221; x7 "съемной перегородкой, которая отделяет две стороны полигона равномерно; сократить три ¼ "отверстия диаметром в нижней части перегородки, чтобы позволить доступ перехвата, расположенных один" друг от друга, и один "с передней перегородкой (рис 1С).
2. Порядок Обзор (Рисунок 2)
- До АСТ, домовые мыши индивидуально и позволить им приспособиться к обратной светового цикла, по крайней мере, одну неделю.
- Акклиматизироваться, поезд и проверить каждого животного в отдельных камерах тестирования. Связать каждую камеру для одной мыши и чистый с 70% этанола после окончания в последний день тестирования. Это позволит свести к минимуму стресс во время тестирования, делая камеры запах как "домашняя клетка» или «я».
- Учуяли тестирования горшки 2 дня до тестирования, чтобы аромат, чтобы рассеять; мыши не будет копаться в горшках, которые имеют очень сильный запах. С помощью шприца с иглой 25 G, добавить приблизительно 0,1 млЭфирное масло в верхней части фильтровальной бумаги.
3. Погрузка (Дни 1-8)
- Ручка мышей, начиная 8 дней до первого дня ограничения пищи. Это позволит снизить нагрузку, связанную с обработкой в процессе тестирования.
- Взвешивание и вес запись тело каждый день обращения. Ручка каждой мыши 2-3 мин в день.
- Если несколько экспериментаторы должны быть вовлечены в тестировании набор мышей, убедитесь, что каждый экспериментатор участвует в процессе обработки для увеличения знакомство с экспериментаторами и уменьшить стресс и тревоги, которые испытывают на обучение или тестирование дней.
- Продолжить обработки и записи веса в течение всего периода испытаний.
4. Ограничение еды (Дни 9-12)
- С 4 дней до начала акклиматизации, место мышей на ограниченном рационе для поддержания мышей на 80-85% их веса тела свободной подачи. Дайте 1 грамм пищи на мышь в день. Если вес тела падает нижеУказанный диапазон дают 2 г в сутки, пока они не вернуться из соответствующего диапазона.
- Поместите 2 ramekins на передней панели каждого дома клетке для того, чтобы позволить мыши, чтобы акклиматизироваться к тестированию горшках. Это те же самые места, используемые для обучения мышь, чтобы выкопать для пищевой наградой.
- Добавить 2 граммов пищи и 1 кусок пищевой наградой (половина кусок зерновых в каждой) в ramekins каждый день в течение 4 дней.
- Если поведение должны быть выполнены в отдельной комнате, чем тот, в котором размещаются мышей, начиная с дня 1 ограничения пищи, транспортные мышей в комнату тестирования в течение по меньшей мере 1 ч в день перед возвращением в жилищном помещении, чтобы позволить им акклиматизироваться к испытательной комнате.
- В последний день ограничения питания, до начала акклиматизации, изменить домашний клетки и постельные принадлежности. Клетка постельные принадлежности не будут изменены снова, пока после завершения тестирования, чтобы уменьшить стресс или беспокойство испытывали во время обучения и тестирования (если не абсолютно необходимо).
- Поддерживатьмыши на пищевые ограничения до конца тестирования. В те дни, 13-17, дают мышей пищу после акклиматизации, обучения или тестирования на основе оценки суммы вознаграждения потребляемой пищи (как правило, <1 г пищевой гранулы).
5. Акклиматизация (Дни 13-14)
- С 2 дней до начала обучения, выполняют акклиматизации в темное цикла при красном освещении.
- Распределить небольшое количество грязной подстилки из дома клетку в камере, это приведет к снижению стресса от пребывания в новой среде путем введения знакомый "дом-клетка" или "я" запах в испытательной камере (той же камере будет используется для одной мыши в течение всего срока обучения и тестирования).
- Поместите чистую ramekin с водой, в зоне ожидания камеры; мыши, как правило, не едят, если они не имеют доступа к воде.
- Поместите две ramekins, которые были использованы для ограничения пищи в области тестирования с наградой пищи (~ 20мг зерновых шт) в каждом.
- Наведите в зоне ожидания; удалить стартовые ворота и позволить мышь, чтобы исследовать камеру в течение 1 часа.
- Постоянно добавить пищевые награды (~ 20 мг зерновых шт) в пустую ramekins в целях поощрения мышей, чтобы исследовать область тестирования, а часто горшки.
- Убедитесь, что мыши могут видеть экспериментатора в течение всего периода акклиматизации, так что присутствие экспериментатора не дополнительным стресс во время тестирования.
6. Обучение (15 день)
- Наведите в зоне ожидания.
- Поместите пустой ramekins, каждый из которых содержит пищевого вознаграждения (~ 20 мг зерновых кусок), в области тестирования и поднять стартовые ворота. Разрешить мыши 3 мин, чтобы получить как продовольственных, так наград. Повторите этот шаг несколько раз.
- Постепенно добавить опилки / мыши клетку кроватях в горшки в последующих опытах. Разрешить мыши 3 мин до получения пищевого вознаграждения с каждого банка до окончания Triи др. После того, как мышь получены пищевого подкрепления из каждого банка, переходите к следующему суда. Если мышь не пытаются копать раз награда пища частично охвачены, намеки могут быть предоставлены (то есть, посыпать зерновых пылью области пищевого подкрепления, сделать отступ в опилках над площадью пищевой наградой, раскрыть часть пищевой наградой).
- Продолжайте добавлять опилки / постельные принадлежности после каждого испытания до тех пор, пищевой наградой не полностью покрыты и мышь надежно демонстрирует способность копать в полном горшок, чтобы найти пищевого подкрепления.
- Если мышь не надежно продемонстрировали способность найти пищевого вознаграждения в полном горшок в 2 часа из начала обучения, по-прежнему второй день обучения. Поддержание мыши на пищевые ограничения и повторите эту процедуру на следующий день.
- Если мышь не удается добывать награды пищи после двух последовательных дней, исключить его от остальной части эксперимента, как и аннотировать "не рыть" в ехрerimental запись.
7. Тестирование (Дни 16-17):
- В первый день тестирования простой дискриминации (SD), соединение с дискриминацией (CD), разворот (R1), а внутри сдвиг измерений (IDS).
- На второй день, проверить внутри размерной сдвиг 2 (IDS2), внутри сдвиг измерений 3 (IDS3), разворот 2 (R2; приобретается отдельно), экстра-сдвиг измерений (ЭЦП).
- Пара информации и ароматы, как показано в таблице 1.
- Во время обработки результатов тестирования на день, дают мышам один пищевого вознаграждения, чтобы избежать недостаточное внимание во время тестирования из-за голода. С этого момента и до конца дня тестирования, не обеспечивают никакой пищи, кроме вознаграждения за правильного выбора.
- В начале тестирования, с помощью пинцета (ограничивает распространение запахов между горшками), поместите кусок пищевого подкрепления в банке, который указывает правильный выбор. Награда пища должна быть полностью освещалось средствами массовой информации (рис 3). Чтобы избежать запах реплику от пищевого подкрепления, посыпать зерновых пыли Oвер все горшки в начале стадии.
- Наведите в зоне ожидания с стартовых ворот закрыты. Поместите горшки с каждой стороны испытательной камеры. Испытание начинается, когда начала стробирования удаляют и таймер. Разрешить каждой мыши 3 мин на суде, чтобы сделать выбор. Запишите свой выбор (правильный или неправильный) и время, до мышь не сделал свой выбор в каждом испытании.
ПРИМЕЧАНИЕ: "выбор" указывается попытке выкопать в любом банке. Копать записываются только как выбор, если мышь перемещенных СМИ и ткнул его носом достаточно далеко в пространстве создает найти пищевого подкрепления или перемещенных достаточно средств массовой информации, чтобы раскрыть пищевого подкрепления. Если мышь не сделал выбор в 3 мин, это записывается как без выбора (неправильной). - После того, как выбор был сделан для любого банка, снять горшок, который не был выбран из испытательной камеры. Если правильно был сделан выбор, позвольте мыши, чтобы закончить пищевого подкрепления до размещения мышь обратно взона ожидания. Если неправильный выбор сделан, позволяют мышь, чтобы исследовать горшок, чтобы показать, что нет пищевой наградой за свой выбор перед возвращением мышь, чтобы зоне ожидания.
- В конце каждого испытания, разместить мышь обратно в зону ожидания и заменить стартовые ворота.
- Убедитесь, что мышь соответствует критерию 8 правильных испытаний последовательно, чтобы перейти к следующему этапу АСТ. Если мышь не получить 8 правильный выбор последовательно в течение 50 испытаний, он не тот этап, и не может двигаться дальше, чтобы завершить испытание. 6 последовательных нет выбора (3 мин без выбора) не является неучастие и запрещает мышь двигаться дальше к следующей стадии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Типичный зависит мера в этом тесте количество испытаний на этапе удовлетворяла критерию (или 8 правильный выбор последовательных). 4А показывает среднее число испытаний, чтобы удовлетворить критерий на каждой стадии необработанного C57BL / 6J с использованием AST. Как мышей образуют к вниманию набор на соответствующем измерении кий (запах или средств массовой информации), производительность будет улучшаться, как показано снижением испытаний для удовлетворения критерия в последовательных сдвигов intradimensional и этапы разворота и смещения внепространственной потребует дополнительных испытаний в соответствии критерием. Важно, чтобы уравновесить количество животных, которые начинаются на каждой из двух соответствующих размеров (например, медиа или запах), как мы наблюдали некоторое различие в простом этапе дискриминации отражены в увеличению числа испытаний критерию, если запах соответствующих кий (Фиг.4В). Если испытания для достижения критерия на этапе SD значительно отличаются между гое два соответствующих размеров кий (то есть, более высокую производительность, когда средства массовой информации является актуальной как показано на рисунке 4, б), данные о производительности для каждой мыши в течение последующих этапах могут быть нормализованы к своей деятельности в ходе простого этапе дискриминации. Как показано на рисунке 4C, это нормализация шаг уменьшает изменчивость, связанную с изучением первоначально соответствующую реплику и повышает визуализацию повышения производительности на последующих этапах IDS. Хотя размеры групповые ~ 20 мышей будет достаточно для проведения анализа исходных данных, без нормализации. Важно отметить, что значительное увеличение в испытаниях, чтобы удовлетворить критерий при extradimentional сдвига по отношению к предыдущему intradimentional сдвигов показывает является важной мерой контроля испытательного срока действия (рис 4D и 4E). До стадии ED сдвига, мыши научиться обращать внимание на одного соответствующего размера кия (запах или носитель) для того, чтобы найти награду. Переход к пеж соответствующего размера кий, который был ранее значения, должны требовать больше испытаний, чтобы достичь критерий, в результате чего ID / Под ред сдвига. Интересно, что анализ ID / Под ред сдвига в исходных данных выявлено значительное увеличение испытаний, чтобы достичь критерий между IDS2 и ЭД (рис 4D), и тенденция к увеличению между IDS3 и ЭД (данные не показаны, р <0,1) и увеличение между средними испытаний, чтобы достичь критерий IDS2 и IDS3 сравнению с ED (данные не показаны). Интересно, что значительный сдвиг ID / ED было очевидно, между обоими IDS2 и IDS3 по сравнению с ЭД, когда данные были нормированы на выступления на сцене SD (рис 4д).
Ожидается, что примерно 70-80% от контрольных мышей завершит все задачи (20-30% отсева). Альтернативные зависимые меры включают среднюю задержку, чтобы сделать выбор, как измеряется на каждом этапе задачи (хотя мы обнаружили, что это сильно различаться между мышами),общее количество ошибок и число "установлены потери" ошибки в повороте и этапов экстра-мерных сдвига, как это определено Lapiz-Блюм и др., 14, как несколько раз неправильный выбор был сделан после трех или более последовательно правильный выбор. Увеличение числа "установлены потери" ошибки может указывать на персеверативного поведение. Кроме того, у мышей, как правило, выполнения каждого этапа тестирования менее чем за 30 минут (рисунок 5), и продолжительность времени, проведенного в каждой стадии функция испытаний, чтобы достичь критерий.
В предыдущем исследовании, используя подобную парадигму, описанных здесь, нейротоксическое поражения в ОФК или mPFC в мышей, ухудшая производительность на этапах смены разворота и экстра-мерных соответственно, проверка использования этого теста для определения функционального дефицита в же регионы, как крысы и приматов studies11 не являющихся людьми. В то время как последовательность задач в вышеупомянутом исследовании VВесы слегка, что показано здесь, можно ожидать, что поражения или дефицит в ОФК и mPFC также приведет к нарушению производительности при R1 и EDS, о чем свидетельствует увеличение числа испытаний критерию на этих этапах. ,
| Этап | Соответствующая | Примеры | Соответствующая | Примеры | ||
| Простой Дискриминация (SD) | Среда | Войлок (+) | Бумага (-) | Запах | Мускатный орех (+) | Розмарин (-) |
| Соединение Дискриминация (CD) | Среда | Войлок (+) / Мускатный орех | Бумага (-) / Rosemary | Запах | Мускатный орех (+) / Фетр | Розмари (-) / Бумага |
| Войлок (+) / розмарин | Бумага (-) / Мускатный орех | Мускатный орех (+) / Бумага | Розмари (-) / Фетр | |||
| Восстановление 1 (R1) | Среда | Бумага (+) / розмарин | Войлок (-) / Мускатный орех | Запах | Розмари (+) / Бумага | Мускатный орех (-) / Фетр |
| Бумага (+) / мускатный орех | Войлок (-) / розмарин | Розмарин (+) / Фетр | Мускатный орех (-) / Бумага | |||
| Intradimensional Shift (IDS) | Среда | Помпонами | Блестки (-) / Гвоздика | Запах </ TD> | Корица (+) / помпонами | Клов (-) / блестками |
| (+) / Корицы | ||||||
| Помпонами (+) / гвоздики | Блестки (-) / корицы | Корица (+) / Блестки | Клов (-) / помпонами | |||
| IDS2 | Среда | Pipecleaners | Googly глаза (-) / Ginger | Запах | Красный тимьян (+) / Pipecleaners | Имбирь (-) / Googly глаза |
| (+) / Красный тимьян | ||||||
| Pipecleaners (+) / Ginger | Googly глаза (-) / Красный тимьян | Красный тимьян (+) / Googly глаза | Имбирь (-) | |||
| IDS3 | Среда | Лента (+) / Ванильный | Металлические полоски (-) / Лимонная | Запах | Ваниль (+) / Лента | Лимон (-) / Металлические полосы |
| Лента (+) / Лимонная | Металлические полоски (-) / Ванильный | Vanilla (+) / Металлические полоски | Лимон (-) / Лента | |||
| R2 | Среда | Металлические полоски (+) / Ванильный | Лента (-) / Lemon | Запах | Лимон (+) / Лента | Ваниль (-) / металлических полосок |
| Металлические полоски (+) / Лимонная | Лента (-) / Vanilla | Лимон (+) / Metal ТИК полосы | Ваниль (-) / Лента | |||
| Внепространственной Shift (EDS) | Запах | Citronella (+) / плетеная | Анисовый (-) / пена | Среда | Плетеная (+) / цитронеллы | Пена (-) / анисовый |
| Citronella (+) / пена | Анис (-) / плетеная | Плетеная (+) / анисовый | Пена (-) / цитронеллы | |||
Таблица 1. Пример комбинации запахов и копать среды. Ароматы и перекопали СМИ в этих комбинациях были проверены в данном исследовании. Представитель результаты, полученные с помощью этих конкретных комбинаций показаны на рисунке 2.
hres.jpg "/>
Рисунок 1. АСТ испытательной камере. (А) Изображение и размеры ramekin и примера размещения фильтровальной бумаги. (Б) Изображение АСТ испытательной камеры, приспособленной для мышей и (С) трехмерная схема испытательной камере, иллюстрирующее размещение отверстий в пределах раздела.
Рисунок 2. Рытье среду. Примеры копать средние пары, используемые в настоящем протоколе, как указано в списке материалов (ii.-xi.). Горшки заполнены примерно на внутренней окружности с рыть среды.
Рисунок 3. Срок выполнения тестирования.
Рисунок 4. C57Bl / 6J выступление в АСТ. () Среднее количество испытаний для удовлетворения критерию в AST для мужчин C57BL / 6J мышей. Данные представляют среднее ± SEM (n = 22 мышей / группа), р = 0,013 для основного эффекта стадии. (B) Среднее число испытаний для достижения критерия на этапе SD для различных начальных соответствующих размеров Cue. Данные представляют собой среднее ± SEM (n = 22 мышей / группа), * р = 0,01. (C) нормализованные данные, представленные в виде процента от индивидуальной работы каждой мыши в на этапе SD. Данные представляют среднее ± SEM (n = 22 мышей / группа), р = 0,06 для основного эффекта стадии. (D) ID / ED сдвиг в исследованиях, чтобы достичь критерий между IDS2 и ЭД. Данные представляют среднее ± SEM (n = 22 мышей / группа), * р = 0,03. (E) ID / ED сдвиг в нормированных данных между IDS3 и ЭД. Данные представляют среднее ± SEM (n = 22 мышей / группа), * р = 0,012.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Дефицит познавательной гибкости при посредничестве PFC представляет собой значительный инвалидности, связанных с различными неврологическими и нервно-психических расстройств, и может оказать существенное влияние на результаты и качество жизни людей, страдающих от этих заболеваний. Оптимизация АСТ для использования в мышей является жизненно важным для исследования генетических основ при заболеваниях связанных с префронтальную коры головного мозга, опосредованного когнитивную дисфункцию. Мы обнаружили, что способ, описанный выше, является надежным показателем конкретного когнитивной недостаточности, когнитивной гибкости и приближен результаты, полученные с помощью этой задачи у крыс и приматов. Описанный способ результатом широкого обзора, описанных ранее протоколов у крыс и мышей, а также советы и рекомендации экспертов в нашем учреждении.
Предыдущие доклады с использованием аналогичных задач в мышах показали, адаптивность такого поведения меры, хотя и снесколько предостережений 2,6,11. Colacicco и др. Ограничивали количество дискриминации проверенных за день до 2, которые распространяются тестирование в течение четырех дней 11. Это включало повторений ранее стало известно стимулов пар на последовательных дней тестирования. Эффективным, хотя цель разработки протокола, представленный здесь, чтобы свести к минимуму продолжительность периода тестирования и обеспечения максимальной эффективности. Здесь мы ограничимся тестирование на двухдневный период и устранить повторения ранее изученного стимулов пар. Предыдущие исследователи отмечают, что у мышей, требуют перетренированности, чтобы сформировать к вниманию набор и проявляют «окно проверяемости" небольшой, в которых они будут поддерживать Effortful отвечает. Наш протокол также включает в себя скромный перетренированности на intradimensional сдвига в первоначально соответствующей размерности метки. В частности, при оценке нормированных данных в фигуре 4C, кажется, что у мышей, проверенные на наших протокола могут проявлять более острый дефицит Дуринг второй intradimensional разворот (относительно непосредственно предшествующей стадии). Это наблюдение согласуется с понятием перетренированности в целях обеспечения формирование для повышенного внимания множества, как мыши также проявляли ID / Под ред сдвиг. Одна из возможностей, почему мышей поддержания Effortful производительность в нашем протокола (рисунок 5), которая включает в себя среднюю длину сеанса 2 часа, может быть связано с использованием обратной светового цикла. Мы протестировали поведение в изолированной и выделенной для тестирования комнате под красными условиях освещения в течение первых четырех часов темноте (бодрствования) цикла. Тем не менее, систематическое тестирование выходит за рамки этого метода рукописи необходимо будет определить, какие факторы способствуют продолжительности, в которых мыши будут продолжать выполнять AST, и если дефицит в обонятельной дискриминации подозревается, для предварительного могут быть оправданы перед тестированием в качестве заместителя без запаха, методологии поступало.
Кроме того, в ходеначальное развитие метода, мы обнаружили, что молодые взрослые мыши (8-12 недель) выполняется с большей изменчивостью, что постарше 4-6 месячных мышей. Мы полагаем, что протокол ограничение пищи влияет растет мышей иначе, чем более зрелых мышей, и в то время, в классическом смысле нервной системы, мозга мыши считается полностью разработан 6 недель, не исключено, что при переходе от подростков до взрослых зрелости и юношеском возрасте синаптической реконструкции в префронтальной коре производительности посрамить АСТ молодых мышей. Тем не менее, эти увлекательные вопросы еще предстоит изучить.
Другие варианты протоколов АСТ мышей включают "свободные" испытания, а это означает указанное число испытаний (обычно 4) в начале каждого этапа не забил, и животное позволили исследовать обе кастрюли, пока награда не извлекается. Протокол подробно здесь не включают каких-либо "свободные" испытания. Кроме того, мы устанавливаем ТРЕБОВАНИЯНТС для удовлетворения критериев больше строгие (8 последовательно правильные испытания критерию вместо ранее описано 8/10 испытания, чтобы встретиться критерий) и обнаружили, что это эффективна индикатором того, как животное действительно узнал правила. Гарнер и др. показали, что период перетренированности после СОВ (т.е., представление ранее соответствующих стимулов для дополнительных 50 исследований), значительно увеличили испытания критерию в EDS 2. Здесь мы включать в себя несколько внутри--мерного изменения, в попытке "перетренированности" и обеспечить формирование в для повышенного внимания, установленного на соответствующий измерению, в соответствии с Bissonette и др. 6. Кроме того, Garner др. ограниченные сеансы тестирования на приблизительно 1 ч (или, когда мышь уже не ответил) 2, в то время как мы обнаружили, что C57BL6 / J мышей адекватно и надежно мере прохождения всех четырех стадий, представленных на них каждый день в течение примерно в течение 2 ч (при контролемышей). Хотя, потенциальные различия в двигательной способности между экспериментальными группами следует учитывать при интерпретации производительности. Наша процедура ограничивает время и труд, инвестиции в 17 дней для каждого животного с начала обработки посредством завершения тестирования. Рекомендуется, чтобы индивидуальный экспериментатор ограничить количество мышей, испытанных в течение одного дня, чтобы не более чем на 2 (это может быть изменена на основании индивидуальной способности экспериментатора и опыта), которая позволяет одним экспериментатором способность завершить тестирование, по крайней мере 6 Мыши в неделю. Если функция двигатель слегка нарушена, длина каждого испытания может быть увеличена, как правильно реагировать, а не скорость реагирования, является ключом зависимой переменной.
Визуальный дискриминации парадигмы аналогичны тем, которые были использованы для оценки когнитивных функций в приматов недавно были адаптированы для использования в грызунов, и могут быть использованы в качестве альтернативы запах и среднего discriminatioп задач, описанных здесь. Этот подход может быть необходимо, если существенные различия в обонятельной дискриминации присутствуют между экспериментальными группами мышей. Brigman и др. Показали, что у мышей, легко различить составные визуальные стимулы в ID и ED сдвига парадигмы 15. Хотя это автоматизированный способ лучше характеризует тест используются для изучения префронтальной дисфункции коры у человека и приматов, стоимость оперантного камер и сенсорных экранов, необходимых для выполнения этой автоматизированной тест на мышах может быть непомерно высокой.
Рекомендуется, что поведение быть выполнена последовательно, как это возможно для каждой мыши, т.е. привыкание, обучение и тестирование следует проводить в то же время суток для каждого животного. Кроме того, поведение комната должна оставаться неизменной в течение всего эксперимента, что делает использование общей / космического сообщества проблематично из-за неконтролируемого потока трафика, внедрение запах и т.д. Если животные будут транспортироватьсяиз корпуса комнаты в удаленном помещении поведения (как это имеет место здесь), тем же путем, должны быть приняты каждый раз. Номер поведение должно быть в районе, где не будет нарушен экспериментатор и животные во время процедуры тестирования. Если несколько экспериментаторов выполнения задачи в той же комнате, въезда и выезда из помещения должны быть как можно более ограниченным, чтобы избежать каких-либо громкие шумы или дезинтеграции, которые могут увеличить стресс или беспокойство животного во время тестирования. Кроме того, экспериментаторы должны быть осторожны при удалении и замене стартовые ворота, а также горшки в и из камеры таким образом, чтобы создать как можно меньше шума и нарушения, как это возможно. Эксперименты, проведенные на крысах показали, что производительность АСТ может быть нарушена различными стресса.
Чуя горшков должны быть выполнены каждую неделю, и в тот же день каждую неделю, по крайней мере за 2 дня до первого тестирования день. Рекомендуется, чтобы горшки с запахом в хорошо вентиляцииilated область за пределами области, где тест будет выполняться (например, отдельный лаборатория, прихожая, вытяжной шкаф). Это поможет избежать перекрестного загрязнения запахами и избежать путаницы мышей с ароматами, которые не являются частью теста. Кроме того, до и во время тестирования, сильные запахи, которые могут отвлечь животное от дискриминации (т.е. потребление резинки или кофе непосредственно перед тестированием, сильный духов / дезодоранта, и т.д.) следует избегать вышеупомянутого причине. Если экспериментаторы желание использовать альтернативный копания среде, чем то, что описано в данном протоколе, рекомендуется средней быть одинаковой плотности и веса, как описано здесь (избыточный вес / плотность делает его трудным для мыши копать адекватно). Например, мы обнаружили, что небольшие пластиковые шарики не были пригодны, потому что они были трудными для мыши оттеснить. Кроме того, любые средства массовой информации с очень сильным ароматом (например., Резиновые полосы и некоторые пластIC материал) не подходит, поскольку это может повлиять на способность обнаруживать запахи проходят испытания.
Обучение и тестирование индивидуальной мыши должны быть выполнены с помощью одного экспериментатора, однако акклиматизации может быть сделано любым экспериментатора тех пор, пока они участвовали в обработке. Все горшки, которые будут использоваться в четыре этапа, выполненных каждый день должна быть в пределах досягаемости для того, чтобы ограничить количество времени, которое животное в зоне ожидания между этапами. Это поможет поддерживать внимание мыши на каждой задачи. Кроме того, после тестирования начал важно не останавливаться до завершения задач на этот день тестирования (т.е. все 4 стадии для каждого дня тестирования должны быть завершены подряд).
В заключение, протокол, описанный здесь предоставляет подробные методические указания для эффективного использования AST для измерения префронтальной коры головного мозга, в зависимости когнитивные функции у мышей, в том числе описаниеанализа данных и потенциальных оговорками. Разнообразные мыши методов AST представлены в первичной литературе, каждый со своим собственным процедурным подробно. Уникальный связь как текстовый и визуальной информации будет особенно полезно для исследователей пытаются внедрить эту мощную поведения анализа в своей научной репертуара.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано грантами R01-MH090127, P30-MH089868 из Национального института психического здоровья и награда номер UL1TR001120 от Национального Центра для продвижения трансляционных наук. Содержание исключительно ответственности авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения никель-металлогидридных или NCATS. Кроме того, мы хотели бы с благодарностью признать доктор Дэвид Morilak за его ценный опыт в руководстве раннее развитие метода.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Testing Chamber | Fabricated in-house, specifications can be found in protocol | ||
| 3 oz. Ramekins | BIA Cordon Bleu | 900002S12 | Purchased on amazon.com |
| Essential Oils: | Fronteir Natural Products Co-Op | Purchased on http://www.frontiercoop.com/prodlist.php?ct=anpceoeo | |
| Clove Bud | 191114 | ||
| Red Thyme | 191140 | ||
| Lemon | 190810 | ||
| Cinnamon Leaf | 191111 | ||
| Rosemary | 191133 | ||
| Citronella Java | 191112 | ||
| Vanilla in jojoba oil | 191231 | ||
| Anise Seed | 191102 | ||
| Ginger | 191121 | ||
| Nutmeg | 191161 | ||
| Filter Paper, 9.0 cm diameter | VWR International | 28310-048 | Purchased on https://us.vwr.com/ |
| Digging Media | |||
| Raffia | Ashland 8 oz Raffia | Purchased on http://www.michaels.com/ Cut into 1/2" to 1" strips |
|
| Green Felt | Creatology Basic Felt Forest/Dark Green 36 in x 36 in | Purchased on http://www.michaels.com/ cut into 1 cm x 1 cm squares |
|
| Brown foam | Creatology Fun Foam 18 x 12 in sheets (light brown/tan) | Purchased on http://www.michaels.com/ cut into 1/2 cm x 2 cm rectangles |
|
| Crepe paper (yellow) | Celebrate It Paper Crinkle 4 oz yellow jumbo | Purchased on http://www.michaels.com/ Cut into 1/2" to 1" strips |
|
| Ribbon (turqoise) | Celebrate It Wide Ribbon 4 in x 10 yd 100% polyester | Purchased on http://www.michaels.com/ cut into 1 cm x 1 cm squares |
|
| Metallic | Celebrate It Metallic Crinkle Gold 2 oz | Purchased on http://www.michaels.com/ Cut into 1/2" to 1" strips |
|
| Googly Eyes, 4 mm | ME4144 | Purchased on http://factorydirectcraft.com/index.php | |
| Black Sequins, 3 mm | 8780BK | ||
| Pink Pom Poms, 1/4 inch | 1018221 | ||
| Pipe Cleaners, red | 108430 | ||
| Bedding material/sawdust | Obtained from in-house animal resources | ||
| Timer | Control Company | 5000 | Purchased on http://www.control3.com/5000p.htm |
| Lightly sweetened dry breakfast cereal loops | HEB | Honey nut toasted oats used in the protocol described, any lightly sweet coated breakfast cereal is recommended |
References
- Birrell, J. M., Brown, V. J. Medial frontal cortex mediates perceptual attentional set shifting in the rat. J Neurosci. 20 (11), 4320-4324 (2000).
- Garner, J. P., Thogerson, C. M., Wurbel, H., Murray, J. D., Mench, J. A. Animal neuropsychology: validation of the Intra-Dimensional Extra-Dimensional set shifting task for mice. Behav Brain Res. 173 (1), 53-61 (2006).
- Nagahara, A. H., Bernot, T., Tuszynski, M. H. Age-related cognitive deficits in rhesus monkeys mirror human deficits on an automated test battery. Neurobiol Aging. 31 (6), 1020-1031 (2010).
- Rock, P. L., Roiser, J. P., Riedel, W. J., Blackwell, S. Cognitive impairment in depression: a systematic review and meta-analysis. Psychol Med. , 1-12 (2013).
- Stuss, D. T., et al. Wisconsin Card Sorting Test performance in patients with focal frontal and posterior brain damage: effects of lesion location and test structure on separable cognitive processes. Neuropsychologia. 38 (4), 388-402 (2000).
- Bissonette, G. B., et al. Double dissociation of the effects of medial and orbital prefrontal cortical lesions on attentional and affective shifts in mice. J Neurosci. 28 (44), 11124-11130 (2008).
- Chase, E. A., Tait, D. S., Brown, V. J. Lesions of the orbital prefrontal cortex impair the formation of attentional set in rats. Eur J Neurosci. 36 (3), 2368-2375 (2012).
- McAlonan, K., Brown, V. J. Orbital prefrontal cortex mediates reversal learning and not attentional set shifting in the rat. Behav Brain Res. 146 (1-2), 97-103 (2003).
- Dias, R., Robbins, T. W., Roberts, A. C. Primate analogue of the Wisconsin Card Sorting Test: effects of excitotoxic lesions of the prefrontal cortex in the marmoset. Behav Neurosci. 110 (5), 872-886 (1996).
- Bissonette, G. B., Powell, E. M. Reversal learning and attentional set-shifting in mice. Neuropharmacology. 62 (3), 1168-1174 (2012).
- Colacicco, G., Welzl, H., Lipp, H. P., Wurbel, H. Attentional set-shifting in mice: modification of a rat paradigm, and evidence for strain-dependent variation. Behav Brain Res. 132 (1), 95-102 (2002).
- Kos, T., Nikiforuk, A., Rafa, D., Popik, P. The effects of NMDA receptor antagonists on attentional set-shifting task performance in mice. Psychopharmacology (Berl). 214 (4), 911-921 (2011).
- Tait, D. S., Chase, E. A., Brown, V. J. Attentional Set-Shifting in Rodents: a Review of Behavioural Methods and Pharmacological Results. Curr Pharm Des. , (2013).
- Lapiz-Bluhm, M. D., et al. Behavioural assays to model cognitive and affective dimensions of depression and anxiety in rats. J Neuroendocrinol. 20 (10), 1115-1137 (2008).
- Brigman, J. L., Bussey, T. J., Saksida, L. M., Rothblat, L. A. Discrimination of multidimensional visual stimuli by mice: intra- and extradimensional shifts. Behav Neurosci. 119 (3), 839-842 (2005).
